JPH03172180A - α―アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素およびその製造方法 - Google Patents
α―アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素およびその製造方法Info
- Publication number
- JPH03172180A JPH03172180A JP2234616A JP23461690A JPH03172180A JP H03172180 A JPH03172180 A JP H03172180A JP 2234616 A JP2234616 A JP 2234616A JP 23461690 A JP23461690 A JP 23461690A JP H03172180 A JPH03172180 A JP H03172180A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacillus
- acetolactate
- enzyme
- licheniformis
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/08—Bacillus brevis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/10—Bacillus licheniformis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/833—Bacillus brevis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/836—Bacillus licheniformis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（１）産業上の利用分野
本発明は、新規なα−アセトラクテート デ力ルポキシ
ラーゼおよびその製造方法に関する。
ラーゼおよびその製造方法に関する。
（２）従来技術
アルコールｔｔ飲料、例えばビールもしくはぶどう酒の
発酊中、しばしば少量のジアセチルが生威する。ジアセ
チルの生成は最も不利である。と言うのは、その臭いが
強くしかも不快なものであり更にビールの場合には、０
．ｌＯ〜０．ｌ５■／ｌのジアセチルの少里においても
ビールの香りと味に好ましくない影響を与えるからであ
る。ビール中のジアセチルは、直接ジアセチルを生成す
るペデイオコソカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）菌株の
感染によって一部引き起こされ（Ｅ．Ｇｅｉｇｅｒ、ジ
アセチル イン ビア（旧ａｃｃｔｙｌ ｉｎ Ｂｉｅ
ｒ）， Ｂｒａｕｗｅｌｔ ４６． １６８０〜１６９
２． １９８０）更に以下の事実によっても一部引き起
こされる。すなわち、ピルへート（ｐｙｒｕｖａｔｃ）
からのビール酵母はα−アセトラクテートを形威しこれ
は酵素依存反応ではなく、温度依存反応によりジアセチ
ルに変換される。ビールの熟或中、ジアセチルは醇母細
胞中の還元酵素によりアセトインに変換される。アセト
インは、味と風味に関しジアセチルよりもより高い濃度
でビールにおいて許容できる． ビール中のジアセチル量を減少する他の可能性は、アセ
トラクターゼ デカルボキシラーゼによりα−アセトラ
クターテをアセトインに直接変換することにある（ＥＰ
特許出願第４６０６６号参照）。
発酊中、しばしば少量のジアセチルが生威する。ジアセ
チルの生成は最も不利である。と言うのは、その臭いが
強くしかも不快なものであり更にビールの場合には、０
．ｌＯ〜０．ｌ５■／ｌのジアセチルの少里においても
ビールの香りと味に好ましくない影響を与えるからであ
る。ビール中のジアセチルは、直接ジアセチルを生成す
るペデイオコソカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）菌株の
感染によって一部引き起こされ（Ｅ．Ｇｅｉｇｅｒ、ジ
アセチル イン ビア（旧ａｃｃｔｙｌ ｉｎ Ｂｉｅ
