JPH06500925A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原、診断方法およびワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原、診断方法およびワクチン技術分野 本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎構造蛋白質をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ） の断片およびそのＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ　（ｒＤＡＮ）に関する。本発 明のｒＤＮＡにより形質転換された細胞、およびＮＡＮＢＶ構造蛋白質を製造す る方法も企図する。この発明は、診断方法およびワクチンに有用なＮＡＮＢＶ構 造蛋白質を含有する組成物も記載するものである。

発明の背景 非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）および非Ａ非Ｂ 型肝炎ウィルス（ＮＡＮＢＶ）の両者として言及される伝染性ウィルスにより引 起されると考えられている。この伝染性の疾患は何年も前に発見されたにも拘ら ず、原因因子の完全な特徴付けがなお進展しているところである。

ＮＡＮＢＶの単離物は既に得られており、種々の単離物のウィルスゲノムの一部 または全部が分子的にクローン化され配列決定された。チューら、５ｃｉｅｎｃ ｅ、２４４：３５９−３６２　（１９８９）、チューら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８８：２４５１−２４５５　（１９９１）、タヵミ ザワら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５　：１１０５−１１１３　（１９９１）、カドら 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８７：　９５２４−９５２ ８（１９９０）およびタケウチらＮｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８：４６２ ６（１９９０）。ＮＡＮＢＶの異なる単離物の間のヌクレオチド塩基配列の類似 性は、これらが関連するウィルス系統群の一部であることを示唆する。才力モト ら、Ｊａｐａｎ　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、６０＋１８３−１７７　（１９９０）お よびオガタらＰｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、ＵＳＡ、８８　：　３ ３９２−３３９６　（１９９１）。ＮＡＮＢＶゲノムの性質は、ＮＡＮＢＶはフ ラビウィシス系統群の極めて遠い類縁であり得ることを示唆する。しかしながら 、構造蛋白質の大きさおよび水治療性の両者における類似性は、ＮＡＮＢウィル スかベスチウイシス系統群に対しても遠い類縁であり得ることを示唆する。ミラ ーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８７：２０５７−２０ ６１　（１９９０）および才力モトら、Ｊａｐａｎ　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、６０ ：１６３−１７７（１９９０）。

ＮＡＮＢＶ単離物を分類学的に特徴付けることは困難であり、ＮＡＮＢＶゲノム によりコードされる蛋白質に関する情報が欠如していることから、診断マーカー およびＮＡＮＢＶワクチンの生産に有用な関連する遺伝子産物を同定することか 困難となっている。

ＮＡＮＢＶゲノムは、単一のポリ蛋白質をコードする陽性のｌＲＮＡ分子からな る。ＮＡＮＢＶの遺伝子産物は、特徴付けられた関連するウィルスに対する相同 性に基き、構造および非構造蛋白質の両者を含むと考えられている。これらの相 同性から、ＮＡＮＢＶは完全なウィルスゲノムから単一のポリ蛋白質遺伝子産物 を発現し、その後これが機能的に別個の構造および非構造蛋白質に開裂されるこ とが予想される。この形式のウィルス形態形成により、個々の成熟ウィルス蛋白 質の積極的な同定は、これらが物理的に単離されて特徴付けられるまで排除され る。ウィルスを繁殖させるための試験管内培養系はＮＡＮＢＶについては開発さ れていないため、ＮＡＮＢＶ構造または非構造遺伝子産物（蛋白質）は、生物学 的標本またはＮＡＮＢＶ感染細胞から未だ単離されていない。よって、ＮＡＮＢ Ｖ蛋白質の同定、ウィルスのライフザイクルにおけるその役割、および疾患にお けるその役割はなお決定すべきものである。特に、ＮＡＮＢＶ誘発疾患について の抗原性マーカーはなお十分に特徴付けるべきものである。

１つのＮＡＮＢＶ遺伝子産物、すなわちＮＳ３およびＮＳ４と命名された非構造 遺伝子の一部から誘導された抗原Ｃ１００−３が、融合蛋白質として発現され、 種々の形態のＮＡＮＢ肝炎を持つ患者において抗Ｃ−１００−３抗体を検出する ために使用されている。例えば、りすら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４：３６２−３ ６４　（１９８９）および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０４１２５を参照 することができる。Ｃ１００−３抗原に基く診断検定は、オルト・ダイアグノス ティクス社（ラリタン、ＮＪ）から市販されている。このＣＩ　００−３検定は 、ＮＡＮＢ　Ｖ感染を検出する当業界の状態を現段階で表している。しかしなが ら、Ｃ１００−３抗原に基く免疫検定は、慢性的感染患者からの血清中の抗体を 優先的に検出するものであることが報告されている。Ｃ１００−３の血清変換は 一般に肝炎の発症後４〜６箇月で起こり、場合によってはＮＡＮＢＶ感染か存在 してもＣ１００−３によっては如何なる抗体も検出できないことがある。アルタ −ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、３２１　：ｌ５３８−３９　（１９８９） 、アルタ−ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、３２１　：１４９４−１５００　 （１９８９）およびウニイナーら、Ｌａｎｃｅｔ、３３５　：　１−３　（１９ ９０）、７り７７−レンら、Ｌａｎｃｅｔ、３３５　：　７５４−７５７　（＋ 　９９０）ｌ：Ｉ；！、自己免疫慢性活性肝炎を持つ患者においてＣ１００−３ に基づく免疫検定を使用して抗体を測定した場合、偽陽性の結果が記載されてい る。Ｃ１００−３に基づく免疫検定を使用し、グレイら、Ｌａｎｃｅｔ、３３５ ：６０９−６１０　（１９９０）には、ＮＡＮＢＶ以外の種々の条件によって生 じた肝臓疾患を持つ患者からの血清に対する偽陽性の結果か記載されている。

感染後の初期の血清変換を正確に検出し得るが、急性ＮＡＮＢＶ感染を同定し得 るＮＡＮＢＶ免疫検定は現段階では利用可能ではない。

ＨＣＶのハツチ（Ｈｕ　ｔ　ｃ　ｈ）株は、トン（Ｄｏｎｎ）株（ＨＣＶ−１＞ と比較して臨床的に興味ある単離物である。ＨＣＶ−Ｈは、患者中で極めて高い 滴定値に生育するからである。

発明の要旨 ハツチｅ５９単離物（またはＨＣＶ−ＨＣ５９）と命名した非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ ルス（ＮＡＮＢＶ）の１つのハツチ株（ＨＣＶ−Ｈ）を動物中の経路を介して繁 殖させ、全ウィルスゲノムをクローン化し配列決定した。「サブグループ」とい う用語を使用する場合、本発明では、ハツチｃ５９株のような特定の株により血 清学的に特定されるＮＡＮＢＶの群に言及するものである。先に報告されたＮＡ 、ＮＢＶ株と比較した場合、配列データはヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの 両者において差異を示している。以下のＨＣＶ単離物の配列を参照することがで きるが、ここでは単離物の呼称を比較のために括弧内に示す、才力モトら、Ｊａ ｐａｎ　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、６０：１８３−１７７．１９９０　（ＨＣ−Ｊｌ 、ＨＣ−Ｊ４）、タケウチら、Ｎｕｅ］ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋８二４ ６２６゜］　９９０　（ＨＣＶ−ＪＨ）、チューら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１． Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ。

ＵＳＡ、８８：２４５１　２４５５．　１９９１　（ＨＣＶ−ＩＬ　カドら、Ｐ ｒ。

ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８７　：　９５２４−９５２８ ．１９９０（ＨＣＶ−Ｊ）　、タカミザワら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５：１１０５ −１１１３゜１９９１　（ＨＣｖ−ＢＫ）、タカハシらに対する米国特許第５， ０３２，５１１号、オガタら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、８８　：３３９２−３３９６．１９９１　（ＨＣＶ−Ｈｈ）、および国際出 願番号ＰＣＴ／ＵＳ８８１０４１２５゜ 同定された配列を、ＮＡＮＢＶの構造蛋白質をコードするものとしてここに示し た。ＮＡＮＢＶ構造蛋白質も、ＮＡＮＢＶの構造蛋白質と免疫反応性の抗体の診 断に、およびＮＡＮＢＶに対する中和抗体を誘導するワクチンにおける使用に有 用な抗原性エピトープを含むものとしてここに示す。特に、この発明のＮＡＮＢ Ｖ抗原は、ハツチｃ５９単離物ＮＡＮＢＶ抗原である。

ＮＡＮＢＶのハツチ株の構造遺伝子のアミノ末端ポリ蛋白質部分をコードするヌ クレオチド配列は、配列番号：　ｌ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・］）に含まれる。

他のＮＡＮＥＶ単離物、フラビウイルスおよびベスチウイルスと比較することに より、配列番号、１に含まれるヌクレオチド配列は、ＮＡＮＢＶの構造蛋白質、 すなわちカプシドおよびエンベロープの蛋白質をコードすると考えられる。

ここに記載する構造抗原は、配列番号：ｌのアミノ酸残基位置１〜１２０に含ま れる推定されるカプシド蛋白質中に存在し、また配列番号：１の残基位置１２１ 〜３２６に含まれる推定されるエンベロープ蛋白質のアミノ末端部分に存在する 。

ヌクレオチドおよびアミノ酸残基配列は、開始塩基またはアミノ酸残基位置番号 から終了塩基または残基位置番号でここに特定する。この種の全ての配列は、開 始および終了位置番号の両者を含むことが理解される。

ハツチｃ５９単離物のゲノムの完全配列も決定し、記載する。よって本発明は、 配列番号・４６のヌクレオチド位１ｔ１〜９４１６に含まれるＮＡＮＢＶのハツ チｃ５９単離物のウィルスゲノムをコードするＤＮＡ断片を企図する。

また本発明は、ＮＡＮＢＶ構造抗原、好ましくはカプシド抗原からなるＮＡＮＢ Ｖ構造蛋白質をコードするＤＮＡ断片も企図する。特に好適なカプシド抗原は、 配列番号・ｌの残基ｌ〜残基２０、残基２１〜残基４０、残基２〜残基４０また は残基ｌ〜残基７４により表されるアミノ酸残基配列を含み、ＤＮＡ断片は、好 ましくは配列番号：ｌの塩基位置１〜塩基位置６０．塩基位置６１〜塩基位置１ ２０、塩基位置１〜塩基位置１２０または塩基位置１〜塩基位ｆｔ２２２により 表されるヌクレオチド塩基配列をそれぞれ含む。

ハツチｃ５９単離物ポリ蛋白質の部分、特にｖｌＶい看またはＶｓｔｉｆ域にお けるｃ５９の配列特異的領域の部分をコードするヌクレオチド配列からなるポリ ヌクレオチドも企図する。

また企図するものは、本発明のＤＮＡ断片に機能的に連結されたベクタ、好まし くは発現ベクタからなる組換えＤＮＡ分子である。好適な組換えＤＮＡ分子はｐ ＢＥＧ−３Ｘ−６９０：　ｅ９１、ｐＧＥＸ−３Ｘ−６９０：　６９４、ｐＧＥ Ｘ−３Ｘ−６９３：　６９１、ＰＣ；ＥＸ−３Ｘ−１５：１７、ｐＧＥＸ−３Ｘ −１５，１８、ｐＧＥＸ−２Ｔ−１５：　１７、ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−八、 ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−ＢまたはｐＣ；ＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ａ−Ｂである。

ＮＡＮＢＶ構造抗原、好ましくはカプシド抗原、更に好ましくは配列番号：１の 残基ｌ〜残基２０、残基２１〜残基４０、残基２〜残基４０または残基１〜残基 ７４に含まれるアミノ酸残基配列を含むものを特定するアミノ酸残基配列からな るＮＡＮＢＶ構造蛋白質を企図する。この発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質からなる 融合蛋白質も企図する。

またこの発明は、ＮＡＮＢＶのハツチｃ５９単離物とは免疫反応するが、ＮＡＮ ＢＶ単離物ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣ−Ｊｌ、ＨＣ−Ｊ４、 ＨＣＶ−ＪＨまたは）（（：Ｖ−Ｈｈとは免疫反応しない抗体分子、すなわちｃ ５９特異的抗体分子を含む抗体も企図する。

更に企図するものは、この発明の組換えＤＮＡ分子により形質転換された細胞の 培養物、およびその培養物を使用するこの発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質の製造方 法である。

また企図するものはＮＡＮＢＶ構造蛋白質からなる組成物である。この組成物は 、好ましくは（ａ）原核抗原および（ｂ）他のＮＡＮＢＶ関連蛋白質を実質的に 含存しないことを特徴とする。

なお更に企図するものは、少なくとも１つの検定を行うのに十分な量のこの発明 のＮＡＮＢＶ構造蛋白質組成物、ポリペプチドまたは融合蛋白質を別個のパッケ ージ試薬として含むキット形態の診断システムである。好ましくは、診断システ ムは、固体マトリックスに固定化された融合蛋白質を含存する。

更に企図するものは、ここに記載するＮＡＮＢＶ構造抗原の少なくとも１つに対 する抗体の存在について体液サンプルを検定する方法、好ましくは試験管内の方 法である。この方法は、体液サンプルと、この発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質、ポ リペプチドまたは融合蛋白質のような免疫学的試薬とを混合（接触）することに より免疫反応混合物を形成することからなる。免疫反応混合物は、存在する全ゆ る抗体が混合した免疫学的試薬と免疫反応して免疫反応生成物を形成するのに十 分な時間期間の間維持し、この生成物は、検出する際に、抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白 質抗体の存在を示すものとする。好ましくは、この方法を実施する場合、免疫学 的試薬は固体マトリックスに固定する。

またこの発明は、ＮＡＮＢＶポリ核酸の存在について体のサンプルを検定する方 法、好ましくは試験管内の方法も企図する。この方法は一般にａ）体のサンプル とこの発明のポリヌクレオチドとを混合することにより水性ハイブリダイゼーシ ョン混合物を形成し、ｂ）体のサンプル中に存在する全ゆるＮＡＮＢＶポリ核酸 が混合したポリヌクレオチドとハイブリダイズしてハイブリダイゼーション生成 物を形成するのに十分な時間期間の間およびハイブリダイズ条件の下で水性ハイ ブリダイゼーション混合物を維持し、Ｃ）形成された全ゆるハイブリダイゼーシ ョン生成物の存在およびこれにより体のサンプル中のＮＡＮＢＶポリ核酸の存在 を検出することからなる。

他の態様では、この発明は、薬学的に許容し得るキャリヤおよび／または希釈剤 中に分散した免疫学的に前動な量のこの発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質、ポリペプ チドまたは融合蛋白質からなる接種物（またはワクチン）を企図する。この接種 物は（ａ）原核抗原および（ｂ）他のＮＡＮＢＶ関連蛋白質を実質的に含有しな い。

感染を処！する予防方法にの方法は本発明の接種物を投与することからなる）も 企図する。

図面の簡単な説明 図１は、ＨＣｖ−Ｈｃ５９ゲノムおよびゼロ〜３９の番号を付したＨＣＶ−Ｈｃ ５９のｃＤＮＡクローンの位置を図示的に示すものである。フラビウィルスによ りコードされる蛋白質の列を、ＨＣＶＣ−コードゲノム中定ドメインと併せて示 す。デングタイブ２Ｎｓ３ウィルスおよびカーネーション斑紋ウィルス（ＣＡＲ Ｍｖ）とのアミノ酸相同性の領域を、それぞれ斜線入りおよび斜線なしの箱で示 す。

ある。標準的なポリペプチド命名法、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４３：３５５ ７−５９（１９８９）を保持し、アミノ酸残基の省略は次の対応表に示す通りで ある： 対応表 Ｃ；Ｉｙ　Ｌ−グリシン Ｐｈｅ　Ｌ−フェニルアラニン Ｍｅｔ　Ｌ−メチオニン Ａｌａ　Ｌ−アラニン Ｓｅｒ　Ｌ−セリン ｌｉｅ　Ｌ−イソロイシン Ｌｅｕ　Ｌ−ロイシン Ｔｈｒ　Ｌ−スレオニン Ｖａｌ　Ｌ−バリン Ｇｌｕ　Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｘ　ＧｉｎまたはＧｌｕ Ａｓｐ　Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｎ　Ｌ−アスパラギン Ａｓｘ　ＡｓｐまたはＡｓｎ Ｃｙｓ　Ｌ−システィン Ｘａａ　未知またはその他 典型的にはここでは「残基配列」として言及する全てのアミノ酸残基配列は、こ こではその左から右の方向性をアミノ末端からカルボキシ末端への慣用的な方向 とする式により示すことを銘記すべきである。

は、抗原性決定基またはエピトープとして言及する。

炭素）を介して糖部分と結合し、塩基と糖とのその組合せがヌクレオシドである 。

ヌクレオシドがペントースの３′または５′位置に結合したリン酸基を含有する 場合、これはヌクレオチドと呼ばれる。ヌクレオチドの機能的に連結した配列を ここでは典型的には［塩基配列」として言及し、ここではその左から右の方向性 が５′末端から３′末端への慣用的な方向である式により表す。

の鎖の実質的に相補的なポリヌクレオチドからなる二本鎖核酸分子。塩基対を形 成するヌクレオチドはりボヌクレオチド塩基またはデオキシリボヌクレオチド塩 基たり得るため、ＥデユーブレックスＤＮＡＪという記載は、２つのＤＮＡ＊（ ｄｓＤＮＡ）からなるＤＮＡ−ＤＮＡデユーブレックス、または１つのＤＮＡと １つのＲＮＡ鎖とからなるＲＮＡ−ＤＮＡデユーブレックスを指す。

鬼ｉ材（ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、または シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）対合。ＲＮＡでは、ウラシル（Ｕ）がチミン水 素結合により特異的に（非無作為に）ハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡの 一本鎖分子中のヌクレオチドの配列。

ハイブリダイゼーション：相補的塩基対の間の水素結合の確立により２以上の一 本鎖核酸を含むデユーブレックス、ヘテロデユーブレックスまたは複合体を形成 する相補的ヌクレオチド配列（核酸の＃Ｉ）の対合。これは、競合的に阻害され 得る相補的ポリヌクレオチドの間の特異的な、すなわぢ非無作為の相互作用であ る。

ハイブリダイゼーシコン生成物：ボリヌクレオチドが一本鎖または二本鎖核酸に ハイブリダイズする際に形成される生成物。ポリヌクレオチドが二本鎖核酸にハ イブリダイズする場合、形成されるハイブリダイゼーション生成物はトリプルへ りックスまたは二本鎖核酸分子として言及される。モサーら、５ｃｉｅｎｃｅ。

２３８：６４５−５０　（１９８７）。

ヌクレオチドアナログ：Ａ、　’ｒ、　ｃ、　ＣまたはＵとは構造的に異なるが 、核酸分子中で通常のヌクレオチドを置換するには十分に類似するプリンまたは ピリミジンヌクレオチド。イノシンＣＩ）は、他のヌクレオチド、Ａ、ＴＳＧＳ ＣまたはＵのいずれかと水素結合し得るヌクレオチドである。また、核酸ハイブ リダイゼーションに参与し得るメチル化塩基が知られている。

コードを介して蛋白質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配 列に直接関連する。よって構造遺伝子は、それかコードするアミノ酸残基配列、 かって、多数の異なるヌクレオチド配列が、特定のアミノ酸残基配列をコードし 得る。この種のヌクレオチド配列は機能的には等価であると考えられている。こ れらは全ての生物中で同一のアミノ酸残基配列の生産に帰着し得るからである。

場合によっては、プリンまたはピリミジンのメチル化された変種が、与えられた ヌクレオチド配列に組込まれ得る。しかしながら、このようなメチル化は如何な る様式においてもコード関係には影響を与えない。

１つの態様では、本発明は、カプシド抗原、エンベロープ抗原または両者のよう なＮＡＮＢＶ構造抗原からなるＮＡＮＢＶ？ｊｌ造蛋白質をコードするヌクレオ チド塩基配列からなる単離されたＤＮＡ断片を企図する。好ましくは、構造抗原 は、ＮＡＮＢＶのハツチ株に免疫学的に関連する。

更に好ましくは、コードされたＮＡ、ＮＢＶ構造抗原は、配列番号　１に含まれ るアミノ酸残基に対応する、好ましくは同一のアミノ酸残基配列を有する。

１つの態様では、推定されるカプシド抗原は、配列番号：】の残基１〜残基２０ 、残基２１〜残基４０、残基２〜残基４０または残基１〜・残基７４に含まれる アミノ酸残基配列を含む。他の態様では、カプシド抗原は、配列番号−１の残残 基１７Ｇまたは残基１２１＝−残基３２６に含まれるアミノ酸残基配列を含むも ２０５〜塩基位置３６０、塩基位１３６１〜塩基位置５２８または塩基位置くは 約１．０００塩基以下である。

特に好適なＮＡＮＢＶ構造蛋白質のアミノ酸残基配列は、配列番号；２の残基１ 〜残基３１５、配列番号２３の残基１〜残基２５２、配列番号：４の残基１〜残 基２５２および配列番号：６の残基１〜残基２７１に含まれる。

この発明の精製されたＤＮＡ断片は、この発明のＤＮＡ断片についてここに特定 したヌクレオチド塩基配列を含まない他の核酸を実質的に含まず、ＤＮＡ断片か 精製されたＤＮＡ断片を含む組成物の形態で、または溶液懸濁物または特定の処 方物として存在するかを問わない。実質的に含有しないとは、ＤＮＡ断片が、重 量にして存在する全核酸の少なくとも１０％、好ましくは重量にして全核酸の５ ０％を越え、更に好ましくは９０％より多く存在することを意味するものとする 。

他の態様では、この発明のＤＮＡ断片は、融合蛋白質を発現し得る構造遺伝子を 特定するヌクレオチド塩基配列を含む。「融合蛋白質Ｊという記載は、ここに開 示するようにＮＡＮＢＶ構造抗原を特定する第２のポリペプチド部分にペプチド 結合により機能的に結合したポリペプチド部分を有する蛋白質を指す。

好適な第」のポリペプチド部分は、配列番号：２の残基約１〜残基約２２１に含 まれる配列に対応するアミノ酸残基配列を育し、蛋白質グルタチオン−ｓ−トラ ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）から誘導される。

融合蛋白質中でＮＡＮＢＶ構造抗原を特定する好適な第２のポリペプチド部分は 、配列番号：Ｉの残基１〜残基２０．残基２１〜残基４ｏ％残基２〜残基４ｏ、 残基ｌ−残基７４、残基６９〜残基１２０Ｓ残基１２１−残基１７６または残基 １２１〜残基３２６に含まれる配列により表されるアミノ酸残基配列を含むもの である。

１つの態様では、融合蛋白質は、例えば配列番号：１の残基ｌ〜残基１２０また は配列番号・ｌの残基ｌ〜残基３２６に含まれるアミノ酸残基配列により示され るような異なる構造抗原を表す２つのポリペプチド部分の組合せとして、ＮＡＮ ＢＶ４１１造抗原を特定する１以１；のポリペプチド部分を含み得る。

特に好適な態様では、ＮＡＮＢＶカプシド抗原を特定するポリペプチド部分をコ ードするこの発明のＤＮＡ断片をコードする融合蛋白質のその部分は、配列番号 　１の残基ｌ−残基２０、残基２１〜残基４０、残基２〜残１に４０または残基 ｌ残基７４に含まれるようなアミノ酸残基配列をコードする配列に対応するヌク レすチド塩基配列を含み、更に好ましくは配列番号：１の塩基１〜塩基６０、塩 基６１〜塩基１２０、塩基４〜塩基＋２０または塩基１〜塩基２２２に含まれる ような塩基配列に対応するヌクレオチド塩基配列をそれぞれ含む。

他の態様では、ＮＡＮＢＶエンベロープ抗原を特定するポリペプチド部分をコー ドするこの発明のＤＮＡ断片をコードする融合蛋白質のその部分は、配列番号： １の残基１２１〜残基１７６または残基１２１〜残基３２６に含まれるようなア ミノ酸残基配列をコードする配列に対応するヌクレオチド塩基配列を含み、更に 好ましくは配列番号：１の塩基３６１〜塩基５２８または塩基３６１〜塩基９７ ８に含まれるヌクレオチド塩基配列に塩基配列において対応するヌクレオチド塩 基配列をそれぞれ含む。

この発明のＤＮＡ断片をコードする特に好適な融合蛋白質は、配列番号＝２の塩 基１〜塩基９４５、配列番号：３の塩基１〜塩基７５６、配列番号：４の塩基１ 〜塩１＆７５６および配列番号・６の塩基１〜塩基８１３に含まれる配列に対応 するヌクレオチド塩基配列を有する。

好適な態様では、本発明のＤＮＡ断片は相補的ＤＮＡ断片に結合し、これにより 二本鎖ＤＮＡ断片を形成する。また、この発明の二本１１ＤＮＡ断片は、好まし くはその末端の一方または双方に一本鎖付着尾部を有することを銘記すべきであ る。

他の態様では、本発明のＤＮＡ断片は、ＮＡＮＢＶのハツチ単離物のゲノムをコ ードするヌクレオチド塩基配列からなる。好ましくは、ＤＮＡ断片は、ハツチｅ ５９単離物のゲノムにより生産されるポリ蛋白質のアミノ酸残基配列をコードす るヌクレオチド塩基配列を存し、そのアミノ酸残基配列は配列番号：４６の残基 １〜残基３０１１に示される。更に好ましくは、この態様のＤＮＡ断片は、配列 番号　４６の塩基１〜塩基９４１６に示されるヌクレオチド配列を育するもので ある。

ｃ５９単ｌｌ＋ｉＩ物ゲノムをコードするＤＮＡ断片は、ポリヌクレオチドを使 用する核酸ハイブリダイゼーションに基く診断方法におけるハイブリダイゼーシ ョン標坐または対照のｍ製に、組換えＤＮＡ法によるＮＡＮＢＶ構造抗原または 融合蛋白質の調製に、培養におｆＪる感染性ＮＡＮＢＶｃ５９単離物粒子の１１ 製等に有用てあり、その全てをここに記載する。

他の態様では、本発明は、ＮＡＮＢＶゲノムの一部に対応するか、ＮＡＮＢＶ構 造抗原の一部をコードするこの発明のＤＮＡ断片の断片を企図する。これらの断 片は、−重鎖形態で存在するか二本鎖ＤＮＡ断片の１つの鎖の前後関係で特定す る場合、ここではポリヌクレオチドとして言及する。

ポリヌクレオチドをＮＡＮＢＶ構造抗原またはハツチｃ５９単離物ポリ蛋白質の 領域をコードするものとして使用する場合、ポリヌクレオチドはここに記載する ようにＮＡＮＢＶゲノムのコード鎖に対応する。ポリヌクレオチドをＮＡＮＢＶ 誘導核酸とのハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーションプローブ またはプライマとして使用する場合、鎖の意味は周知のようにハイブリダイゼー ションを向ける標的配列に依存し得る。

よって１つの態様では、本発明は、ＮＡＮＢＶのハツチ単離物ｌこより発現され るポリ蛋白質の一部に対応するアミノ酸残基配列をコードするヌクレオチド塩基 配列を含むヌクレオチド塩基配列からなるポリペプチドを企図する。好ましくは ポリペプチドは、配列番号：４６の残基ｌ〜残基３０１１に示されるｃ５９単離 物のアミノ酸残基配列の一部に対応する配列をコードする。

特に好適なのは、独特であり、これによりアミノ酸残基またはヌクレオチド塩基 配列の差異に基いてハツチ単離物、更に好ましくはｃ５９単離物とＮＡＮＢＶの 他の単離物とを区別する手段を与えるハツチｃ５９単離物の領域である。ｊｌｔ ＃物を区別するのに有用なｃ５９単離物のゲノムの領域はヌクレオチド塩基配列 における差異を含み、好ましくは区別されるべき単離物のヌクレオチドまたはア ミノ酸残基配列と比較した場合、コードされたアミノ酸残基配列における差異を 特定するものである。

ハツチ単離物配列の差異を同定するための代表的な比較は、ここでは実施例中に 、特に表１１に示す。

よって１つの態様におけるこの発明のポリヌクレオチドは、ＨＣＶ−１，ＨＣＶ −ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣ−Ｊｌ、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣＶ−ＪＨおよびＨＣＶ−Ｈ ｈよりなる群から選択されるＮＡＮＢＶＯ株のヌクレオチド配列と比較した場合 にポリヌクレオチドが配列において少なくとも１つのヌクレオチド塩基の差異を 育するものとして、配列番号、４６に示すＮＡＮＢＶのハツチｃ５９単離物の配 列の部分に対応するアミノ酸残基配列をコードするヌクレオチド配列を含むヌク レオチド塩基配列からなる。好ましくはヌクレオチド塩基配列は、ヌクレオチド 塩基配列のＶ可変領域（配列番号＝４６の塩基１４９７〜塩基１５７４）、ヌク レオチド塩基配列のＶ、可変領域（配列番号・４６の塩基１０７７〜塩基１１６ ６）、ヌクレオチド塩基配列のＶ、可変領域（配列番号＝４６の塩基！７０７〜 塩基１７８７Ｌおよびヌクレオチド塩基配列のＶ、可変領域（配列′＃号　４６ の塩基７４０７〜塩基７４７８）よりなる群から選択されるＮＡＮＢＶゲノムの 可変領域の部分を特定する配列を含む。

配列番号および配列の対応する塩基を、ここでは配列に対する言及の後に括弧内 に簡便に言及する。例えば、配列番号−４６に示される塩基１〜塩基９４１６の ヌクレオチドの配列は、　ｒ４６　：　１−９４１６Ｊとして言及する。

特に好適なポリヌクレオチドは、■可変領域ヌクレオチド塩基配列（４６１４９ ７−１５７４Ｌ　Ｖ、可変領域ヌクレオチド塩基配列（４６：１０７７−１１６ ６）、Ｖ、可変領域ヌクレオチド塩基配列（４６：１７０７−１７８７）、およ びＶ、可変領域ヌクレオチド塩基配列（４６：７４０７−７４７８）よりなる群 から選択されるヌクレオチド塩基配列を有する。

他の態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号＝４６の残基３９１〜残基４０４ 、配列番号、４６の残基２４６〜残基２５６、配列番号；４６６の残基４６１〜 残基４６６、配列番号＝４６の残基４７３〜残基４８２、および配列番号、４６ の残基２３５６〜残基２３７９よりなる群から選択されるアミノ酸残基配列をフ ードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド塩基配列からなる。好ましくは、 含まれるヌクレオチド配列は、配列番号、４６に示される配列に対応する。前記 示した範囲のアミノ酸残基は、公知のＨＣＶ単離物と比較すると多量の配列相違 点を含むｖ、ｙ、、Ｖｌおよびｖｊの部分に対応し、したがって最も好適である 。

合成の容易性および配列特異性の理由のため、好適なポリヌクレオチドは長さに して約１０〜約２００ヌクレオチドであるか、特定の長さはポリヌク１ノオ千ド を使用する目的に依存し得る。

その種々の態様で本発明で使用するポリヌクレオチドには、プライマ、プローブ 、または核酸が包含される。

「プローブ」という用語は、ここで使用するように、核酸制限消化物からｆｆｌ 製された場合または合成により製造された場合を問わず、約８〜２００ヌクレオ チドの長さであって、意図する遺伝子、すなわち標的核酸中に存在する所定の特 異的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド塩基配列１を育するポリヌクレオ チドを指す。

ポリヌクレオチドプローブは、意図する遺伝子中に存在する特異的な核酸配列と ハイブリダイズ条件下でハイブリダイズし得る程十分に長くなければならない。

ポリヌクレオチドプローブの正確な長さは、ハイブリダイゼーション温度および プローブのヌクレオチド配列を含む多くの因子に依存し得る。例えば、標的配列 の複雑性に応じて、ポリヌクレオチドプローブは典型的には１５〜２５以上のヌ クレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含むことができる。ポリヌクレ オチドとして８ヌクレオチドと少ないものが、使用のために有効であるとして報 告されている。スッジェルら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 。

