DK152383B - Hurtig, foelsom fremgangsmaade til paavisning af antibiotika - Google Patents

Description

i

DK 152383B

Den foreliggende opfindelse angår en hurtig, følsom fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af antibiotika i væsker såsom mælk, legemsvæsker, kødekstrakter og gæringssubstrater.

5

Muligheden for at påvise små antibiotikakoncentrationer i væsker er vigtig i forskellige situationer. Et eksempel er fødevareindustrien, hvor anvendelsen af antibiotika ved behandlingen af dyr, som frembringer fødevarer, har skabt 10 behov for en hurtig, nøjagtig testfremgangsmåde, som kan anvendes som rutine f.eks. af fødevaregrossister. Da penicilliner anvendes til at behandle mastitis hos malkekvæg, er penicillinpåvisningsfremgangsmåder, som er egnede til hurtigt og nøjagtigt at undersøge mælk, særlig vigtige.

15 Således fører den voksende medicinske bekymring om menneskers indtagelse af små mængder antibiotika til, at man interesserer sig for forekomsten af penicillin i mælk i mængder i området 0,010 - 0,050 I.U./ml eller mere og for simple undersøgelsesmetoder til påvisning af sådanne små mæng-20 der penicillin eller andre antibiotika.

Der kendes en række fremgangsmåder til påvisning af antibiotika. De fleste af disse involverer mikrobiologiske teknikker, ved hvilke tilstedeværelsen eller fraværelsen af 25 penicillin eller andre antibiotika bestemmes ved at observere inhiberingen af væksten af antibiotikum-følsomme mikroorganismer i tilstedeværelse af den undersøgte prøve. Sådanne procedurer har hidtil krævet inkuberingstider på fire timer eller mere, men ved anvendelsen af mikroorga-30 nismestammer, som er "superfølsomme" over for antibiotika, er den nødvendige tid til udførelse af forsøgene reduceret til mellem 2 og 2 1/2 time.

Andre antibiotikumpåvisningsteknikker udnytter andre karak-35 teristiske egenskaber hos det antibiotikum eller den klasse af antibiotika, som skal påvises, som testgrundlag.

Således beskrives i Immobilized Enzyme-Based Flowing-Stream 2

DK 152383 B

Analyzer for Measurement of Penicillin in Fermentation Broths/ J.F. Rusling et al., Analytical Chemistry, bind 48, side 1211, (juli 1976) en test baseret på den enzymatiske hydrolyse af penicillin med et immobiliseret β-5 — lactamasederivat·. 1 Simple Ultrasensitive Test for Detec ting Penicillin in Milk, J.M.A. Palmer et al., J. Dairy Science, bind 50, side 1390, 1968, beskrives en fremgangsmåde til påvisning af penicillin på basis af væksten af Bacillus subtilis-sporer på sporenæring-farvepapirplader i en 10 lille prøve mælk, som eksponeres for den atmosfæriske luft.

Efterhånden som’mælkens vandindhold fordamper, forøges penicillinkoncentrationen, hvis der er penicillin til stede, hvorved der i farvestoffet induceres et farveskift, der indicerer koncentrationen. I USA-patentskrift nr. 3.586.483 15 beskrives en fremgangsmåde til at detektere tetracyclin-antibiotika i væsker ved at absorbere væsken på en absorberende strimmel, som indeholder et complexdannende metal, der danner et fluorescerende metalcomplex med antibiotikummet, og ved observering af metalcomplexets fluorescens un-20 der ultraviolet lys.

Den ovenfor beskrevne og andre tilgængelige påvisningsteknikker er meget forskellige med hensyn til deres følsomhed og hastighed. Det formodes, at ingen hidtil tilgængelig 25 test er i stand til at påvise så lidt som 0,01 I.U. penicillin pr. ml(6 ng/ml) på mindre end 1 time. Hvis en sådan test var tilgængelig, ville man på økonomisk vis hurtigt og pålideligt f.eks. kunne bestemme, om mælkeprøver indsamlet i praksis fra relativt små charger indeholder anti-30 biotikumkoncentrationer, som overskrider de officielle nor mer.

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt, hurtig, følsom fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af 35 et antibiotikum i en flydende prøve, især i mælk, legemsvæsker, kødekstrakter og gæringssubstrater, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter trinnene:

3 DK 152383 B

A) Prøven inkuberes sammen med en fast fase omfattende en antibiotikumfølsom mikroorganisme eller en del deraf, som har receptorsteder, der er i stand til at bindes med antibiotikummet, idet inkuberingen udføres under betingeler, 5 som tillader antibiotikummolekylerne, hvis de er til stede i prøven, at bindes til disse receptorsteder, B) blandingen fra trin A) inkuberes sammen med et mærket stof, der kan være en antibiotikum, et derivat deraf 10 eller en precursor derfor, som er i stand til reversibelt at bindes til de pågældende receptorsteder, C) den faste fase skilles fra væsken, 15 D) mængden af mærket stof i den faste fase eller i væsken bestemmes, og E) bestemmelsen sammenlignes med en standard til opnåelse af en indikation for tilstedeværelsen af antibiotikum i 20 prøven.

Hvis der er antibiotikummolekyler til stede i prøven, så vil de mærkede og umærkede molekyler begge forsøge at binde sig til et begrænset antal receptorsteder på 25 cellerne eller de cellulære underenheder, og den mængde mærket antibiotikum, som bliver immobiliseret, er omvendt proportional med koncentrationen af antibiotikum i testprøven. På lignende måde er den mængde mærket antibiotikum som forbliver i væskefasen, en funktion af den oprin-30 delige antibiotikumkoncentration.

Den særlige fordel ved fremgangsmåden ifølge den forelig gende opfindelse er, at den er i stand til at påvise meget små antibiotikumkoncentrationer, f.eks. 0,001 I.U./ml 35 penicillin, og kan gøre det hurtigt, f.eks. på mindre end 10 minutter.

Visse udførelsesformer for den foreliggende opfindelse er ideelt egnede til bestemmelse af, om mælk indeholder antibiotika af penicillintypen, og den foreliggende opfindelse vil i det følgende blive beskrevet i detaljer 4

DK 152383B

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen foretrækkes det at bestemme mængden af mærket stof i den faste fase. Trinnene A) og B) udføres hensigtsmæssigt samtidigt.