ｒ）， Ｂｒａｕｗｅｌｔ ４６． １６８０〜１６９
２． １９８０）更に以下の事実によっても一部引き起
こされる。すなわち、ピルへート（ｐｙｒｕｖａｔｃ）
からのビール酵母はα−アセトラクテートを形威しこれ
は酵素依存反応ではなく、温度依存反応によりジアセチ
ルに変換される。ビールの熟或中、ジアセチルは醇母細
胞中の還元酵素によりアセトインに変換される。アセト
インは、味と風味に関しジアセチルよりもより高い濃度
でビールにおいて許容できる． ビール中のジアセチル量を減少する他の可能性は、アセ
トラクターゼ デカルボキシラーゼによりα−アセトラ
クターテをアセトインに直接変換することにある（ＥＰ
特許出願第４６０６６号参照）。
アセトラクテート デカルボキシラーゼは、ビールの主
発Ｉ１ｉタ中又は熟成過程中に添加される。
発Ｉ１ｉタ中又は熟成過程中に添加される。
細胞内醇素は、微生物クレブシエラ ニューモニア（Ｋ
ｌｅｂｓｉｃｌｌａ即送儲埠圓）から回収される（Ｊｕ
ｎｉ Ｅ．， Ｂ．旧ｏｌ．ｃｈｅｍ．１９５＋ ７１
５−７２６（１９５２））。
ｌｅｂｓｉｃｌｌａ即送儲埠圓）から回収される（Ｊｕ
ｎｉ Ｅ．， Ｂ．旧ｏｌ．ｃｈｅｍ．１９５＋ ７１
５−７２６（１９５２））。
クレブシヱラ ニューモニア（村地ゴ辛は孕肌弘壓城櫨
）としては、病原微生物が存するが、しかしこれは工業
的利用し゛ζは十分通しない。更に、該微生物により生
産されたアセトラクテート デ力ルポキシラーゼは、そ
の企図されている使用条性中、ビールの場合約ｐＨ４．
３でありかつ約ｌＯ゜Ｃである条件下では安定性が悪い
。
）としては、病原微生物が存するが、しかしこれは工業
的利用し゛ζは十分通しない。更に、該微生物により生
産されたアセトラクテート デ力ルポキシラーゼは、そ
の企図されている使用条性中、ビールの場合約ｐＨ４．
３でありかつ約ｌＯ゜Ｃである条件下では安定性が悪い
。
（３）発明が解決しようとする問題点
本発明の目的は、上記条件のもとでより良好な安定性を
有し更に改善された収率で非病原微住物から回収できる
新規なアセトラクテート デカルポキシラーゼ酵素を提
イハすることにある。
有し更に改善された収率で非病原微住物から回収できる
新規なアセトラクテート デカルポキシラーゼ酵素を提
イハすることにある。
（４）問題点を解決する手段および作用本発明は以下の
驚くべき知見に基づく．すなわら、かかる性質を有する
新規なアセトラクテートデカルボキシラーゼがバシラス
プレビスる微生物により高収率で得られるという事実
である． 第一の面によれば、本発明はバシラス ブレビ菌株ＡＴ
ＣＣ１２７５９， ＡＴＣＣ１２７１３，八ＴＣＣ１１
９４６， ＡＴＣＣ２７３２６．ＮＲＲＬ Ｂ−３７５
１，ＮＣＴＣ２１２０，ＮＣＴＣ８７２１，ＮＣ４Ｂ６
８１６．ＮＣＩＢ８５３７および、ＮＣＩＢ１１８６８
の適当な栄養培地中で培養することによって得られるα
−アセトラクテート デカルポキシラーゼ酵素を提供す
る。
驚くべき知見に基づく．すなわら、かかる性質を有する
新規なアセトラクテートデカルボキシラーゼがバシラス
プレビスる微生物により高収率で得られるという事実
である． 第一の面によれば、本発明はバシラス ブレビ菌株ＡＴ
ＣＣ１２７５９， ＡＴＣＣ１２７１３，八ＴＣＣ１１
９４６， ＡＴＣＣ２７３２６．ＮＲＲＬ Ｂ−３７５
１，ＮＣＴＣ２１２０，ＮＣＴＣ８７２１，ＮＣ４Ｂ６
８１６．ＮＣＩＢ８５３７および、ＮＣＩＢ１１８６８
の適当な栄養培地中で培養することによって得られるα
−アセトラクテート デカルポキシラーゼ酵素を提供す
る。
α−アセトラクテート デカルポキシラーセ酵素製品は
、固体又は液状形でありかつ一般に固体形でタンパクｌ
ｍｇ当たりＯ． ｌ〜ＩＯＮＵ （以下に定義される）
の範囲内にある活性度を有する．本発明の別の面によれ
ば、α−アセトラクテート デカルポキシラーゼ酵素の
製造方法が提イ』（され、この方法は、炭素および窒素
源を含ｆ『する適当な栄養給地中で、バシラス ブレビ
ス（ｊｌａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）およびバシラス