８６：６９１７−２１　（＋９８９）。短いポリヌクレオチドプローブは、標的 ５と十分安定なハイブリッド複合体を形成するためには、一般により低い温度を 要求する。

好適な態様では、ポリヌクレオチドプローブは、長さにして約２００ヌクレオ千 ド未満、好ましくは１００ヌクレオチド未満、更に好ましくは３ｏヌクレオチド 未満の大きさを育する。

プローブに関して「実質的に相補的」およびその文法上等価なものによって、対 象ポリヌクレオチドプローブと意図する遺伝子中に存在する特異的な核酸配列と の間に十分なヌクレオチド塩基配列類似性があり、プローブがハイブリダイズ条 件下で特異的な配列とハイブリダイズし得てプローブと特異的配列とからなるデ ユーブレックスを形成することを意味する。

したがって、プローブが標的配列と実質的な相補性を含む限り、ポリヌクレオチ ドプローブ配列は、標的配列の正確な配列を反映しないこともある。例えば、非 相補的なポリヌクレオチドがプローブの１つの端部に付着することができ、この 場合プローブ配列の残余か標的配列に対して実質的に相補的である。この種の非 相補的ポリヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ制限部位または蛋白質結合のた めの部位をコードし得る。また、非相補的塩基または長い配列かプローブ中に散 在し得るが、これはプローブ配列は標的績の配列に対しこれと非無作為にハイブ リダイズする程十分な相補性を有し、これによりハイブリダイゼーション条件下 でハイブリダイゼーション生成物を形成する場合である。

ポリヌクレオチドプローブは、最大の効率のためには一本鎖形懸で提供するが、 その他二本鎖とすることもできる。二本鎖の場合、ハイブリダイゼーシヨンに使 用してハイブリダイゼーション生成物をｉｌ製する前に、ポリヌクレオチドプロ ーブを最初に処理してその鎖に分離する。好ましくは、プローブはポリデオキシ リボヌクレオチドとする。

本発明のＤＮＡ断片またはポリヌクレオチドは、ここに記載するようにＮＡＮＢ Ｖｇ染個体の血液から得られる単離されたウィルスから容易にｔＪＲ１２するこ とかでき、または化学的技術により新規に合成することができる。

ＤＮＡ断片またはポリヌクレオチドの新規化学合成は、例えばホスホトリエステ ルまたはホスホジエステル法のようないずれかの適切な方法を使用して行うこと かできる。ナラングら、Ｍｅｔｈ、ＥｎｚｙｍｏＪ、６８：９０　（１９７９） 、米国特許第４，３５６，２７０号、イタクラら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｔｏｃｈ ｅｍ、５３：３２３−５６　（１９８９Ｌブラウンら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ ｌ。

６８　：　１０９　（１９７９）およびｖ−７テウシら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ。

１０３：３１８５　（１９８１）を参照することができる。（ここに引用した技 術の開示を参考によりここに取入れる。）勿論、構造遺伝子部分を化学的に合成 することにより、天然のアミノ酸残基をフードするものについて適切な塩基を単 に置換することによって、全ゆる所望の修飾を行うことができる。しかしながら 、配列ＩＤ番号１．２．３．４または６に含まれる断片と同一の配列を含むＤＮ Ａ断片が好適である。

核酸からのポリヌクレオチドの誘導には、クローン化ベクタによる適切な宿主へ の核酸のクローン化、ベクタの復製したがってクローン化された核酸の量の増幅 、およびその後のクローン化された核酸のサブ断片の単離が包含される。サブク ローン化核酸断片の記載については、マニアナイスら、［分子クローン化、実験 室マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ、第３９０〜 ４０１頁（１９８２）を参照することができ、また米国特許第４，４１６．９８ ８号および第４，４０３．０３６号を参照することかできる。

また、ＤＮＡ断片は、最初にＤＮＡ断片の一部に対応するオリゴヌクレオチドを 合成し、その後そのオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションにより会合さ せ、完全なりＮＡ断片に連結することにより調製することができる。この種の方 法も当業界で周知である。例えば、バダーリンら、Ｃｅ１ｌ、４８：４４１−４ ５２（１９８７）およびリンドレイら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｆ、８５：９１９９−９２０３　（２９８８）を参照することができ、この場合 は組換えペプチド、好中球活性化因子が化学的に合成された遺伝子の発現からイ ー・コリ中で生産された。

この発明のＤＮＡ断片は、この発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質または融合蛋白質を 発現するベクタの構築に際してｒＤＮＡ分子の調製に、またはサンプル中のＮＡ ＮＢＶ特異的核酸配列の存在を検出するハイブリダイゼーションプローブとして 使用することができる。

ＤＮＡ断片の使用が蛋白質調製のためである場合、特定のアミノ酸残基が重要で あると考えらね、ＤＮＡ断片のヌクレオチド塩基配列は、所望のアミノ酸残基配 列を提供するために、周知のように遺伝子コードの重複に基いて変動し得るもの である。

ＤＮＡ断片の使用が特異的な核酸配列に対するハイブリダイゼーションプローブ としてである場合、好適なものは、ここに開示するハツチ株ＮＡＮＢＶヌクレオ チド塩基配列に対応するヌクレオチド塩基配列である。

Ｃ１組換えＤＮＡ分子 本発明は、ベクタに機能的に連結された本発明のＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ 　（ｒＤＮＡ）を更に企図する。本発明の好適なｒＤＮＡは、和合性の宿主中で この発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質または融合蛋白質を直接発現できることを特徴 とする。ｒＤＮＡに使用する好適なりＮＡ断片はここに前記したものである。

「直接発現する」とは、より大きい翻訳された前駆体蛋白質からの２以上の末端 アミノ酸残基の蛋白質分解開裂に対するものとして、蛋白質の成熟ポリペプチド 鎖か翻訳のみにより形成されることを意味する。本発明の好適なｒＤＮＡは、実 施例１に記載したプラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ−６９０：　６９４、ｐＧＥＸ−３ Ｘ−６９３：　６９１．ｐＧＥＸ−３Ｘ−６９０＋　６９１．ｐＧＥＸ−３Ｘ− １５・１７、ｐＧＥＸ−３Ｘ−１５：　１８、ｐＧＥＸ−２Ｔ−１５：　Ｉ　７ 、ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−ＡＳｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−ＢおよびｐＧＥＸ− ２Ｔ−ＣＡＰ−Ａ−Ｂである。

本発明の組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）は、本発明のＤＮＡ断片をベクタに既機 能的に連結することによって製造することができる。例示的なｒＤＮＡ分子およ びそれらの調製方法を実施例１に記載する。

他の態様では、この発明のｒＤＮＡ分子は、ＮＡＮＢＶのハツチ単離物のゲノム をコードするヌクレオチド塩基配列からなるＤＮＡ断片に機能的に連結したベク タからなる。好ましくは、ｒＤＮＡは、ハツチｃ５９単離物のゲノムにより生産 されたポリ蛋白質のアミノ酸残基配列をコードするヌクレオチド塩基配列を含み 、そのアミノ酸残基配列を配列番号：４６の残基１〜残基３０１１に示す。更に 好ましくは、この態様のｒＤＮＡ分子は、配列番号＝４６の塩基１〜塩基９４１ ６に示すヌクレオチド塩基配列を含む。

ここで使用するように、　「ベクタ」という用語は、細胞中で自己複製すること のできるＤＮＡ分子を指し、これに対して他のＤＮＡ断片か機能的に連結して付 着した断片の複製を生起することができる。典型的なベクタはプラスミド、バク テリオファージ等である。、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質または融合蛋白質の発現を指 向し得るベクタは１、コニではＦ発現ベクタＪとして言及する。よって組換えＤ ＮＡ分子（ｒＤＮＡ）は、通常は天然には一緒には見出せない少なくとも２つの ヌク１ノオチト配列からなるハイブリッドＤＮＡ分子である。

本発明のＤＮＡ断片が機能的に連結するベクタの選択は、当業界で周知のように 所望する機能的性質、例えば蛋白質発現および形質転換されるべき宿主細胞に直 接依存し、これらは組換えＤＮＡ分子を構築する技術における固有の制限である 。しかしながら、本発明により企図されるベクタは、それか機能的に連結される ＤＮＡ断片に含まわる組換えまたは融合蛋白質構造遺伝子の少なくとも複製、ま た好ましくは発現をも指向することができる。

好適な態様では、本発明により企図されるベクタは原核レプリコン（ｏｒｉ）を 含むが、これはすなわち原核宿主細胞、例えばこれにより形質転換されたＩＢ菌 宿主細胞中にて染色体外で組換えＤＮＡ分子の自己複製および維持を指向する能 力を存するＤＮＡ配列である。この種のレプリコンは当業界で周知である。また 、原核レプリコンを含むこのような態様は、典型的にはその発現がこれにより形 質転換された細菌宿主に薬剤耐性を与える遺伝子も含むものである。これらのベ クタで使用する典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイ クリンに対する耐性を与える。この種のベクタプラスミドの典型は、バイオラド ・ラボラトリイズ（リッチモンド、ＣＡ）から入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、 ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９である。

原核レプリコンを含むこのようなベクタは、これにより形質転換されたイー・コ リのような細菌宿主細胞中でＮＡＮＢＶ構造蛋白質または融合蛋白質をコードす る遺伝子の発現（転写および翻訳）を指向し得る原核プロモータも含むことがで きる。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および後続して生起する転写開 始を許容するＤＮＡ配列により形成される発現ＷＲ節要素である。細菌宿主と和 合性のプロモータ配列は、典型的には本発明のＤＮＡ断片の挿入に便利な制限部 位を含むプラスミドベクタ中に与えられる。典型的なベクタは、ファルマシア（ ビス力タウェイ、ＮＪ）から入手可能なｐＰＬ−λである。

ＩＰＴＧにより誘導性である細菌プロモータを有するベクタプラスミドは、アマ ジャム（アーリントン・ハイ入　ＩＬ）から入手可能なｐＴＴＱプラスミド、お よびファルマシアから入手可能なｐＫＫ２２３−３プラスミドである。融合蛋白 質の形管でクローン化遺伝子産物を原核生物中で生産する更なる発現ベクタは周 知であり、市販されている。

発現ベクタｒ）ＧＥＸ−３ＸおよびｐＧＥＸ−２Ｔをここに記載する融合蛋白質 を生産するのに例どして使用したが、他の機能的に等価の発現ベクタを使用する ことかできる。機能的に等価のベクタは、イー・コリ中での融合蛋白質発現につ きｒＰＴＧにより誘導性の発現プロモータを含み、構成はベクタへのＤＮＡ断片 の挿入１こ際して融合蛋白質か生産されるものとする。ここで使用するベクタｐ ＧＥＸ−３ＸおよびｐＧＥＸ−２Ｔに機能的に等価である市販のベクタには、Ｔ ７遺伝子１０蛋白質のアミノ末端部分とクローン化挿入物遺伝子との間の融合を 与えるプロメガ（マジソン、Ｗ＋）からのｐＧＥＭＥＸ−１プラスミドベクタ、 Ｌプラスミドベクタ、および酵素グルタチオン−８−トランスフェラーゼ（ＧＳ Ｔ）とクローン化挿入物遺伝子との融合を与えるファルマシアからのｐＧＥＸ− ３ＸおよびｐＧＥＸ−２７ブラスミドがそれぞれ包含される。

ｐＧＥＸ−３ＸおよびｐＧＥＸ−２Ｔベクタの構成および使用は、スミスら、Ｇ ｅｎｅ、６７：３１−４０　（１９８ｇ）により記載されており、この参考文献 を参考によりここに取入れる。

特に好適な態様では、融合蛋白質は、この発明のＮＡＮＢＶ構造抗原に機能的に 連結した付加された！能ドメインとしてＧＳＴ誘導ポリペプチド部分を含む。

全ゆる誘導性プロモータ誘導ベクタ、例えば前記したベクタｐＴＴＱ、ｐＫＫ２ ２３−３、ｐＧＥＸ−３Ｘま７’＝ｌ；１ｐＧＥＸ−２Ｔ等を使用し、ＧＳＴ− ＮＡＮＢＶ構造蛋白質（ここではＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ融合蛋白質として言及する ）を発現することができる。よって、ｐＧＥＸ−３ＸおよびｐＧＥＸ−２Ｔベク タを例として記載するが、この発明のＤＮＡ分子は、これらのベクタに限定され るものとして解釈すべきではない。なぜなら、１つの態様の発明がＧＳＴに融合 したＮＡＮＢＶ構造抗原を有する蛋白質の発現のためのｒＤＮＡに向けられたも のであり、ベクタ自体から引出されたものではないからである。

相補的付着末端を介してＤＮＡ断片をベクタに機能的に連結する種々の方法が開 発されている。例えば相補的ホモポリマ系を、挿入されるべきＤＮＡ断片および ベクタＤＮＡに付加することができる。その後、ベクタおよびＤＮＡ断片を水素 結合により相補的ホモポリマ尾部の間に結合させ、組換えＤＮＡ分子を形成す１ 以上の制限部位を含む合成リンカは、ＤＮＡ断片をベクタに結合する他の方法を 提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化により生成したＤＮＡ断片を、その３’ −５’工クソ核酸分解活性により突出する３′一本鎖末端を除去し、その重合活 性により窪んだ３′末端を埋める酵素であるバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリ メラーゼまたはイー・コリＤＮＡポリメラーゼ■により処理する。

したかってこれらの活性の組合せにより、平滑末端ＤＮＡ断片が生成する。その 後、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような、平滑末端ＤＮＡ分子の連 結を触媒することのできる酵素の存在下で、大モル過剰のリンカ分子を用いて平 滑末端断片をインキュベートする。このようにして、反応の生成物はその末端に ポリマ性リンカ配列を担持するＤＮＡ断片となる。その後これらのＤＮＡ断片を 適切な制限酵素により開裂し、ＤＮＡ断片のものと和合性の末端を与える酵素に より予め開裂した発現ベクタに連結する。

種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカは、インターナショナル・ バイオチクノロシーズ社、ニュー・ヘブスＣＮを含む多数の供給元から市販され ている。

また本発明により企図されるものには、前記した組換えＤＮＡ分子のＲＮＡ等価 物もある。

Ｄ、形質転換細胞および培養物 本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主細胞にも関する ものである。「宿主細胞」という用語は、真核および原核宿主の両者を含む。

形質転換細胞で使用する好適なｒＤＮＡ分子はここに前記したものであり、好ま しくは組換えまたは融合蛋白質を発現することのできるｒＤＮＡである。形質転 換された細胞の特定の好適な態様は、ここに前記した好適なりＮＡ断片の１つを 育するｒＤＮＡ分子を含むものであり、特にｒＤＮＡプラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ −６９０：６９４、ｐＧＥＸ−３Ｘ−６９３＋　６９１、ｐＣｙＥＸ−３Ｘ−６ ９０゛６９１、ｐＧＥＸ−３Ｘ−１５＋１７、ｐＧＥＸ−３Ｘ−１５：　１　Ｂ 、ｐＧＥＸ−２Ｔ−１５：１７、ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ａ、ｐＧＥＸ−２Ｔ −ＣＡＰ−ＢまたはｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ａ−Ｂにより形質転換された細胞 である。

細菌細胞は好適な原核宿主細胞であり、典型的にはイー・コリの株、例えばベセ スダ・リサーチ・ラボラトリイズ社、ベセスダ、ＭＤから入手可能なイー・コリ 株ＤＨ５とする。本発明の組換えＤＮＡ分子による適切な細胞宿主の形質転換は 、典型的には使用するベクタの種類に依存する周知の方法により行う。原核宿主 細胞の形質転換に関しでは、例えばコーエンら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ ｄ、ＳＣｉ、ＵＳＡ、６９：２１１０　（１９７２）およびサムブｌコックら、 　「分子クローン化、実験室マニュアル」、第２版、コールド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリイ、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ（＋９８９）を 参照する二とが−Ｃきる。

成功裡（７形質転換された細胞、すなわち本発明の組換えＤＮＡ分子を含む細胞 は周知の技術（−より同定することができる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入 に起因する細胞は、単一コロニーとして単離することかできる。このようなコロ ニーからの細胞を回収し、溶解し、サザン、Ｊ、　Ｍｏ　１．　８　ｉｏ　１゜ ９８：５０３（＋９７５）ｔたはベレントら、Ｂｉｏｔｅｃｈ、３　：　２０８ 　（１９８５）に記載されたような方法を使用してｒＤＮＡの存在についてその ＤＮＡ内容物を試験することかできる。

ｒＤＮＡの存在について直接検定することに加えて、ｒＤＮＡがＮＡＮＢＶ構造 蛋白質の発現を指向し得る場合、適切なｒＤＮＡにより形質転換された細胞を周 知の免疫学的方法により同定することができる。例えば１．二の発明の発現ベク タにより成功裡に形質転換された細胞は、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗原性を示す蛋 白質を生産する。形質転換されたと予想される細胞のサンプルを回収し、その抗 原ｌ二対して特異的な抗体（この種の抗体はここに更に記載する）を使用してＮ ＡＮＢＶ構造抗原の存在について検定する。

よって、形質転換宿主細胞自体に加えて、本発明は、栄養培地中のこれらの細胞 の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に同Ｐ１）培養物、またはモ ノクローナル培養物から誘導された培養物も企図する。好ましくは、この培養物 もＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗原性を示す蛋白質を含有する。

形質転換宿主細胞を培養するのに有用な栄養培地は当業界で周知であり、幾つか の市販供給元から得ることができる。

Ｅ、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質、ポリペプチドおよび融合蛋白質の製造方法本発明の 他の観点は、この発明の組換え蛋白質および融合蛋白質を製造する方法に関する 。

本方法は、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質または融合蛋白質を発現することのできる本発 明の組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主細胞、好ましくはイー・コリ細 胞を含む栄養培地からなる培養を開始することを伴う。形質転換された細胞がＮ ＡＮＢＶ構造蛋白質または融合蛋白質を発現するのに十分な時間期間の間培養を 維持する。その後発現された蛋白質を培養から回収する。

ＮＡＮＢＶ構造蛋白質を生産する発現ベクタおよび発現ベクタ培養条件は一般に 当業界で周知である。この種のベクタおよび培養条件は、本発明の精神に影響を 与えることなく変更することができる。しかしながら、好適なのは、ＮＡＮＢＶ 構造蛋白質を発現するのに使用される宿主細胞中には通常は認められない蛋白質 の生産のために特に設計されたベクタである。例には、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質を コードするＤＮＡ断片の発現を指向する誘導性プロモータを含むベクタがある。

ＩＰＴＧにより誘導性のプロモータを有するベクタも周知である。例えば、それ ぞれファルマシアおよびアマジャムから入手し得るプラスミドｐＴＴＱおよびｐ ＫＫ２２３−３を参照することができる。特に好適なのは、ここに記載したｐＧ ＥＸベクタ、Ｉ）ＧＥＸ−３ＸおよびｐＧＥＸ−２Ｔ中に存在するＩＰＴＧによ り誘導性のプロモータである。

誘導性のプロモータを存するベクタを使用し、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質の発現には 、公知のように、また実施例２に詳細に説明するように、蛋白質を発現する前記 した維持工程の開始に際して誘導期を必要とする。

発現された蛋白質を培養物から回収する方法は当業界で周知であり、周知の生化 学的技術を使用して蛋白質含有部分を分画することを含む。例えば、蛋白質分画 について公知であるようなゲルろ過、ゲルクロマトグラフィ、限外ろ過、電気泳 動、イオン交換、アフィニティクロマトグラフィ等の方法を使用し、培養物に認 められる発現された蛋白質を単離することができる。また、周知の方法を使用し 、免疫アフィニティ、免疫吸着等の免疫学的方法を行うことができる。

特に好適なのは、蛋白質の複雑な混合物から融合蛋白質を分離する手段としてデ ルタチオン−３ｆ、ランスフェラーゼ（Ｃ；　Ｓ　Ｔ）を特定するポリペプチド 部分の存在を利用する単離方法である。固定されたグルタチオンを含む固相に対 するＧＳＴ含有融合蛋白質の親和力吸着は、スミスら、Ｇｅｎｅ、６７：３１（ ＋９８８）により記載されたように行うことができる。また、融合蛋白質のＧＳ Ｔ含存ポリペプチド部分は、スミスら、Ｇｅｎｅ、６７：３１　（１９８８）の 方法により、特異的な蛋白質分解開裂部位における融合蛋白質の選択的開裂によ ってＮＡＮＢＶ構造抗原から分離することかできる。例示的な単離方法を実施例 ５および６に記載する。

ｒＤＮＡ発現ベクタの使用によるその調製に加え、ＮＡＮＢＶ構造抗原からなる ＮＡＮＢＶ構造遺伝子は合成ポリペプチドの形態で調製することができる。

ポリペプチドは、ポリペプチド技術の当業者に公知の全ゆる技術により合成する ことかできる。面相メリフィールド型合成のような合成化学技術は、純度、抗原 特異性、所望しない副生物を含まないこと、製造の容易性等の理由から好適であ り、メリフィールドら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８５　：２１４９−２１ ５４（１９６３）およびホウテンら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔ、Ｐｒｏｔ、Ｒｅｓ 、１６：３１１−３２０（１９８０）に記載された方法により実施することかで きる。利用し得る多くの技術の優ねた要約は、ジェイ・エム・ステワードとノエ イ・ディ・ヤング、「固相ペプチド合成」、ダブリュ・エッチ・フリーマン社、 サンフランシスコ、１９６９、エム・ボダンスキイら、「ペプチド合成」、ジョ ン・ライレイ・アンド・ランス、第２版、１９７６、および固相ペプチド合成に ついてジェイ・メイエンホファ、　「ホルモン性蛋白質およびペプチド」、第２ 巻、第４６頁、アカデミツク・プレス（ＮＹ）、１９８３、および古典的な溶液 合成についてイー・シュロダーとケー・クブケ、「ペプチド」、第１１ｋ、アカ デミツク・プレスにューヨーク）、１９６５に認めることができ、これらのそれ ぞれを参考によりここに取入れる。

この種の合成に使用し得る適切な保護基は、前記テキスト中およびジエイ・エフ ・ダブリュ・マコミー、ｒ有機化学における保護基Ｊ、ブレナム・プレ入ニュー ヨーク、１９７３に記載されており、これを参考によりここに取入れる。

対象ポリペプチドは、そのアミノ酸残基配列をここに示すポリペプチドの全ゆる 化学的誘導体を含む。したがって、本ポリペプチドは種々の改変に供することか でき、この場合、この種の改変によってその使用において所定の利点か与えられ る。

「化学的誘導体」とは、官能性側部基の反応により化学的に誘導された１以上の 残基を存する対象ポリペプチドを指す。この種の誘導された分子には、例えば遊 離のアミノ基が誘導されてアミンヒドロクロリド、ｐ−トルエンスルホン酸基、 カーボベンゾキシ基、ｔ−ブチロ牛ジカルボニル基、クロロアセチル基またはホ ルミル基を形成するような分子が包含される。遊離のカルボキシル基を誘導して 塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の種類のエステルまたはヒドラジドを 形成することができる。遊離の水酸基を誘導してＯ−アシルまたはＯ−アルキル 誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導してＮ− ｌｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また化学的誘導体として包 含されるものに、２０の榎準アミノ酸の１以上の天然に存在するアミノ酸誘導体 を含むようなペプチドがある。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンを置 換することができ、５−ヒドロキシリジンはリジンを置換することができ、３− メチルヒスチジンはヒスチジンを置換することができ、ホモセリンはセリンを置 換することができ、またオルニチンはリジンを置換することができる。また本発 明のポリペプチドは、必要な活性が維持される限り、その配列をここに示すポリ ペプチドの配列に関して１以上の付加を育する全ゆるポリペプチドも包む。　付 加的な残基は、この発明のポリペプチドをラベルまたは固体マトリックスまたは キャリヤに便利に固定することのできる「リンカ」を与える目的のために、いず れかの末端に付加することもできる。好ましくは、リンカ残基はＮＡＮＢＶ構造 抗原を形成しない。

この発明のポリペプチドと共に使用することのできるラベル、固体マトリックス およびキャリヤはここに後記する。

アミノ酸残基リンカは通常は少なくとも１つの残基とし、４０以上の残基、更に 多くの場合は１〜１０残基とすることができるが、ＮＡＮＢＶエピトープを形成 しないものとする。リンキングに使用する典型的なアミノ酸残基は、チロシン、 ソステイン、リジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸等である。また、対象 −ポリペプチドは、他に明記しない限り、末端ＮＨ２アシル（！Ｚ、例えばアセ チル化、またはチオグリコール酸丁ミド化により、例えばアンモニア、メチルア ミン等を用いる末端カルボキシ了ミド化により修飾された配列により、ＮＡＮＢ Ｖポリ蛋白質の天然の配列と異なり得る。

キャリヤと共役させて当業界でキャリヤーハブテン接合物として知られるものを 形成する場合、本発明のポリペプチドは、ＮＡＮＢＶど免疫反応する抗体を誘導 することができる。したがって、免疫学的交差反応性の十分に確立された原理に 照らして、本発明はここに記載するポリペプチドの抗原的に関連する変種を企図 する。「抗原的に関連する変種」とは、本発明のポリペプチドおよびＮＡＮＢＶ と免疫反応する抗体分子を誘導し得る対象ポリペプチドである。

本発明の全ゆるペプチドは、薬学的に許容し得る塩の形態で使用することができ る。本発明のペプチドと塩を形成することのできる適切な酸には、無機酸、例え ば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酢酸、プロピ オン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マ レイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホシ酸、スルフ ァニル酸等が包含される。

本発明のペプチドと塩を形成することのできる適切な塩基には、無機塩基、例え ば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等、および有機塩基 、例えばモノ−、ジーおよびトリーアルキルおよびアリールアミン（例えばトリ エチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）およ び必要（こ応じて置換されたエタノールアミン（例えばエタノールアミン、：） エタノールアミン等）が包含される。

一般に、企図する固相合成方法は、成長しつつあるペプチド鎖に対し、１以上の アミノ酸残基または適切に保護したアミノ酸残基を順次添加する。：とからなる １゜通常は、第１のアミノ酸残基のアミノまたはカルボキシル基を、適切な選択 的に除去し得る保護基により保護する。リジンのような反応性の側部基を含む了 ミノ酸については、異なる選択的に除去し得る保護基を利用する。

例どして固相合成を使用し、保護または誘導されたアミノ酸をその保護されてい ないカルボキシルまたはアミノ基を介して不活性な固体支持体に付着させる。

その後アミノまたはカルボキシル基の保護基を選択的（二除去し、適切に保護さ れた相補的（アミノまたはカルボキシル）基を有する、配列において次のアミノ 酸を混合し、既に固体支持体に付着している残基とアミド結合を形成するのに適 切な条件下で反応させる。その後アミノまたはカルボキシル基の保護基をこの新 たに付加したアミノ酸残基から除去し、その後（適切に保護した）次のアミノ酸 を添加し、以後同様とする。全ての所望のアミノ酸を適切な配列に結合しｔｍ後 、全ゆる残留する末端および側部基保護基（および固体支持体）を順次または同 時に除去し、最終的なポリペプチドを与える。

Ｆ、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質および融合蛋白質組成物能の態様では、本発明は、こ の発明のＮＡＮＢＶ構造抗原を特定するアミノ酸残基配列からなる好ましくは単 離されたＮＡＮＢＶ構造蛋白質を含有する組成物を企図する。

単離されたとは、この発明のＮＡＮＢ”Ｖ構造蛋白質が、主要な蛋白質構成成分 として、典型的には組成物中の全蛋白質の１０％より多い量で、ただし好ましく は組成物中の全蛋白質の９０％より多い量で、組成物中に存在することを意味す る。

ここで使用するようにＮＡＮＢＶ構造抗原は、ＮＡＮＢＶのゲノムによりコード される構造蛋白質であり、ここに特定するような、すなわち抗体と特異的に免疫 反応することができる抗原の性質を存する。ＮＡＮＢＶｌｌＩ造蛋白質はカプシ ドおよびエンベロープとして仮に示し、ここに記載するようにそれぞれＮＡＮＢ Ｖ構造抗原カプシドおよびエンベロープを含むものとして部分的に特徴付けた。

ここに記載するようにＮＡＮＢＶカプシドは、推定されるハツチ株ＮＡＮＢＶカ プシド抗原に刻して配列において免疫学的に関連するアミノ酸残基配列からなり 、その配列は配列番号：ｌの残基ｌ〜残基１２０に含まわる。

ここに記載するようにＮΔＮＢＶエンベロ・−ブ抗原は、推定されるハツチ株Ｎ ＡＮＢＶエンベロープ抗原に対して配列において免疫学的に関連するアミノ酸残 基配列からなり、その配列の部分は配列番号：ｌの残基１２１〜残基３２６に含 まわる。

「免疫学的に関連するｊとは、１つの蛋白質に特異的な抗体か他の蛋白質と免疫 反応（交差反応）することを比較し、２つの蛋白質配列中にアミノ酸配列におけ る十分な相同性が存在することを意味する。免疫学的交差反応性は、ここに記載 する免疫検定方法を含む周知の方法によって測定することかできる。

ここで使用するように、　「組換え蛋白質」という記載は、長さにして少なくと も２０アミノ酸残基、好ましくは少なくとも５０残基であって、配列番号　■に 含まれるＮＡＮＢＶ構造蛋白質の部分に対応する、好ましくは同一のアミノ酸残 基配列を含む蛋白質を指す。

好適な態様では、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質は、配列番号・１の残基ｌ−残基２０、 残基２１〜残基４０、残基２〜残基４０または残基ｌ〜残基７４に含まれる配列 に免疫学的に関連する、好ましくは同一のアミノ酸残基配列を含む。示した配列 を有するＮＡＮＢＶ構造蛋白質は、診断方法およびシステムで使用するのに特に 好適である。なぜなら、これに含まれるカプシド抗原は、ここで急性ＮＡＮＢＶ 感染の検出に特に有用であることが示されたからである。関連するＮＡＮＢＶ構 造蛋白質は、配列番号、ｌの残基１〜残基１２０、残基１〜残基１７６および残 基】〜残基３２６に含まれる配列を含む。例には、配列番号：２の残基ｌ〜残基 ３１５、配列番号、３の残基ｌ〜残基２５２、配列番号：４の残基１〜残基２５ ２または配列番号：６の残基１〜残基２７１に含まれる配列を有するここに記載 する蛋白質がある。

他の態様では、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質は、配列番号：ｌの残基６９〜残基１２０ に含まれる配列に免疫学的に（！Ｉ達する、好ましくは同一のアミノ酸残基配列 を含む。例示的なＮＡＮＢＶ構造蛋白質は、ｒＤＮＡプラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ −６９３：６９１によりコードされる発現された蛋白質の配列を存する。

配列番号：ｌの残基１２１〜残基１７６に含まれる配列に免疫学的に関連する、 好ましくは同一のアミノ酸残基配列を含むＮＡＮＢＶエンベロープ抗原を含む更 なるＮＡＮＢＶ構造蛋白質を企図する。例には、ｒＤＮＡＤＮＡプラスミドルＸ −３Ｘ−１５：１７、ｐＧＥＸ−３Ｘ−１５：　１８およびｐＧＥＸ−２Ｔ−１ ５：１７の１つによりコードされる発現された蛋白質の配列を有する蛋白質があ る。

他の態様では、この発明のポリペプチドによるアミノ酸残基配列からなるＮＡＮ ＢＶ構造蛋白質を企図する。

好適な態様では、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質は、原核抗原（すなわち宿主細胞特異的 抗原）および他のＮＡＮＢＶ関連蛋白質の両者を実質的に含有しない。［実質的 に含有しないＪとは、ＮＡＮＢＶ構造抗原構造抗原対外側抗原原核抗原または他 のＮＡＮＢＶ関連蛋白質の比が少なくとも１０：１、好ましくは１００＋１゜更 に好ましくは２００：１であることを意味する。

ＮＡＮＢＶ構造蛋白質調製物中の夾雑蛋白質の存在および量は周知の方法により 決定することかできる。好ましくは、組成物のサンプルをドデシル硫酸ナトリウ ムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、存在する全ゆ る蛋白質夾雑物からＮＡＮＢＶｍ造蛋白質を分離する。その後、サンプル中に存 在する蛋白質の量の比を、当業界で周知のよう１：１１度計ソフトレーザー走査 により決定する。グイリアンら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２９：２７７− ２８７　（１９８３）を参照することができる。