5 Testens overraskende følsomhed og hurtighed formodes at skyldes både den høje bindingskonstant for tiltrækningen mellem antibiotikummolekyler og receptorstederne på cellevæggene eller andre subcellulære strukturer hos den antibiotikumfølsomme organisme og antibiotikummolekylernes IC specificitet for deres virkningssteder på sådanne organismer. F.eks. er bindingskonstanten for penicilliner med receptorsteder på grampositive celler størrelsesordener større end bindingskonstanten for den immunokemiske antigen-antistof-reaktion, på hvilken analoge detekte-15 ringsteknikker (immunobestemmelse) har været baseret.

I J.R. Edwards et al., Journal of Bacteriology, august 1969, s. 459 - 462, beskrives binding af penicilliner og cephalosporiner til Staphylococcus aureus, og der påvi-20 ses en sammenhæng mellem disse antibiotikas evne til at inhibere vækst og den hyppighed, hvormed de binder til receptorsteder på cellemembranen og derved forhindrer cellevægsyntesen. De i artiklen beskrevne forsøg er udført med kendte og forinden udvalgte antibiotikakoncen-25 trationer.

I modsætning hertil angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til påvisning og kvantitativ måling af en ukendt mængde antibiotikum i en flydende prøve, og 30 der opnås ved denne fremgangsmåde en forbedring med hensyn til hastighed og følsomhed på mindst en størrelsesorden i forhold til den kendte teknik. Opnåelsen af en sådan forbedring ved måling af en ukendt antibiotikumkoncentration ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen 33 er ikke nærliggende på grundlag af det i ovennævnte artikel beskrevne.

5

DK 152383B

Ved en vigtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, udføres der til opnåelse af en hurtig test, der er egnet til anvendelse til screening af mælk, en enkelt inkubering, i hvilken der medtages den 5 antibiotikumfølsomme mikroorganisme, den prøve, der skal testes, og den mærkede antibiotikumprecursor, og adskillelsestrinnet udføres ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt ved centrifugering. Når det f.eks. drejer sig om påvisning af et β-lactamantibiotikum, omfatter det mærkede 10 stof således ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt en β-lac-tamdel, og mikroorganismen er ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt en β-lactamantibiotikum-følsom mikroorganisme.

Både bestemmelsens hastighed og følsomhed fremmes ifølge opfindelsen ved at anvende cellestammer, der er superføl-15 somme over for en klasse af antibiotika eller et specifikt antibiotikum, der skal påvises. Til yderligere effektivisering af testen er de foretrukne antibiotikumfølsomme mikroorganismer ifølge opfindelsen stammer, der har en optimal væksttemperatur over ca. 50°C. I dette tilfælde kan 20 inkuberingen udføres ved relativt høje temperaturer, og kinetikken for den organiske antibiotikum-receptorsted--reaktion fremmes. Den foretrukne mikroorganiske til udførelse af tests for β-lactamantibiotika er ifølge opfin-selsen Bacillus stearothermophilus (ATCC nr. 10149 eller 25 15952). Der kan imidlertid anvendes forskellige andre antibiotikumhøjfølsomme stammer, og der kan, hvis en reduceret følsomhed kan tolereres, simpelt hen anvendes følsomme stammer. Eksempler på egnede cellestammer er f.eks. visse mutanter af Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, 3Q Bacillus subtilis og Streptomyces aureus.

Ved udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, hvor hurtigheden er mindre vigtig end følsomheden, inkuberes cellekulturen en tid/ og det mærkede 35 antibiotikum tilsættes senere. Når der anvendes følsomme mikroorganismer med en høj optimal vækstrate, er det kon-

DK 152383 B

stateret, at følsomheden ikke forøges lineært med tiden, og at der ikke bør udføres inkuberinger med mere end 15 minutters varighed.

5 Ved foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfindelse er det antibiotikum, der skal påvises, et (3-lactam-antibiotikum såsom benzylpenicillin, cephalosporin, ampicillin, oxacillin, methicillin, cloxacillin, cephaloridin og cephalothin, og det mærkede antibiotikum, som kan være radioaktivt mær-10 ket, er valgt blandt gruppen bestående af 6-aminopenicil-lansyre og benzylpenicillin. Andre eksempler på antibiotika, der kan påvises, er f.eks. erythromycin, lincomycin, actinomycin, vancomycin, bacitracin eller aminoglycosider såsom streptomycin, gentamycin, kanamycin eller neomycin.

15 I tilfælde af at det antibiotikum, der skal påvises, er streptomycin, kan det mærkede stof ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt være tritium-mærket tetrahydrostreptomy-cin. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse arbejder enestående godt med penicillin eller penicillin-20 lignende antibiotika af den type, som inhiberer cellereproduktionen ved at binde sig til steder på cellemembranen og inhibere cellevægssyntesen. Antibiotika med andre virkningssteder såsom rifamycin og tetracycliner kan imidlertid også påvises. Det mærkede stof kan ifølge op-25 findelsen hensigtsmæssigt være mærket med et radioaktivt atom, et enzym, en enzyminhibitor eller et coenzym. Fore- 14 trukne mærker er f.eks. et C-atom inkorporeret i anti- 125 biotikummolekylets struktur, et I-atom bundet til an- i tibiotikummet via reaktion med f.eks. tyrosin eller et 30 egnet derivat deraf, eller et enzym såsom peroxidase.

Ved en anden betydningsfuld udførelsesform for den foreliggende opfindelse immobiliseres mikroorganismen eller delene deraf, som indeholder receptorsteder, på en ikke-35 vandopløselig bærer, f.eks. en vattampon. Ved denne udførelsesform lettes adskillelsestrinnet, da bæreren efter inkuberingen simpelt hen kan fjernes fra væsken og skyl-

DK 152383B

7 les. Behovet for et apparat, der er i stand til at detektere radioaktive henfaldsprodukter, kan elimineres ved at mærke med et enzym. I dette tilfælde opnås ifølge opfindelsen en indikation for den tilstedeværende enzymmængde ved inkubering med en enzymsubstratopløsning, der er i stand 5 til at undergå et farveskift som svar på den katalytiske virkning af enzymmærket, og den i trin E) anvendte standard omfatter en optisk densitetsværdi bestemt under standardbetingelser, hvorhos værdien svarer til en udvalgt antibiotikumkoncentration. Et foretrukket system omfatter 10 et peoxidasemærke og en substratopløsning, der indeholder H202 og 4-aminoantipyrin, som skifter farve i nærværelse af peroxidase.

Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse er et test-15 sæt til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning af tilstedeværelsen af et antibiotikum i en flydende prøve,hvilket testsæt er ejendommeligt ved, at det omfatter en kombination af 20 A) koncentrationsstabiliserede celler eller celledele fra en antibiotikumfølsom mikroorganisme med receptorsteder, der er i stand til at binde antibiotikummet, B) et mærket antibiotikum, en mærket antibiotikumprecur-25 sor eller et mærket derivat deraf, der er i stand til at binde sig til receptorsteder ved inkubering sammen med cellerne eller celledelene, og C) en standard, med hvilken resultater for bestemmelser 30 udført med cellerne og det mærkede materiale kan sammenlignes.

Ved foretrukne udførelsesformer omfatter testsættet frysetørret Bacillus stearothermophilus, det mærkede an- 35 tibiotikum er benzylpenicillin mærket med et radioaktivt 14 atom, f.eks. C, og standarden er enten en standardkur-

g . DK 152383 B

ve eller mindst én prøve, der indeholder en kendt koncentration af det antibiotikum eller den klasse af antibiotika, der skal påvises.

5 ved en anden udførelsesform for testsættet ifølge opfindelsen omfatter reagenset A) en ikke-vandopløselig bærer, hvorpå der er immobiliseret celledele fra en antibioti-kumsuperfølsom mikroorganisme, og reagens B) omfatter et enzymmærket antibiotikum, hvorhos sættet endvidere omfat-10 ter en enzymsubstratopløsning, der er i stand til at undergå en farveændring som svar på enzymmærkets katalytiske påvirkning. Enzymmærket kan være oxidase; substratopløsningen omfatter I^C^, phenol og 4-aminoantipyrin.

Ifølge opfindelsen kan reagenset A) fremstilles ud fra 15 Bacillus stearothermophilus, og reagenset B) kan være mærket med tritium, 125I eller 14C. Standarden omfatter ifølge opfindelsen mindst én standard udvalgt blandt gruppen bestående af en standardkurve, mindst én prøve, der indeholder en kendt koncentration af det antibiotikum, 20 som skal påvises, og en mærkeudlæsningsværdi bestemt under standardbetingelser og svarende til en udvalgt antibiotikumkoncentration .

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde 2c til detektering af antibiotika, ved hvilken fremgangsmåde der kan detekteres en lang række forskellige antibiotiske medikamenter i en lang række flydende medier, og hvilken fremgangsmåde kan tilpasses til at være meget hurtig og acceptabelt følsom, eller til at være lidt langsommere, men 30 ekstraordinært følsom. Den foreliggende opfindelse angår også en hurtig antibiotikumpåvisningsteknik, som hensigtsmæssigt kan udføres uden for laboratoriet. Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse er et testsæt, der et egnet til bestemmelse af tilstedeværelsen af så lidt som et 35 ng/ml antibiotikum i en væskeprøve fra materialer såsom mælk, legemsvæsker, kødrester eller gæringsv,æsker. Et andet aspekt er et testsæt, med hvilket der åbnes mulighed for udførelse af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse uden en centrifuge eller scintillationstæller.

9 DK 152383B

På tegningen viser fig. 1 en skematisk gengivelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og fig. 2 en standardkurve for benzyl-penicillin.

5 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse omfatter fire grundlæggende trin: En inkubering, ved hvilken antibiotikummet (hvis der er noget) i prøven og det mærkede antibiotikum bindes til antibiotikumfølsomme celler eller cel-leunderenheder, en adskillelse, ved hvilken cellerne med 10 bundet antibiotikum isoleres fra resten af systemet, en bestemmelse, ved hvilken der fås en indikation for mængden af mærket antibiotikum forbundet med enten cellerne eller den fraskilte væske, og en sammenligning, ved hvilken bestemmelsen sammenlignes med en standard. Når koncen-15 trationen af antibiotikum i testprøven forøges, vil færre mærkede antibiotikummolekyler findes i forbindelse med cellerne (og flere i den fraskilte væske).

Ved at fremstille en serie prøver med kendt antibiotikum-20 koncentration og behandle dem i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan der frembringes en standardkurve over f.eks. antibiotikumkoncentration mod tællinger pr.minut (i tilfælde af radioaktive mærker). Bestemmelser på ukendte prøver vil give en kvantitativ in-25 dikation for antibiotikumkoncentrationen, hvis de sammenlignes med en sådan kurve. Den i trin E) anvendte standard er således ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt en standardkurve for antibiotikumkoncentrationen mod en kvantitativ indikation for mængden af mærket stof i forbindelse i for-30 bindelse med den faste fase. En indikation for tilstedeværelsen af antibiotikum i en prøve kan også opnås ved at sammenligne testprøveresultatet for mærket antibiotikum med resultaterne fra parallelle bestemmelser på prøver med kendte mængder antibiotikum. Hvis der kun søges efter til-35 stedeværelsen af antibiotikum i koncentrationer over et vist maksimum, kan den nødvendige sammenligning udføres indirekte. Dette udføres ved at notere udlæsningen for testprøven og sammenligne med en tidligere foretaget udlæsning, som er korreleret med den kritiske antibiotikumkon-

10 DK 152383 B

standardisering af reagenser og procedurer. Den tekniker, som udfører testen, foretager da uden videre sammenligningen, når han tolker udlæsningen.