リケニ フオルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｓｉｓ）からなる群から選ばれるα−アセト
ラクテート デカルボキシラーゼ生産バシラス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）菌株を培養し、しかる後培地中、細胞から
α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素を回収
することを含んでなる．本発明の好ましい態様において
、バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ
ｓ）菌株がＡＴＣＣＩ １０３１であるか、又はα−ア
セトラクテート デカルボキシラーゼ醇素を生産するそ
れらの突然変異体もしくは変異体で興る。
、固体又は液状形でありかつ一般に固体形でタンパクｌ
ｍｇ当たりＯ． ｌ〜ＩＯＮＵ （以下に定義される）
の範囲内にある活性度を有する．本発明の別の面によれ
ば、α−アセトラクテート デカルポキシラーゼ酵素の
製造方法が提イ』（され、この方法は、炭素および窒素
源を含ｆ『する適当な栄養給地中で、バシラス ブレビ
ス（ｊｌａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）およびバシラス
リケニ フオルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｓｉｓ）からなる群から選ばれるα−アセト
ラクテート デカルボキシラーゼ生産バシラス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）菌株を培養し、しかる後培地中、細胞から
α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素を回収
することを含んでなる．本発明の好ましい態様において
、バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ
ｓ）菌株がＡＴＣＣＩ １０３１であるか、又はα−ア
セトラクテート デカルボキシラーゼ醇素を生産するそ
れらの突然変異体もしくは変異体で興る。
好ましいバシラ．ス リケニフオルミス菌株は、ＡＴＣ
Ｃ１２７５９，＾ＴＣＣ１２７１３， ＡＴＣＣ１１９
４６，＾ＴＣＣ２７３２６，ＮＲＲＬ Ｂ−３７５１，
ＮＣＴＣ２１２０， ＮＣＴＣ８７２１， ＮＣＩＢ
６８１６．ＮＣＩＢ８５３７、およびＮＣＩＢｌ１８６
Ｆｌ並びにα−アセトラクテート デカルポキシラーゼ
酵素を生産するそれらの突然変異体および変異体である
。
Ｃ１２７５９，＾ＴＣＣ１２７１３， ＡＴＣＣ１１９
４６，＾ＴＣＣ２７３２６，ＮＲＲＬ Ｂ−３７５１，
ＮＣＴＣ２１２０， ＮＣＴＣ８７２１， ＮＣＩＢ
６８１６．ＮＣＩＢ８５３７、およびＮＣＩＢｌ１８６
Ｆｌ並びにα−アセトラクテート デカルポキシラーゼ
酵素を生産するそれらの突然変異体および変異体である
。
バシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ１ｉｃ
ｈｃｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株を、本発明のα−アセトア
セテート デカルボキシラーゼ酵素の製造用に用いる場
合、栄養培地は遊離アミノ酸含量がα−アセ１・ラクテ
ート デカルポキシラーゼ生成を抑制しないような窒素
源を好ましくは含んでなるべきであり、好ましくは無機
窒素源を含むべきである．バシラス プレビスが酵素源
である場合、有機窒素源が使用できる。
ｈｃｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株を、本発明のα−アセトア
セテート デカルボキシラーゼ酵素の製造用に用いる場
合、栄養培地は遊離アミノ酸含量がα−アセ１・ラクテ
ート デカルポキシラーゼ生成を抑制しないような窒素
源を好ましくは含んでなるべきであり、好ましくは無機
窒素源を含むべきである．バシラス プレビスが酵素源
である場合、有機窒素源が使用できる。