ＮＡＮＢＶ構造蛋白質は、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質を製造するここに開示する方法 により、単離された、更に好ましくは原核抗原またはＮＡＮＢＶ非構造抗原を実 質的に含有しない蛋白質としてＴＮ４１８！することができる。特に好適なのは 、融合蛋白質のポリペプチド領域の性質による方法であり、その領域は、親和力 に基き宿主細胞蛋白質からの融合蛋白質の分離を促進すべく融合蛋白質中に存在 する。

例にはＧＳＴ含有含金融合蛋白質り、そのアミノ酸配列は配列番号：２．３．４ または６に含まれ、この場合それぞれのＧＳＴポリペプチド領域により、ＧＳＴ に対する通常の基質、すなわちグルタチオンに結合する親和力を有する機能性ド メインを有する融合蛋白質が与えられる。ＧＳＴポリペプチド領域を存する融合 蛋白質の精製はここに更に記載する。

関連する態様では、この発明はＮＡＮＢＶ坑原を特定するポリペプチドを記載す るものである。よってこの発明は、ここに記載するように血清学的検定において または抗ＮＡＮＢＶ抗血清を誘導する接種物においてＮＡＮＢＶ抗原として有用 なウィルスの抗原性決定基を特定するＮＡＮＢＶポリ蛋白質の領域に対応するポ リペプチドを企図する。

この発明のポリペプチドは、長さにして約７〜約２００残本、好ましくは長さに して約２０〜１５０残基のアミノ酸の配列からなり、これはこの発明のポリヌク レオチドのヌクレオチド配列により特定されるアミノ酸残基配列からなる。

好適なポリペプチドは、配列番ｑ：４６の残基３９１〜残基４０４、配列番号・ ４６の残基２４６〜残基２５６、配列番号：４６の残基４６１〜残基４６Ｇ、配 列番号、４６の残基４７３〜残基４８２および配列番号　４６の残基２３５６〜 残１２３７９よりなる配列の群から選択されるアミノ酸残基配列を含むアミノ酸 残基配列からなる。特に好適なｔｉ様では、ポリペプチドは、配列番号　４６に 示される配列に対応するアミノ酸残基配列を存するウポリベブチドがハツチ単離 物を区別するのに有用である限り、この発明は、約７〜約２００のアミノ酸残基 の長さを有し、配列番号：４６に示されるＮＡＮＢＶのハッヂｃ５９単離物の配 列の部分に対応するアミノ酸残本配列からなるボリベブｆ　ｔ”ｔＪ’：図１ｍ ６゜：の懸ｍでは、ＨＣＶ−Ｌ　ＨＣＶ−ＢＫＳＨＣ’Ｖ−Ｊ、ＨＣ−Ｊｌ、Ｈ Ｃ−Ｊ４．１（ＣＶ−ＪＨおよびＨＣＶ−Ｈｈよりナル群カラ選択されるＮＡＮ ＢＶの単離物のアミノ酸残基配列と比較した場合、ポリペプチドは配列において 少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を存する。

好ましくは、ここに記載するような標準的な血清学的免疫検定で測定した場僑、 ポリペプチドは抗ハツチ株ＨＡＮＢＶ抗血清と免疫反応性である。

更１こ好ましくは、ポリペプチドは、ここに特定するようにＮＡＮＢＶウィルス ゲノムコードポリ蛋白質の可変領域において少なくとも１つのアミノ酸残基の差 異を含む。例えば、■可変領域アミノ酸残基配列（配列番号・４６の残基３８６ 〜残基４１１）、Ｖ、可変領域アミノ酸残基配列（配列番号：４６の残基２４６ 〜残基２７５）、Ｖ、可変領域了ミノ酸残基配列（配列番号：４６の残基４５６ 〜残基、Ｈ１２）、およびＶ、可変領域アミノ酸残基配列（配列番号：４６の残 基２３５６−−残基２３７９）よりなる配列の群から選択されるアミノ酸残基配 列である。

他の態様では、単離された融合蛋白質からなる組成物も本発明により企図され、 これはペプチド結合により他のポリペプチドに一方または両方の末端で機能的に 連結したこの発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質からなる。付加されるポリペプチドは 、融合蛋白質上に存在する機能性ドメインを増加すべく設計された全ゆるポリペ プチドとすることかできる。付加される機能性ドメインは、付加的な抗原性エピ トープを与え、融合蛋白質に対して質量を付加し、融合蛋白質の溶解性を変化さ せ、融合蛋白質の親和力に基く単離の手段を与える等のために含まれるものであ る。

付加される機能性ドメインの例は、ここに記載するように対象融合蛋白質をベク タｐＧＥＸ−３ＸまたはｐＧＥＸ−２Ｔ中で生産する場合にそれぞれ与えられる トロンビンまたは因子Ｘａ特異的開裂部位である。更なる例示的なドメインは、 固定されたグルタチオンを含む固相に対するアフィニティクロマトグラフィを使 用して迅速な単離を可能とするＧＳＴ誘導蛋白質ドメインである。

１つの態様では、トロンビンまたは因子Ｘａ開裂部位含有ドメインをここで使用 し、ＧＳＴ機能ドメインを含有しないＮＡＮＢＶ構造蛋白質の製造を可能どする 。例は、配列番号　２の残基２２６〜残基３１５に含まれるアミノ酸残基配列を 存する実施例６で製造される蛋白質である。因子ＸａＭ裂部位含存ドメインも、 ここに記載するニュー・イングランド・バイオラプス（〜（−リイ、ＭＡ）から 入手し得る市販の融合蛋白質発現ベクタｐＭＡＬ中で使用する。

関連する態様では、ｐＧＥＸ−２Ｔベクタを使用して製造される蛋白質、例えば 配列番号：３の残基２２５〜残基２５２、配列番号＝４の残基２２５〜残基２５ ２または配列番号　６の残基２２５〜残基２７１に含まれるアミノ酸残基配列を 有する蛋白質のトロンビン開裂によってＮＡＮＢＶ構造蛋白質を製造する。

本発明の融合蛋白質は、配列番号＝１の残基１〜残基２０、残基２１〜残基４０ 、残基２〜残基４０、残基１〜残基７４、残基６９〜残基１２０、残基１２１〜 残基１７６または残基１２１〜残基３２６に含まれるアミノ酸残基配列にアミノ 末端からカルボキシ末端まで対応するアミノ酸残基配列を含む。好適な融合蛋白 質は、配列番号：２の残基ｌ〜残基３１５、配列番号：３の残基１〜残基２５２ 、配列番号：４の残基１〜残基２５２または配列番号＝６の残基ｌ〜残基２７１ 中のアミノ酸残基配列に対応する、更に好ましくは同一の配列を有する。

他の好適な融合蛋白質は、ｒＤＮＡプラスミドｐＧＥＴ−３Ｘ−６９０：　６９ ４、ｐＧＥＸ−３Ｘ−６９０：６９Ｌ　ｐＧＥＸ−３Ｘ−６９３：６９１、ｐＧ ＥＸ−３Ｘ−１５：１７、ｐＧＥＸ−３Ｘ−１５：　ｌ　８、ｐＧＥＸ−２Ｔ− ＋　５　：１７、ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−ＡｌｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ｂお よびｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ａ−Ｂ中に存在する発現蛋白質コード配列のアミ ノ酸残基配列により特定される。

「融合蛋白質」という記載は、ここで使用する場合、この発明のＮＡＮＢＶ構造 蛋白質について特定されたものとして単離された蛋白質に言及するものである。

よって単離された融合蛋白質は、組成物中の全蛋白質の１０％より多い、好まし くは組成物中の全蛋白質の９０％より多い量でこの発明の融合蛋白質を有する組 成物である。

好適な融合蛋白質は異種起源融合蛋白質、すなわち異種起源種のウィルス、生体 、病原体または動物に由来する蛋白質、すなわち非ＮＡＮＢＶ蛋白質から誘導さ れたポリペプチド部分を含む融合蛋白質である。好ましくは異種起源融合蛋白質 は、この発明のＮＡＮＢＶ構造抗原に免疫学的に関連しない非ＮＡＮＢＶポリペ プチド部分を含む。

１つの態様では、融合蛋白質は、ここに特定するＮＡＮＢＶ構造抗原以外の免疫 原性または抗原性エピトープを与える機能性ドメインを含み、好ましくは別の病 原体から、または幾つかの病原体から誘導される。機能性ドメインは免疫原性で あり、その場合そのドメインは、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質および第２の病原体の両 者と免疫反応性の抗体を誘導する目的で多価ワクチンまたは免疫原を形成すべく 存在する。機能性ドメインは抗原性であり、その場合そのドメインは、少なくと も２つの種の抗体を検出する診断システムおよび方法で使用するための多価抗原 を形成すべく存在する。

このｔ！！様で特に興味あるものは、ＢＷ肝炎ウィルスおよびＡ型肝炎ウィルス のような他の肝炎発症ウィルスから誘導される機能性ドメインを含むよう設計さ れた融合蛋白質である。これらのウィルスは、この発明の融合蛋白質で使用する のに適切な抗原性決定基および免疫原性決定基を含むものとして十分に特徴付け られており、診断およびワクチン用途の両者において多目的生化学的試薬の利点 を与えるものである。更に、包含される機能性ドメインは、他の病原体、好まし くはＨＴＶのようにＮＡＮＢＶ肝炎を持つ個体にも感染するものに由来するアミ ノ酸配列を含むことができる。

本発明のＮＡＮＢＶ構造抗凍からなる好適なＮＡＮＢＶ構造蛋白質または融合蛋 白質は、分子内Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合のため、非還元形態であり、すなわちスルフ ヒドリル基を実質的に含有しない。

好適な組成物では、ここに記載するＮＡＮＢＶ構造蛋白質または融合蛋白質は、 例えば殺菌懸濁物または溶液のような、または適切な保存剤を含む等張調製物の ような液体組成物中に存在する。

動物中て抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗体を誘導するのに有用なこの種の組成物の１ つはワクチンとして言及され、この発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質または融合蛋白 質を含むものである。

「ワクチン」という飴は、その種々の文法上の形態において、ＮＡＮＢＶと免疫 反応性の哺乳動物中の抗体の生産を誘導すべく、好ましくはＮＡＮＢＶｌ、：対 する宿主哺乳動物中の活性な免疫を誘導すべく使用される薬学的に許容し得る賦 形剤中の活性構成成分としてこの発明の１以上のＮＡＮＢＶ構造抗原を含有する 接種物の形式を記載すべくここで使用するものである。

接種物は、免疫原性構成成分、免疫学的に有効な量のこの発明の少なくとも１つ のＮＡＮＢＶ構造蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質、またはその組合せか らなる。

接種物は典型的には特異的な抗体を誘導すべく設計されるため、融合蛋白質につ いて記載したように、接種物はＮＡＮＢＶ構造抗原のみからなり他の機能性ドメ インを含まないＮＡＮＢＶ構造蛋白質を含むのが好適である。よって好適な接種 物は、配列番号：ｌの残基ｌ〜残基２０、残基２１〜残基４０、残基２〜残基４ ０、残基ｌ〜残基７４、残基６９〜残基１２０、残基Ｉ２１〜残基１７６または 残基」２１〜残基３２６に含まれるアミノ酸残基配列を含むこの発明のＮＡＮＢ Ｖ構造蛋白質を含む。接種物中の活性構成成分として特に好適なものは、配列Ｉ Ｄ８号ｌの残基ｌ〜残基２ｏ、残基２１〜残基４０．残基２〜残基４ｏ、残基ｌ 〜残基７４、残基１〜残基１２０に含まれる、または配列番号＝２の残基２２６ 〜残基３１５に含まれる、配列番号：３の残基２２５〜残基２５２に含まれる、 配列番号・４の残基２２５〜残基２５２に含まれる、または配列番号　６の残基 ２２５〜？！１．基２７１に含まれるアミノ酸残基配列を有するＮＡＮＢＶ構造 蛋白質である。

好適な接種物は、配列番号：４６のヌクレオチド５７１〜２１９７に渡るＤＮＡ 配列によりコードされる全Ｅ１　ドメインおよびＥ、／ＮＳＩドメインからなる 。

接種物は、活性構成成分としてこの発明の１以上のポリペプチドを含むことがで きる。この種の接種物はＮＡＮＢＶと免疫反応性の抗体を生産するのに特に有用 である。なぜなら、ＮＡＮＢＶポリ蛋白質の小さく、したがって独特のエピトー プを特定するポリペプチドを設計することができるからである。この種の抗体は 、ここで特定するように単離物特異的である。

また、ｌを越える免疫原性機能性ドメインを育し、異なる抗原、すなわちここで 記載するような第１のＮＡＮＢＶ構造抗原、またはＨＣＶの異なる株に由来する 対応領域および別個の病原体上に存在する更なる抗原に対して特異的な抗体のク ラスを誘導するのに有用な融合蛋白質からなる多価接種物を企図する。好適な更 なる抗原は、典型的にはＮＡＮＢＶ感染患者に随伴して認められる病原体、すな わちＢ型肝炎ウィルス、ヒト免疫欠損ウィルス（ＨＩＶ）等から誘導されるもの である。

Ｍ達する態様は２つの免疫原性ドメインを企図するが、嵐−の接種物がポリ蛋白 質にコードされるＨＣＶの２つの領域に特異的な抗体を誘導するよう、それぞれ はＨＣＶの異なる領域（こ由来する。

とするのに適切な個体Ｐ東注射前の液体も調製することができる。ｙ４製物は在 学的に許容し得る」　（生理学的に容認し得る）という記載は、ヒトに投与した 場合に、典型的には胃の障害、眩量等のアレルギー性または類似する所望しない 反応を生起しない分子実体および組成物に言及するものである。適切な賦形剤は 、意図する使用に応じて広範な種類の形態をとることができ、例えば塩類を含有 する水溶液、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセリン、エ タノール等およびこれらの組合せとする。また、所望に応じて、接種物は、接種 物の有効性を増強する少量の助剤物質、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、 鉱油、キャリヤまたはアジュバントを含有することができる。好適な態様は、活 性構成成分として少なくとも約０．ＯＩ％〜約９９％のＮＡＮＢＶ構造蛋白質ま たは融合物を、典型的には賦形剤のｍ１当り約１０〜２００μｇの活性構成成分 の濃度で含存するものである。

３、キャリヤ 接ｆｌ物は、免疫化された哺乳動物における免疫応答の生起を促進するため、キ ャリヤまたは抗原性キャリヤに結合されたこの発明のポリペプチドまたはＮＡＮ ＢＶ構造蛋白質からなる。

その位置に既に存在していない場合、１以上の付加的なアミノ酸残基をＮＡＮＢ Ｖ構造蛋白質のアミノ−またはカルボキシ−末端に付加し、ギヤリヤに対する蛋 白質の結合を補助することができる。アミノ−またはカルボキシ−末端に付加さ れたシスティン残基は、ジスルフィド結合を介してポリマーを形成するのに特に 有用であることが認められた。しかし、なから、接合物を調製する当業界で周知 の他の方法も使用することができる。例示的な付加結合手順には、ミカエル付加 反応生成物、ジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒド、クリブステインら、Ｊ 。

Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、＋４７＋３１８−３２６　（１９８３）等の使用、また は水溶性カルボジイミドを使用してキャリヤに対するアミド結合を形成するよう なカルボジイミド技術の使用が包含される。

有用なキャリヤは当業界で周知であり、一般に蛋白質それ自体である。この種の キャリヤの例には、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）　、エデスチン、チログロ ブリン、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アル ブミン（Ｈ３Ａ）　、赤血球細胞、例えばヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）、破傷風毒 素、コレラ毒素並びにポリアミノ酸、例えばポリ（Ｄ−リジン　Ｄ−グルタミン 酸）する場合、中間体結合基は好ましくはｎ〕−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒトＯ キシスて使用すべき場合、その特定の動物中で望ましくない反応を生起しないキ ャリヤを選択すべきである。

４、投与 接ｍ物は便利には注射により非経口的に、例えば皮下または筋肉内に投与する。

投与の他の様式に適切な更なる処方物には、座薬および幾つかの場合では経口処 方物か包含される。座薬については、伝統的なバインダおよびキャリヤは例えば ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができ、この種の座 薬は、活性構成成分を０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で含有する 混合物から形成することができる。経口処方物は、次のような通常用いられる賦 形剤、例えば薬学等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネ シウム、ナトリウム・サッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等を含む。組 成物は溶液、懸濁物、錠剤、ビル、カプセル、徐放性処方物または粉末の形態を とり、１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性構成成分を含む。

ＮＡＮＢＶ構造蛋白質は、中性または塩の形態で接種物に処方することができる 。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（抗原の遊離のアミノ基により形成される ）を包含し、これは無機塩、例えば塩酸またはリン酸、または有機酸、例えば酢 酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等により形成する。遊離のカルボキシル基に より形成される塩は、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニ ウム、カルシウムまたは第２鉄、および有機塩基、例えばイソプロピルアミン、 トリメチルアミン、ヒスチジン、プロ力イン等から誘導することもできる。

接種物は、投与量処方物と和合性の様式で投与し、免疫応答を誘導するのに免疫 原性かつ有効たり得る量とする。ワクチンとして使用した場合に所望の完全保護 免疫を達成するために投与すべき接種物の量は、免疫化する対象、抗体を合成す るか細胞媒介応答を誘導する対象の免疫系の能力、および所望する保護の程度に 依存する。投与するのに必要な活性構成成分の正確な量は、処置医の判断に依存 し、それぞれの個人に特有のものであるが、一般に広範な集団について適切な投 与量を特定することができる。適切な投与量範囲は、成人ヒトに対してそれぞれ の単一免疫化投与について、約１０マイクログラム（μｇ）〜数ミリグラム（ｍ ｇＬ好ましくは約１０〜５００マイクログラム、更に好ましくは約１００マイク ログラム活性構成成分のオーダーである。最初の投与および追加投与についての 適切な療法も変動し得るが、最初の投与の後２〜６週間の間隔で次の注射または 他の投与を行うことを典型とする。

また接種物は、賦形剤の一部としてアジュバントを含むこともできる。実験室哺 乳動物で使用する完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）　、不完全フロインド アジュバント（ＩＦＡ）のようなアジュバントは当業界で周知である。ミョウバ ンのような薬学的に許容し得るアジュバントも使用することができる。よって例 示的な接種物は、約０．５ｍｇ〜約２．５ｍｇのミョウバンまたは０．１％〜１ ％のＡＩ　（ＯＨ）を上に吸着された約５０〜２００μｇのＮＡＮＢＶ構造蛋白 質またはポリペプチドを含有する１ｍｌのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）からな る。好適な接種物は、２．５ｍｇのミョウバンキャリヤ上に吸着された１００μ ｇのＮＡＮＢＶ構造蛋白質を含有する１ｍｌのＰＢＳからなる。

接種物の投与後、接種物を受容する哺乳動物またはヒトを、哺乳動物の免疫系が 免疫原ど免疫反応性の抗体を生産することにより免疫学的に応答するのに十分な 時間期間（典型的には周知のように２〜８週間のオーダー）の間維持する。

Ｈ１抗体組成物 本発明の抗体は、ＮＡＮＢＶ構造抗原と、ＮＡＮＢＶのノ１ツチ単離物、好まし くはｃ５９単離物と、および本発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質、ポリペプチドまた は融合蛋白質（抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗体分子）と免疫反応する抗体分子を含 有する組成物である。好適な抗体は、配列番号＝１の残基ｌ〜残基３２６に含ま れるアミノ酸残基配列を有するポリペプチド上に存在するエピトープと免疫反応 する、好ましくは配列番号＝１の残基Ｉ〜残基２０、残基２１〜残基４０、残基 ２〜残基４０、残基ｌ〜残基７４、残基４９〜残基１２０または残基１２１〜残 基３２６に含まれる配列を育するポリペプチドと免疫反応する抗体分子を含む。

また、抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗体分子は、ＮＡＮＢＶ単離物ＨＣＶ−Ｌ　ＨＣ Ｖ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣ−ＪＬ　ＨＣ−Ｊ４、ＨＣＶ−ＪＨまたＩ；！ＨＣ Ｖ−Ｈｈと、またはここに記載しオルト・ダイアグノスチクスから入手可能の市 販の検定で利用可能なＣ−１００−３と免疫反応しないことが好適である。

本発明の抗体は、典型的にはこの発明のハツチＣ５９単離物またはＮＡＮＢＶ構 造蛋白質またはポリペプチドを含有する接種物により哺乳動物を免疫化し、これ によりここに記載するＮＡＮＢＶ構造抗原に対する免疫特異性を有する抗体分子 を哺乳動物中で誘導することにより製造する。その後抗体分子を哺乳動物から集 め、例えばＤＥＡＥセファデックスを使用することにより周知の技術により所望 の程度に単離し、ＩｇＧ画分を得る。

抗体の特異性を増強するため、固相固定免疫化ＮＡＮＢＶ構造蛋白質を使用し、 免疫アフィニティクロマトグラフィにより抗体を精製することができる。ＮＡＮ ＢＶ構造蛋白質が抗体分子と免疫反応して固相固定免疫複合体を形成するのに十 分な時間期間の闇、抗体と固相固定ＮＡＮＢＶ構造蛋白質とを接触させる。結合 した抗体は、標準的な技術により複合体から分離する。

Ｃ−１００−，３抗原または前記同定したＮＡＮＢＶ単離物ど免疫反応しない抗 固定された１以上の抗原またはＮＡＮＢＶ単離物を有する固相とを接触させて免 疫吸着混合物を形成することを含む。好ましくは、免疫吸着混合物中の所望しな い免疫特異性を有する組成物中の抗体に比例して固相中の過剰の抗原またはＮＡ ＮＢＶが存在するものとする。

その後免疫吸着混合物を免疫反応条件下で、免疫複合体を固相に形成するのに十 分な時間期間の間維持する。その後、液相と固相とを分離し、固相上に免疫吸着 されなかった所望しない抗体分子を有する液相を保留する。

特に好適なのは、ハツチＣ５９単離物による、または好ましくはｃ５９に独特の アミノ酸残基配列を有し、好ましくはＮＡＮＢＶのｖ、ｖ、、ＶｌまたはＶ。

可変領域から誘導されたものとしてここに特定するように選択されたこの発明の ポリペプチドによる免疫化によって形成されるｃ５９単離物特異的抗血清を含有 する抗体組成物である。その後、生産された抗体組成物を免疫吸着し、ここに記 載するようにｃ５９以外のＮＡＮＢＶ単離物と免疫反応性の抗体を除去する。

このようにして生産された抗体を、就中本発明の診断方法およびシステムで使用 し、ここに記載するように体のサンプル中に存在するＮＡＮＢＶ構造抗原を検出 することができる。

■構造抗原と免疫反応性の抗体の調製に使用する活性構成成分としてこの発明の のここにおける記載と、ワクチンが同様に抗体の生産を誘導するため（こ設計さ れ、接種物の調製および使用の例示とする限りにおいて、大きく近似している。

鍵となる差異は、周知のように、接種物はヒトより寧ろ動物に対する使用のため に処方される点である。

好適な抗体はモノクローナル抗体であり、本発明の抗体についてここに開示すま たこの発明が企図するものは、）１イブリドーマ細胞、およびこの発明のモノて 微生物による汚染の危険を除去する。

またはＮＡＮＢＶ構造抗原の存在について検定するための診断システムを企図す ＢＹ抗体組成物を含む。梱包した試薬の使用のための指示も典型的には含まれる 質または抗ＮＡＮＢＶ抗体を含有する複合体の形成のシグナルを与え得るラベル または表示手段を更に含む。

ここで使用するように、「ラベル」および「表示手段」という用語は、それらな 蛋白質、方法および／またはシステムにより使用される限り、この発明の一部る ことができる。適切な蛍光ラベル化試薬には、蛍光色素、例えばフルオレセイン イソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオンアネート（ＦＩＴＣ）、 ５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）　、テ トラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＴＴＣ）、リサミン、ローダミ ン８２００スルホニルクロリド（ＲＢ２ｏｏＳＣ）、キレートランタニド結合（ 例えばＥｕ、Ｔｂ、Ｓｍ）等がある。免疫蛍光分析技術の記載は、デル力、ｒ免 疫蛍光分析」、ｒ道具としての抗体ｊ中、マル力ロニスら纒、ジョン・ライレイ ・アンド・ランズ社、第１８９〜２３１頁（＋９８２）に認めらへこれを参考に 一スオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等のような酵素とする。主要なラベ ルがＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼのような酵素であるような場合、抗体 は、２，２′−アジノージ−（３−エチルベンズチアプリン−６−スルホン酸） 同様に１用なのは、＋＋インジウム、３　Ｈ，ＩＩｓ、１４Ｃまたは８！Ｐのよ うなベーを使用することかできる。対合の例にはビオチン：アビジンがあり、こ の場合はビオチンがラベルであり、またペルオキシダーゼ：抗ペルオキシダーゼ （ＰＡＰ）かあり、この場合はペルオキシダーゼがラベルである。

ラベルの結合、すなわちポリペプチドおよび蛋白質のラベル化は当業界で周知で ある。例えば、ハイブリドーマにより生産された抗体分子は、培養培地の成分と して与えられたラジオアイソトープ含存アミノ酸の代謝的取込みによりラベルす ることができる。例えば、ガルフレら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、７３：３− ４６（１９８１）を参照することができる。活性化された官能基を介する蛋白質 接合または兵役の技術は特に適用可能である。例えば、アウラメアスら、５ｃａ ｎｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ！、第８巻補遺、７：７−２３　（１９７８Ｌｌ：ｌド ウエルら、Ｂｉｏｔｅｃｈ、３，８８９−８９４　（１９８４）および米国特許 第４．４９３．７９５号を参照することができる。

診断システムは、好ましくは別の梱包として、特異的結合剤を含むこともできる 。「特異的結合剤」は、試薬種に選択的に結合することのできる分子実体であり 、これは次いで本発明の生成物と反応することができるが、それ自体は本発明の 蛋白質発現生成物ではない。例示的な特異的結合剤は、抗体分子、例えば抗ヒ） １ｇＧまたは抗ヒトＩｇＭ、相補的蛋白質またはその断片、プロティンＡ等であ る。好ましくは特異的結合剤は、抗体が免疫複合体の部分として存在する場合、 検出すべき抗ＮＡＮＢＶ抗体に結合することができる。

好適な態様では、特異的結合剤はラベルするものとする。しかしながら、診断シ ステムがラベルされていない特異的結合剤を含む場合、その結合剤は典型的には 増幅手段または試薬として使用する。これらの態様では、増幅手段が試薬種含有 複合体に結合する場合に、ラベルした特異的結合剤は増幅手段に特異的に結合す ることができる。

本発明の診断キットは、血清、血漿または唾液のような体液サンプル中の抗体の 存在または量を検出するｒＥＬＩＳＡ」形式で使用することができる。ｒＥＬＩ ＳＡ」は、固相に結合した抗体または抗原およびサンプル中に存在する抗原また は抗体の量を検圧し定量する酵素−抗原または酵素−抗体接合物を用いる酵素連 関免疫吸着剤検定を指す。ＥＬＩＳＡ技術の記載は、１９８２年にランデ・メデ ィカル・パブリケーンヨンズ・才ブ・ロス・アルド人ＣＡにより刊行されたディ ・ピー・サイトらによる「基礎および臨床免疫学」の第４版の第２２章、および 米国特許第３，６５４．０９０号、第３．８５０．７５２号および第４．０１６ ．０４３号に認められ、これらを全て参考によりここに取入れる。

よって好適な！’１様では、本発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質、ポリペプチド、融 合蛋白質または抗ＮＡＮＢＶ抗体は、固体マトリックスに固定して対象診断シス テムに別個に梱包された固体支持体を形成することができる。

試薬は典型的には水性媒体からの吸着により固体マトリックスに固定するが、当 業者に周知の固定の他の様式を使用することかできる。

有用な固体マトリックスは当業界で周知である。この種の材料には、ファルマシ ア・ファイン・ケミカルズ（ビス力タウエイ、ＮＪ）から登録商標セフアゾ・ソ たはマイクロタイタブレートの穴、例えばポリスチレンまたはポリビニルクロリ 用して体のサンプル中のＮＡＮＢＶ核酸の存在を検定する診断システムを企図す れた試薬として、少なくとも１つの検定に十分な量の本発明のポリヌクレオチド ダイゼーシコン複合体の形成のシグナルを与えることのできるラベルまたは表示 融合蛋白質、抗ＮＡＮＢＶ抗体、ポリヌクレオチド、ラベルした特異的結合剤ま たは増幅試薬は、溶液中で、液体分散物としてまたは例えば凍結乾燥形態の実質 的に乾燥した粉末として提供することができる。表示手段が酵素である場合、酵 素の基質はシステムの別の梱包中に与えることもできる。前記したマイクロタイ タブレートのような固体支持体および１以上の緩衝液も、この診断検定システム 中の別個に梱包された要素として含むことができる。

診断システムに関してここに論じた梱包は、診断システムにおいて慣例的に利用 されるものである。この種の梱包はガラスおよびプラスチック（例えばポリエチ レン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）ボトル、バイアル、プラスチッ クおよびプラスチックホイル積層封筒等を含む。

２、診断方法 本発明は、この発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質、ポリペプチド、融合蛋白質または 抗ＮＡＮＢＶ構造抗原抗体を免疫化学試薬として使用してその量がサンプル中の 検出すべき材料の量に直接的または間接的に相関する免疫反応生成物を形成する 、体のサンプル中の抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗体またはＮＡＮＢＶ構造抗原の検 出に帰着する全ゆる診断方法を企図する。当業者であれば、この発明の免疫化学 試薬を使用してその量が体のサンプル中の特異的抗体または抗原の量に相関する 免疫反応生成物を形成し得る多数の周知の臨床診断化学手順があることを理解し よう。

競合的であれ非競合的であわへ種々の異種起源および同種起源の手順を、この− 発明の検定方法を実施するのに用いることができる。よって、例示的な方法をこ こに記載するが、この発明はこれに限定されるものではない。

患者中の抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白質の存在を検出するため、体のサンプル、好まし くは患者からの血液、血漿、血清または唾液のような体液サンプルを、ＮＡＮＢ Ｖ構造蛋白質のようなこの発明のＮＡＮＢＶ抗原性分子と、好ましくは本発明の ポリペプチドまたは融合蛋白質と、生物学的検定条件下で混合により接触させ、 免疫反応混合物を形成する。その後混合物を、ＮＡＮＢＶ抗原性分子−抗体分子 免疫反応生成物（免疫複合体）の形成を可能とするのに十分な時間期間の間維持 する。その後複合体の存在、および好ましくは量をここに記載するように検出す る。複合体の存在は、サンプル中の抗ＮＡＮＢＶ抗体を示すものである。

好適な態様では、ＮＡＮＢＶ抗原性分子と患者の抗体との間で形成された免疫反 応生成物の存在は、ここに論するような特異的結合試薬を使用することにより検 出する。例えば、免疫反応生成物を最初にラベルした特異的結合剤と混合してラ ベル化混合物を形成する。ラベルした特異的結合剤は、ここに記載するように特 異的結合剤およびラベルからなる。その後ラベル化混合物を、特異的結合に適合 する条件下で、存在する全ゆる免疫反応生成物がラベルした特異的結合剤と結合 してラベルした生成物を形成するのに十分な時間期間の間維持する。その後、形 成されるラベルした生成物の存在、および好ましくは量を検出し、免疫反応生成 物の存在または量を表示する。

好適な態様では、本発明の診断方法は、診断システムについてここで開示したよ うに、免疫複合体か固相で形成され検出される様式で実施する。

よって好適な診断方法では、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質またはポリペプチドを固体マ トリックスに固定して固相を形成する。特異的結合剤を、ＮＡＮＢＶ構造蛋白質 と固相で免疫複合する抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗体と複合することのできるプロ ティンＡまたは抗ヒトＴｇ、例えばＩｇＧまたはＩｇＭとするのが更に好適であ る。最も好適なのはラベルした特異的結合剤の使用であり、この場合ラベルは、 診断システムについて記載したように、または以下に示す参考により詳述される ように、放射能活性アイソトープ、酵素、ビオチンまたは蛍光マーカー、例えば ランタニドとする。