5 Det formodes, at bestemmelsesmetodens gode følsomhed og hurtighed skyldes de typisk høje bindingskonstanter for reaktionerne mellem antibiotika og celler og antibiotikaenes specificitet for deres virkningssteder. Således kan ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse endog 10 ekstremt små mængder antibiotikum i en testprøve hurtigt bindes til receptorsteder på cellemembranen eller en anden lokalitet på den mikroorganisme, sammen med hvilken antibiotikummet inkuberes. I denne henseende er det kendt, at mange antibiotika fungerer ved at binde sig til visse cel-15 lelokaliteter , hvorved de forhindrer normal reproduktiv metabolisme. F.eks. er det kendt, at vancomycin, bacitracin, penicilliner og cephalosporiner inhiberer cellereproduktionen ved at binde sig til receptorsteder på cellemembranen og derved forhindre cellevægssyntesen. Se 20 f.eks. Correlation between Growth Inhibition and the Binding of Various Penicillins and Cephalosporins to Staphylococcus aureus, J.R. Edwards et al., Journal of Bacteriology, August 1969, side 459-462, og The Actions of Penicillin and Other Antibiotics on Bacterial Cell Wall 25 Synthesis, J.L. Strominger, Hopkins Med. J., V. 133, side 63 (1973). Andre antibiotika har virkningssteder, der er noget mindre tilgængelige end cellemembranen, men ikke desto mindre virker de ved at binde sig til specifikke cellelokaliteter såsom ribosomer eller nucleinsyrer. Frem-30 gangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan derfor ud over β-lactamantibiotika og andre ovenfor nævnte antibiotika anvendes til at påvise erythromycin, lincomycin, actinomycin og tetracyclin samt aminoglycosider såsom streptomycin eller neomycin. De sidstnævnte stoffer har 35 forskellige virkningssteder i cellerne, f.eks. ribosomer.

Hvis mærkede antibiotika tilsættes ved inkuberingen af prøven, så vil mærkede og umærkede molekyler konkurrere om de tilgængelige receptorsteder, idet de relative mængder af mærkede oa umærkede antibiotikummolekvler, der bin-

. DK 152383B

il Ji" trationen i prøven. Hvis de mærkede molekyler er tilsat, efter at prøven er inkuberet sammen med cellerne i en periode, så vil de mærkede antibiotikummolekyler binde sig til de resterende receptorsteder. I hvert tilfælde 5 fås, da der ved detektering af tilstedeværelsen af mærkede molekyler immobiliseret på cellerne kan opnås et mål for graden af bindingen af mærket antibiotikum, et indirekte mål for bindingen af umærkede molekyler, da mængden af mærket antibiotikum på cellerne er en funk-10 tion af mængden af antibiotikum, der er til stede i prøven.

Sagt på en anden måde beror fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse på, at mærkede antibiotikummolekyler og 15 antibiotikum, der kan være til stede i prøven, søger af reagere med et endeligt antal receptorsteder hos cellerne, enten samtidigt eller efter hinanden. Der kan således ifølge opfindelsen opnås en vellykket test, når det antibiotikum, der skal påvises, og det mærkede stof er samme antibiotikum. Der 20 kan imidlertid ved inkuberingen anvendes en hvilken som helst egnet mærket repræsentant for den klasse af antibiotika eller beslægtede molekyler såsom antibiotikumprecursorer eller -derivater, der binder sig til samme gruppe receptorsteder som det antibiotikum, der skal påvises. F.eks. kan et hvilket 25 som helst specifikt penicillin- eller cephalosporinantibio-tikum, hensigtsmæssigt mærket, anvendes til at detektere den samme penicillin eller cephalosporin, en hvilken som helst anden penicillin eller cephalosporin eller en blanding af penicilliner eller cephalosporiner. Foretrukne 30 antibiotika anvendt til mærkning er imidlertid sådanne repræsentanter for en given klasse, som har en høj bindingskonstant såsom benzylpenicillin (penicillin G), am-picillin eller cephalosporin inden for klassen af β-lactam-antibiotika. Et eksempel på en antibiotikumprecursor in-35 den for denne klasse er 6-aminopenicillansyref et eksempel på et derivat er reaktionsproduktet af 6-aminopenicil-lansyre og tyrosin. Udtrykket "mærket antibiotikum" eller "mærket stof" betegner her mærkede antibiotika, mærkede

12 DK 152383 B

antibiotikumprecursorer og mærkede antibiotikumderivater samt andre beslægtede stoffer, der har en affinitet for virkningsstederne for de antibiotika, med hvilke de er beslægtet, eller af hvilke de er afledt.

5

Med hensyn til arten af mærkningen findes der inden for den kendte teknik adskillige typer af tilgængelige mærker.

14 Således kan det mærkede antibiotikum indeholde C eller 125 I eller et andet radioaktivt atom, der f.eks. kan detek-10 teres med en tæller, eller et hvilket som helst enzym, en hvilken som helst enzyminhibitor, f.eks. methotrexat, eller et hvilket som helst coenzym, f.eks. NAD (nicotinamidade-nin-dinucleotid), som kan detekteres ved at påvirke det mærkede antibiotikum med en substratopløsning, som undergår en 15 detekterbar kemisk reaktion under katalytisk indflydelse af mærket, eller i hvilken en reaktion inhiberes. Der er opnået fremragende resultater under anvendelse af radio- 14 aktivt mærkede antibiotika, f.eks. C-mærket benzyl-penicillin (penicillin G), som nu er kommercielt tilgæn-20 deligt. Det er for fagmanden klart, at der i de fleste tilfælde må syntetiseres et derivat af antibiotikummole-kylet for at tilvejebringe et sted ,, hvor et radioaktivt iodatom kan tilknyttes. Enzymmærker er også blevet anvendt med held, og coenzymer såsom dehydrogenasecoenzy-25 mer kan anvendes. Tilstedeværelsen af enzymmærket påvises på i og for sig kendt måde under anvendelse af en enzymsubstratopløsning, som f.eks. skifter farve, når den udsættes for enzymet. Den kvantitative bestemmelse af coen-zymet udføres ved at behandle de fraskilte celler (eller 33 den tilbageværende væske) med en opløsning, der indeholder et substrat, som skifter farve, når det påvirkes af et enzymsystem, i hvilket coenzymet indgår som kritisk komponent. De andre enzymer i systemet indgår i opløsningen.

35

Generelt kan de celler, som kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, være en hvilken som helst celle, der er følsom over for det antibiotikum, som

13 DK 152383B

skal påvises. Således kan f.eks. en hvilken som helst mikroorganisme, der inhiberes med penicillin, anvendes til at påvise antibiotika af penicillintype. Det foretrækkes imidlertid for at forbedre følsomheden at anvende en mi-5 kroorganisme, der er "superfølsom" over for det antibiotikum, der skal påvises. I de seneste år er mange stammer af celler, der er superfølsomme over for enten specifikke antibiotika eller klasser af antibiotika blevet tilgængelige. Eksempler på β-lactamfølsomme mikroorganis-10 mer er f.eks. Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Streptomyces aureus, Pseudomonas aeruginosa samt visse mutanter af Escherichia coli. De mest gunstige resultater med hensyn til hurtighed og følsomhed er opnået under anvendelse af superfølsomme mikroorganismestammer med en 15 optimal væksttemperatur, der generelt ligger over ca.