本発明のα−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵
素を生産する微生物は、α〜アセトラクテートを次いで
検出されるアセトインに変換できるそれらの能力によっ
て選択される。
素を生産する微生物は、α〜アセトラクテートを次いで
検出されるアセトインに変換できるそれらの能力によっ
て選択される。
以下の手順に従い３００以上のバシラス（Ｆｌａｃｉ
ｔ Ｉｕｓ ）菌株を試験した： 菌株を、次のＢＣＭ−ｉ質上振とうフラスコ内で３０’
Ｃおよび３７゜Ｃで２４時間培養する。
ｔ Ｉｕｓ ）菌株を試験した： 菌株を、次のＢＣＭ−ｉ質上振とうフラスコ内で３０’
Ｃおよび３７゜Ｃで２４時間培養する。
Ｋ２１｛ＰＯ４ １ ｇＮａｔｌｚ
ＰＯａ， ２１ｌ２ｏ １ ｇ（Ｎｉｌ４）
ｚｓＯａ ２． ５ ｇＮａＣｌ
Ｏ．２５ｇＭＲＳＯ４，７１１２０
０． ２ ｇＦｅＣＩ！．３， ６１Ｌｚ０
０．０４ｇＦ１ｎＳＯ＜． Ｈｚ０
０．２５■グルコース ｌＯｇ 酵母エキス ３ｇ 水を加えて Ｉ０００ｇとする培養後、細胞を
遠心分離により集め、０．０３Ｍの燐酸塩／クエン酸塩
緩衝液（ｐｌｌ６．０）中で洗浄し次いで００（４５０
）〜４ｏまで同緩衝液中で再懸濁させる。次いで２ｄの
アリコートを超音波処理に委ねるか又は１■当たり１■
のりゾチームを用い３７℃で３０分処理し次いで遠心分
離する。
ＰＯａ， ２１ｌ２ｏ １ ｇ（Ｎｉｌ４）
ｚｓＯａ ２． ５ ｇＮａＣｌ
Ｏ．２５ｇＭＲＳＯ４，７１１２０
０． ２ ｇＦｅＣＩ！．３， ６１Ｌｚ０
０．０４ｇＦ１ｎＳＯ＜． Ｈｚ０
０．２５■グルコース ｌＯｇ 酵母エキス ３ｇ 水を加えて Ｉ０００ｇとする培養後、細胞を
遠心分離により集め、０．０３Ｍの燐酸塩／クエン酸塩
緩衝液（ｐｌｌ６．０）中で洗浄し次いで００（４５０
）〜４ｏまで同緩衝液中で再懸濁させる。次いで２ｄの
アリコートを超音波処理に委ねるか又は１■当たり１■
のりゾチームを用い３７℃で３０分処理し次いで遠心分
離する。
上澄み液のα−アセトラクテート デヵルボキシラーゼ
活性を、節「α−アセトラクテート デカルポキシラー
ゼ活性の決定」中で説明される千類に従って決定した。
活性を、節「α−アセトラクテート デカルポキシラー
ゼ活性の決定」中で説明される千類に従って決定した。
スクリーニング手段の結果、試験した約３００の微生物
の内わずか二三神の微生物が検出可能量のα−アセトラ
クテート デカルボキシラーゼを生産することが判った
。これらの微生物を、上記手順に従って決定したＮ素活
性と共に次の第１表に掲げる． 筆−１一表 Ｂ，ブレビス Ｂ．コアギュランス Ｂ．バミラス Ｂ．パミラス Ｂ．パミラス Ｂ．サブチリス Ｂ．サブチリス Ｂ．リケニフォルミス ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルごス Ｂ，リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ａ ３０３ Ａ３４５ Ａ１８５ Ａ３２８ Ａ３２９ Ａ５１８ Ｃ６０１ Ａ４４６ Ｃ ６００ Ａ８８ Ａ１０５ Ａ１０６ Ａ２００ Ａ２０３ Ａ２４４ Ａ２４８ ＡＩ２４０ ０．１３ ０．００？ ０．００８ ０．０１１ ０．００４ ０．００５ ０．０６ ０．１１ ０． １９ ０．１５ ０． １３ ０，１５ ０． １５ ０．２５ ０．１１ ０，１４ ０．１３ 菌株ｃ ６ｏｏおよびＣ６０１は、１９８３年５月２７
日にナシジナル コレツクション オブ インダストリ
アル ハクテリア、トリーリサーチステーション（アハ
ディーン、スコッ］・ランド）に本出願人により宵北さ
れ、それぞれ寄託番号ＮＣＩＢＩｌ８６８およびＮＣＩ
旧１８６９を１１￥た。
の内わずか二三神の微生物が検出可能量のα−アセトラ
クテート デカルボキシラーゼを生産することが判った
。これらの微生物を、上記手順に従って決定したＮ素活