この固相のＢ様では、実施例７に記載するように融合蛋白質において態様を示す ように、配列番号：Ｉの残基夏〜残基２０、残基２１〜残基４０、残基２〜残基 ４０または残基夏〜残基７４に含まれるアミノ酸残基配列により特定される抗原 を含む組換え蛋白質を使用するのが特に好適である。

他の好適な診断方法では、この発明のＮＡＮＢＶ抗原性分子を前記したように固 体マトリックスに固定し、サンプルの希釈物と固体表面とを接触させ、未結合材 料を除去することにより、生物学的サンプルの希釈物を免疫複合工程に供する。

感染した個体からの生物学的サンプル中に存在する抗体の多価性（ＩｇＧについ て２価、ＩｇＭについて５価）のため、この混合物に対するこの発明のラベルし たＮＡＮＢＶ構造蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質の後続する添加は、こ の発明の固相ＮＡＮＢＶ抗原性分子と可溶性のラベルした分子との間の架橋とし て働Ｘサンプル抗原により同相に付着されることとなる。固相中のラベルの存在 は、サンプル中の特異的抗体の存在、および好ましくは量を示す。当業者であれ ば、希釈の範囲を決定し、これから固相中のラベルした抗原の濃度を決定するこ とかできる。生物学的サンプルおよびこの発明のラベルしたＮＡＮＢＶ抗原性分 子は、生物学的サンプルと固相とを接触させつつ予めまたは同時に混合すること かでき、２価または多価特異的抗体の架橋特性を利用することにより面相にて三 重分子複合体の形成を特徴とする特に有用なラベルとして、この発明のビオチニ ル化ＮＡＮＢＶ抗原性分子をラベルした抗原とすることかでき、酵素−ストレプ トアビジンまたは酵素−アビジン複合体、その後の適切な基質の添加によるその 後の検出を可能とする。西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファター ゼ、β−ガラクトシダーゼまたはウレアーゼのような酵素はしばしば使用され、 これらは、他のものも幾つかの適切な基質と共に市販されている。形成された複 合体の直接検出を可能とするマーカーを用いる好適なラベルには、放射能活性ア イソトープ、例えばヨウ素、またはユーロピウムのようなランタニドキレートが 包含される。

患者からの体のサンプル中のＮＡＮＢＶ構造抗原の存在を検出すべく設計された 他の態様では、サンプル（例えば血液、血漿、血清、尿または唾液）を、この発 明の抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗体と生物学的検定条件下で混合することにより接 触させ、免疫反応混合物を形成する。その後、この発明の抗体と複合したＮＡＮ ＢＶ構造抗原を含有する抗原−抗体免疫反応生成物の形成を可能とするのに十分 な時間期間の間混合物をｊｌ＃する。その後、複合体の存在および好ましくは量 を決定し、これにより体液サンプル中の抗原の存在を示すことができる。

好適な態様では、抗体は固相中に存在するものとする。更に好適には、形成され る免疫複合体の量を競合免疫検定形式により測定するものとし、その場合患者の 体液サンプル中の抗原がこの発明のラベルした組換え抗原に対し、同相抗体への 結合について競合するものとする。この方法は、体液サンプルを、（１）固定し たこの発明による抗体を育する固体支持体および（２）固相抗体と免疫反応する この発明のラベルしたＮＡＮＢＶ抗原性分子と混合し、液相および固相の両者を 育する競合免疫反応混合物を形成することからなる。その後、固相中でラベルし たＮＡＮＢＶ抗原性分子含有免疫反応生成物を形成するのに十分な時間期間の間 この混合物を維持する。その後、固相中に存在するラベルの量を決定し、これに より体液サンプル中のＮＡＮＢＶ構造抗原の量を示す。

酵素免疫検定技術は、同種起源または異種起源検定形式を使用する直接的または 競合的いずれの検定にせよ、当業界で広範に記載されている。例示的な技術は、 マギす、［酵素免疫検定Ｊ　、ＣＲＣブレス、クリーブランド、０Ｈ（１９８１ ）、およびチズセン、　「酵素免疫検定の実際と理論Ｊ１エルセビエル、アムス テルダム（１９８８）に認めることができる。

生物学的検定条件は、免疫反応混合物中でＮＡＮＢＶ抗原性分子および抗ＮＡＮ ＢＶ構造蛋白質の生物学的活性を維持するようなものである。これらの条件には 、約４°Ｃ〜約４５°Ｃ５好ましくは約３７°Ｃの温度範囲、約５〜９、好まし くは約７のｐＨ値範囲、および蒸留水〜約１モルの塩化ナトリウム、好ましくは 生理食塩水の範囲のイオン強度が包含される。この種の条件を至適化する方法は 当業界で周知である。

また企図するものは、ラベルを使用することなく免疫反応生成物形成を検出する ことのできる免疫学的検定である。この種の方法は［検出手段」を用いるもので あり、この手段は臨床診断化学でそれ自体周知であり、これらが特に新規なポリ ペプチド、方法およびシステムを利用する限り、この発明の一部を構成するもの である。例示的な検出手段には、バイオセンサとして知られる方法が包含さね、 表面の反射力の変化（表面プラズモン共鳴）、光ファイバによる表面消散波の吸 収の変化または表面音響波の伝達の変化を検出することに基くバイオ検知方法が 包含される。

他の態様では、時間分解蛍光分析（ＴＲ−ＦＩＡ）を用いる免疫反応生成物の検 出を企図し、この場合使用するラベルがＴＲ−ＦＩＡにより検出し得るシグナル を生成する。ＴＲ−ＦＩＡに適切な典型的なラベルは、ランタニドと芳香族β− ジケトンとにより形成されるランタニドキレートのような金属錯体剤であり、ラ ンタニドがＥＤＴＡアナログを介して抗原または抗体に結合するため、蛍光ラン タニド複合体が形成される。

時間分解蛍光分析の原理は、ソイニら、ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ、２５　：　３５ ３−３６１　（１９７９）により記載されており、免疫検定に広範に適用されて いる。

例えばハロネンら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０４：１３３−１４６（１９８５） 、スオンパら、Ｃ１１ｎｉｃ　Ｃｈｆｍｉｃａ　Ａｃｔａ、１４５：３４ｆ−３ ４８（１９８５）、ロブグレンら、Ｔａ１ａｎｔａ、３１　：　９０９−９１６ 　（１９８４）、米国特許第４，３７４，１２０号、４，５６９．７９０号、お よび公開された国際特許出願番号ＥＰＯ１３９６７５およびＷＯ３７１０２７０ ８を参照することができる。ＴＲ−Ｆ　ＩＡで使用するのに好適なランタニドは ユーロピウムである。

ＴＲ−ＦＩＡ技術を実施する試薬および系は、商業的供給元（ファルマシア・ダ イアグノスチクス、アブサラ、スウェーデン）から入手可能である。

特に好適なのは、典型的な「ウェスタンプロット」として行う、ここに実施例７ に記載した固相免疫検定である。

本診断方法は、ＮＡＮＢＶにより感染された種における抗ＮＡＮＢＶ抗体の出現 を検出するため他の別の方法と組合せて実施することができる。例えば、この発 明の組成物は、２つの抗原と免疫反応性の抗体種のいずれかまたは両者の存在を 決定する検定で、市販のＣ１００〜３抗原（オルト・ダイアグノスチクス社、ラ リタン、Ｎ、Ｊ、　）と共に使用することができる。

また本発明は、この発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ断片を使用して体のサ ンプル中のＮＡＮＢＶ核酸の存在を検出する核酸ハイブリダイゼーション方法の 使用も企図する。この方法は、一般にａ）体のサンプルとこの発明のポリヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオチドとを混合することにより水性ハイブリダイゼー ション混合物を形成し、ｂ）体のサンプル中に存在する全ゆるＮＡＮＢＶポリ核 酸が混合したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして ハイブリダイゼーション生成物を形成するのに十分な時間期間およびハイブリダ イズ条件の下で水性ハイブリダイゼーション混合物を維持し、Ｃ）形成される全 ゆるハイブリダイゼーション生成物の存在およびこれにより体のサンプル中のＮ ＡＮＢＶポリ核酸の存在を検出することからなる。

検出されるべきＮＡＮＢＶ核酸配列は、こ５二では標的核酸配列としでＳ゛及す る。

本方法でハイブリダイズされるべき標的核酸配列は、純度および濃度についてサ ンプルか核酸ハイブリダイゼーション反応と和合性の形態である限り、全ゆる核 酸含有サンプル中に存在するものとする、二とができる。ハイブリダイゼーシヨ ンに適切な程度に核酸を単離することは一般に公知であり、多様な手段によって 行うことかできる。例えば、体組織、例えば皮膚、筋肉、髪等、および体液、例 えば血液、血漿、尿、羊膜液、脳を髄液等を含む多様な核酸含有サンプルから核 酸を単離することができる。例えば、マニアティスら、ｒ分子クローン化：実験 室マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバ−・ライラリー（１９８２）、 およびアウスベルら、「分子生物学の現代の手順」、ジョン・ライレイ・アンド ・ソング（１９８７）を参照することができる。

ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブかサンプル中に存在する相 補的な核酸配列とハイブリダイズしてハイブリダイゼーション生成物、すなわち プローブおよび標的核酸を含む複合体を形成するのに十分な時間期間の間ハイブ リダイズ条件下に、ハイブリダイゼータ３ン反応混合物を企図する方法に」こり 維持する。

「ハイブリダイズ条件」という記載およびその文法」二の等傷物は、維持時間期 間と共に使用する場合、ポリヌク［オチドまたはオリゴヌクし・才子ドブローブ か標的配列とアニールして典型的には核酸デユーブレックスを形成するのに十分 な時間、温度およびｐＨ条件に、混合物中の反応体および随伴する試薬の濃度の 関係において、ハイプリダイ）！−ジョン反応混合物を供することを示す。−１ イブリダイゼーシヨンを行うのに必要なこのような時間、温度およびｐＨ条件は 、当寥界で周知のように、ハイブリダイズすべきポリヌクレオチドまたはオリゴ ヌクレすチドブローブの是さ、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドブリ ーブど標的との［ｊｌ！の相補性の程度、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌク１ ７オドのグアニジンおよびントシン含１１所望するハイブリダイゼーションの＠ 重性、およびハイブリダイゼータ９ンの動力学に影響を与え係るものとしてハイ ブリダイゼーション反応混合物中の塩または付加的な試薬の存在に依存する。与 えられたハイブリダイゼータ３ン反応混合物に対するハイブリダイゼータ３ン条 件を至適化する方法は当業界で周知である。。

典型的なハイブリダイズ条件には４〜９のｌ）Ｈ値に緩衝された溶液を使用する ことか包含さね、１８度Ｃ（１８°Ｃ）−７５°Ｃ１好ましくは約３７°Ｃ〜約 ６５℃、更イニ好ましくは約５４℃の温度で、０．５秒〜２４時間、好ましくは ２分の時間期間の間行う。

ハイブリダイゼーションは、周知のように同種起源または異種起源の形式で行う ことができる。同種起源ノゾブリダイゼーシコン反応は完全に溶液中で生起し、 この場合ポリヌクレオチドプローブおよびハイブリダイズすべき核酸配列（ｆ１ ！的）は溶液中に可溶性形態で存在する。異種起源反応は、ポリヌクレオチドプ ローブまたは標的核酸が結合した、反応媒体に不溶性のマトリックスの使用を含 む。例えば、検定すべき体のサンプルを固体マトリックスに固定し、その場での ハイブリダイゼーション（こ供する。二とができる。

その場でのハイブリダイゼーションは、典型的には通常は約Ｘ＝クロン〜約１０ ０ミクロン、好ましくは約１ミフロン〜約２５ミクロン、更に好ましくは約１ミ クロン−約１０ミクロンの範囲の厚さを有する組織の切片または断片の形態の体 の（ブンブル上で行う。この種のサンプルは、市販のクリオスタツトを使用して 調製する、二とができる。

また、広範に使用されＺ）異種起源形式はサザンブロソト手順で２二）す、この 場合は制限酵素消化の後にゲノムＤＮＡを電気泳動し、電気３泳動したＤＮＡ断 片を最初に変性させた後、不溶性−７）リックス」−に移１゜プロット手順では 、その後相補的核酸（標的）配列を含む固定化ゲノ１、核酸に対１７てポリヌク １．・オチドまたはオリゴヌク１７オヂドをハイブリダイズさせる３、また更に 、広範に使用される異種起源形式はライブラリー・検索手順であり、こローン化 核酸のライブラリーを形成する。その後ブｒｌｌ−ｄ・したライブラリーをポリ ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドブリーブとハイブリダイズし、意図すす る固体７１−リソクスとして、ガラススライド、ニトロセルロースシート等の使 用か包含される。

また好適なのは、ｃＤＮＡを形成するための単離されたｍＲＮＡの逆転写、ジブ オキソ配列決定およびポリヌク１７オチドまたはオリゴヌクレオチドハイプリダ イゼーンヨンを最初の工程とするプライマ延長反応を使用する他の手順について 行われるような同種起源ハイブリダイゼーション反応である。特に好適なのは、 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して特異的核酸配列を増幅する同種起源ハ イブリダイゼーション反応である。

標的配列を含有する核酸か二本Ｍ（ｄｓ）形態である場合、ハイブリダイゼーシ ョン反応を行う前に加熱またはアルカリ処理により最初にｄｓＤＮＡを変性させ るのか好適である。ｄｓＤＮＡの変性は、ハイブリダイズするポリヌクレオチド またはオリゴヌクレオチドとの混合の前に行うことができ、またはｄｓＤＮＡと ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとの混合の後に行うことができる。

ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド自体か二本鎖分子として与えられる 場合、これもハイブリダイゼーション反応混合物中での混合の前に変性させるこ とができ、またはこれと共に標的含有ｄｓＤＮＡを同時に変性させることができ る。

特異的標的核酸配列を検出する方法は、最初に前記したハイブリダイゼーション 反応を行ってハイブリダイゼーション生成物を形成し、その後形成されたハイブ リダイゼーション生成物の存在を検出し、これにより核酸含有サンプル中の特異 的核酸配列の存在を検出することによって実施する。

核酸含有サンプルは体組織または体液とすることができ、ハイブリダイゼーショ ン反応混合物について前記したように調製することができる。

ハイブリダイゼーション反応で形成されたハイブリダイゼーション生成物の検出 は、種々の手段で行うことができる。ハイブリダイゼータ３ン生成物の検出につ いて好適な態様をここに開示するが、当業者に容易に明らかとなる他の周知の検 出手段が、この度企図する方法および随伴する診断システムでの使用に適切であ ることを理解すべきである。

特異的核酸配列の存在を検出するだめの１つのアプローチでは、ポリヌクレオチ ドまたはオリゴヌクレオチドプローブは、プローブが検出し得るものとして存在 するハイブリダイゼーション生成物を与え得るラベルまたは表示群を含む。典型 的には、この種のラベルは放射能活性原子、化学的に修飾されたヌクレオチド塩 基等を含む。

ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブに機能的に連結されるか一 部として存在する放射能活性元素は、ハイブリダイゼーション生成物の検出を促 進する有用な手段を与える。典型的な放射能活性元素は、β線放射を与えるもの である。′Ｈ１＋４ｃ：、、Ｕｐおよび■Ｓのようなβ線を放射する元素は、β 線放射生成放射能活性元素ラベルの種類を代表する。放射能活性ポリヌクレオチ ドまたはすリゴヌクレオチドブローブは、典型的にはＤＮＡポリメラーゼを使用 する核酸への放射能活性ラベルヌクレオチドの酵素的取込みにより調製し、その 後ラベルした核酸を変性し、放射能ラベルしたポリヌクレオチドまたはオリゴヌ クレオチドプローブを形成する。

放射能によりラベルしたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブの 代替物は、化学的に修飾して金属複合剤、ビオチン含有群、蛍光化合物等を含む ものとしたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。

１つの有用な金ｉ＊ｉ合剤は、ランタニドおよび芳香族β−ジケトンにより形成 されるランタニドキレートであり、ランタニドは、ＥＤＴＡアナログのようなキ レート形成化合物を介して核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに 結合し、これにより蛍光ランタニド複合体が形成される。米国特許第４．３７４ ．１２０号および第４，５６９．７９０号並びに公開された特許出願番号ＥＰ０ １３９６７５および番号ＷＯ３７１０２７０８を参照することができる。

ビオチンまたはアクリジンエステルラベル化オリゴヌクレオチド、およびこれら のポリヌクレオチドにおける使用は既に記載されている。米国特許第４．７０７ ．４０４号、公開された特許出願ＥＰＯ２１２９５１およびヨーロッパ特許第０ ０８７６３６号を参照することができる。有用な蛍光マーカー化合物には、フル オレセイン、ローダミン、テキサス・レッド、ＮＢＤ等が包含される。

ハイブリダイゼーション生成物中に存在するラベルしたヌクレオチドにより、・ Ａイブリダイゼーション生成物自体がラベルさ托したがって検定すべきサンブル 中に存在する他の核酸と区別し得るものとなる。ハイブリダイゼーション生成物 中のラベルの存在、およびこれによるハイブリダイゼーション生成物の存在の検 出は、典型的にはハイブリダイゼーション生成物にハイブリダイズされていない 全ゆるラベルしたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブからハイ ブリダイゼーション生成物を分離することを含む。

−重鎖ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えば未ハイブリダイゼー ションラベル化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブをハイブリ ダイズした生成物から分離する技術は周知であり、典型的にはそれらの化学的性 質に基いて非−重鎖核酸から一本鎖を分離することを含む。更に多くの場合、分 離技術には、典型的には洗浄により固体マトリックスに結合したハイブリダイゼ ーション生成物から未ハイブリダイズプローブを分離する異種起源ハイブリダイ ゼータ３ン形式を使用することを含む。例はサザンプロット技術であり、この場 合はマトリックスをニトロセルロースシートとし、ラベルを”Ｐとする。サザン 、Ｊ、Ｍｏ１．８ｊｏ１．９８：５０３　（１９７５）。

他の態様では、ハイブリダイゼーション生成物検出工程は、増幅された核酸生成 物を検出することからなる。増幅された核酸生成物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）として言及される当業界で周知の増幅方法の生成物である。

特異的核酸配列を増幅する方法およびシステムは、共にムリスらに対する米国特 許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、およびｒＰＣＲ技術 」、エルリチ纒、ストックトン・プレス（１９８９）中の教示、ファロナら、Ｍ ｔｈ。

ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、＋５５＋３３５−５０　（１９８７）および「ポ リメラーゼ連鎖反応」、エルリチら編、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ ラトリイズ・プレス（１９８９）に記載されている。

実施例 以下の実施例は説明の目的のためにのみ示すものであり、如何なる様式において もこの発明の範囲を限定するものではない。

実施例１１組換えＤＮＡ分子の製造 Ａ、ＮＡＮＢＶクローンの単離と配列分析ＮＡＮＢＶウィルス粒子の供給源とし て、急性相ＮＡＮＢＩ（を示すハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｊｎｓｏｎ）（ハツチ ）株により感染されたチンパンジーから血液を集めた。遠心分離およびろ過によ り血漿を清浄化した。その後プロティンＧセファロースに結合させたＨＡＮＢＶ 　ＩｇＧ　（ハツチ株）のカラム上での免疫アフィニティクロマトグラフィによ り、清浄化した血漿からＮＡＮＢＶウィルス粒子を単離した。グアニジウムチオ シアネート中に浸漬することによりＮＡＮＢＶ　ＲＮＡをセファロースビーズか ら溶出し、その後溶出したＲＮＡを塩化セシウム（ＣｓＣＩ）緩衝剤を介して濃 縮した。サムブロックら、　「分子クローン化：実験室マニュアル」、サムブロ ックら編、第２版、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ・プレス、 ＮＹ（１９８９）。

ピコグラム量の精製したＮＡＮＢＶ　ＲＮＡを、ランダムおよびオリゴｄＴプラ イマ、ｄＮＴＰおよび逆転写酵素を含有するプライマ延長反応混合物中で鋳型と して使用し、第１の鎖のｃＤＮＡを形成した。得られた第１の鎖のｃＤＮＡを、 ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡ５ｅＨを含有する反応混合物中で第２の鎖の ｃＤＮＡの合成のための鋳型として使用し、二本＠（ｄｓ）ｃＤＮＡを形成した （サムブロックら、前記）。非対称合成プライマーアダプタ系を使用して合成し たｄｓｃＤＮＡを増幅したが、その際、センスおよびアンチセンスプライマを互 いにアニールさせ、平滑末端条件下でＴ４リガーゼを用いて二本ｊｌｌＮＡＮＢ ＶｃＤＮＡの末端に連結し、ｃＤＮＡ−アダプタ分子を形成した。ｃＤＮＡ−ア ダプタ分子と、同じ陽性センスアダプタプライマ、ｄＮＴＰおよびＴＡＱポリメ ラーゼ（プロメガ・バイオチク、マジソン、ＷＴ）とを混合することにより、後 記するようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行い、増幅されたＮＡＮＢ ＶｃＤＮＡをｍ製した。その後得られた増幅したＮＡＮＢＶｃＤＮＡ配列を、特 異的ＮＡＮＢＶオリゴヌクレオチドプライマを用いるＰＣＲ反応での後続する増 幅のための鋳型として使用した。

Ｃ型肝炎の５′配列に対応するようオリゴヌクレオチドを選択した（ＨＣＪＩ配 列：才力モトら、Ｊａｐ、Ｊ、ＥＸＰ、Ｍｅｄ、６０　：１６７−１７７．１９ ９０）。

選択したオリゴヌクレオチドを製造業者の指示に従いファルマシア・ジーン・ア ッセンブラにより合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製したが、 表１に示すように、ヌクレオチド塩基配列および１５で始まり２３で終る連続配 列番号を有している。

表１ 合成オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチド　推定ＮＡＮＢＶ領域　オリゴヌクレオチド　配　列名体８ 　配列　番号 ６９０（＋）　カプシド１−２１　ＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＴｒＣＣＣＡＡＡＣＣ Ｔ　１５６９３（＋）　カプシド１４６−＋６２　ＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴｒＣＣ ＧＡＧＣ１６６９４（−）　カプシド２０８−２２４　ＧＴＣＣＴＧＣＣＣＴＣ ＧＧＧＣＣＧ　Ｉ　７６９１（−）　カプシド３４０−３５９　ＡＣＣＣＡＡＡ Ｉ↑χαｔＡｃｃＴＡｃＧ　１８１４　（＋）　エンベロープ３５６−３７４　 ＴＧＧＧＴＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＣ１９＋５　（＋）　エンベロープ３６ １−３７７　ＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣＣＴ　２０１８　（−）　エンベ ローフ”５１２−５２９　ＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＭＣ２１１Ｓ（−） 　工：ｚベロープ９６０−９８１　ＧＧＡＣＣＡＧＴｒＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴ ＡＴ　２２＋７　（−）　エンベロープ９５７−９７６　ＣＡＧＴｒＣＡＴＣＡ ＴＣＡＴＡＴＣＣＣＡ　２３８オリゴヌクレオチドは番号により特定し、センス およびアンチセンスコード鎖に対応する配列を示すその極性を（十）および（− ）としてそれぞれ示す。全ての配列は５′〜３′の方向性で列記する。

（３）ＮＡＮＢＶＣＤＮＡ（７）ＰＣＲ増輻実施例ＩＡ　（１）で調製したプラ イマ適合増幅ｃＤＮＡ配列とプライマとしての合成オリゴヌクレオチド６９０お よび６９４（プライマ対６９０：６９４）とを混合することによりＰＣＲ増幅を 行った。得られたＰＣＲ反応混合物は、プライマ適合増幅ｃＤＮＡ鋳型、オリゴ ヌクレオチド６９０および６９４、ｄＮＴＰ。

塩（ＫＣＩおよびＭｇＣ１ｔ）およびＴＡＱポリメラーゼを含有していた。ｃＤ ＮＡｃ）ＰＣＲ増幅は、３７°Ｃのアニール温度で３０サイクル混合物を維持す ることにより行った。最初の回の増幅からのサンプルの画分を、５５°Ｃのアニ ール温度で３０サイクル類似する条件下で再増幅した。

（４）ＰＣＲ増輻ｄｓＤＮＡを含むベクタの調製ＰＣＲ増幅の２回目の画分を５ ％アクリルアミドゲル上での電気泳動に供した。

ＰＣＲ反応生成物の分離の後、約２２４ｂｐの予想される６９０：６９４増幅生 成物に対応するＤＮＡ断片を含有するゲルの領域を切出し、標準的な電気溶出技 術（サムブロックら、前記）に従って精製した。精製した断片をキテーゼ処理し 、Ｓｍａｌポリリンカ部位にてｐＵｃ１８プラスミドクローン化ベクタにクロー ン化し、ｐＵｃ１８に機能的に連結されたＤＮＡ断片６９０：６９４を含むプラ スミドを形成した。

ｐＵＣｌ　Ｂおよび６９０：６９４配列に対応する断片を含有する得られた混合 物を、その後イー・コリ株ＪＭ８３に形質転換した。アンピシリンを含むＸ−ｇ ａ１培地上で、挿入物を含むプラスミドをＩａｃ−（白色）コロニーとして同定 した。６９０：６９４ＤＮＡ断片を含むｐＵｃ１８プラスミドを、制限酵素分析 およびその後のアガロースゲル上での電気泳動により同定し、ｐＵＣ１８６９０ ：６９４ｒＤＮＡ分子とした。

６９０：６９４ＤＮＡ断片（ｐＵＣｌ８　６９０：６９４）を有するｐＵｃ１８ ベクタを含むと考えられる２つの独立したコロニーを増幅し、標準的な手順（サ ムブロックら、前記）によるＣｓＣ１密度勾配遠心によりプラスミドＤＮＡを調 製するのに使用した。ｐＵＣ１８特異的プライマを用いるｓｓＳジデオキシ手順 を使用してプラスミドを配列決定した。両者のＤＮＡＮ玉鎖上つのプラスミドを 独立に配列決定し、配列決定の正確性を確保した。得られた配列情報を、配列Ｉ Ｄ番号ｌの塩基１〜塩基２２４として示す。

プラスミドｐＵ０１８　６９０：６９４は２２４ｂｐの長さのＮＡＮＢＶ　ＤＮ Ａ断片を含み、ＨＣＪＩプロトタイプ配列と比較した場合、推定されるカプシド 蛋白質のアミノ末端領域において２つのヌクレオチド置換および１つのアミノ酸 残基の差異が明らかである。

（６）ゲノムの５′末端からのＮＡＮＢＶクローンの調製カプシド領域の残余を コードするＮＡＮＢＶハツチゲノムの配列を得るため（才力モトら、前記）、オ リゴヌクレオチド６９３および６９１（表１に記載）をＰＣＲ反応で使用した。

ハツチからのウィルスＮＡＮＢＶ　ＲＮＡへ実施例１Ａ（］）に記載したように ｃＤＮＡをｌｌＩ製し、オリゴヌクレオチド対６９３：６９１を用いて実施例Ｉ Ａ　（３）に記載したようにＰＣＲ増幅で使用した。得られたＰＣＲ増輻ｄｓＤ ＮＡを、その後ｐＵｃ１８クローン化ベクタにクローン化し、実施例ＩＡ（４） に記載したように挿入物を検索し、ｐＵｃ１８　６９３：６９１を形成した。そ の後実施例ＩＡ　（５）に記載したようにｐＵｃ１８特異的プライマを用いてク ローンを配列決定した。

プラスミドｐＵｃ１８　６９３：６９１は、ｌ　５７ｂｐの長さで、配列ＩＤ番 号１のヌクレオチド塩基２０３〜３６０に渡るＮＡＮＢＶ　ＤＮＡ断片を含む。

この断片は、断片を生成するのに使用した６９３プライマの配列までは伸長して いない。この断片の配列は、ＨＣＪＩの公知の配列と比較した場合に３つのヌク レオチドの差異が明らかであり、ＨＣＪＩ配列に対して対応するアミノ酸変化を 全く存していない。

推定されるエンベロープ領域（才力モトら、前記）をコードするＮＡＮＢＶハツ チゲノムの配列を得るため、オリゴヌクレオチドプライマ１４〜１８（ｍｌに記 載）を、ＮＡＮＢＶハツチＲハツザンブルとの種々の組合せにおいて使用した。

ＮＡＮＢＶ　ＲＮＡの供給源として、４週間の後接種でハツチ株を接種し急性感 染を示すチンパンジーからの肝臓生検標本を使用した。生検したサンプルを最初 に凍結し、その後粉砕した。得られた粉末を、ＲＮＡの抽出のためにグアニジン イソチオシアネートにより処理した。ＳＤＳの存在下に６５℃で、フェノールに よりグアニジウム処理肝臓サンプルからＲＮＡを抽出した。肝臓サンプルを２回 抽出し、その後クロロホルムで抽出した。イソプロパツールおよび酢酸ナトリウ ムを用い、抽出１７たＲＮＡを一２０℃で沈殿させた。

オリゴヌクレオチド１Ｂおよび１６を用いるプライマ延長反応で、精製した肝臓 から誘導したＲＮＡを鋳型として使用し、ＮＡＮＢＶ特異的ｃＤＮＡを生成した 。ハツチ株アミン末端蛋白質フード配列ｊ：対するｃＤＮＡを調製するため、ｄ ＮＴＰおよび逆転写酵素の存在下に４２°Ｃで、アンチセンスオリゴヌクレオチ ド応生成物と別個の対のオリゴヌクレオチド１４：１６（１６プライムされたｅ Ｄ２回目の増幅のための鋳型として使用し、その際それぞれオリゴヌクレオチド 対１５８１７および１５：１８をプライマとして使用した。

それぞれのプライマ対反応からのＰＣＲ反応生成物を、低融点アガロースゲルニ ー断片およびキナーゼにより別々に処理し、ｐブルースクリプトプラスミドベう に制限酵素分析により、形質転換されたイー・コリＤＨ５コロニーをプラスミス ミド中に存在するＤＮＡ断片を、実施例ＩＡ（５）に記載したようにそれぞれ配 列決定した。

＋５：１７ＤＮＡ断片は、配列番号：ｌのヌクレオチド３６１〜９７８に含まれ る。１５：１８ＤＮＡ断片の配列も、配列番号：１のヌクレオチド３６１〜５２ ９に与えられる。２つのクローンは、１５：１８ＤＮＡ断片の１６８ｂｐにより 重複する。

配列決定結果は、ＨＣ，月間列（才力モトら、前記）と比較した場合、１５６９ ０：６９４ＤＮＡ断片のプラスミドを形成した。

ミドを同定した。定常期の細菌培養物をアルカリ溶解手順に供し、粗ｖＤＮＡ！ ［がｐＧＥＸ−３Ｘ内にはない単一のＸｈｏ１部位を使用し、６９０：６９４Ｄ ＮＡ断片を含むベクタを検索した。

幾つかの６９０：６９４ＤＮＡ断片含有ベクタを増幅し、得られた増幅ベクタＤ ＮＡ’ｆ：Ｃｓ　Ｃｌ密度勾配遠心により精製した。配列ＩＤ番号２に含まれる ヌクレオチド位ｆｔ８１４〜６３３でｐＧＥＸ−３Ｘ配列にハイブリダイズする ブライを有する６９０・６９４ＤＮＡ断片を含むベクタをこのようにして同定し て選択を用いる消化により、ＮＡＮＢＶポリペプチドをＧＳＴキャリヤから開裂 するこれる蛋白賀生成物は、ＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ６９０　：　６９４融合蛋白質 およびＣＡｐＧＥＸ−３Ｘ−６９３＋　６９１　：実施例ＩＡ　（６）でｉＥＩ 製したプラスミドｐＵＣＩ８　６９３：６９１を実施例ＩＢ（１）で行ったよう にＥｃｏＲｒおよびＢａｍＨＩによる制限酵素消化に最初に供することにより、 プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ−６９３：６９１を形成した。配列番号：１の塩基２ ０５〜塩基３６０に含まれる配列を有する得られた遊離のＤＮＡ断片を、実施例 ＩＢ（１）で行ったように精製した。精製したＤＮＡ断片と、Ｔ４リガーゼの存 在下でＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより１６°Ｃで制限酵素消化によって線状 化したｐＧＥＸ−３Ｘベクタとを混合して連結し、プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ− ６９３：　６９１を形成した。