50°c. Den foretrukne mikroorganisme er i denne hensende Bacillus stearothermophilus (ATCC nr. 10149). Bacillus stearothermophilus ATCC nr. 15952 kan også anvendes. Da inkuberingerne kan udføres ved høj temperatur med denne 20 type mikroorganisme, forøges antibiotikumbindingshastigheden.

Det skal bemærkes, at der ikke nødvendigvis behøver anvendes hele celler ved fremgangsmåden ifølge den forelig-25 gende opfindelse. Således kan de celleunderenheder, på hvilke de pågældende receptorsteder er placeret, f.eks. cellevægge eller -membraner, ribosomer eller bundne enzymer, anvendes i steder for hele celler. F.eks. er det kendt, at penicillin G bindes til og inhiberer virkningen 30 af D-alanincarboxypeptidase, som normalt er immobili- seret på cellemembraner. Der findes imidlertid nu fremgangsmåder til isolering af sådanne enzymer, og disse kan anvendes i stedet for hele celler (se Purification and Characterization of Thermophilic D-Alanine Car-35 boxypeptidase from Membranes of B. stearothermophilus, R. Rogers et al., J. Biol. Chem. V. 249, side 4863 -4876).Selv om adskillelsen af sådanne underenheder fra 14

DK 152383 B

resten af reaktionsblandingen kan være vanskelig at udføre hurtigt/ medmindre underenhederne, som det beskrives her, immobiliseres på et uopløseligt fast stof, vil det være klart for fagmanden, at anvendelsen af sådanne 5 materialer er ækvivalent til anvendelsen af hele celler. Udtrykket "celledele" betegner således her hele celler samt cellulære underenheder såsom cellemembraner eller andre strukturer, der indeholder receptorsteder.

10 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan også udføres under anvendelse af receptorsted-holdige celledele, der er immobiliseret på egnet bærer såsom en vattampom, collagenmatrix, en fordybning i et polystyrenlegeme eller polystyrenperler, polyacrylamidgel el-15 ler en lille mængde af en formfast næringsagar anbragt på en duppe-stav. På denne måde kan adskillelsen af cellerne fra væskebestanddelene i reaktionsblandingen udføres meget simpelt og hurtigt. Når der anvendes hele celler, er en foretrukken adskillelsesmetode centri-20 fugering. Der kan imidlertid anvendes andre fremgangsmåder til at adskille cellerne fra resten af reaktionsblandingen, f.eks. ultrafiltrering.

Af det ovenstående er det klart, at testen ifølge den 25 foreliggende opfindelse kan tilpasses til at påvise tilstedeværelsen af en række antibiotika eller blandinger deraf i et antal forskellige flydende medier.

En række mærkede antibiotika eller celler eller celle-30 underenheder kan anvendes, og der kan udføres enten en kvalitativ eller kvantitativ test. Fremgangsmåden i-følge den foreliggende opfindelse belyses nærmere ved følgende eksempler, af hvilke de første beskriver en metode egnet til hurtig undersøgelse af mælkeprøver for 35 tilstedeværelsen af så lidt som 0,001 I.U. penicillin pr. ml.

15 DK 152383B

Eksempel 1.

Bacillus stearothermophilus dyrkes som følger: 5 Medium:

Opløsning A - Difco gærekstrakt 2,58 kg

Difco bactotrypton 2,58 kg dibasisk natriumphosphat 1,54 kg • monobasisk kaliumphosphat 515 g 10 ammoniumsulfat 515 g destilleret vand 515 liter

Opløsning B - Vandfrit magnesiumsulfat 103 g

Destilleret vand 1,29 liter 15

Opløsning C - Calciumchloriddihydrat 12,9 g manganchlorid 0,52 g destilleret vand 1,29 liter 20 Opløsning D - glucose 2,58 kg destilleret vand 12,9 liter

Betingelser: 60°C, beluftning, 10% inoculum.

Væksttid: 2,5 timer.

25

Fremgangsmåde:.

Opløsning A steriliseres i fermentoren. Opløsning B 30 steriliseres separat, og 2,5 ml tilsættes pr. liter opløsning A. Den endelige koncentration af magnesiumsulfat i mediet er 0,2 g/liter. Opløsning C steriliseres separat, og der tilsættes 2,5 ml pr. liter opløsning A, Den endelige koncentration i mediet er: 35

Calciumchloriddihydrat 0,025 g/liter manganchlorid 0,001 g/liter.

16 DK 152383 B

Opløsning D steriliseres separat, og der tilsættes 25 ml for hver liter af opløsning A. Den endelige koncentration af glucose i mediet er 5 g/liter.

5 Temperaturen af opløsning A i fermentoren bør ligge mellem 60 og 65°C. Opløsningerne B,C og D tilsættes under kraftig omrøring i fermentoren. En langsom tilsætning af opløsning C og kraftig omrøring er nødvendig for at forhindre dannelsen af et bundfald. Det fær-10 dige medium har en pH-værdi på 6,9 uden indstilling. Der tilsættes "Dow Corning B antifoam" til en koncentration på 0,1%. Der kræves en meget kraftig beluftning til dyrkning af organismen.

15 Når fermentationen er begyndt, podes en 6-liters glasballon med fuldstændigt medium med indholdet af 2 1-li-ters Ehrlenmeyerkolber, der hver indeholder 150 ml af en kultur, der er dyrket natten over. Når der er opnået en værdi for den optiske densitet på 0,150 (600nyu) anvendes 20 hele glasballonens indhold til podning af 60 liters fermentoren. Når faststofindholdet er 0,03%, anvendes 60 liters fermentoren til podning af 530 liters fermentoren.

25 Cellerne vaskes to gange med fem rumfang 0,2M ammonium-chlorid, pH-værdi 7,0, derpå to gange med 10 rumfang af en puffer, der indeholder 0,01M magnesiumacetat, 0,01M mercaptoethanol og 0,02M tris-HCl-puffer, pH-værdi 7,8. 1 2 3 4 5 6

Cellerne centrifugeres derpå og suspenderes efter dekan 2 tering af supernatanten i en blanding af de ovennævnte 3 opløsninger A,Bog C og fordeles i ampuller. Indholdet 4 i hver ampul kan frysetørres på i og for sig kendt måde 5 og lagres ved ca. 4°C i lang tid. Frysetørring i vækstme- 6 diet (minus glucoseopløsningen) bevarer cellernes maksimale aktivitet med hensyn til binding af antibiotikum.