粗製ｃＤＮＡ調製物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより消化して６９３：６９ １挿入物を遊離させる以外は実施例ＩＢ（２）で行ったように、６９３：６９１ ＤＮＡ断片を含むｐＧＥＸ−３Ｘプラスミドを選択により同定した。ＮＡＮＢＶ 構造蛋白質のフレーム内翻訳の正確なコード配列を有する６９３：６９１ＤＮＡ 断片を含むｐＧＥＸ−３Ｘベクタを、実施例ＩＢ（２）で行ったように配列分析 により同定して選択し、ｐＧＥＸ−３Ｘ−６９３：　６９１を形成した。

得られたベクタは融合蛋白質（ＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ　６９３：６９１）をコード し、これは配列番号：２に含まれるＧＳＴの残基１〜２２１に対応するアミン末 端ポリペプチド部分、残基２２２〜２２５に対応しプロテアーゼ因子Ｘａの開裂 部位を特定する中間ポリペプチド部分、それぞれヌクレオチド塩基配列（配列番 号：２４）： ＧＧＧ　ＡＴＧ　ＣＣＣＡＡＴ　ＴＣＡによりコードされるアミノ酸残基配列（ 配列番号：２５）二Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒよりなる残基２２ ６〜２３０に対応するｉルカ蛋白質、配列番号＝１のアミノ酸残基配列６９〜１ ２０を有するＮＡＮＢＶカプシド抗原を特定する残基２３１〜２８企に対応する カルボキシ末端ポリペプチド部分、およびそれぞれヌクレオチド塩基配列（配列 番号＋２６）： ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＴＧＡ によりコードされるアミノ酸残基配列（配列番号：２７）：Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓ ｅｒ　ＥＮＤ よりなる残基２８３〜２８７に対応するカルボキシ末端リンカ部分により構成さ れる。

ｐＧＥＸ−３Ｘ−１５：Ｉ８　：実施例ＩＡ　（６）で調製したプラスミドブル ースクリプト１５：１８をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩによる制限酵素消化に最 初に供することによりプラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ−１５：１８を形成し、Ｂａｍ Ｈ■付着末端を実施例ＩＢ（１）で行ったように埋めた。配列番号＝１の塩基３ ６１〜塩基５２８を含む配列を有する得られた遊離のＤＮＡ断片を、実施例ＩＢ （１）で行ったように精製した。実施例ＩＢ（＋）で行ったようにＳｍａＩによ る制限酵素消化によって線状化したｐＧＥＸ−３Ｘｌ：？ｔＪ製したＤＮＡ断片 を混合して連結し、プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ−１５：１８を形成した。

１５：１８ＤＮＡ断片を含むｐＧＥＸ−３Ｘプラスミドを実施例＋Ｂ（２）で行 ったように選択により同定し、粗製ＤＮＡｌ１製物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断して１５：１８挿入物を遊離させた。ＮＡＮＢＶ構造蛋白質のフレーム 内翻訳の正確なコード配列を有する１５：１８ＤＮＡ断片を含むｐＧＥＸ−３Ｘ ベクタを実施例ＩＢ（２）で行ったように同定して選択し、ｐＧＥＸ−３Ｘ−１ ５：１８を形成した。

得られたベクタは融合蛋白質（ＧＳＴ：ＮＡＮＢＶｌ　５　：　１８）をコード し、これはＧＳＴの残基１〜２２１に対応するアミノ末端ポリペプチド部分、残 基２２２〜２２５に対応しプロテアーゼ因子Ｘａの開裂部位を特定する中間ポリ ペプチド部分、それぞれヌクレオチド塩基配列（配列番号＋２８）：ＧＧＧ　Ａ ＴＣＣＣＣＡＴＣＧＭ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＣＣによりコードされるアミ ノ酸残基配列（配列番号：２９）＋Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　 Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

よりなる残基２２６〜２３４に対応するリンカ蛋白質、配列番号：ｌのアミノ酸 残基配列１２１−１７６を有するＮＡＮＢＶエンベロープ抗原を特定する残基２ ３５〜２９０に対応するカルボキシ末端ポリペプチド部分、およびそれぞれヌク レオチド塩基配列（配列番号：３０）：ＴＧＧ　ＧＧＧ　ＡＴＣＧＧＧ　ＭＴ　 ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＴＧＡによりコードされるアミノ酸残基配列（配列番号：３１ ）：Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　［ｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＥＮＤよりな る残基２９１〜２９８に対応するカルボキシ末端リンカ部分により構成される。

に供することによりプラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ−１５：　１７を形成し、付着末 端を実施例ＩＢ（＋）で行ったように埋めた。配列番号：１の塩基３６１〜塩基 ９７８を含む配列を存する得られた遊離のＤＮＡ断片を、実施例ＩＢ　（１）で 行ったようにｆｆ１ｌ！した。実施例ＩＢ（１）で行ったようにＳｍａｒによる 制限酵素消化によって線状化したｐＧＥＸ−３Ｘに精製したＤＮＡ断片を混合し て連結し、プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ−１５：Ｉ７を形成した。

１５：ｌ７ＤＮＡ断片を含むｐＧＥＸ−３Ｘプラスミドを実施例ＩＢ（２）で行 ったように選択により同定し、ＤＮＡ１ｉ製物を前記示したようにＥｃｏＲＩお よびＢａｍＨＩで消化した。ＮＡＮＢＶ構造蛋白質のフレーム内翻訳の正確なコ ード配列を有する１５：１７ＤＮＡ断片を含むｐＧＥＸ−３Ｘベクタを実施例よ り（２）で行ったように同定して選択し、ｐＧＥＸ−３Ｘ−１５：１７を形成し た。

得られたベクタは融合蛋白質（ＧＳＴ：ＮＡＮＢＶｌ　５　：　１７）をコード し、これはＧＳＴの残基ｌ〜２２１に対応するアミノ末端ポリペプチド部分、残 基２２２〜２２５に対応しプロテアーゼ因子Ｘａの開裂部位を特定する中間ポリ ペプチド部分、それぞれヌクレオチド塩基配列（配列番号：３２）：ＧＧＧ　Ａ ＴＣＣＣＣＡＡＴ　ＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴによりコードされるアミノ酸残基 配列（配列番号＋３３）：Ｇｌｙ　ＩＩｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　 Ｓｅｒ　Ｐｒ。

よりなる残基２２６〜２３３に対応するリンカ蛋白質、配列番号：ｌのアミノ酸 残基配列１２１〜３２６を育するＮＡＮＢＶエンベロープ抗原を特定する残基２ ３４〜４３９に対応するカルボキシ末端ポリペプチド部分、およびそれぞれヌク レオチド塩基配列（配列番号：３４）：ＧＧＧ　ＡＴＣＧＧＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ 　ＴＣＧ　ＴＧＡによりコードされるアミノ酸残基配列（配列番号：３５）：Ｇ ｌｙ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＥＮＤよりなる残基４４０〜 ４４６に対応するカルボキシ末端リンカ部分により構成される。

■付着末端を実施例ＩＢ（１）で行ったように埋めた。配列ＩＤ番号ｌの塩基３ ６１〜塩基９７８を含む配列を有する得られた遊離のＤＮＡ断片を、実施例１Ｂ 　（］）で行ったように精製した。実施例ＩＢ（１）で行ったようにＳｍａｌに よる制限酵素消化によって線状化したｐＧＥＸ−２Ｔベクタ（ファルマシア社） に精製したＤＮＡ断片を混合して連結し、プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−１５：１ ７を形成した。

＋　５　二Ｉ　７ＤＮＡｒｒｆｒ片を含むｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドを実施例Ｉ Ｂ（２）で例ＩＢ（２）で行ったように同定して選択し、ｐＧＥＸ−２７−１５ ：　Ｉ　７を形これはＧＳＴの残基ｌ〜２２１に対応するアミノ末端ポリペプチ ド部分、残基２２２〜２２６に対応しそれぞれヌクレオチド塩基配列（配列番号 ：３６）：ＧＴｒ　ＣＣＧ　ＣＧＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣによりコードされるアミノ 酸残基配列（配列番号：３７）：Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒより なるプロテアーゼトロンビンの開裂部位を特定する中間ポリペプチド部分、それ ぞれヌクレオチド塩基配列（配列番号＋３８）：ＣＣＡ　ＴＣＧ　ＭＴ　ＴＣＣ ＴＧＣＡＧＣＣＣＴによりコードされるアミノ酸残基配列（配列番号、３９）Ｐ ｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

よりなる残基２２７〜２３３に対応するリンカ蛋白質、ＮＡＮＢＶエン・ベロー ブ抗原を特定する残基２３４〜４３９に対応するカルレボキシ末端ボＩＪペプチ ド部分、およびそれぞれヌクレオチド塩基配列（配列番号：４０）：ＧＧＡ　Ａ Ｔｒ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＧＡＣＴＧＡによりコードされるアミノ酸残基配列（配 列番号：４１）：Ｇｌｙ　［ｌｅ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　ＥＮＤよりなる残 基４４０〜４４６に対応するカルボキシ末端１ノン力部分（こより構成される。

（６）で行ったように、オリゴヌクレオチド６９０：６９１をＰＣＲ反応で使用 した。得られたＰＣＲ増幅ｄｓＤＮＡを実施例ＩＡ　（４）ｉこ記載したよう（ こｐＵＣ１８クローン化ベクタにその後クローン化し、ｐＵｃ１８　６９０：６ ９１を形成した。実施例ＩＡ（５）に記載したようにｐＵＣｌ　８プライマ（二 よりクローンをその後配列決定し、完全な配列を含むプラスミドを同定しｔ二。

得らｔ１７′こ同定したプラスミドを選択し、ｐＵｃ１８　６９０：６９１とし ｔこカ（、長さにして３６１ｂｐで配列番号：１のヌクレオチド１〜３６０１： ：渡るＮＡＮＢＶ　ＤＮＡ断片を含有するものである。

プラスミドｐＵｃ１８　６９０：６９１を実施例ＩＢ（１）で行つｆ、Ｚ　Ｊ： うにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる制限酵素消化に最初（こ供すること（二 よりプラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ−４９０：　６９１を形成した。ｐｔｒｃｔｓボ Ｉ〕１ノンカ配グｊを備え配列番号：１の塩基１−・−塩基３６０を含む配列を 有するｉ等られた遊離のＤＮＡ断片を、実施例ＩＢ　（＋）で行ったように精製 した。実施例ＩＢ（１）で行ったようにＳｍａＩによる制限酵素消化によって線 状化しｔこｐＧＥＸ−３Ｘベクタにｒｔ製したＤＮＡ断片を混合して連結し、プ ラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ−６９ｏ　：６９１を形成した。

６９０：６９１ＤＮＡ断片を含むｐＧＥＸ−３Ｘプラスミドを実施例ＩＢ（２） で行ったように選択により同定した。ＮＡＮＢＶ構造蛋白質のフレーム内翻訳の 正確なコード配列を有する６９０：６９１ＤＮＡ断片を含むｐＧＥＸ−３Ｘベク タを実施例ＩＢ（２）で行ったように同定して選択し、ｐＧＥＸ−３Ｘ−６９０ ：６９１を形成した。

得られたべ’）９は融合蛋白質（ＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ６９０　：　６９１）をコ ードし、これはＧＳＴの残基ｌ〜２２１に対応するアミノ末端ポリペプチド部分 、残基２２２〜２２５に対応しプロテアーゼ因子Ｘａの開裂部位を特定する中間 ポＩＪペプチド部分、それぞれヌクレオチド塩基配列（配列番号：４２）：ＧＧ Ｇ　ＡＴＣＣＣＣＡＡＴ　ＴＣＧ　ＡＧＣＴＣＧ　ＧＴＡ　ＣＣＣによりコード されるアミノ酸残基配列（配列番号：４３）：Ｇｌｙ　ｌｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ 　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

よりなる残基２２６〜２３４に対応するリンカ蛋白質、ＮＡＮＢＶカプシド抗原 を特定する残基２３５〜３５５に対応するカルボキシ末端ポＩＪペプチド部分、 およびそれぞれヌクレオチド塩基配列（配列番号：４４）：ＡＣＧ　ＧＧＧ　Ａ ＴＣＧＧＧ　ＭＴ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＴＧＡによりコードされるアミノ酸残基配 列（配列番号：４５）：Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　［ｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓ ｅｒ　ＥＮＤよりなる残基３５６〜３６３に対応するカルボキシ末端ｌルカ部分 （こより構成される。

２０（−）を、それぞれ配列番号ニアおよび配列番号二８（二対応するヌクレオ チド塩基配列を有するものとして、実施例ＩＡ　（２）に記載したように調製１ ．六二。

オリゴヌクレオチド１−２０（＋）および１−２０（−）を、ＥｅｏＲＩおよび ＢａｍＨＩにより予め予備消化した発現ベクタｐＧＥＸ−２Ｔ　（ファルマシア ）と等量で混合し、アニール条件下で維持して、相補的オリゴヌクレオチドのハ イブリダイゼーションを可能とし、得られる二本鎖（ｄｓ）ｔリボヌクレオチド 生成物の付着末端がＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ付着末端でｐＧＥＸ−２Ｔｆこ ノ）イブリダイズするのを可能とした。連結の後、ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ａ とした得られたプラスミドは、単一コピーのｄｓオリゴヌクレオチド生成物、お よび配列番号、３の残基ｌ〜残基２５２に示すアミノ酸残基配列を有するＣＡＰ −Ａとした融合蛋白質をコードする構造遺伝子を含むものである。

得られる融合蛋白質が部位特異的プロテアーゼトロンビンを用（する消化１；よ り開裂性である以外は、ｐＧＥＸ−２７ベクタは前記したｐＧＥＸ−３Ｘベクタ 番二類似する。

２ｌ−４０（−）を、それぞれ配列番号：９および配列番号：１０ｆこ対応する ヌクレオチド塩基配列を有するものとして、実施例ＩＡ　（２）＋こ記載したよ うに調製した。

オリゴヌクレオチド２ｌ−４０（十）および２ｌ−４０（−）を、ＥｃｏＲＩお よびＢａｍＨＩにより予め予備消化したｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクタと等量で混合 し、アニール条件下で維持して、相補的オリゴヌクレオチドの７１イブ１ノダイ ゼーシヨンを可能とし、得られる二本鎖オリゴヌクレオチド生成物の付着末端力 （ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＴ付着末端でｐＧＥＸ−２Ｔｌこ）１イブ＋）ダイ ズするのを可能とした。連結の後、ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ｂとした得られた プラスミドは、単一コピーのｄｓオリゴヌクレオチド生成物を含み、および配７ ｆｉ１番号＝４の残基１〜残基２５２に示すアミノ酸残基配列を有するＣＡＰ− Ｂとした融合蛋白質をコードする構造遺伝子を含むものである。

４ｌ−６０（−）を、それぞれ配列番号：ｌｌおよび配列番号：１２＋：対応す るヌクレオチド塩基配列を有するものとして、実施例ＩＡ　（２）ｉこ記載した よう番＝１１Ｅ！した。

オリゴヌクレオチド４ｌ−６０（＋）および４ｌ−６０（−）を、ＥｃｏＲＩお よびＢａｍＨＩにより予め予備消化したｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクタと等量で混合 し、了ニール条件下で維持して、相補的オリゴヌクレオチドのノ１イブ１ノダイ ゼーションを可能とし、得られる二本鎖オリゴヌクレオチド生成物の付着末端か ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ付着末端でｐＧＥＸ−２Ｔにハイブリダイズするの を可能とした。連結の後、ｐＧＥＸ−２７−ＣＡＰ−Ｃとした得られたプラスミ ドは、単一コピーの二本鎖オリゴヌクレオチド生成物を含み、および配列番号： ５の残基ｌ〜残基２５２に示すアミノ酸残基配列を育するＣＡＰ−Ｃとした融合 蛋白質をコードする構造遺伝子を含むものである。

ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ａ−Ｂ　：ＣＡＰ−Ａ−Ｂ融合蛋白質を発現するベク タｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ａ−Ｂを構成するオリゴヌクレオチドを、それぞれ 配列番号：１３および配列番号：１４に対応するヌクレオチド塩基配列を有する ものとして、実施例ＩＡ　（２）に記載したように調製した。

配列番号：１３および配列番号＝１４によるオリゴヌクレオチドを、実施例ＩＢ （２）に記載したプラスミドＰＧＥＸ−３Ｘ−６９０：　６９４と等量で混合し た。混合物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための試薬と合せ、ＰＣＲ反応 での鋳型として混合したｐＧＥＸ−３Ｘ−６９０＋６９４上で２つの混合したオ リゴヌクレオチドをプライマとして使用し、配列番号：ｌの残基２〜４０に含ま れるアミノ酸残基配列をコードすると共に５′末端にＢａｍＨＩについて３′末 端にＥｃｏＲＩについてのＰＣＲ付加制限部位を含む二本鎖核酸分子よりなるＰ ＣＲ延長生成物を形成した。その後ＰＣＲ延長生成物を制限酵素ＢａｍＨＩおよ びＥｃｏＲＩにより開裂し、ＰＣＲ延長生成物上で付着末端を生成した。付着末 端を育する得られた生成物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより予め予備消化 したｐＧＥＸ−２７発現ベクタと等量で混合し、アニール条件下で維持して、二 本鎖ＰＣＲ延長生成物の付着末端が、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ付着末端でｐ ＧＥＸ−２Ｔとハイブリダイズするのを可能とした。連結の後、ｐＧＥＸ−２Ｔ −ＣＡＰ−Ａ−Ｂとした得られたプラスミドは、単一コピーの二本１．ＰｃＲ延 長生成物を含み、かつ配列番号：６の残基１〜残基２７１に示すアミノ酸残基配 列を有するＣＡＰ−Ａ−Ｂとした融合蛋白質をコードする構造遺伝子を含むもの である。

ｐＧＥＸ−３Ｘ−６９０＋　６９４プラスミドを正確な方向性で含む細菌コロニ ーを選択し、融合蛋白質の性質を検討した。アンピシリンの存在下（５０℃ｇ／ ｍ１最終濃度）に３７℃で、Ｉ）ＧＥＸ−３Ｘ−６９０：　６９４の細菌培養物 を定常期まで生育させた。この培養物を、アンピシリンの存在下に３７℃で１： ５０希釈で新鮮なＬＢ培地に接種し、２５　Ｏｒ　ｐｍの攪拌にて３７°Ｃに維 持し、５５０ｎｍ波長の光源検出器を備える分光光度計を使用して測定した場合 に、細菌が０．５の光学密度に達するものとした。その後細菌培養物に対し１ｍ Ｍの最終濃度でイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を混合し 、ｐＧＥＸ−３Ｘベクタ中のｔａｃプロモータの調節下で融合蛋白質の合成を開 始（誘導）した。

ＩＰＴＧの混合後ゼロ時間により開始し、その後１時間間隔で３時間（すなわち 誘導期）、細菌培養物を前記のように維持し、組換え蛋白質の発現を可能とした 。この維持期の際し、細菌培養物の光学密度を測定し、遠心分離のために１ｍ■ の百分を除去した。粗製蛋白質溶解物を含有する得られたそれぞれのベレットを 、それぞれ０．５の０Ｄ５５０単位について５０μｍの最終容積で１％β−メル カプトエタノールを含むラエミリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）色素ミックス中に再懸濁し た。サンプルを１５分間煮沸し、それぞれのサンプルの１０μｍを１０％５ＤＳ −ＰＡＧＥラエミリゲル上で電気泳動した。

適切な発現ベクタを用いる形質転換および前記したような誘導により、他のＧＳ Ｔ：ＮＡＮＢＶ融合蛋白質も細菌中で発現させた。

実施例３３発現した融合蛋白質の検出 ＩＰＴＧ誘導融合蛋白質を視覚化するため、ラエミリゲルをクーマシーブルーに より染色し、酢酸およびメタノール中で脱染色した。別々のクローンからの誘導 された蛋白質を検査し、ＩＰＴＧ処理後の時間ゼロから時間３時間にて、予想さ れた大きさ範囲における蛋白質バンドの増加に基いて比較した。融合蛋白質の発 現は、融合蛋白質に対応する蛋白質バンドの強度におけるゼロ時間からの増加を 示したクローンにおいて認められた。

実施例２に記載したように１２．５％ＰＡＧＥラエミリゲル上で分析した場合、 ＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ融合蛋白質ＣＡＰ−ＡＳＣＡＰ−ＢおよびＣＡＰ−Ｃは、約 ３０．０００ダルトンの見かけの分子量を示した。

実施例４．ウェスタンプロット分析 この発明のＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ融合蛋白質を含むＩＰＴＧ誘導物からのサンプル をゲル電気泳動により分離し、続く免疫プロット分析のためにニトロセルロース 上に移した。ニトロセルロースフィルタを、抗体ブロック緩衝液（２０ｍＭリン 酸ナトリウム、ｐＨ７，５，０，５Ｍ塩化ナトリウム、１％ウシ血清アルブミン および０．０５％ツイーン４０）と室温で３〜１２時間混合した。ＮＡＮＢＶ構 造蛋白質と免疫反応性の抗体を含むと考えられるＮＡＮＢＶ肝炎を持つヒトまた はチンパンジーからの血清を抗体ブロック緩衝液中で１：５００に希釈し、ニト ロセルロースと混合し、室温で１２時間維持して固相上に免疫反応生成物を形成 させた。その後ニトロセルロースを過剰容積の抗体ブロック緩衝液中で３回洗浄 した。洗浄の後に５０μｍのｌ１ｌｌプロテインＡ（二ニー・イングランド・ヌ クレア、ボストン、ＭＡ）を用いて１：５００希釈で抗体ブロック緩衝液中で１ 時間室温でニトロセルロースの混合を行い、ラベルしたプロティンＡをニトロセ ルロース上の固相に存在する全ゆる免疫反応生成物と結合させた。その後ニトロ セルロースをここに記載するように洗浄して乾燥し、ラベル、したがってニトロ セルロース上の全ゆる免疫反応生成物を視覚化するため、１〜３時間−７０℃で Ｘ線フィルムに露呈した。

ウェスタンプロット免疫検定の結果を表２〜７に示す。対照ＧＳＴを生産するｐ ＧＥＸ−３Ｘベクタを使用して１ｌＩ２シたサンプルも前記したように調製し、 ウェスタンプロット手順を使用して対照として試験した。この発明の融合蛋白質 （例えばＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ６９０　：　６９４融合蛋白質）と免疫反応すると 示された血清を使用する免疫反応性により測定されるものとしては、発現された ＧＳＴ蛋白質は検出し得なかった。

形質転換されたイー・コリ株Ｗ３１１０の培養物を３時間培養した後、ｆＰＴＧ 誘導処理を行った。その後細胞を遠心分離して細菌細胞ベレットを形成し、ｌ／ ２００培養物容量の溶菌緩衝液（ＭＴＰＢＳ：　ｌ　５０ｍＭＮａＣ］、＋６ｍ ＭＮａｔ　ＨＰＯ４，４ｍＭＮａ５　ＰＯ４、ｐＨ７，３）に細胞を再懸濁し、 フレンチプレスセルにより細胞懸濁物を溶解した。トリトンＸ−１００を細胞溶 解物に混合して１％の最終濃度を与えるものとした。混合物を５０，０００Ｘｇ で３０分間４°Ｃで遠心分離した。得られた上澄を集め、ＭＴＰＢＳ中で予備膨 潤させた２ｍｌの５０％（Ｗ／Ｖ）グルタチオンアガロースビーズ（シグマ、セ ントルイス、ＭＯ）と混合した。混合物を５分間２５゛Ｃで維持してＧＳＴと固 相中のグルタチオンとの特異的親和力結合を可能とした後、ＩｏｏｏＸｇの遠心 分離によりビーズを集め、ＭＴＰＢＳ中で３回洗浄した。

５ｍＭの還元型グルタチオンを含む２ｍｌの５０ｍＭトリフ、ＨＣｌ、ｐＨ８， ０を用いて２５°Ｃで２分間グルタチオンビーズを混合しインキュベートするこ とにより、ＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ６９０　：６９４融合蛋白質を洗浄したグルタチ オンビーズから溶出させ、精製したＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ６９０　：　６９４融合 蛋白質を形成した。

前記した親和力精製手順により、ＳＤＳ　ＰＡＧＥにより決定されたものとして ９５％を越えて純粋な融合蛋白質が製造された。すなわち、精製した蛋白質は、 ここに特定するように、原核抗原および非構造ＮＡＮＢＶ抗原を実質的に含有し ない。

また、ＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ６９０　：　６９４融合蛋白質を陰イオン交換クロマ トグラフィにより精製した６前記したように培養物を調製し、細胞ペレットを８ Ｍグアニジンに再懸濁し、４°Ｃで一夜維持して融合蛋白質を可溶化した。その 後細胞懸濁物をＳ−３００セフアロースクロマトグラフイカラムに供し、ＧＳＴ ：ＮＡＮＢＶ６９０　：ｌ３９４融合蛋白質を含むピーク画分を集めてプールし 、４Ｍ尿素中で透析し、陰イオン交換クロマトグラフィに供して精製した融合蛋 白質を形成した。

イー・コリ宿主への形質転換によるその導入の後に、実施例１で製造したＧＳ丁 融合蛋白質ベクタを使用し、ここに記載する他のＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ融合蛋白質 も前記したようにイー・コリ株Ｗ３１１０の培養物中に発現させた。培養物の誘 導および溶解後、グルタチオンアガロースアフィニティクロマトグラフィを使用 して前記したようにＧＳＴ融合蛋白質を精製し、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定さ れたものとして９５％を越えて純粋な融合蛋白質を生成した。よって、それぞれ ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ａベクタ、ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ｂベクタまたは ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＣＡＰ−Ｃベクタを使用し、ＣＡＰ−Ａ、ＣＡＰ−ＢおよびＣ ＡＰ−Ｃ融合蛋白質を全て前記のように発現させて精製し、またＰＧＥＸ−２Ｔ −ＣＡＰ−Ａ−Ｂベクタを使用し、ＣＡＰ−Ａ−Ｂ融合蛋白質を発現させて精製 した。

実施例５でｖＲ製した精製したＧｓＴ：ＮＡＮＢＶ６９０　：　６９４融合ｉ白 質を活性化因子（Ｘａ）（シグマ）を用いる処理に供し、ＧＳＴキャリヤをＮＡ ＮＢＶ６９０：６９４融合蛋白質から開裂させる（スミスら、前記）。７５ナノ グラム（ｎｇ）の活性化酵素、８ｍＭ）リスＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、７０ｍＭ ＮａＣ１および８ｍＭＣａＣ１ｔと３７°Ｃで５分間混合して維持することによ り、精製した融合蛋白質と混合する前に７μｇの因子Ｘを活性化する。その後、 実施例５に記載し５０ｍＭトリスＨＣＩ、５ｍＭ還元型グルタチオン、１００ｍ ＭＮａＣｌおよびＩｍＭＣａＣＩ＊を含む溶出緩衝液中で、５０℃ｇの精製した 融合蛋白質をｓｏｏｎｇの活性化したヒト因子Ｘａと混合し、２５°Ｃで３０分 間維持する。

その後得られた開裂反応生成物を実施例５で調製したグルタチオン−アガロース ビーズ上に吸着させ、全ゆる開裂したＮＡＮＢＶ構造抗原含有蛋白質から遊離の ＧＳＴを親和力結合させて分離する。その後液相を集め、配列ＩＤ番号２の残基 ２２６〜残基３１５に含まれるアミノ酸残基配列を有する精製したＮＡＮＢＶ構 造蛋白質を含む溶液を形成する。

で血液サンプルを集め（ＩＮＯｃ）、５つの異なる診断検定によりＮＡＮＢＶに 対する免疫学的応答を分析した。チンパンジーは、感染の急性または慢性相いず れにあるかについて分類した。免疫応答の評価に利用した検定には、ｌ）アラニ ンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）酵素検出（アルタ−ら、Ｊ　ＡＭＡ。

２４６：６３０−６３４．１９８１、およびアーチら、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、　Ｍ ｅｄ、３０４：９８９−９９４．１９８１）、２）ＩＥ子顕微鏡（ＥＭ）による ＮＡＮＢＶウィルス粒子についての組織学的評価、３）Ｃ１００−３抗原を含む 市販のキット（オルト・ダイアグノスチクス社）を使用する抗ＨＣＶ抗体の検出 、４）ＣＡＰ−Ｎ融合蛋白質を使用する実施例４に記載したような免疫プロット 分析による抗ＣＡＰ−Ｎ抗体の検出、および５）実施例１に記載したようなＰＣ Ｒ増幅によるウィルスの検出が含まれる。

急性ＮＡＮＢ肝炎のチンパンジーからの血清に対するＡＬＴ、ＥＭ、抗ＨＣＶ（ 抗Ｃ１００−３）、抗ＣＡＰ−ＮおよびＰＣＲ検定の結果を表２に示す。

表２ チンパンジー５９−急性ＮＡＮＢＶ肝炎１接種後の週。

”プラス（＋）は、混合した血清と融合蛋白質との間に免疫反応が認められたこ とを示し、ｒｃＡＰ−Ｎｊとしたのは、これが推定されるＮＡＮＢＶカプシド蛋 白質のアミノ末端に対応するためである（実施例４に記載したウェスタンプロッ ト免疫検定を使用）ａ 表２の結果は、融合蛋白質と試験した血清中の抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗体との 間の免疫反応を示す。更に、カプシド抗原を含む融合蛋白質を使用する免疫検定 により、同じ血清をＣ１００−３に基く免疫検定において検定するより早い時点 で血清変換を検出し得る。

確定ＮＡＮＢ肝炎のヒトから集めた血清に対するＡＬＴ、抗ＨＣＶ　（抗Ｃ１０ ０−３）および抗ＣＡＰ−Ｎ検定の結果を表３に示す。

表３ 表３の結果は、ヒト系統１６９血清変換血清サンプルでは、融合蛋白質中に存在 するＣＡＰ−Ｎ抗原により接種後早くも１４週にＮＡＮＢＶ特異的抗体が検出さ れるのに対し、ＣＩ　００−３に基く免疫検定では、検討した時間では抗ＮＡＮ ＢＶ抗体は何ら検出されないことを示す。

与えられた自己制限感染のチンパンジーからの血清に対するＡＬＴ、ＥＭ、抗Ｈ ＣＶおよび抗ＣＡＰ−Ｎ検定の結果を表４に示す。

表４ １３２８ＮＤ　−十 １６　２５ＮＤ　−＋ １８　２３ＮＤ　＋　＋ ２０２５−＋＋ 表４の結果は、自己制限ＮＡＮＢＶ感染の経過に際してサンプリングした血清を 使用した場合、ＣＡＰ−Ｎ抗原はＣ１００−３抗原より早く抗ＮＡＮＢＶ抗体を 検出することを示す。

急性感染様式から慢性のものに変換したチンパンジーからの血清に対するＡＬＴ 、抗ＨＣＶおよび抗ＣＡＰ−Ｎ検定の結果を表５に示す。

表５ 急性　２　２２３　−　十 慢性　４０　２２３　＋　十 慢性　４２　２２３　＋　＋ 慢性　４４　２２３　＋　＋ 慢性　５１　２２３　＋　− 表５の結果は、ＣＡＰ−Ｎ抗原は、ＮＡＮＢＶ！染の急性段階の抗ＮＡＮＢＶ抗 体を優先的に検出することを示す。

急性または慢性ＮＡＮＢ肝炎の幾つかのチンパンジーから種々の間隔で集めた血 清ニ対するＡＬＴ、ＥＭ、抗ＨＣＶ　（抗Ｃ１００−３）および抗ＣＡＰ−Ｎ検 定の結果を表６に示す。