Sådanne frysetørrede celler udgør en ideel koncentrationsstabiliseret kilde for celler til anvendelse i testsæt.

17 DK 152383 B

Det anvendte mærkede antibiotikum er benzylpenicillin, 14 der indeholder et C-atom (15Cyu Curie/mg) , leveret af

Amersham Searie Co. Dette reagens kan også frysetørres af hensyn til stabiliteten.

5

Til opnåelse af kvantitative resultater og som kontrol kan der parallelt testes to eller flere flydende prøver, hvoraf én vides at være antibiotikumfri,.og den anden indeholder en kendt mængde af den antibiotikum, der skal på-10 vises, f.eks. 0,01 enhed penicillin pr. ml. Disse prøver kan også frysetørres af hensyn til stabiliteten. Et hvilket som helst af de ovenfor nævnte reagenser kan rekonstitueres med destilleret vand eller phosphatpuffer med svagt sur pH-værdi. For penicilliner-sker bindingen optimalt mellem 15 PH-værdi 6,0 og 7,0. De stabiliserede celler, det mærkede antibiotikum og kontrollerne (eller standardkurven) udgør et téstsæt'der er egnet til udførelse af bestemmelserne i henhold til den foreliggende opfindelse.

20 De ovennævnte reagenser anvendes1 til at fremstille en standardkurve og til at teste ukendte prøver for tilstedeværelsen af penicillin. En standardkurve fremstilles ved at underkaste 12 mælkeprøver på hver 1,0 ml indeholdende kendte koncentrationer af benzylpenicillin (penicillin 25 G) en inkubation med 1) en 100 ml's prøve af en B. stea-rothermophilus-suspension (rekonstitueret fra frysetørret materiale ved tilsætning af 2,5 ml destilleret vand til 14 en ampul fremstillet som angivet ovenfor) og 2) C-mær-ket benzylpenicillin (penicillin G) i tilstrækkelig mæng-30 de til at give ca. 10.000 tæl linger/minut. Inkubationen udføres i 3 minutter i en tørbadsinkubator ved 90°C.

Cellerne skilles derpå fra ved centrifugering ved 3.000 g i 2 minutter. Supernatanten kasseres, og glasset skylles med phosphatpuffer uden at forstyrre cellerne.

35 Cellerne overføres derpå fra glasset til en scintilla- tionsampul under anvendelse af scintillationsvæske som 125 skyllevaske. Hvis der anvendes et I-mærke, kan det sidste trin udelades, og de mærkede molekyler påvises direkte. Resultaterne er anført i nedenstående tabel I.

is DK 152383 B

Tabel I.

Standardkurve til påvisning af benzylpenicillin.

5 Prøve Benzylpe- Tællinger/ Baggrunds- Gennemsnit C/C a nr. nicillin 10 minut- korrigerede tællinger/10 ng/ml ter tællinger/10 minutter _minutter_ 1 4 331 84 102 0.007 2 S 367 120 10 3 0 15457 15210 15272,5 1,000 4 0 15582 15335 5 1,0 13165 12918 13019,5 0,853 6 1,0 13368 13121 7 5'0 9859 9612 ,ΛΛΛ, n n 10002,0 0,655 8 5,0 10639 10392 9 10 7615 7368 7699 0,504 10 10 8277 8030 11 50 4175 3920 4071 0,267 12 50 4461 4214 20 * 20.000 enheder benzylpenicillin (penicillin G) sat til prøven.

** Tællinger for prøve/tællinger for kontrol (intet penicillin G til stede i prøve).

25

Som det fremgår af ovenstående tabel, sker der et signifikant og drastisk fald i tællingerne, når mængden af benzylpenicillin i prøverne forøges fra 0 (3,4) til 10 ng/ml (9, 10). Dataene i tabel I er vist grafisk i fig.

2, hvori penicillinkoncentrationen i ng/ml er afbildet som funktion af prøvetælling/nultælling.

Under anvendelse af den ovenstående tabel som sammen-ligningsstandard udføres tests på 20 mælkeprøver frem-stillet i et kommercielt mælkebehandlingsanlæg. Den anvendte fremgangsmåde er identisk med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til fremstilling af standardkurven bortset fra, at man yderligere sammenligner tællinger/

19 DK 152383B

minut målt med testprøverne med kurven og omsætter ng/ml penicillin til I.U./ml (0,01 I.U.«6 ng) . Resultaterne af disse tests er anført i nedenstående tabel II: 5

Tabel II.

Sammenligning af følsomheden af mikrobiologisk teknik og teknikken ifølge den foreliggende opfindelse.

10

Prøve Kendt penicil- Forsøgsresultater Testresul-nr. linkoncentration med mikrobiologisk tater (pr.

IU/ml teknik (IU/ml) ml) IU ifølge _opfindelsen 1 0,005 - 0,007 15 2 0,005 - 0,009 3 0,003 - 0,008 4 0,002 - 0,003 5 0,000 - 0,002 6 0,007 - 0,006 7 0,000 - 0,001 8 0,042 0,1 0,005 -o 9 0,003 - 0,004 10 0,030 0,06 0,07 11 0,020 0,04 0,05 12 0,020 0,03 0,04 13 0,025 0,02 0,03 14 0,037 0,05 0,06 15 0,007 - 0,01 16 0,017 0,01 0,02 25 17 0,043 0,09 0,10 18 0,022 0,08 0,09 19 0,030 0,07 0,08 20 0,000 - 0,001 •5,0 Det skal bemærkes, at de ovenfor beskrevne tests pålideligt påviser tilstedeværelsen af så lidt som 0,01 I.U. penicillin pr. ml. på ca. 6 minutters testtid (tælletid ikke medregnet). 1

Det skal også bemærkes*. at den ovenfor beskrevne fremgangsmåde omfattede samtidig inkubering af både prøven og mærket penicillin i kun 3 minutter og 2 minutters centrifugering. Denne test er specifikt tilpasset til acceptabel følsomhed og så hurtig udførelse som muligt.