表６ ８　＋４　１２５　−　＋ ＋５　＋１　８２　−　＋ １５６　＋１３１１１０　＋　十 表６の結果は、ＣＡＰ−Ｎ抗原は、急性感染個体からの血清中の抗ＮＡＮＢＶ抗 体をＣ１００−３抗原より頻繁に検出することを示す。

表２〜６の結果は、ＣＡＰ−Ｎ抗原を含みベクタｐＧＥＸ−３Ｘ−６９０＝６９ ４により生産された融合蛋白質の形態のこの発明のＮＡＮＢＶ構造蛋白質は、Ｃ １００−３抗原を使用する現段階の技術の方法によって検出し得るより早く、感 染患者またはチンパンジー中の特定の血清変換系統を時に応じて検出することを 示す。更に、これらの結果は、ＣＡＰ−Ｎ抗原は、感染の初期の急性ＮＡＮＢＶ 感染を検出するのに特に有用であることを示す。

併せてこれらの結果は、ＮＡＮＢＶＩ：感染した患者は、ここで構造抗原として 示したＮＡＮＢＶ抗原に免疫特異性で、特にＣＡＰ−Ｎにより特定される推定さ れるカプシド抗原と免疫反応すると示される、その血液中を循環する抗体を含む ことを示す。したがって、これらの抗体は、抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗体として 言及されるものであり、ＮＡＮＢＶ非構造蛋白質抗原Ｃ１００−３を使用して先 に検出された抗体の種類とは区別されるべきものである。

次（７）ＨＣＶカプシド融合蛋白質：ＣＡＰ−Ｎ、ＣＡＰ−Ａ、ＣＡＰ−Ｂおよ びＣＡＰ−Ｃに対する種々のチンパンジーおよびヒト血清を使用する実施例４に 記載した基本的免疫プロット検定による抗ＨＣＶカプシド融合蛋白質からの比較 結果を表７に示す。

表７ 血清　種類”　ＣＡＰ−Ｎゝ　ＣＡＰ−Ａ’　ＣＡＰ−Ｂ’　ＣＡＰ−Ｃ”Ｃ１ ０チンパンジー１０（Ａ）　＋＋＋＋＋　十−ＣＩＯチンパンジー１９４（Ａ） 　＋＋十＋＋＋　＋＋＋　−５９−１６チンパンジー５９（Ａ）　＋＋＋　＋　 ＋＋＋　ＮＤ５９−１２　チンパンジー５９（Ａ）　ＮＤ’　＋＋　＋＋＋　− Ｃ９チンパンジー１８１（Ａ）　＋＋＋　−＋＋＋＋２＋３−１８　チンパンジ ー２１３（Ａ）　ＮＤ　＋　＋　−Ｃ２チンパンジー１０（Ｃ）　＋＋　−−− ＣＩ　チンパンジー１０（Ｃ）　＋十十−−−Ｃ１９チンパンジー１０（Ｃ）　 ＋十十−−−Ｃ４チンパンジー６８（Ｃ）　＋＋＋＋＋＋　＋＋＋　ＮＤ１６９ −１６　ヒト　ＮＤ　＋＋＋　＋＋＋　−パンジーに由来する場合のチンパンジ ー同定番号、および血清をサンプリングした時点で血清供与体が急性（Ａ）また は慢性（Ｃ）ＨＣＶ感染を示す場合の表示（括弧内）により示す。

ｂ、ＣＡＰ−Ｎは、ＨＣＶカプシド蛋白質残基ｌ〜７４を含む実施例５で製造し たＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ６９０　：　６９４融合蛋白質を示す。

ｃ、ｃＡＰ−Ａは、ＨＣＶカプシド蛋白質残基１〜２０を含む実施例５で製造し たＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ融合蛋白質を示す。

ｄ、ＣＡＰ−Ｂは、ＨＣＶカプシド蛋白質残基２１〜４０を含む実施例５で製造 したＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ融合蛋白質を示す。

ｅ、ｃＡＰ−Ｃは、ＨＣＶカプシド蛋白質残基４１〜６０を含む実施例５で製造 したＧＳＴ：ＮＡＮＢＶ融合蛋白質を示す。

ｆ、＋、＋＋および＋＋＋は、ウェスタンプロット検定により検出された抗ＨＣ Ｖカプシド抗体免疫化生成物の相対的な量を示し、この場合、士はＸＰＪ！フィ ルムの一夜露呈後の弱いバンドを示し、＋＋はＸ線フィルムの一夜露呈後の強い バンドを示し、＋＋＋はＸ線フィルムの１〜２時間露呈後の強いバンドを示し、 また＋／−または−はＸ線フィルムの一夜露呈後のそれぞれ微かまたは存在しな いバンドを示す。

ｇ、ｒＮＤＪは試験しなかったことを示す。

表７に示す結果は、ＣＡＰ−Ａ抗原またはＣＡＰ−Ｂ抗原を含む融合蛋白質は、 ＨＣＶ感染ヒトまたはチンパンジーに由来する血清中に存在する抗体と免疫反応 性であることを示す。更に、ＣＡＰ−Ｃ抗原は、ＨＣＶ感染ヒトまたはチンパン ジーに由来する血清とは存意に免疫反応しない。

Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）としても言及されるＮＡＮＢＶを、実施例ＩＡ（１ ）に記載したようにＨＣＶのハツチ（Ｈ）株（ＨＣＶ−Ｈｃ５９と示す）を接種 したＨＣＶ感染チンパンジー、番号５９（Ｃ５９）に由来する２つの組織供給源 から単離した。感染の急性相（接種後４週間）の際のチンパンジー肝臓を生検し 、接種後１３週でチンパンジーの血漿を取った。オガタら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８Ｂ：３３９２−３３９６　（１９９］）および 実施例ＩＡ（６）に記載のように肝臓からの核酸の抽出を行った。１０’・１〜 １０’・’ＣＩＤＩ。／ｍｌのウィルス滴定値を有するものとしてＨＣウィルス 粒子を血漿から単離した。実施例ＩＡ　（１）に記載した免疫アフィニティクロ マトグラフィにより、またはイソプロパツール沈殿により、ＨＣＶ　ＲＮＡを血 漿サンプルから精製した。

簡略には、４．２Ｍグアニジニウムイソチオシアネート、０．　５％ザルコシル および０．０２５Ｍトリス−Ｈ（１、ｐＨ８，０を含有する水冷緩衝液を用いて ５０μｌの血漿を希釈した。その後、希釈した血漿と１００ｍＭ１’リスＨＣＩ 、ｐＨ８，０、ｌ　ＯｍＭＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳを含有する５０μｌの抽出 緩衝液とを混合して抽出混合物を形成した。混合物をポルテックスにより攪拌し 、６５°Ｃで５分間維持して抽出を開始した。その後６５°Ｃでフェノール／ク ロロホルムを用いて血清蛋白質を混合物から除去した後、クロロホルム単独によ る１回の抽出を行った。その後２容量の水冷イソプロパツールおよび１０分の１ 容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを混合し、混合物を一２０℃で一夜維持することによ り、蛋白質を含存しない混合物からＨＣＶ　ＲＮＡを沈殿させた。エツベンドル フ遠心機中で１４００ｒｐｍで３０分間４℃での遠心分離によりベレット化した 後、ＨＣＶ　ＲＮＡを７０％エタノールにより１回洗浄し、真空乾燥した後、９ μｍのＲＮ八へｅを含有しない水に再懸濁した。以下におよび実施例ＩＡ　（１ ）に記載するようにして行うｃＤＮＡ合成の前に、精製したＨＣＶ　ＲＮＡサン プルを５分１！ｌ＄６５°Ｃで加熱した。

（２）ＨＣＶ−Ｈｃ５９ｃＤＮＡのクローン化５μｇのｆｆＩ製肝臓または血漿 誘導ＨＣＶ　ＲＮＡをｃＤＮＡプライム反応当り使用した。公開されたＨＣＶ配 列から誘導され報告された全ゲノム配列に渡る特異的ヌクレオチドプライマを使 用して反応を開始した。才力モトら、Ｊａｐａｎ。

Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、６０　：１６７−１７７　（１９９０）、カドら、Ｐｒｏ ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８７：９５２４−９５２８　（１９９０ ）　、ハンら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｔ、ＵＳＡ、８８　： １７１１−１７１５（１９９１）およびホウトンら、ヨーロッパ特許出願［＊８ ８３１０９２２．５号および公開第３１８２１８号を参照することができる。選 択した標的配列は、実施例ＩＡ　（３）に記載したような種々のヌクレオチドプ ライマを使用するＰＣＲに基く方法を使用して増幅した。プライマのヌクレオチ ド配列を以下の表８に列記するが、プライマ番号および対応する配列番号により 同定したものである。

ＨＣＶ−ＨＣ５９ｃＤＮＡのクローン　に　したヌクレオ千ドブライマプライマ 　配列　ヌクレオチド配列（５゛−３’）　ｆｆｉ性８（＃）　１０番号 ８コＱ　７８　ＣＡＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＴＣ＋７９５　’　７９　 ＣにＧＧＣＴＣＣＧＴＣＡＣＴＧＴＧ７９４　８０　ＧＴＡＴｒＧＣＡＧＴＣＴ 入τＣＡＣＣＧＡに４６４　１１１１　ＧＧＣＴｋＴＡＣＣＧＧＣ（、ＡＣＴ’ ｒＣＧｋ　壽４０　８２　ＣＧＴｒＧＡＧＴＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧ４６３　Ｂ ３　ＴＣＡＣＣ入ＴＴＧＡＧＡＣ入ＡＴＣＡＣＣ＋７８８　Ｆｉ４　ＧＴＡＡＧ にＡＡＣ；ＧＴＴＣＴＣＣＣＣＡＣＴＣ−５７１８５ＡＴＧＣＣＣＡＣＴＴｒＣ ＴＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡｊ＋ＪにＣ＋６２５　Ｅ１８　Ｃ（、ＴＡＴＴＧＣＣＴ にＴＣＡＡＣＡＧＧＣ＋６コ１　８９　λＧＣＧＣＣＣＡＣ入入入ＧＧＣ入ＧＴ λＧ３４２　９０　ＣＣＴＣＴＴｃＡＡＣＡＴＡＴＴにＧＧＧ　＋８４コ　９１ 　ＣＣＡＧＧ入八ＣＣにへにＡＧＣＡＴ（：Ｇ３５９　９２　λＣＯ，ＧＴＧＧ ｋＴＡＡＧｃＴｃＧＧ　＋９０４　９：ｌ　ＣＣ，ＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣ入ＴＴ 入入ＴＧ８６２　９４　ＡＴＧＴＧＩ；ＡＧＴＧＧＧＡＣＣＴＴＣＣ＋８６１　 ９５　ＣＴＣＴＣＣＴＣ；ＴＴＡＴＡＴにＧＧＡＧＧＦ４　９６　にＴＴＧＡＣ ＧＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＣＴＧ　＋入４　９７　ＴＴＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＣＡ ＣＴＡＧＣＣ；　−８４９９８ＧＴ［；ＡＧＣλＣＯ八〇〇ＧＴへＣＧＣＦｌ　 ９９　ＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣ；り請ＧＴＣＣＣ（’Ｉ’　↓５０　１０５　人Ｇ ＣＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣＣＡＡ５０２　１０６　ＧＡＴＣＧＣＴｒＴＧＴ ＡＣＣＡＣＧＴＣ；　＋５５　１０７　Ｃ；ＣＡＣＣＴＧＣＧ入Ｔ入ＧＣＣにＣ ＡＧＴＥ１５２　１０８　ＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＧλＧ入ＧＧＣＴ　＋８５コ　 １０９　ＧＡＴＴＧＧＡＧＣＴＡＧＡＴこＡＡＣＴＧ４　１１０　ＴＡＣＣＡＣ ＴＴにＧＡ（、ＣＴＣＡＴＡＡＣ６２ｉｎ　入にＣＡＡＧ入ＣＡＣＡＣＴＣＣ入 ＧＴＣＡ６１　１Ｌ！　ＧＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧにＴＴＡＧＣａ （＋）はセンス値を示す （＝）はアンチセンス鎖を示す 増幅した配列をその後単離し、平滑末端とし、実施例ＩＡ　（４）に記載したよ うな標準的な手順によりｐＵＣまたはｐブルースクリプト（ストラタジーン）ク ローン化ベクタに挿入した。

（３）クローン化したＨＣＶ−Ｈｃ５９ｃＤＮＡの配列分析デュポンの自動配列 決定装置ゲネシス２０００を使用し、ジデオキシ連鎖終止法を使用してクローン を配列決定した。ＰＣＲ人為現象（Ｔａｑポリメラーゼによる読み違い）による 配列決定誤差を最小にするため、それぞれの標的配列について３つの独立のクロ ーンを単離し、その後配列決定した。ＨＣＶハツハツ（ＨＣＶ−Ｈ）ゲノムを代 表する最終のコンセンサス配列を誘導するため、得られた配列を比較した。幾つ かの場合で、独立した検討から誘導された幾つかのクローンは、同じゲノムドメ インを包含した。これらのクローンの配列により更に確認的なデータが与えられ る。

（４）ｃＤＮＡクローンの特徴とＨＣＶ−Ｈｃ５９の一次構造前記および実施例 ＩＡ　（３）に記載したようにプライマの対を選択し、ＨＣＶ−Ｈｃ　５９ゲノ ムの特異的領域を増幅し、重複クローンを生成した（その配列は全ゲノムからな り得る）。特異的ＰＣＲ反応で使用したプライマ対を以下の表９に列記する。選 択したプライマ対から生成した得られた４０のｃＤＮＡクローンは、同表にゼロ から開始し３９で終る番号により列記するが、図１に示す推定されるマツプ位置 に対応するものである。それぞれの単離したｃＤＮＡの塩基対の演鐸された大き さも表９に示す。

表９ ＰＣＲ誘導ＨＣＶ−ＨＣ５９クローン ２　６り０：６９４　２２４ ７　７１フ＋５６７　５４８ ａ１２１　に示ｔＨｃＶ−Ｈａ５９’ｆ／ム上（：’）相ｎ位置。

５表１および配列列記に示すヌクレオチド配列を有するセンス（＋）およびアン チセンス〈−ンプライマ対。

゛実施例ＩＡ（３）および８Ａ　（３）に記載するように示したプライマ対を使 用するＰＣＨにより生産されたクローン化挿入物の塩基対Ｃｂ　ｐ）の演鐸され た大きさ。

同じゲノムドメインから独立に単離した３つのｃＤＮＡの配列の比較により、ヌ クレオチドの差異は殆どないことが明らかとなり、ウィルスの保存物は均一であ ることを示す。完全なＨＣＶ−Ｈゲノムの配列を演鐸したが、９４１６ヌクレオ チドを示し、これは先に単離されたＨＣＶゲノムＨＣＶ−ＩＳＨＣＶ−Ｊおよび ＨＣＶ−ＢＫと長さが類似する。カドら、前記、チューら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ］ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８８：２４５１−２４５５　（１９９１）および タカミザワら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５：１１０５−１１１３　（＋９９１）を参 照４６）、３０１１アミノ酸残基の蛋白質（配列番号二４６）に対応する１つの 大きなオーブンリーディングフレームを含む。ＨＣＶ−Ｈｃ５９の演鐸されたヌ クレオチド配列はゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に寄託し、受託番号Ｍ６７４６ ３を存するものとした。

それぞれ３４１および４２ヌクレオチドに及ぶ５′および３′端部末端非フード （ＮＣ）　ドメインからのＨＣＶ−Ｈｃ５９配列を同定した。最初の１２ヌクレ オチドおよび最後の２０ヌクレオチド（配列番号：４６、特徴を参照することが できる）は増幅過程で使用したヌクレオチドプライマに対応し、このためＨＣＶ −Ｈ配列としては確認されない。しかしながら、先に報告されたＨＣＶゲノムの ５′非コ一ド配列は極めて保存されており（〉９８％）、ここで報告されたＨＣ Ｖ−Ｈの５′末端配列は、示されたものと同一ではないとしても、極めて類似す る可能性を与える。しかしながら、Ｆ（ＣＶ−３’非コーロ配列の大きな相違の ため、ＨＣＶ−Ｈｃ５９　３’末端配列はなお確認すべき対象である。オリゴ（ ｄＴ）プライマをｃＤＮＡ合成に使用した後に異なる組合せのプライマを使用し てＰＣＲ増幅を行った場合、ウィルス配列は得られなかった。この結果は、ウィ ルスゲノムは３′末端端部または３′末端ポリｂＡ）配列にて内部の八に富む部 分を欠損することを示す。同様に、２つの報告された日本型単離物、ＨＣＶ−Ｊ およびＨＣＶ−ＢＫの３′末端（Ｕに富む）ヌクレオチド配列に相補的な八に富 むプライマをＲＴブライミング反応で使用した場合は配列は増幅されなかったた め、ＨＣＶ−Ｈｃ５９のゲノム中にはＵに富む末端配列は存在しないことが示唆 される。

ＨＣＶ−Ｈｃ５９ＲＮＡゲノムの大きなオーブンリーディングフレームは、５つ のＡＵＧコドン（配列番号：４６に示すようにｃＤＮＡ＝八ＴＧ−へクレオチド 塩基番号Ｉ３．３２．８５．９６および２＋４）ｌ：より先導され、ＨＣＶゲノ ムの５’ＮＣ領域中の仮定された小さなオーブンリーディングフレームの存在が 確認される。列記の特徴部分に部〜Ｒ６として列記する配列ＩＤ番号４６に示す 幾つかの繰返し配列が、５′および３’ＮＣ領域中で、および推定されるＮＳ５ ドメインのＣ末端で同定された。これらの配列は、ウィルス複製の制御に関与す る重要なＣｉｓ作用要素に対応するものであろう。

繰返し配列Ｒ１およびＲ１は、全てのＨＣＶ単離物において保存されていると認 められる。他の繰返し配列がＨＣＶゲノムの末端端部に今や既に認められている が、制御機能を有する配列は、ＲｔおよびＲ８のように全てのＨＣＶウィルスに おいて保存された配列である可能性がある。繰返し配列Ｒ１は特に意義のある流 に局在するためである。ＨＣＶウィルスの推定される環化については未だ何も知 られていない。これらの極めて保存された自己相補的配列は、恐ら（ウィルスゲ ノムのプラスおよびマイナス鎖の両者に使用されるレプリカーゼ認識部位を示す 可能性もある。

他のＨＣＶ単離物についての先の報告に記載されたように（カドら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８７：９５２４−９５２８　（１９９０ ）、チューら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８８：２４５ １−２４５５　（＋９９１）およびタカミザワら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５：１１ ０５−１１１３　（１９９１）Ｌ　ＨＣＶ−Ｈｃ５９ゲノムマタハ蛋白質は、３ つのドメイン以外は、他の公知のウィルス配列と限定された類似性のみを共育す る：　（Ｌ）５’ＮＣ配列中のヌクレオチドの幾つかの鎖は、アメリカ型プロト タイプＨＣＶ−１（配列番号＝４６）についてチューら、前記により報告された ものと同一のベスチウイルスにより保存され、（２）推定されるＮＴＰ結合へリ カーゼおよびトリプシン様セリンプロテアーゼに対応する推定されるＮＳ３ドメ イン（ヌクレオチド塩基番号３６９３〜５１９８、配列番号：４６）に認めれる アミノ酸のブロックは、フラビウイルスおよびペスチウイルスにより保存され、 （３）ＧＤＤコンセンサス配列は、全てのウィルスによりコードされるＲＮＡ依 存性ＲＮＡポリメラーゼ（アミノ酸残基２７３７〜２７３９、配列番号：４６） において保存されている。更に、合計１９の推定されるＮ−グリコジル化部位が 、メイヤーら、Ｖｉｒｏｌ、１７＋＋５５５−５６７（１９８９）およびコレッ トら、Ｖｉｒｏｌ。

＋６２：１６７−１８０　（１９８８）に記載されたように、ベスチウイルスの エンベロープ蛋白質について認められた構成と類似する様式で、アミノ酸残基１ ９６および６４７の間に位置し、主として密集していた。

ＨＣＶ−Ｈｃ５９の異なるゲノムドメインとアメリカ型（ＨＣＶ−１）またはア メリカ型様（ＨＣ−Ｊｌ）単離物との間の、および日本型単離物ＨＣ−Ｊ４、Ｈ ＣＶ−ＪＨ，Ｉ（ＣＶ−ＪおよびＨＣｖ−ＢＫについての比較）要旨を表１０に 示す。配列比較はＨＣ−Ｊｌ、ＨＣ−Ｊ４およびＨＣ−ＪＨにより制限される。

これらの単離物のゲノムの完全な配列は未だ報告されていないためである。配列 から演鐸されるＨＣＶコード蛋白質の仮定的マツプの提示、およびＨＣＶゲノム とフラビウイルスおよび／またはペスチウイルスとの間の疎水性状態の類似性を 、比較を行うために使用した。比較した配列についての参考は表１Ｏの底部に列 記する。関連するウィルスに対する配列比較に基き、ＨＣＶゲノムは、表１０に 示すように少なくとも８つのドメインをコードすると考えられる。すなわち、ヌ クレオカプシド（Ｃ）および２つのエンベロープ（ＥｌおよびＲ２）蛋白質より なる構造ドメインおよび５つの蛋白質ＮＳ２、ＮＳ３、Ｎ５４ａ、Ｎ５４ｂおよ びＮＳ５よりなる非構造領域である。ドメインの命名は比較の目的で関連するＨ ＣＶ株の構成に基くもので、ＨＣＶ−Ｈｃ５９のドメインを特徴付ける現段階の 技術からして、ＨＣＶ−Ｈｃ５９のドメインを必ずしも反映するものではない。

表１Ｏ ＨＣＶ−Ｈｃ５９　起、　とのＨの クレオチドお　び　纏されｔ・アミ７　丁の　ロドメイン１ ４１己 ５’ＮＣ比ヱ爲　巳３二　≦５区　エ！≦■　≦工ｉ　比ユ≦■＊ｂｐ”　９９ ，７　９９．１　９９．１　９Ｂ、９　９Ｌ２　９８．Ｂｂｐ　９８．４　９８ ．９　９０．０　９０．）　９１．０　９０ｊｂｐ　９３．６　９ユ、７　６７ ．７　６５゜４　７３．５　７１２ｂｐ　９コ−８−−−−−−７１４７２，７ ｂｐ　９５．４　−−　−−　−−　８０．１　７１３．９≦ヱ」　巳りム　≦ ｂム　辻ユ≦■　≦凹ゴ　出Ｎヨ本５４ａ Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５：１１０５−１１１３　（１９９１）から演鐸されたヌク レ４６）に認められる２つの組の繰返し配列は、報告された全ての単離物で保存 されている。繰返し配列Ｒ１の２つのコピーも２つのアメリカ型単離物ＨＣＶ− Ｈｃ５９およびＨＣＶ−１の間で保存されているが、日本車単離物ＨＣＶ−Ｊお よびＨＣＶ−ＢＫの両者では１つのコピーのみが認められる。これらのゲノムの ５’ＮＣ配列は、第２のコピーに及ぶ程遠くには延長していない。他のＨＣＶ単 離物について報告されたヌクレオチド配列は、比較を可能とする程遠くには５′ ＮＣへと延長していない。

緩い同一性の領域は非構造ドメイン全体に認めら托この場合２つの群（アメリカ 型７日本型）の単離物の間の明確な分離を認め得る。ＨＣＶ−Ｈｃ５９を第１の 群と比較した場合は９３，８〜９５，９％のヌクレオチド同一性が認められるの に対し、第２の群とは７２．７〜８０．０％の同一性が認められるのみである（ それぞれ９５．１〜９７．２％および７８．２〜９２．６％のアミノ酸の同一性 ）。推定されるＮＳ５に認められ（配列番号＝４６のアミノ酸残基位Ｉｔ２３５ ６〜２３７９）、以下の表１１に示すように領域Ｖ３と呼ばれる１つの領域は、 ＨＣＶ単＃物の２つのサブグループの間のより著しい相違を反映していた。この 領域は２つのアメリカ型単離物の間で１００％の同一性を示したが（データは示 さず）、いずれかの日本Ｙ株とは１２．５％であるのみだった。大半の変化は保 存性の変化であると考えられ、したがって蛋白質の機能の修飾には帰着し、得な いが、このゲノム領域が免疫学的に活性か否か、またＨＣＶ単離物の２つのザブ グループの間に抗原性の変動も存在するか否かを評定するのは興味あることであ ろう。

表１１’ 領域Ｖ （配列番号、４６の残基３８６〜４１１）単離物２ （配列番号：１１３） Ｈｉｓ　ｖａｘ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＧＩＹ　ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　 Ｔｈｒ　Ｖａｌ　５ｅｒＧ１ｙ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　入 １ａ　Ｐｒｏ　ＧＩＹ　入１ａ　Ｌｙｓ　ＧｌｎＡＳｎ　Ｖａｌ （配列番号：１１４） Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　にｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　入１ａ　入１ａ　Ａｒｇ　 入１ａ　Ｍｅｔ　５ｅｒＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＴｈ ｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇ１ｎ５ｅｒ　ｘＡｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ 　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ｓｉｒ　Ｇｉｎλｒｇ　 Ｗｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　入ユａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓ ｅｒ　ＧｌｎＴｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　入ユａ　Ｓａ ｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　５ｅｒＴｈｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ 　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇ〕Ｙ　入ユａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ（配列番号：１１ ＦＩ） １ノｉＳ　Ｖａコ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　５ｅｒＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｏｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　 Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　入ユａ　Ｓｅｒ　ＧｌｎＨｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｙ　ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　入ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＡユとＧｌ ｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌ ａ　Ｌｙｓ　ＧｉｎＨＣＶ−Ｈｌ＞−Ｈ２Ｏ： Ｈｉｓ　ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　入１ａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　 Ｓｅｒ　ＶａＬ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｉｌｅ　入１ａ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ＧｌｎＡＳｎ”　（配列１　：　１２ １　） 領域Ｖ。

（配列番号：４６の残基２４６〜２７５）Ｌａｕ　入１ａ　入１ａ　Ａｒｇ　入 Ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　工１ａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒｌｌｅ　Ａｒ ｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌ ａ　λユａ入ユａ、　ｍｕ　ｃｙｓ　ｓｅｒ入”　Ｍｅｔ（配列１号：　１２４ 　）Ｌｅｕ　入ユａ　入ユａ　Ａｒｇ　入ｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　工１ａ　Ｐｒ ｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒｌｌｅ　Ａｒｇ　）ｓｒｑ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　Ａｓ ｐ　Ｌｅｕ　ＬＱｕ　−、’ａｌ　ＧＩＹ　Ａｌａ　入１ａＡｌａ　、　Ｐｈ″ Ｃｙｓ　Ｓ°″′１″Ｍｅｔ　（配列番号：１２５）ＨＣ−Ｊ４： Ｌｅｕ　Ａｌａ　入１ａ　Ａｒｇ　入ｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒｌｌｅ　Ａｒｇ　入ｒｇ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　入１ａ　入１ａＡｌａ　Ｐｈｅ　Ｃ！ＩＩ’５ ５ｅｒＡｌａＭ”　（配列１８号：１２６）Ｌｅｕ　入１ａ　Ａｌａ　ｋｒｑ　 Ａｓｎ　入１ａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＬｅｕ　Ａ ｒｇ　入ｒｇ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔ ｈｒ　入１ａ入１ａ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　入１ａ　Ｍｅｔ（配列番号：１ ２７） Ｖａｌ　入ｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　入ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＧｉｎＬｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　工１ｅλｓｐ　Ｌｅ ｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　入１ａＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ 入””　（配列番号：１２２＞Ｖａｌ　入ユａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　入ｓｐ　Ｇｌ ｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＧユｎＬｅｕ　Ａｒ（ｌ　Ａｒ ｇ　Ｈｉｓ　工１ｅ　入ｓｐ　ＴＡｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　入１ ａＴｈ″Ｌ″嶋゛°”Ａ１°″″　（９列番号２１゜２）領域Ｖ。

（配列番号＝４６の残基４５６〜４８２）Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ｃｙｓ　Ａ ｒｇ　入ｒｇ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｉ　Ａｌａ　Ｇｌｒ＋Ｇｌｙ　Ｔ ｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　エユｅ　５ｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓ ｅｒ　ＧｌｙＬｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ （配列番号：１２８） Ｌｅｕ　Ａｌａ　ｓｅｒ　ＣｙＳ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　 Ｐｈｅ　八ｓｐ　ＧｉｎＧｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　工１ｅ　Ｓｅｒ　’ ｒｙｒ　入１ａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　ＧｌｙＰｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ （配列番号　１２９） ＨＣ−Ｊｌ： Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｉｌａ　Ｓｅｙ：　Ｈｉｓ　入１＆　入ｓｎ 　Ｇｌｙ　５ａｒ　ＧｌｙＰｒ’　”ｐ”　（配列１号：　１３０　’）°”Ａ ｓｐ　Ｇｌ”　、１番号：１３１）Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　ｐｒｏ　エユａ　 Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　入ユａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　入ｒ９５°ｙ　Ａｓｐ　Ｇ ｌｏ　（配列番号・１３２）Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ工１ｅ　Ｔｈｒ　 Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　５ｅｒＬｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　（ 配列番号・１２８）”　”ｐＧｌｕ（配列１１号：　１３４　）領域Ｖ。

（配列番号：４６の残基２３５６〜２３７９）（配列番号：１３５） Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　入１ａ　５ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　 Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｕｙ（配列番号＋１３６） （配列番号＋１３７） １他のアメリカ型および日本型単離物と共に、ＨＣＶ−Ｈｃ５９の領域■、Ｖ、 、Ｖ、およびｖ３の演揮されたアミノ酸配列の列Ｌ２単離物： ＨＣＶ−Ｈｃ５９：アメリカ型／チンパンジー５９、インシャウスベら、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９９１．ゲンバンク受託番Ｓｃｉ 、ＵＳＡ、８８　：１７１１−１７１５　（１９９１）、ゲンバンク受託番号Ｍ ５８４０７、 ＨＣＶ−１：　３’末端、ハンラ、前記、ゲンバンク受託番号Ｍ５８４０６、Ｈ Ｃ−Ｊｌ：アメリカ型、才力モトら、Ｊａｐａｎ　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。

ＨＣＶ−ＢＫ：日本型、タカミザワら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５：１１０５−１１ １３（１９９１）、ゲンバンク受託番号Ｍ５８３３５．４６２６　（１９９０） 、 圧力下にあり、領域ｖＩおよびＶ、の場合のサブタイプ特異的たり得る標的保護 （すなわちアメリカ型対日本型単離物）であると考えられる。配列の異種性はフ Ｖｉｒｏ１．１７１：５５５−５６７（１９８９）、コレットら、Ｖｆｒｏｌ。

存在によって、ＨＣＶはフラビウイルスよりベスチウイルスにより密接に関連し た独特の構造および構成を示すことがデータにより確認される。

れの列の最初の塩基残基の位置番号を用いて、左から右に５′末端から３′末端 の方向で慣用的に示す。

それぞれのアミノ酸残基についての３文字コード（対応表）がそれぞれの残基を コードする３つの塩基（コドン）の直ぐ下に位置するよう、コードする蛋白質の 演揮されたアミノ酸残基配列をヌクレオチド配列の下に配置することにより、配 列番号　１のヌクレオチド配列のリーディングフレームを示す。また配列番号・ ｌは、配列番号・１のヌクレオチド配列によりコードされる線状アミノ酸残基配 列も含み、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端への方向で慣用的に示す。

５毎のアミノ酸残基の位Ｉｆ番号を、そのアミノ酸残基配列の下に示すものとす る。

配列番号、２は、ＣＡＰ−Ｎとした好適な融合蛋白質の線状アミノ酸残基配列を 含み、グルタチオン−３−）ランスフェラーゼの残基工〜２２１に対応するアミ ノ末端ポリペプチド部分、残基２２２〜２２５に対応しプロテアーゼ因子Ｘａの 開裂部位を特定する中間ポリペプチド部分、残基２２６〜２３４に対応するリン カ部分、配列番号＝１のアミノ酸残基配列ｌ〜７４を有するＮＡＮＢＶカプシド 抗原を特定する残基２３５〜３０８に対応するポリペプチド部分、および残基３ ０９〜３１５に対応するカルボキシ末端リンカ部分により構成される。また配列 番号：２は、ここに記載する融合蛋白質をコードする線状−重鎖ＤＮＡ断片のヌ クレオチド塩基配列も含む。命名法および配列情報の提示は配列番号＝１につい て記載したのと同様である。

配列番号：３は、ＣＡＰ−Ａとした好適な融合蛋白質の線状アミノ酸残基配列を 含み、グルタチオン−Ｓ−＋−ランスフェラーゼの残基ｌ〜２２０に対応するア ミノ末端ポリペプチド部分、残基２２１〜２２６に対応しプロテアーゼトロンビ ンの開裂部位を特定する中間ポリペプチド部分、配列番号＝１のアミノ酸残基配 列１〜２０を育するＮＡＮＢＶカプシド抗原の部分を特定する残基２２７〜２４ ６に対応するポリペプチド部分、および残基２４７〜２５２に対応するカルボキ シ末端リンカ部分により構成される。また配列番Ｊ＋：３は、ここに記載する融 合蛋白質をコードする線状−重鎖ＤＮＡ断片のヌクレオチド塩基配列も含む。

命名法および配列ｔｆｊｊＮの提示は配列番号：１について記載したのと同様で ある。

配列番号＝４は、ＣＡＰ−Ｂとした好適な融合蛋白質の線状アミノ酸残基配列を 含み、グルタチオン−３−トランスフェラーゼの残基ｌ〜２２０に対応するアミ ノ末端ポリペプチド部分、残基２２１〜２２６に対応しプロテアーゼトロンビン の開裂部位を特定する中間ポリペプチド部分、配列番号＝１のアミノ酸残基配列 ２■〜４０を有するＮＡＮＢＶカプシド抗原の部分を特定する残基２２７〜２４ ６に対応するポリペプチド部分、および残基２４７〜２５２に対応するカルボキ シ末端リンカ部分により構成される。また配列番号：４は、ここに記載する融合 蛋白質をフードする線状−重鎖ＤＮＡ断片のヌクレオチド塩基配列も含む。

命名法および配列情報の提示は配列番号、１について記載したのと同様である。

配列番号、５は、ＣＡＰ−Ｃとした好適な融合蛋白質の線状アミノ酸残基配列を 含み、グルタチオン−３−）ランスフェラーゼの残基１〜２２０に対応するアミ ノ末端ポリペプチド部分、残基２２１〜２２Ｇに対応しプロテアーゼトロンビン の開裂部位を特定する中間ポリペプチド部分、配列番号＝１のアミノ酸残基配列 ４１〜６０を育するＮＡＮＢＶカプシド抗原の部分を特定する残基２２７〜２４ ６に対応するポリペプチド部分、および残基２４７〜２５２に対応するカルボキ シ末端リンカ部分により構成される。また配列番号：５は、ここに記載する融合 蛋白質をコードする線状−重鎖ＤＮＡ断片のヌクレオチド塩基配列も含む。

命名法および配列情報の提示は配列番号：ｌについて記載したのと同様である。

配列番号：６は、ＣＡＰ−Ａ−Ｂとした好適な融合蛋白質の線状アミノ酸残基配 列を含み、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼの残基１〜２２０に対応する アミノ末端ポリペプチド部分、残基２２１〜２２６に対応しプロテアーゼトロン ビンの開裂部位を特定する中間ポリペプチド部分、配列番号：１のアミノ酸残基 配列２〜４０を有するＮＡＮＢＶカプシド抗原の部分を特定する残基２２７〜２ ６５に対応するポリペプチド部分、および残基２６６−２７１に対応するカルボ キシ末端リンカ部分により構成される。また配列番号：６は、ここに記載する融 合蛋白質をコードする線状−重鎖ＤＮＡ断片のヌクレオチド塩基配列も含む。

命名法および配列情報の提示は配列番号＝１について記載したのと同様である。

前記した説明および実施例は例示を意図するものであり、限定するものとして受 取るべきではない。この発明の精神および範囲内でなお他の変形が可能であり、 当業者に対してそれ自体容易に与えられよう。他の態様はここに記載する請求の 範囲内に存するものである。

配列表 （＋）一般的な情報： （１）出願人、スザンヌ・ゼベダイ ジエネブイーブ・インチョウスブ マルタ・ナソフ アルフレッド・プリンス （ｉ　ｉ）発明の名称：非Ａ、非Ｂ型肝炎ウィルス抗原、診断法及びワクチン （ｉｉｉ）配列の数：１３７ （ｊｖ）連絡先： （Ａ）受取人：ドレスラー・ゴールドスミス・ショー・サトカー＆ミルナモウ・ リミテッド （Ｂ）通り：１８０ノースステートソン、スィート４７００（Ｃ）市ニジカゴ （Ｄ）州：イリノイ （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰ：８０８０１ （ｖ）コンピューター読取り形式： （Ａ）媒体の種類：フロッピィ・ディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互 換性（Ｃ）オペレーションシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−Ｄ。

（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０、バージョン＃１．　２ ５ （ｖ　ｉ）本件出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ　０７／６１６３６９（Ｂ）出願日：１９９０年１１月２ １日（ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ　０７１５７３６４３（Ｂ）出願日：］９９０年８月２５ 日 （ｖ　ｉ　ｉ　ｆ）代理人の情報： （八）名前：ニドワード・ビー・ガムソン（Ｂ）登録番号：２９，３８１ （Ｃ）事件番号：ＰＨＡＯＯ２９Ｐ （ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話＋３１２−６１６−５４００（Ｂ）７ｙｙりｘ：３１２−６１６−５ ４８０（２）配列番号：ｌ： ＣＤ配列の特性： （Ａ）長さ：９７８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイボセティカ ル二Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｆｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．９７８ （Ｄ）その他の情報：／コドンのはじまり＝１／生成物＝“ＮＡＮＢＶ構造抗原 ” ／数＝１ （ｘ　ｉ）配列：配列番号：ｌ： ＣＴＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＣＣＣＣＴ　ＧＧＣＴＣＴ　ＣＧＧ　ＣＣＴ　ＡＧＣ ＴＧＧ　ＧＧＣＣＣＣＡＣＡ　ＧＡＣＣＣＣコ３６（２）配列番号、２： （１）配列の特性： （Ａ）長さ、９４８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 ＜ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセテ ィカル二Ｎ０（ｉＶ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／牛−：ＣＤ５ （Ｂ）存在位ｆｔ：　１．　、　９４５（ｘｉ）配列：配列番号二２： ８５　タ０　９５ （２）配列番号・３゜ （ｉ）配列の特性。

（Ａ）長さ、７５９塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数−一本鎖 （Ｄ）トポロノー、直鎮状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏ＋ａｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセ テイカル　Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス、Ｎｏ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／キー　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置　１．．７５６ （ｘｌ）配列　配列番号　３・ （２）配列番号　４゜ （１）配列の特性 （Ａ）長さ　７５９塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎮 （Ｄ）トポロジー　直鎮状 （１１）配列の種１ｊ　：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｅ）（１目）ハイポセティカ ル　Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス　Ｎｏ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／キー　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置　１０．７５６ （ｘｌ）配列　配列番号　４ （２）配列番号、５゜ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さニア５９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロノー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏ＠１ｃ）（口ｉ）ハイポセティカル ：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置、１．．７ｓ６ （ｘｉ）配列：配列番号、５： τＡＴ　ＧＡＧ　ＣＧＣＧＡＴ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　入入入　πＧＣＧλ 入ＡＣ入入Ａ　入＾Ｇ　’！７Ｔ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　１４４Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａ ｒｇ　Ａｊｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＬＹＩＩ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　 Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　Ｐｈ＊　Ｇｌｕ　Ｍｕコ５　４０　４５ ＧＧＡ　ＴＣＣＧＧＣＣＣＴ　ＡＧＡ　？’ｒＧ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＣＧＣＧＣ Ｇ　ＡＣＧ　ＡＧＧ　入ＡＧ　ＡＣ！’　ＴＣＣＧＡＧ　７Q０ Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　入ｒｇ　ＸＡｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　入ｒ’Ｊ 　入１ａ　Ｔｈｒ　入ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｂａｒ　Ｇｌ■ ２２５　２コ０　２コ５　２４０ （２）配列番号　６・ （蔦）配列の特性： （Ａ）長さ＝８１６塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 ＣＤ）トポロジー・直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティ カル：Ｎ０（１ｖ）アンチセンス＝ＮＯ （１ｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．８１３ （Ｘｌ）配列、配列番号、６゜ （２）配列番号ニア。

（ｉ）配列の特性・ （Ａ）長さ：６６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （爾）配列の種類　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル ：Ｎ０（ＩＶ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：配列番号ニア： （２）配列番号＝８゜ （ｊ）配列の特性： （Ａ）長さ二６６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｅ）（ｉｉｉ）ハイボセティカ ル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：配列番号：８： （２）配列番号・９ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ二６６塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｊｌ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティ カル二Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列、配列番号：９： ＧＡＴＣＣＧＡＣＧＴ　ＣＡＡＧＴｒＣＣＣＧ　ＧＧπ；ＧＣＧＧＴＣＡＧＡＴ ＣＧＴｒＧＧ　ＴＧＧＡＧｍＡＣＴＴＧＴｒＧＣＣＧＣ６０ＧＣＡＧＧＧ　６６ （２）配列番号：１ｏ： （ｉ）配列の特性・ （Ａ）長さ二６６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｌｏｉｅ）（ｉｉｉ）ハイポセティカ ル二Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：配列番号＝１ｏ： ＡＡＴＴＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＡＣＡＡ　ＧＴＡＡＡＣＴＣＣＡ　ＣＣＡＡ ＣＧＡＴＣＴ　ＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＡＡＣＴＴＧ@８０ ＡＣＧＴＣＧ　６６ （２）配列番号＋１１： （Ｄ配列の特性： （Ａ）長さ＝６６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏＩｌｉｃ）（ｉｉｉ）ハイポセティカ ル：Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：配列番号・ｌｌ： ＧＡＴＣＣＧＧＣＣＣＴＡＧＡＴＩ’ＧＧＧＴ　ＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡ　ＣＧＡ ＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧ　ＴＣＧＣＡＡＣＣＴb６０ （２）配列番号＝１２： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ、６６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｊｊ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティ カル二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号：１２： （２）配列番号＝１３゜ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｌＩｌｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポ セティカル、Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス°Ｎ０ （ｘｌ）配列：配列番号、１３： ＧｋＡＴＴ′…＾Ｃ口道届ぼＡ＾ＣＡＡＧＴＡＡＡＣτＣ３２（２）配列番号： １４・ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数・−重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセテ ィカル・Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス、Ｎｏ （ｘｉ）配列：配列番号＝１４： ＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡ　ＧＣＡＣＧＡＴｒＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＡＡ　ＡＧ　３ ２（２）配列番号：１５： （ｉ）配列の特性・ （Ａ）長さ＝２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｅ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列、配列番号：１５： ＡＴＧＡＧＣＡ（ＧＡ　ＴＴＣＣＣＡＡＡＣＣＴ　２１（２）配列番号・１６： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｌｌｌｉｅ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポ セティカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ’）配列：配列番号＝１６、 ＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴ　ＴＣＣＧＡＧＣ１７（２）配列番号＝１７＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティ カル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：Ｉ７； ＧＴＣＣＴＧＣＣＣＴ　ＣＧＧＧＣＣＧ　１７（２）配列番号：１８： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：１８： ＡＣＣＣＡＡＡＴＴＧ　ＣＧＣＧＡＣＣＴＡＣＧ　２１（２）配列番号二Ｉ９： （ｉ）配列の特性； （Ａ）長さ二１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （肯）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティカ ル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：配列番号：１９： ＴＧＧＧＴＡＡガＣＡＴＣＧＡＴＡＣ１９（２）配列番号＝２０＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 Ｃｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｃｆｃ）（ｉｆｉ）ハイポセティカ ル：Ｎ０ （ｊｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：配列番号＝２０： ＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧ　ＡＴＡＣＣＣＴ　１７（２）配列番号＝２１： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号＝２１： ＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡ　ＡＧＡＧＣＡＡＣ１８（２）配列番号：２２： （ｉ）配列の特性； （Ａ）長さ＝２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティ カル＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：２２； ＧＧＡＣＣＡＧＴｒ’ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴ　ＡＴ　２２（２）配列番号＝２ ３＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 ＣＣ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイボセティカル コＮ。

（ｊｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号＝２３： ＣＡＧＴｒＣＡＴＣＡ　ＴＣＡＴＡＴＣＣＣＡ　２０（２）配列番号＝２４＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置＋１．．１５ （Ｄ）その他の情報：／生成物＝“ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　６９３−６９１におけ るリンカ−タンパク質”（ｘｉ）配列：配列番号：２４： ＧＧＧ　ＡＴＣＣＣＣＡＡＴ　ＴＣＡ　１５Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　 Ｓｅｒ（２）配列番号：２５： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：２５： Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ（２）配列番号＝２６＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０（ｉ　ｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｉ　ｘ）特徴； （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．９ （Ｄ）その他の情報：／生成物−“ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　６９３−６９１におけ るカルボキシ末端リンカ−タンパク質” （ｘｉ）配列：配列番号：２６： ＭＴ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＴＧＡ　１２ Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ （２）配列番号：２７゜ （ｉ）配列の特性・ （Ａ）長さ：３アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：２７： Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ （２）配列番号＝２８＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．２７ （Ｄ）その他の情報：／生成物＝“ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　１５−１８におけるリ ンカ−タンパク質”（ｘｉ）配列：配列番号＝２８： ＧＧＧ　ＡＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡＡ　ＴｒＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＣＣ２７Ｇａｙ 　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒ。

（２）配列番号＝２９゜ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号＝２９： Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

（２）配列番号＝３０＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎮状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｆｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティ カル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．２１ （Ｄ）その他の情報：／生成物＝“ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　１５−１８におけるカ ルボキシ末端リンカ−タンパク質” （ｘｉ）配列：配列番号：３０： ＴＧＧ　ＧＧＧ　ＡＴＣＧＧＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＴＧＡ　２４Ｔｒｐ 　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（２）配列番号＝３１： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：３１・ Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（２）配列番号＝３ ２： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｅ）（ｉｉｉ）ハイポセティカ ル＝ＮＯ （ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．２４ （Ｄ）その他の情報：／生成物＝“ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　１５−１７におけるリ ンカ−タンパク質”（ｘｉ）配列：配列番号：３２： ＧＧＧ　ＡＴＣＣＣＣＡＡＴ　ＴＣＣｒＧｃＡＧＣＣ（Ｔ　２４Ｇｌｙ　Ｉｌｅ 　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

（２）配列番号：３３： （１）配列の特性： （Ａ）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：３３゜ Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

（２）配列番号：３４゜ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏａ＋１ｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセ ティカル二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｘ）　判■改二 （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ ＣＢ）存在位置：１．．１８ （Ｄ）その他の情報：／生成物＝“ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　１５−１７におけるカ ルボキシ末端リンカ−タンパク質” （ｘｉ）配列：配列番号：３４： ＧＧＧ　ＡＴＣＧＧＧ　ＭＴ　ＴＣＡ筋胚Ａ　２１Ｇｌｙ　ＩＩＣＧｌｙ　Ａｓ ｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（２）配列番号：３５： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号＝３５＝ Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（２）配列番号：３６： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置＝１８．１５ （Ｄ）その他の情報：／生成物；“ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　１５−１７におけるト ロンビン切断サイト”（ｘｉ）配列：配列番号：３６： ＧＴｒ　ＣＣＧ　ＣＧＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣ１５Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ 　Ｓｅｒ（２ン配列番号：３７゜ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：３７： Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ（２）配列番号：３８： （ｉ）配列の特性； （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｏｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．２１ （Ｄ）その他の情報：／生成物；“ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　１５−１７におけるリ ンカ−タンパク質”（ｘｉ）配列：配列番号：３８： ＣＣＡ　ＴＣＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴ　２１Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａ ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

（２）配列番号＝３９： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さニアアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号二３９： Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

（２）配列番号＝４０＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉ　ｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハ イポセティカル＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位Ｉｔ：　１．．１５ （Ｄ）その他の情報；／生成物；”ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　１５−１７におけるカ ルボキシ末端リンカ−タンパク質“ （ｘｉ）配列：配列番号：４０： 叩Ａ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＧＡＣＴＧＡ　１８Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　 Ａｒｇ　Ａｓｐ（２）配列番号：４１： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類二タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号＝４１： Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ（２）配列番号：４２： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｊｉｉ）ハイポセティカ ル＝ＮＯ （ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．２７ （Ｄ）その他の情報：／生成物；“ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　６９０−６９１におけ るリンカ−タンパク質”（ｘ　ｉ）配列：配列番号：４２： ＧＧＧ　ＡＴＣＣＣＣＡＡＴ　ＴＣＧ　ＡＧＣＴＣＧ　ＧＴＡ　ＣＣＣ２７Ｇｌ ｙ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

（２）配列番号：４３： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉ　ｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号　４３ Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

（２）配列番号　４４： （ｉ）配列の特性・ （Ａ、）長さ・２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数・−重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉ　ｉ’）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｏ＋１ｅ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポ 七ティカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス、Ｎｏ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．２１ （Ｄ）その他の情報：／生成物＝“ＧＳＴ−ＮＡＮＢＶ　６９０−６９１におけ るカルボキシ末端リンカ−タンパク質” （ｘｉ）配列：配列番号：４４： ＡＣＧ　ＧＧＧ　ＡＴＣＧＧＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　Ｔ作孔Ａ　２４Ｔｈｒ　Ｇｌ ｙ　Ｉｌｅ　Ｇｆｉｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（２）配列番号：４５： （ｉ）配列の特性。

（Ａ）長さ＝７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （百）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号＝４５＝ Ｔｈｒ　ＧＩ３Ｔ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（２）配列番号　 ４Ｇ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：９４１６塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ｅＤＮＡ （１目）ハイポ七ティカル　Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置＋３４２．．９３７４ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｍｆｓｅの特徴 （Ｂ）存在位置：１．．１２ （Ｄ）その他の情報：／注＝　”ＨＣＶ−Ｈｅ５９配列として確認されていない ” （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｗｉｓｅの特徴 （Ｂ）存在位置：９３９７．．９４１６（Ｄ）その他の清報：／注＝“ＨＣＶ− Ｈｃ５９配列として確認されていない′ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：繰り返し単位 （Ｂ）存在位置：群（７，，１２，４２，，４７）（Ｄ）その他の情報　／ｒｐ ｔ型＝“その他”／ｒｐｔ群＝“１” （ｉ　ｘ）特徴・ （Ａ）名称／キー・繰り返し単位 （Ｂ）存在位置１群（２３，，２８，３８，，４３，９２０９、，９２１４，９ ３９１，，９３９６）（Ｄ）その他の情報：／ｒｐｔ型＝゛その他”／ｒｐｔ群 ＝“２“ （］Ｘ）特徴。

（Ａ）名称／キー・繰り返し単位 （Ｂ）存在位置：群（１２８，，１３５，３１５，，３２２（Ｄ）その他の情報 ：／ｒｐｔ型＝“その他“／ｒｐｔ群＝“３” （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：繰り返し単位 （Ｂ）存在位置１群（９２３１，。９２３７．９２４５．。

９２５１．９２５６．．９２６２） （Ｄ）その他の情報：／ｒｐｔ型＝“その他”／ｒｐｔ群−″４′ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー・繰り返し単位 （Ｂ）存在位置一群（９２４８，，９２５３，９２２１，。

９２２６．９２２７．．９２３２） （Ｄ）その他の情報：／ｒｐｔ型＝“その他”／ｒｐｔ群＝″５″ （ｘｉ）配列：配列番号：４６： ＧＣＣｊｔＧＣＣＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡｃＡＣＴＣ１’ＪＣＣＡＴＧ ＡＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡ　ＧＧ入入ＣＴＡＣＴＧ@６０ ＣＡＧ　ＡＧＣｉ、１ｃ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＧＣＣＣＡＣσＫＧ　ＣＡＴ　Ｇ（ ｒｊ　ＣＣＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴ　ＡＡＧ　４０４９Ｇｌｎ　５ａｒ　Ｉ ｌｋ＋ｅ　ｃｌｎ　Ｖａｌ　ＡユａＪミｉｓ　ｙＡｕ　Ｊ（ｉｌｉ　Ａｌ、Ｍ　 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　！ＨｅγＧｌ凵@Ｌｙｓ １２２’ｉ　１２３１１　１ノ：１５ ＡＣＣＡｃｃ　ＡＡＣ：　ＧＴＣＣＣＧ　ＧＬＴ　ＧＣＧ　ＴｈＣＧＣＡ　ＧＣ ＣＡＡＧ　Ｇｌ’；Ｃ’ｉ”八ｒ　八ＡＧ　ＧＴＧ　ＬＩＧ@４０９７ Ｂｅ；　Ｔｂｒ　Ｌｙｆｊ　Ｖａｉ　Ｐｘｏ　入１δ　入１ａ　Ｔｙｘ：　Ａ、 ｌａ　入Ｌａ　Ｌｙｓ　ＣｈＴ　ｑＴ　Ｌｙｉ　Ｖａｌ　Ｘ`ｕ ＴＣｒ−八ＡＧ　ＧＣＣＣＡＴ　ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＣｈＴ　ＣＵＴ　Ａ入丁　八 ＴＣＡＧＧ　八ＣＣＧＧＧ　Ｇ’ｆｒ、”　ＡＧＡ　八（こ■@４１９〕 ５ａｒ　Ｔ−ｙ：＜　人Ｉｎ　！（ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｉ　人’ｐ？ｒｔｓ　入 ｓｎ　工１＋ａ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ν４１　Ａｒｇ@Ｔｈｒ １２７０　＾２７５　１２Ｒ０ 八１Ｔ　＾ｃｑ　＼Ｃｒ　ＣＧＣ入ＧＣＣＣ（八ＴＣ入（Ｔａ　’ｉ”八ＣＴＣ Ｃ入ｒＣＴＡＣ’；ＧＣＡＡＧ　Ｔ’ｒＣ（−７〕ゝ　４λSユ ニｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　τｆ〕ｒ　Ｔｙｒ 　Ｓａｒ　Ｔｌ）Ｘ’　Ｔｙｒ　Ｃ１ｙ　Ｌ”／Ｇ　ＰｌｌbＬ４）ｕ １２２５　：Ｌ２’３０　１２９ｓ　１３００！’、ｋＧ　ＴＧＣｒ：Ａ（ＴＣ ＣｈＣＣ；　ＧＡＴ　ＧＣＣＡＣＡ　ＴＣＣＡＴＣＴＣＧ　ＧＧＣｈ’ｒｒ：　 にＧｌ：　ｂａｒ　ａｒｃ@４］３７ ＧＩＩＪＣ：／Ｓ　Ｈユｘ　Ｓｅｒ　Ｔｉｔｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｏｒ　Ｓｅ ｒ工Ｉｓ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　工ｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ＶａP １１λＯＹすＳ　ｌ］：ｌ［＋ ＣＴＴ　ＧＡＣＣＡ人　ｒｔＣＩＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＧＧＣＧＧＧ　ＧＣＧ　 ＡＧＡ　ｃ’ｒｃ　ＧＴＴ　にＴＧ　ＣＴＣ（、−ＣＣ八「s４１１１１５ ７ｊｌｕ　Ａ９ｐ　Ｇ〕−ｎ　ＡＩＪＩ　ｃｌｌｊ　ＴｈＣ入１ａ　Ｇｌｙ　入 １ａ　Ａｒｇ　ＬｅｌＪ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　１ｌａｕ　入１＝@Ｔｈｒ ユ３３５　】コ４０　１コ４５ Ｇｒ：′ｒ　ＡＣＣＣＣＴ　ＣＣＧ　ＧＧＣＴＣＣＧＴＣＡｌ：’Ｔ　ＧＴＧ　 ＴＣＣＣＡＴ　ＣＣＴ　ＡＡＣＡＴＣＧＡＧ　ＧＡＧ　４４R：！ ＡｌａＴｌ’）ｒＰｒｏＰｒｏＧｌｙ５１１！ｒＶａｌτｈｒＶａよｓｓ＋ｒＨ １ｓ？ｒｏ八５ｎＩｌａＧｌｕＧコ、１講１コ５０１３５５１３６０ ＧＴＴ　Ｇ（？Ｔ　ＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＡ　ＧＡＧ　Ａｒｃ　Ｃ（Ｃ ＴＴＴ　ＴＡＣＧＧＣ入入Ｇ　ＣＣＴ　八ＴＣ４４８１Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｉｚｕ 　ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　エユｅ　Ｐｒｅ＋　Ｐｈａ　Ｔｙ ｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　八ｌａ　ｌ１■ １」６５　ユ３７０　１：１７５　１コ８０入ＡＧ　入ＡＧ　ＡＡＧ　ＴＧＣＧ ＡＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＣＣＧＣＧ　入へＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＧＣＪｔ　ＴｒＧ　 ＧＣＣＡＴＣ４５７７Ｌｙｅ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ｃｙｓ　Ａ５ｐ　Ｇｌｕ　Ｉａ ｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　ｌ１ ａ１４００　１４０５　ｉ４１０ ＭＴ　ＧＣＣＧＴＧ　ＧＣＣＴＡＣＴＡＣＣＧＣＧＧＴ　ＣＴＴ　ＣＡＣＧＴＧ 　ＴＣＴ　ＣＴＣ入子ＣＣｃＧ　ＡＣＣ４６２５Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌ ａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　入ｒｑ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｓｒ　Ｖａ ｌ　工１ｍ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ１ｔ１５　１４２０　１４２５ ＡにＣＧＧＣＧＡＴ　ＧＴｒ　ＣＴＣＧＴＣＧＴＧ　ＴＣＧ　ＡＣＣＧＡＴ　Ｇ ＣＴ　ＣＴＣＡＴＧ　ＡＣＴ　ＧＧＣｍ　４６７コＳｉｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖ ａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｍｐ　入１ａ　ｔａｕ　Ｍｅ ｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈ叱１４）０　１４コ５　１４４０ ＾ＣＣＣ，ＧＣＣＡＣＴｒＣＧＡＧ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　入Ｔ＾　ＣＡＣ丁ＧＣ入 ＡＣＡＣＧ　τＧ’Ｔ　ＧＴＣＡＣＴ　ＣＡに　４７２１Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓ ｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　ｒｌ＊　Ａｓｐ　ｃｙｓ　Ａｊｎ　Ｔ？ ＋ｒ　Ｃ’ｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇ撃戟f１ ＡＣＡ　ＧＴＣＧＡＴ　ＴＴｒ　ＡＧＣＣＴｒ　ＧＡＩ：　ＣＣＴ　Ａｃｃ　Ｔ ＴＴ　ＡＣ（：　ＡＴｌｒ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＡＣＣＡＣＧ@４７６９ Ｔｈｒ　Ｖａｌ　入Ｓｐ　Ｐｈａ　Ｓａｒ　Ｉｊｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈ’ ！：　Ｐｈａ　丁ｈｒ　Ｘｌ唸　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　嘯■■ １４６５　１４）Ｏ１４７５ ＣＴＣＣＣＣＣＡＧ　ＧＡＴ　Ｇ（Ｔ　ＧＴＣＴｅＣＡＧＧ　ＡＣＴ　Ｃ入入　 ＣＧＣＣＧＧ　ＧＧＣＡＧＧ　ＡＣＴ　ＧＧＣ４１＋１７Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉ ｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　５ｅｒＡＸｑ　丁ｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　入ｒｇ 　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ１４８０　Ｌ４８５　１４９０ ＧＣＧ　ＴＡＣＡＴＧ　ＡＡＣＡＣＣＣＣＧ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　ＣＣＣＧＴＧ　 ＴＧＣＣＡＧ　ＧＡＣＣＡＴ　Ｃ’ｆｆ　ＧＧＡ　５００９＾１ａ　Ｔ”ｆｒ　 ＭＰｔ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＬａＩ３　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ｃｙｓ 　Ｇｉｎ　入ｓｐ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ｇ撃■ ＴＩ’Ｔ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＧＧＣＧＴＣＴ’ｌ’Ｔ　ＡＣＧ　ＧＧＣＣＴＣＡ ＣＴ　ＣＡＴ　ＡＴＡ　ＣＡＴ　Ｇｅｍ　ＣＡＣＴＴＴ　５O５７ Ｐｈａ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　ｃｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈａ　丁ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　１４ｉｓ　ＩＩ＠　入１ｐ　入１ａ　Ｈｉｓ　Ｐｈ■ １５６０　ユ５６５　１５７０ ｆ７Ａ　ＴＣＣＣＡＧ　ＡＣＡ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　入σＴ　ＧＧＧ　ＧＡＧ　入 ＾ｃ　’ｒｒｒ　ｃｃτ　ＴＡＣＣＴＧ　ＧＴＡ　ＧＣＧ　T１０５ ４ＡｕＳｅｒＧｌｌＩＴｈｒＬＹＧＧｉｎＳｅｔＧＩＹＧｌｕＡｓｎＰｈｅＰｒ ｏＴｙｒＬａｕＶａｌ入ユふ１５７！ｉ　１５Ｒ０１５ａ５ ：光：：番：：　：：　Ｚ）、　：：　）；、；ｚ：会Ｇ会：　３”：１．　社 ：　塁淋：Ｃ：：：　５２４９工６２５１６コ０１６コ５ ＡＣＣＧＡＣ丁ＴＴ　入ＡＧ　ＡＣＣ丁ＧＧ　ＣＴＧ　入入Ａ　Ｇｃｅ　ｋｋＧ 　ＣＴＣＡＴＧ　Ｃ（Ｊ　ＣＡＡ　Ｃ′Ｔｃ　ＣＣＴ　６３T＋ ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＴｒＰ　Ｌａｕ　Ｌ’ｆｌａ　入１ ａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｍａｔ　Ｐｒｏ　ｃｌｎ　Ｌａｕ　Ｐ秩B ＧＧＡ　ＧＡＣＧＧＣＡＴＴ　ＡＴＧ　ＣＡＣＡＣＴ　ｅＧＣＴＧＣＣＡＣＴＣ Ｔ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＧＡＣＡＴＣＡＣＴ　６４４９ｃｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　 工ｉｔ　Ｍａｔ　）ｌｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｒ９　ｅｙｓ　Ｈｌｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ 　入１ａ　Ｇｌｕ　工１儂　丁ｈ■ ２０２５２０３０２０コ５ ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＧＴＣ入ＡＡ　ＡＡＣＧＧＧ　ＡＣＧ　ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＡＴ ＣＧＴＣＧＧＴ　ＣＣＴ　ＡＣ４Ａｃｅ　ＴＧＣ６４９７Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｖａ ｌ　Ｌｙｓ　入ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｍｓｔ　Ａｒｇ　Ｘ１＊　Ｖａｌ　Ｇｌ ｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｃｙ＊ＡＡＧ　ＡＡＣＡＴＧ　ＴＧＧ　ＡＧＴ　 ＧＧＧ　ｋＣＧ　ＴＴＣＴＴＣＡＴＴ　入ＡＴ　ＧＣＣＴＡＣ八ｅＣＡｅＧ　Ｇ ＧＣ６５４５Ｌｙｓ　Ａｓｒ＋　Ｍａｔ　Ｔｒｐ　５ａｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐ ｈａ　Ｐｈａ　Ｘｌａ　入ｓｎ　入１ａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　丁ｈｒ　Ｇｌ■ ＣＣＣ丁ＧＴ　ＡＣＴ　ＣＣＣＣＴＴ　ＣＣＴ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＡＡＣ？ＡＴ 　ＡＡＧ　ＴＴＣＧＣＧ　ＣｒＧ　ＴＣＧ　ｋＧＧ　６５９j Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　丁ｈｒ　ｐｒｏ　Ｘ４＊　ｐｒｏ　入１ａ　Ｐｒ６　Ａｊｎ　 ＴＹ！”　ＬＹＩＩ　Ｐｈａ　Ａｉａ　ｋｕ　Ｔｒｐ　Ａｒ■ ２０フＯ２０７５２０１１０ ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＴＡＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＡＴＡ　Ａ ＧＧ　ＣＧＧ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＧＡＣ丁ＴＣＣＡＣ６６４k ｖａｌ　５ｅｒ　Ａｉａ　Ｇｌｕ　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｃ１ｕ　Ｉｌａ　 Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈ＠ＨｉｓτＡＣＧ丁Ａ　ＴＣＧ 　ＧＧＣＡＴＧ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＡＣＡＡＴ　ＣＴＣｊＬＡＡ　ＴＧＣＣＣ Ｇ　ＴＧＣＣＡＧ　ＡＴＣ６６８９Ｔｙｒ　Ｖａｌ　ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　入Ｓｐ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙ＠　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　 Ｇｌｎ　ｌｌ−ＣＣＡ　丁ＣＧ　ＣＣＣＧＡＡ　ＴＴｒ　ＴＴＣＡＣＡ　ＧＡＡ 　’ＩＴＧ　ＧＡＣＧにＧ　にＴＧ　ＣＧＣＣ丁ＡＣへ丁　ＡＣＧ　６７３V Ｐｒｏ　５ｅｒ　Ｐｌ：ＯＧｌｕ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　 Ａｊｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｘ４＊　Ｈｌｓ　Ｍ７丁ＴＴ　ＧＣＧ　ＣＣ ｅ　ＣＣＴ　丁Ｇ（：　ＡＡＧ　ＣＣＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧ　ＧへＧＧ＾ＧＧ丁 Ａ　ＴＣＴ　Ｔ１’ＣＡＧＡ　６７８T Ｐｈｉｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｅｙｓ　Ｌｙｇ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｌａｕ 　Ａｒｇ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ａｒ■ ２１コ５２１４０２１４５ （ｉ？Ａ　ＧＧＡ　ＣＴＣＣＡＣＧＡＧ　ＴＡＣｅｅＧ　にＴＧ　ＧＧＧ　ＴＣ Ｇ　ＣＡＡ　ＴｒＡ　ＣＣＴ　ＴＣＣＧＡＧ　ＣＣＣ６８コR Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｎ　Ｇｌｙ　 ５＊ｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｌ：O ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＧＡＣＧＴＡ　ＧＣＣＧＴＧ　ＴＴｃ、ＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣ ＴＣＡＣＴ　Ｇ入子　ＣｅＣＴＣＣＣＡＴ　６８８１Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　ｈｓｐ　 Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＴＡｕ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　Ｍａｔ　！ａｕ　Ｔｈｒ　 入ｓｐ　Ｐｒｏ　ｓａｔ　Ｈ１ｓ２１６５　２１７０　２Ｘ７５　２１８０Ａ丁 ＾　ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　Ｇ（：ＣＧＧＧ　ＡＧＡ　八ＧＧ　ＴＴ Ｇ　ＧＣＧ　ＡＧＡ　ＧＧＧ　丁Ｃ入　ＣＣＣＣ（１’秩@６９２９ Ｘ１ｅ　Ｔｈｒ　入１ａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　にｌｙ　入ｒｇ　Ａｒｇ　 Ｉａｕ　＾１ａ　入ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