20 DK 152383B

En anden testgruppe udføres for at påvise den følsomhed, der kan opnås under anvendelse af Bacillus stea-rothermophilus, mærket benzylpenicillin (1500 counts pr. minut) og 3 minutters inkubering i en tørbadsinkubator 5 ved 90°C. Resultaterne for denne serie tests er anført i nedenstående tabel III. De i tabel III anførte data illustrerer, at der sker en signifikant reduktion i tællinger/ininut for den fraskilte cellefraktion, når antibiotikumkoncentrationen i prøven forøges fra 0 til 10 0,001 I.U. pr. ml, 0,002 I.U;. pr. ml og 0,005 I.U. pr. ml.

Disse tests kan, indbefattet tælletrinnet, udføres på mindre end 10 minutter.

Tabel III

15 Prøve I.U. penicillin g Tællinger/minut Gennemsnit nr. pr. ml i prøve for celler tællinger/minut 1 0 365 2 0 311 *** 3 0,001 207 01- 4 0,001 227 ZL/

On 5 0'002 191 i oo ς 20 6 0,002 176 7 0,005 97 ,nn 8 0,005 103 χυυ 9 0,010 89 lnn - 10 0,010 112 J.uu,o 11 - 27 25

Eksempel 2.

Bacillus stearothermophilus dyrkes i overensstemmelse 30 med den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde. Den resulterende cellesuspension lydbehandles derpå for at lysere cellerne, fortrinsvis medens prøven er neddyppet i et isbad. Ikke-lyserede celler fjernes ved centrifugering af den lydbehandlede suspension ved 2500 g i 5 minutter.

33 Cellemembranerne, der indeholder penicillinbindende steder, isoleres ved centrifugering i 10 minutter ved 5000 g.

2X DK 152383B

100 vattamponer (vatstykker 6,5 g) sættes derpå til 100 ml 30 g/liter CNBr-opløsning indstillet til pH-værdi 11,0 med 5M natriumhydroxid. Efter 10 minutter fjernes tamponerne, vaskes med natriumhydrogen-5 carbonatopløsning og sættes til de cellemembraner, der er frembragt på den ovenfor beskrevne måde, suspenderet i en natriumhydrogencarbonatopløsning, pH-værdi 8,1. Efter omrøring i 18 timer ved 4°C bliver cellemembranerne bundet covalent til tamponerne via oyanogenbro-10 midet. Tamponerne skylles derpå med destilleret vand, gennemvædes med ethanolamin i 2 timer, skylles atter og tørres.

Et konjugat af penicillansyre og peroxidase fremstilles 15 som følger. En alkalisk opløsning (pH-værdi 9,0), der indeholder 28,1 mg 6-aminopenicillansyre,blandes med en phosphatpufret peroxidaseopløsning, der indeholder 8,8 mg peroxidase og 8,2 mg carbodiimid i vand. Reaktionsblandingen holdes ved 4° C i 24 timer under omrø-20 ring. Som resultat bindes peroxidasen og 6-aminopenicillan- syren covalent. Conjugatopløsningen dialyseres derpå mod 0,05M phosphatpufret saltopløsning (PBS); penicillinaktiviteten forsvinder fra den phosphatpufrede saltopløsning efter første opløsningskift. Efter fire opløsning-25 skift er penicillan-peroxidase-konjugatet klar til an vendelse.

Bestemmelsen udføres under anvendelse af de på den ovenfor beskrevne måde fremstillede reagenser ved at sætte 30 en bomuldstampon til de respektive testprøver (eller kontroller) sammen med lOO^uliter konjugatopløsning. Reaktionsblandingen inkuberes i en tørbadsinkubator i 3 minutter ved 50°C. I denne periode konkurrerer penicillinen i prøven (hvis der er penicillin til stede) og den 35 peroxidase-mærkede penicillansyre om bindingssteder på cellemembranerne, der er bundet til tamponerne. Prøven hældes derpå ud af glasset, tamponen skylles med vand til

22 DK 152383B

fjernelse af ubundet konjugat, og 1 ml substratopløsning sættes til glassene. Substratopløsningen består af 1,0 ml 0,3%'s hydrogenperoxid, 25 mg 4-aminoantipyrin og 20 ml phenol opløst i 50 ml destilleret vand.

5

Tamponen plus substrat inkuberes derpå ved 25°c. Hvis der var mindre end 0,05 enheder penicillin til stede i prøven7bliver tilstrækkeligt meget konjugat immobili-seret på tamponen til ved peroxidasevirkningen at frem-10 bringe en visuelt erkendelig lyserød til rød farve på ca. 15 minutter. Hvis der ikke udvikles nogen farve efter 15 minutter, så indeholdt prøven mere end 0,05 enheder penicillin pr. ml.

For at få mere præcise resultater kan substratets optiske densitet måles ved 510 milli^u på et spektrofoto-meter. Resultaterne for nogle tests er anført nedenfor:

Penicillinkoncentration Optisk densitet (510 milli/U) 20 -L- 1) 0,05 enheder 0,75 0,78 0,00 enheder 1,10 1,05 2) 0,05 enheder 0,70 0,77 25 0,00 enheder 1,05 1,00

Gennemsnitlig optisk densitet ved 0,05 enheder penicil-lin/ml - 0,75.

30 Gennemsnitlig optisk densitet ved 0,00 enheder penicil- lin/ml - 1,05.

Eksempel 3 35

En anden gruppe tests udføres for at påvise den hastighed og følsomhed, med hvilken streptomycin kan påvises.

Seks prøver i hver 5 ml mælk blandes med streptomycin

23 DK 152383B

til fremstilling af prøver, der indeholder 0 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1000 ng/ml og 10^ ng/ml.

Hver prøve blandes med tritiummærket dihydrostreptomy-cin med 228.000 tællinger/minut (kommercielt tilgænge-5 ligt, f.eks. fra Amersham Searie Co.) og med B. stea-rothermophilus-suspension fremstillet som beskrevet ovenfor i eksempel 1 og rekonstitueret ud fra 0,2 ml frysetørret materiale fortyndet med 8 ml vand. (En egnet koncentration af materialet før frysetørring opnås 10 ved at resuspendere de ved centrifugering som beskrevet i eksempel 1 fraskilte celler til en koncentration, så at en 1:500 fortynding har en optisk densitet (O.D.) på 0,60 ved en bølgelængde på 600 millu^u.) Blandingerne opvarmes for at lette bindingen af det tritiummærkede dihydroxy-15 -streptomycin til dets bindingssted i cellerne. I dette eksempel opvarmes prøverne, der oprindeligt er ved 10 - 20°C, derfor til 90°C i en tørblokvarmer i 3 minutter, så at temperaturen i prøverne når 60 - 65 C.