ＴＣＴ　ＡＴＣＧＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧ　ＧＣＴ　ＡＧＣＣＡＧ　ＣＴＣ丁Ｃ ＣＧＣＴ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＣＴＣ入入Ｇ　６９７フｓａｒ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　 Ｂａｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　入１ａ　Ｓａｒ　Ｇｌｎ　ｋｕ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｐ ｒｏ　Ｓｉｒ　ＩＡｕ　ＬｙｓＧＡＧ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　入入Ａ　ｃＴｃ　ｃｃ ｃ　入Ｔｅ　入入ＣＧＣＡ　ＣＴに　ＡＧｅ　Ｍｅ　ＴＣＧ　ＴＴＧ　ＣＴＡ　 ＣＧＣ７６X７ にｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｇ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｘｌａ　ＡＪｎ　Ａｌａ　 −ｕ　Ｓａｒ　ｋｉｎ　５＊ｒ　Ｌａｕ　Ｉａｕ　Ａｒ９ＣＡＴ　ＣＡＣ入ＡＴ 　ＣＴＣＧＴＧ　丁入Ｔ　丁ＣＣＡｃｅ　ＡＣＴ　Ｔ（Ｊ　ｅＧｃ　入ＧＴ　Ｃ ＣＴ　’！’ＧＣＣＡＡ　ＡＧＧ　７V４５ Ｈｉｓ　ＨＬｘ　Ａｓｎ　Ｘ４＊　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　 ｓａｗ　Ａｒ９　５ｓｔｒ　入１ａ　ＣＹＩＩ　にｉｎ　入窒■ ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＴＣＡＧＡ　ＴＴＴ　ＧＡＣＡＧＡ　ＣＴＧ　ＣＡ Ａ　ｃ’ｒｒｃτＧ　ＧＡＣＡＧＣＣＡＴ　ＴＡＣフッ９コＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌ ｙｓ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　入ｒｇ　ｋｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌａ ｕ　Ａｓｐ　５ａｒ　Ｈｌｓ　Ｔｙｒ（Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉ　ｉ）ハイボセティ カル二Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：配列番号：５２： ＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴｒＣＣＧＡＧＣ（２）配列番号＝５３： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類二ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティ カル二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ Ｃｘｉ’）配列：配列番号＝５３； ＡＣＣＣＡＡＡＴｒＧ　ＣＧＣＧＡＣＣＴＡＣ（２）配列番号：５４： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイボセティカル ：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号：５４： ＴＭＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣＣＴ　１（２）配列番号＝５５： （Ｄ配列の特性： （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　Ｄ配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｊｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティ カル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：５５： ＣＡｃ口’ＣＡＴＣＡ　ＴＣＡＴＡＴＣＣＣＡ　２（２）配列番号：５６： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１８塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　Ｄ配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイポセティカル ：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：５６： ＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡ　ＡＧＡＧＣＡＡＣＩＩ（２）配列番号＝５７： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘＤ配列：配列番号＝６２＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：６３： ＣＴＧＴＣＧＧＴＣＧ　ＴＴＣＣＣＡＣＣＡ（２）配列番号：６４： Ｕ）配列の特性： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号：６４： ＣＣＧＣＧＡＡＧＡＧ　ＴＧＴＧπｍ刀Ｔ（２）配列番号：６５： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイポセティカ ル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：６５： ＣＡＡＴＧＴＴＣＴＧ　ＧＴＧＧＡＧＧＴＧ　１９（２）配列番号＝６６＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 １９　Ｃ１１）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｒｎｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイ ポセティカル：Ｎ０（ｊｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号二６６： ＧＣＣＡＴｒＡＡＧＴ　ＧＧＧＡＧＴＡＣＧＴ　ＣＧＴｒＣＴＣＣ２８（２）配 列番号二６７： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ２０　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０ （４ｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：６７： ＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡ　ＴＡＣＡＡＧＡＣＣ１９（２）配列番号：６８： （Ｄ配列の特性： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｊｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｔｎｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号＝７３： ＣＴＡＧＧ八ＧＧＣへ　ＣＣＴＴＧＴＣＴＧＣ（２）配列番号ニア４コ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティ カル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：配列番号ニア４： ＣＴＣＧＧＧＣＣＡＧ　ＣＣＧＡＴＧＧＡ（２）配列番号＝７５： （Ｄ配列の特性： （Ａ）長さ＝１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１０配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカ ル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号＝７５： ＧＧＧＧＡＣＣＴＣＡ　ＴＧＧＴｒＧＴＣＴ（２）配列番号＝７６： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 ２０　（ｉ４）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｆｃ）（ｉｉｊ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号ニア６： ＣＣＣＧＴＧＧＡＧＴ　ＧＧＣＴＭＧＧ　１１（２）配列番号ニア７： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 １ｇ　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｊｉｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号ニア７： ＣＴＣＣＴＣＧＡＴＧ　’ＩＴＧＧＧＡＴＧＧ　１’（２）配列番号ニア８： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 １９　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボ セティカル：ＮＯ（２）配列番号二８４： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：８４： ＧＴＡＡＧＧＡＡＧＧ　”ｒＴｃｒｃｃｃｃＡｃ　ＴＣ（２）配列番号＝８５＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝Ｎ。

（ｘｉ）配列：配列番号：８５： ＡＴＧＣＣＣＡＣＴｒ　ＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧ　ＡＣＡＡＡＧＣ（２）配列番号 二８６： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　Ｄ　ＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセ ティヵル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号二８６： ＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴ　ＧＡ″ＴＧＴＡＴ（２）配列番号：８７： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）Ｉの数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ２２　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｔｎｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイ ポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号＝８７： ＧＧＡＣＡＡＧＡＣＧ　ＡＣＣ（ＴｒＣＣ（２）配列番号＝８８＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジｍ：直敵状 ２７（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｆｉｉ）ハイポセティ カル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｘｉ）配列：配列番号＝８８＝ ＣＧＴＡＴｒＧｃＣＴ　ＧＴＣＡＡＣＡＧＧＣ２＋（２）配列番号＝８９＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２０塩基対 （ｊｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｊｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティ カル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号：９４： ＡＴＧＴＧＧＡＧＴＧ　ＧＧＡＣＣＴｒＣＣ（２）配列番号：９５・ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｔｎｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセ ティカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：９５： ＣＴＣＴＧＣＴＧＴｒ　ＡＴＡＴＧＧＧＡＧＧ（２）配列番号：９６： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｊ　ｉ　ｉ）ハイボセテ ィカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号：９６： ＧＴｒＧＡＣＧＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＣＴＧ（２）配列番号＝９７＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 １９　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｆｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポ セティカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：９７： ＴＴｒＣＣＡＣＧＴＣＴＣＣＡＣＴＡＧＣＧ　２１（２）配列番号＝９８＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：Ｉ８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ２０　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポ セティカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘ　ｉ）配列：配列番号二９８： ＧＴＧＡＧＧＡＣＣＡ　ＣＣＧＴＣＣＧＣ１８（２）配列番号：９９： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ２０　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｔＤハイポセティ カル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス二ＮＯ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイポセティカ ル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：ＩＯ２： ＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴ　ＣＡＣＧＧＣＣＡＡ（２）配列番号：ＩＯ２： （Ｄ配列の特性： （Ａ）長さ＝１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ０Ｃ５ｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘ　ｉ）配列：配列番号：１０６： ＧＡＴＧＧＣＴＩＴＧ　ＴＡＣＧＡＣＧＴＧ（２）配列番号：ＩＯ２： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティ カル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：１０７： ＧＣＡＣＣＴＧＣＧＡ　ＴＡＧＣＣＧＣＡＧＴ　２０（２）配列番号＋１０８： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 １９　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポ セティカル二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：配列番号：１０８： ＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＧＡＧＡＧＧＣＴ　１ｇ（２）配列番号：１０９： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 １９　（ｉｆ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｊ　Ｄハイポセ ティカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号：１０９： ＧＡＴｒＧＧＡＧＧＴ　ＡＧＡＴＣＡＡ（ＴＧ　２０（２）配列番号：１１０： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　 Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ@Ｌｅｕ　Ｐｈｅ ｌ　５　１０　１５ Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　ｌｉｅ（２）配列 番号：１１６： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２６アミノ酸 （Ｅ３）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：１１６二 Ｈ３ｓ　ＶａＩ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ@Ｔｒｐ　Ｌｅｕ ｌ　５　１０　１５ Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ（２）配列 番号：１１７： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：ｌＩ７： ）１ｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ 　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅ秩@Ｍｅｔ　Ｐｈｅ ｌ　５　１０　１５ Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ（２）配列 番号二１】８： （Ｄ配列の特性： （Ａ）長さ：２６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号＋１１８＋ Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ@Ｌｅｕ　Ｐｈｅ ｌ　５　１θ　１５ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ｌｉｅ（２）配列 番号＋１１９： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：ｌ１９： Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　 Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ@Ｌｅｕ　Ｐｈｅ ｌ　５　１０　１５ Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ（２）配列 番号：Ｉ２０： （ｉ）配列の特性； （Ａ）長さ：２６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｆ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：１２０： Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ@Ｌｅｕ　Ｌｅｕ ｌ　５　１０　１５ Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ（２）配列 番号：１２１： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （肖）配列の種類：ペプチド （ｘ　ｉ）配列：配列番号：１２１： Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　 Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ@Ｐｈｅ　Ｌｅｕ ｉ　ｓ　ｔｏ　１ｓ Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｔｉｅ（２）配列 番号：１２２： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （Ｘ］）配列：配列番号：１２２： ＶａＩ　Ａｈａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　ｋｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ@Ｉｌｅ　Ａｓｐ ｌ　５　１０　１５ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ（２）配列番号：１２３： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝３０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号＋１２３： Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ@Ｉｌｅ　Ａｓｐ ｌ　５　１０　１５ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ（２）配列番号：１２４： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：１２４： Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ@Ｖａｌ　Ａｓｐ ｌ　５　１０　、　１５ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔ（２）配列番号：１２５二 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：１２５： Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ@Ｖａｌ　Ａｓｐ ｌ　５　１０　１５ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔ（２）配列番号７１２６二 （Ｄ配列の特性： （Ａ）長さ：３０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：１２６： Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ@Ｖａｌ　Ａｓｐ ｌ　５　１０　１５ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔ（２）配列番号：Ｉ２７： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：１２７： Ｌｅｕ　Ａｌａ＾Ｉａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔ ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　uａｌ　Ａｓｐ ｌ　５　１０　１５ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔ（２）配列番号＋１２８： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：Ｉ２８： Ｌｅｕ　Ａｈａ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　 Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇａｙ　Ｐｒｏ@ｌｉｅ　５ｅｒ Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ（ ２）配列番号：１２９： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：Ｉ２９： Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ（ ２）配列番号＋１３０＋ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：１３０： Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　 Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ@Ｉｌｅ　５ｅｒ Ｈｉｓ＾Ｉａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ（２ ）配列番号：Ｉ３１： Ｃｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：Ｉ３１： ＆ｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ＾ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｐｈ ｅ＾Ｉａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｉｌ■@’ｒｈｒ ）１ｉｓ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　ＰｒｏＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ（ ２）配列番号：１３２： （Ｄ配列の特性： （Ａ）長さ、２７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号＋１３２： Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　 Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ@Ｉｌｅ　Ｔｈｒ ｔ　ｓ　ｔｏ　１ｓ Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ（ ２）配列番号：１３３： （ｆ）配列の特性： （Ａ）長さコ２７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種Ｍ：ペプチド （ｘ　ｉ）配列：配列番号：１３３： Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　 Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ@Ｉｌｅ　Ｔｈｒ （２）配列番号＋１３４： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ二２７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：１３４： Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　 Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ@ｌｉｅ　５ｅｒ Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ（ ２）配列番号＋１３５： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類；ペプチド （ｘＤ配列：配列番号：１３５： Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＩＪｅ　Ｔｈｒ　Ｇａｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ@Ａｌａ　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ（２）配列番号二１３６： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：１３６： Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ@Ａｌａ　Ｓｅｒ Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ（２）配列番号：１３７： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列；配列番号：１３７： Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ@Ａｌａ　５ｅｒ Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ田の謹審報告 ｍ−１−−旬一〇−１１ｐロア＋ｌＱ　Ｑ、ｔ、、、、、、。

Ｘｒ＝ｔ＊、−：、ｂ”−Ｌｔ：、＝１　４；上１ｃｈ’ｂＬ：ｒ、Ｉ＋＋、ｒ ？？、”、４２９！、’ｅＥＣ’？７Ｉ−帯、Ｌｖｃ？、＋ｒ、＋ｙｒ＋ｔｔｏ ＰＣτｌτｒ１＝＝＾ｌ二二テーＮＩＴ、　０ＩＩＳｔ’ＦＩＶＡＴ？ＯＮ’： 　ｗ１＋１：ｌ’！ｍ　ｕｌ＋：τＹ　？ｒ　ＩＮＶＥＲＴ：Ｏ）＋　１’：　 Ｌ、１．’ＪI）＋Ｃ Ｇｒｏｕｐ　：Ｘ、ｃｌｓｉ＊ｓ　：’５−２ａ、？二、−【、ピ　フニ＋　己 ｍｂｒ＋　’＋Ｌ　；＝１＞）曇１’−ｉゴーね。

Ｃ工ａｃｔｉ？工ｅｅｌ　ｉｒ、ｃｌａｔ！＋　＝３Ｃ，ｃｖＬｃｌａｚｃ　２ ＳＧ。

Ｏｒ。６　ＮＶ、　ｃ４ａヱ＠−、Ｌ　７５−”ｌ（’、ピｒａｓｈ、ｔ−ｍ醗 ｔｌ＝ゴ　ｖ＝ｉｒ＋；　、−二７ｔ”ｋ’二ご疵−１ｈ−ｈＩＩｔ−Ｌｐｄ　 ；ｒ＋　Ｃｌａｃｇ　４？ｒ、ｃｕＬ；二ｈｃｉ　Ｓ。

ｉ＋ｏ＝ｐ　Ｖ！、Ｃ工ａｉｆｆ　４４．　ｄｒ＆ｗｎ、ｔｂ　＆　ｈ−ｃ（＋ 、ｃ心　ｓ（ｒｈａｋヱ’−Ｑ　ａ　Ｉｔｏｔａ二ｔ。

（ユａＬＬ工ｆ二ｐｄ　ｉｈ　Ｃ二ｍ１ｌｌ　Ｓ２？ｇ　ｃｕＬｃｉａｔｔ　＝ ＝＝１叫 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ＾ｐｐｌｉｃａｔｌｏｎＮｃ、ＰＣＴＵＦ９二ｌの ６む７フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　７１０８　７５３ ７−４Ｈ ７／１０　７５３７−４Ｈ １３１００８６１９−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ２１１０８　８２１４−４Ｂ Ｃ１２Ｑ　１／７０　７８２３−４Ｂ ／／　Ｇｏ　ＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７６　Ｚ　９０１ ５−２Ｊ （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） ｒｃ１２Ｐ　２１１０２ ＣＩ２Ｒ１：１９） ＣＯ７Ｋ　９９：００ Ｉ フロントベージの続き （８１）指定図　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＡＵ 、ＣＡ、ＪＰ、ＫＲ （７２）発明者　ゼベディー　スーザンアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９２１２２　サン　ディエゴ　チャーマントドライヴ　７５４４ （７２）発明者　インチョースブ　ジェネヴイーヴアメリカ合衆国　ニューヨー ク州　１００２１ニユーヨーク　イースト　シックスティサード　ストリート　 ５０４ （７２）発明者　ネイソフ　マーク　ニスアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９２１３１　サン　ディエゴ　ミラ　ラーゴウェイ　１１７３４ （７２）発明者　プリンス　アルフレッド　エムアメリカ合衆国　ニューヨーク 州　１０５７６ポンド　リッジ　ストーン　ギル　ロード　１５４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ハッチサブグループに属する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（ＮＡＮＢＶ）のゲノ ムをコードするＤＮＡ配列であって、次のＤＮＡ配列：（ａ）配列番号：４６に 示すハッチｃ５９ＤＮＡ配列、（ｂ）前記ＤＮＡ配列（ａ）と同一のポリペプチ ドをコードするが、遺伝子コードの縮退の結果として前記ＤＮＡ配列（ａ）とは 異なるＤＮＡ配列、（ｃ）前記ＤＮＡ配列（ａ）または（ｂ）にハイプリダイズ し、主として同一の特異的免疫学的性質を示すＮＡＮＢＶハッチｃ５９株の変異 体または変種を表すＤＮＡ配列、および （ｄ）前記ＤＮＡ配列（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズし、ハッチサブグル ープの免疫学的性質を存するＮＡＮＢＶ株を表すＤＮＡ配列、の群から選択され る前記ＤＮＡ配列。 ２．請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列の一部に対応する約１０〜２００ヌクレ オチドの長さを有するＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列は、ＨＣＶ−１、Ｈ ＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣ−Ｊｌ、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣＶ−ＪＨおよびＨＣＶ −Ｈｈよりなる群から選択されるＮＡＮＢＶの株のヌクレオチド配列と比較した 場合に配列において少なくとも１つのヌクレオチドの相異を有し、前記ヌクレオ チドの相異はサイレント変異または少なくとも１つのアミノ酸における相異を生 起する変異を表すＤＮＡ配列。 ３．ＮＡＮＢＶゲノムの可変領域またはその一部をコードするＤＮＡ配列であっ て、前記領域またはその一部が、 （ａ）Ｖ可変領域： 【配列があります】 （４６：３８６−４１１）、 （ｂ）Ｖの一部： 【配列があります】 （４６：３９１−４０４）、 （ｃ）Ｖ１可変領域： 【配列があります】 （４６：２４６−２７５）、 （ｄ）Ｖ１の一部： 【配列があります】 （４６：２４６−２６５）、 （ｅ）Ｖ２可変領域： 【配列があります】 （４６：４５６−４８２）、 （ｆ）Ｖ２の一部： 【配列があります】 （４６：４６１−４６６）、 （９）Ｖ■の一部： 【配列があります】 （４６：４７３−４８２）、および （ｈ）Ｖ３可変領域 【配列があります】 （４６：２３５６−２３７９） よりなる群から選択されるアミノ酸配列（その配列番号および対応する残基を括 弧内に示す）を有するＤＮＡ配列 ４．ＮＡＮＢＶゲノムから誘導され、請求の範囲第３項に特徴を示したＤＮＡ配 列のいずれかによりコードされる可変領域またはその一部に対応する可変領域ま たはその一部をコーＦするＤＮＡ配列。 ５．請求の範囲第３項または第４項記載のＤＮＡ配列からなる約１８〜２００ヌ クレオチドの長さを有するＤＮＡ配列。 ６．配列番号：４６に示す配列に対応する請求の範囲第３項または第５項記載の ＤＮＡ配列。 ７．配列番号：１の残基工〜１２０に含まれるアミノ酸配列を有するＮＡＮＢＶ 構造カプシド蛋白質をコードするか、または前記蛋白質の免疫学的に活性な部分 をコードするＤＮＡ配列。 ８．請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、ＮＡＮＢＶ構造カ プシド蛋白質または免疫学的に活性なその部分をコードするＤＮＡ配列。 ９．配列番号：１の残基１〜残基２０に含まれるアミノ酸配列を有するＮＡＮＢ Ｖ構造カプシド蛋白質の部分をコードするＤＮＡ配列。 １０．配列番号：１の残基１〜残基７４に含まれるアミノ酸配列を有するＮＡＮ ＢＶ構造カプシド蛋白質の部分をコードするＤＮＡ配列。 １１．配列番号：１の残基２１〜残基４０に含まれるアミノ酸配列を有するＮＡ ＮＢＶ構造カプシド蛋白質の部分をコードするＤＮＡ配列。 １２．配列番号：１の残基２〜残基４０に含まれるアミノ酸配列を有するＮＡＮ ＢＶ構造カプシド蛋白質の部分をコードするＤＮＡ配列。 １３．配列番号：１の残基６９〜残基１２０に含まれるアミノ酸配列を有するＮ ＡＮＢＶ構造カプシド蛋白質の部分をコードするＤＮＡ配列。 １４．配列番号：１の残基１２１〜残基３２６に含まれるアミノ酸配列を有する ＮＡＮＢＶ構造カプシド蛋白質の部分をコードするか、または前記蛋白質の免疫 学的に活性な部分をコードするＤＮＡ配列。 １５．請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、ＮＡＮＢＶ構 造エンベロープ蛋白質または免疫学的に活性なその部分をコードするＤＮＡ配列 。 １６．配列番号：１の残基１２１〜１７６に含まれるアミノ酸配列を有するＮＡ ＮＢＶ構造エンベロープ蛋白質の部分をコードするＤＮＡ配列。 工７．配列番号：１の残基１〜残基３２６に含まれるアミノ酸配列をコードする か、前記アミノ酸配列の免疫学的に活性な部分をコードするＤＮＡ配列。 １８．請求の範囲第１項乃至第１７項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列からな るＤＮＡ配列。 １９．請求の範囲第１項乃至第１８項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列に機能 的に連結されたベクタからなる組換えＤＮＡ分子。 ２０，前記ベクタが発現ベクタであり、前記分子は和合性の宿主中で前記蛋白質 を発現することができ、前記ＮＡＮＢＶ構造蛋白質は配列番号：２の残基１〜残 基３１５に示されるアミノ酸残基配列を有する請求の範囲第１９項記載の組換え ＤＮＡ分子。 ２１．前記ベクタが発現ベクタであり、前記分子は和合性の宿主中で前記蛋白質 を発現することができ、前記ＮＡＮＢＶ構造蛋白質は配列番号：３の残基１〜残 基２５２に含まれるアミノ酸残基配列を有する請求の範囲第１９項記載の組換え ＤＮＡ分子。 ２２．前記ベクタが発現ベクタであり、前記分子は和合性の宿主中で前記蛋白質 を発現することができ、前記ＮＡＮＢＶ構造蛋白質は配列番号：４の残基１〜残 基２５２に含まれるアミノ酸残基配列を有する請求の範囲第１９項記載の組換え ＤＮＡ分子。 ２３．前記ベクタが発現ベクタであり、前記分子は和合性の宿主中で前記蛋白質 を発現することかでき、的証ＮＡＮＢＶ構造蛋白質は配列番号：６の残基１〜残 基２７Ｈこ含まれるアミノ酸残基配列を有する請求の範囲第１９項記載の組換え ＤＮＡ分子。 ２４．請求の範囲第１項乃至第１８項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列または 請求の範囲第１９項乃至第２３項のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子を含 む形質転換された宿主細胞。 ２５．請求の範囲第１項乃至第１８項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列または 請求の範囲第１９項乃至第２３項のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子によ りコードされるポリペプチドまたはペプチド。 ２６．約７〜約２００アミノ酸残基の長さを有する請求の範囲第２５項記載のポ リペプチドまたはペプチド。 ２７．少なくとも２０アミノ酸の長さを有するＮＡＮＢＶ構造蛋白質である請求 の範囲第２５項記載のポリペプチドまたはペプチド。 ２８．請求の範囲第２５項乃至第２７項のいずれか１項に記載の少なくとも１つ のポリペプチドまたはペプチドを含む組成物。 ２９．請求の範囲第２５項乃至第２７項のいずれか１項に記載のポリペプチドま たはペプチドとは免疫反応するが、ＮＡＮＢＶ単離物ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−ＢＫ 、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣＶ−ＪＨまたはＨＣＶ−Ｈｈとは 免疫反応しない抗体。 ３０．ＮＡＮＢＶのハッチｃ５９単離物またはその部分とは免疫反応するが、Ｎ ＡＮＢＶ単離物ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ ４、ＨＣＶ−ＪＨまたはＨＣＶ−Ｈｈとは免疫反応しない抗体。 ３１，少なくとも１つの検定を行うのに十分な量の請求の範囲第２５項乃至第２ 了項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドまたはペプチドを含 む、ＮＡＮＢＶ構造抗原に対する抗体の存在について体液サンプルを検定する診 断キット。 ３２．前記ポリペプチドまたはペプチドが固体マトリックスに固定された請求の 範囲第３１項記載の診断キット。 ３３．少なくとも１つの検定を行うのに十分な量の、（ｉ）（ａ）ＮＡＮＢＶの ハッチ。５９単離物、（ｂ）請求の範囲第２５乃至第２７項のいずれか１項に記 載のポリペプチドまたはペプチドと免疫反応するが、（ｉｉ）（ｃ）ＮＡＮＢＶ 単離物ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣ Ｖ−ＪＨまたはＨＣＶ−Ｈｈ、または（ｄ）Ｃ−１００抗原とは免疫反応しない 、 抗ＮＡＮＢＶ構造蛋白質抗体を含む、ＮＡＮＢＶ構造抗原の存在について体液サ ンプルを検定する診断キット。 ３４．前記抗体が固体マトリックスに固定された請求の範囲第３３項記載の診断 キット。 ３５．ＮＡＮＢＶ構造抗原に対する抗体の存在について体液サンプルを検定する 方法であって、 （ａ）前記体液サンプルと請求の範囲第２５乃至第２７項のいずれか１項に記載 のポリペプチドまたはペプチドとを混合することにより水性免疫反応混合物を形 成し、 （ｂ）存在する全ゆる前記抗体が前記ポリペプチドまたはペプチドと免疫反応し て免疫反応生成物を形成するのに十分な時間湖面の間前記水性免疫反応混合物を 維持し、 （ｃ）形成された全ゆる前記免疫反応生成物の存在、およびこれにより前記抗体 の存在を検出する、 ことを含む方法。 ３６．前記ポリペプチドまたはペプチドが固体マトリックスに固定された請求の 範囲第３５項記載の方法。 ３７．工程（ｃ）における前記検出が、（ｉ）工程（ｃ）で形成された前記免疫 反応生成物とラベルした特異的結合剤とを混合してラベル化混合物を形成し（前 記ラベルした特異的結合剤は特異的結合剤およびラベルからなる）、 （ｉｉ）存在する全ゆる前記免疫反応生成物が前記ラベルした特異的結合剤と結 合してラベルされた生成物を形成するのに十分な期間の間前記ラベル化混合物を 維持し、 （ｉｉｉ）形成された全ゆる前記ラベルされた生成物の存在、およびこれにより 前記免疫反応生成物の存在を検出する、工程を含む請求の範囲第３６項記載の方 法。 ３８．前記特異的結合剤を、プロテインＡおよび抗体抗ヒトＩｇＧおよび抗ヒト ＩｇＭの少なくとも１つよりなる群から選択する請求の範囲第３７項記載の方法 。 ３９．前記ラベルを、ランタニドキレート、ビオチン、酵素および放射能活性ア イソトープよりなる群から選択する請求の範囲第３７項記載の方法。 ４０．ＮＡＮＢＶポリ核酸の存在について体液サンプルを検定する方法であって 、 （ａ）請求の範囲第１項乃至第１８項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を有す るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと前記体液サンプルとを混合する ことにより水性ハイブリダイゼーション混合物を形成し、（ｂ）存在する全ゆる 前記ＮＡＮＢＶポリ核酸が前記ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとハ イブリダイズしてハイブリダイゼーション生成物を形成するのに十分な時間期間 の間およびハイブリダイズ条件下で、前記水性ハイブリダイゼーション混合物を 維持し、 （ｃ）形成された全ゆる前記ハイブリダイゼーション生成物の存在、およびこれ により前記ＮＡＮＢＶポリ核酸の存在を検出する、ことを含む方法。 ４１．ＮＡＮＢＶ構造抗原の存在について体液サンプルを検定する方法であって 、前記サンプルと請求の範囲第２９項または第３０項記載の抗体とを反応させる ことを含む方法。 ４２．免疫学的に有効な量の請求の範囲第２５項乃至第２７項のいずれか１項に 記載のポリペプチドまたはペプチドを含む接種物（前記ポリペプチドまたはペプ チドは、単独または抗原性キャリヤに待合させ薬学的に許容し得る賦形剤中に分 散させる）。 ４３．免疫学的に有効な量の請求の範囲第２５項乃至第２７項のいずれか１項に 記載のポリペプチドまたはペプチドを含むワクチン（前記ポリペプチドまたはペ プチドは、単独または抗原性キャリヤに結合させ薬学的に許容し得る賦形剤中に 分数させる）。 ４４．ＮＡＮＢＶ構造蛋白質を製造する方法であって、（ａ）請求の範囲第２４ 項記載の形質転換された宿主細胞を含む栄養培地を含む培養を開始し、 （ｂ）形質程転された宿主細胞がＮＡＮＢＶ構造蛋白質を発現するのに十分な時 間期間の間培養を維持し、 （ｃ）培養物からＮＡＮＢＶ構造蛋白質を回収する、ことを含む方法。 ４５．哺乳動物中で抗体生産を誘発する方法であって（前記抗体はＮＡＮＢＶと 免疫反応性である）、（ａ）前記哺乳動物に対して請求の範囲第４２項記載の接 種物または請求の範囲第４３項記載のワクチンを投与し、（ｂ）前記哺乳動物が 免疫学的に応答して抗ＮＡＮＢＶ抗体を生産するのに十分な時間期間の間哺乳動 物を維持することを含む方法。