Prøverne centrifugeres derpå i 3 minutter ved 3000 g, 20 supernatanterne dekanteres, og hvert bundfald vaskes to gange med destilleret vand. Bundfaldene (cellerne) overføres derpå med scintillationsvæske til scintillations tælleglas, og tællingerne bestemmes i et minut. Resultaterne for disse tests er anført i nedenstående 25 tabel IV.

Tabel IV.

Prøve Streptomycin- Tællinger Tællinger/kon-on nr. koncentration (cpn) trol tællinger _(pr. ml)_{%}_ 1 0 30.441 100 2 1 ng 25.849 84,9 3 10 ng 22.644 74,5 4 100 ng 18.123 59,6 5 1000 ng 14.189 48,7 1 6 106ng 8.707 28,6

Claims (20)

1. Hurtig, følsom fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af et antibiotikum i en flydende prøve, især i mælk, legemsvæsker, kødekstrakter og gæringssubstrater , 30 kendetegnet ved, at den omfatter trinnene: A) Prøven inkuberes sammen med en fast fase omfattende en antibiotikumfølsom mikroorganisme eller en del deraf, som har receptorsteder, der er i stand til at bindes med anti-35 biotikummet, idet inkuberingen udføres under betingeler, som tillader antibiotikummolekylerne, hvis de er til stede i prøven, at bindes til disse receptorsteder, ,K DK 152383 Β Β) blandingen fra trin A) inkuberes sammen med et mærket stof, der kan være et antibiotikum, et derivat deraf eller en precursor derfor, som er i stand til reversibelt at bindes til de pågældende receptorsteder, 5 C) den faste fase skilles fra væsken, D) mængden af mærket stof i den faste fase eller i væsken bestemmes, og 10 E) bestemmelsen sammenlignes med en standard til opnåelse af en indikation for tilstedeværelsen af antibiotikum i prøven. •*·5

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mængden af mærket stof i den faste fase bestemmes.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, ^ kendetegnet ved, at trinnene A) og B) udføres samtidigt.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mærket på det mærkede 2 5 stof er et radioaktivt atom, et enzym eller et coenzym.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det antibiotikum, der skal påvises, er et 3“lactamantibiotikum, det mærkede 30 stof omfatter en 3-lactamdel, og mikroorganismen er en 3“lactamantibiotikum-følsom mikroorganisme.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mikroorganismen er 35 Bacillus stearothermophilus.

26. DK 152383B

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den antibiotikumfølsomme mikroorganisme er superfølsom over for det antibiotikum, der skal påvises. 5

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den antibiotikumfølsomme mikroorganisme er en stamme med en optimal væksttemperatur over ca. 50°C. 10

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at adskillelsestrinnet udføres ved centrifugering.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mikroorganismen eller delene deraf immobiliseres på en ikke-vandopløselig bærer, og adskillelsestrinnet udføres ved at fjerne bæreren fra væsken og skylle den. 20

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det antibiotikum, der skal påvises, og det mærkede antibiotikum er det samme.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det antibiotikum, der skal påvises, er udvalgt blandt gruppen bestående af benzylpeni-cillin, cloxacillin, cephalosporin, ampicillin, oxacillin, methicillin, cephalosporidin og cephalothin, og det mærkede 30 antibiotikum er et radioaktivt mærket stof udvalgt blandt gruppen bestående af 6-aminopenicillansyre og benzylpeni-cillin.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 35 kendetegnet ved, at det antibiotikum, der skal påvises, er streptomycin, og det mærkede stof er tritium-mærket tetrahydrostreptomycin.

27 DK 152383 B

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den i trin E) anvendte standard er en standardkurve for antibiotikumkoncentrationen mod en kvantitativ indikation for mængden af 5 mærket stof i forbindelse med den faste fase.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes et enzymmærke, der opnås en indikation for den tilstedeværende 10 enzymmængde ved inkubering med en enzymsubstratopløs- ning, der er i stand til at undergå et farveskift som svar på den katalytiske virkning af enzymmærket, og den i trin E) anvendte standard omfatter en optisk densitetsværdi bestemt under standardbetingelser, 15 hvorhos værdien svarer til en udvalgt antibiotikum koncentration .

16. Testsæt til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1 til påvisning af tilstedeværelsen af et antibiotikum 20. en flydende prøve, kendetegnet ved, at det omfatter en kombination af A) koncentrationsstabiliserede celler eller celledele 25 fra en antibiotikumfølsom mikroorganisme med receptor steder, der er i stand til at binde antibiotikummet, B) et mærket antibiotikum, en mærket antibiotikumpre-cursor eller et mærket derivat deraf, der er i stand 30 til at binde sig til receptorstedet ved inkubering sam men med cellerne eller celledelene, og C) en standard, med hvilken resultater for bestemmelser udført med cellerne og det mærkede materiale kan sammen- 35 lignes.

17. Testsæt ifølge krav 16, kendetegnet ved, at reagenset A) omfatter en ikke-vandopløselig bærer, hvorpå der er immobiliseret

28 DK 152383 B celledele fra en antibiotikumsuperfølsom mikroorganisme, og reagens B) omfatter et enzym-mærket antibiotikum, hvorhos sættet endvidere omfatter en enzymsub-stratopløsning, der er i stand til at undergå en farve-5 ændring som svar på enzymmærkets katalytiske påvirkning.

18. Testsæt ifølge krav 16, kendetegnet ved, at reagenset A) er fremstillet ud fra Bacillus stearothermophilus. 10

19. Testsæt ifølge krav 16, kendetegnet ved, at reagens B) er mærket med tritium, I eller C.

20. Testsæt ifølge krav 16, kendetegnet ved, at standarden omfatter mindst én standard udvalgt blandt gruppen bestående af en standardkurve, mindst én prøve, der indeholder en kendt koncentration af det antibiotikum som skal på-20 vises, og en mærkeudlæsningsværdi bestemt under standardtestbetingelser og svarende til en udvalgt antibiotikumkoncentration.