性と共に次の第１表に掲げる． 筆−１一表 Ｂ，ブレビス Ｂ．コアギュランス Ｂ．バミラス Ｂ．パミラス Ｂ．パミラス Ｂ．サブチリス Ｂ．サブチリス Ｂ．リケニフォルミス ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルごス Ｂ，リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ｂ．リケニフォルミス Ａ ３０３ Ａ３４５ Ａ１８５ Ａ３２８ Ａ３２９ Ａ５１８ Ｃ６０１ Ａ４４６ Ｃ ６００ Ａ８８ Ａ１０５ Ａ１０６ Ａ２００ Ａ２０３ Ａ２４４ Ａ２４８ ＡＩ２４０ ０．１３ ０．００？ ０．００８ ０．０１１ ０．００４ ０．００５ ０．０６ ０．１１ ０． １９ ０．１５ ０． １３ ０，１５ ０． １５ ０．２５ ０．１１ ０，１４ ０．１３ 菌株ｃ ６ｏｏおよびＣ６０１は、１９８３年５月２７
日にナシジナル コレツクション オブ インダストリ
アル ハクテリア、トリーリサーチステーション（アハ
ディーン、スコッ］・ランド）に本出願人により宵北さ
れ、それぞれ寄託番号ＮＣＩＢＩｌ８６８およびＮＣＩ
旧１８６９を１１￥た。
残りの菌株は、次のリストから明らかな如く昇ったカル
ヂ叶・−コレソクションから人取した；ＮＯＶＯ番号 Ａ３０３ Ａ３４５ Ａ１８５ Ａ３２８ 寄託番号 ＡＴＣＣ １１０３１ ＮＲＳ ８３ ＡＴＣＣ ７１ ＡＴＣＣ ４５２０ （Ｂ．メサンテリカスｖａｒ．
ｆ Ｉａｖ斤７一 Ａ３２９ 八ＴＣＣ ７０６５Ａ５１８
１八Ｍ １１０９（Ｂ ｌｊ二一Ｊ二
−２１−）Ａ ８８ ＡＴＣＣ １２７５９
Ａ１０５ ＡＴＣＣ １２７１３＝ＮＲＲＬ
Ｂ−ｔｏｏｌＡ１０６ ＾ＴＣＣ １１９４６
Ａ２００ ＮＣＩＲ ６８１６Ａ２０３
ＮＣＩＢ ８５３７Ａ２４４ ＮＣＴＣ
２１２０Ａ２４８ ＮＣＴＣ ８７２１Ａ１２
４０ ＡＴＣＣ ２７３２６先行技術（Ｊｕｎｉ
Ｅ．，同上）は以下の内容を示唆している。すなわち
、バシラス サブチリスそのような抽出物を使用するこ
となく、α−アセトラクテ−１を脱力ルボキシル化しア
セトインを形成し得る。本発明者は６９種の異ったバシ
ラスサブチリス（Ｒａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）菌株を試験した。
ヂ叶・−コレソクションから人取した；ＮＯＶＯ番号 Ａ３０３ Ａ３４５ Ａ１８５ Ａ３２８ 寄託番号 ＡＴＣＣ １１０３１ ＮＲＳ ８３ ＡＴＣＣ ７１ ＡＴＣＣ ４５２０ （Ｂ．メサンテリカスｖａｒ．
ｆ Ｉａｖ斤７一 Ａ３２９ 八ＴＣＣ ７０６５Ａ５１８
１八Ｍ １１０９（Ｂ ｌｊ二一Ｊ二
−２１−）Ａ ８８ ＡＴＣＣ １２７５９
Ａ１０５ ＡＴＣＣ １２７１３＝ＮＲＲＬ
Ｂ−ｔｏｏｌＡ１０６ ＾ＴＣＣ １１９４６
Ａ２００ ＮＣＩＲ ６８１６Ａ２０３
ＮＣＩＢ ８５３７Ａ２４４ ＮＣＴＣ
２１２０Ａ２４８ ＮＣＴＣ ８７２１Ａ１２
４０ ＡＴＣＣ ２７３２６先行技術（Ｊｕｎｉ
Ｅ．，同上）は以下の内容を示唆している。すなわち
、バシラス サブチリスそのような抽出物を使用するこ
となく、α−アセトラクテ−１を脱力ルボキシル化しア
セトインを形成し得る。本発明者は６９種の異ったバシ
ラスサブチリス（Ｒａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）菌株を試験した。
これらの内、わずか５種のみがα−アセトラクテート
デカルポキシラーゼ活性を示し、更にこれらの５菌株は
醇素生産が劣る。バシラス コアギュランス（ Ｂ ａ
ｃ ｉ Ｉ Ｉ ｕ ｓ ｇ虫蓮巨叶）およびバシラ
スバミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ停ｑ１リ）菌株は又、工
業的適用に対しｆｉｌ素生産が非常に劣っていることが
判明した。
デカルポキシラーゼ活性を示し、更にこれらの５菌株は
醇素生産が劣る。バシラス コアギュランス（ Ｂ ａ
ｃ ｉ Ｉ Ｉ ｕ ｓ ｇ虫蓮巨叶）およびバシラ
スバミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ停ｑ１リ）菌株は又、工
業的適用に対しｆｉｌ素生産が非常に劣っていることが
判明した。
試験したハシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株の内、検出できる
量のαーアセトラクテート デカルポキシラーゼを生産
せず、２ｌ神の菌株は低レヘル量で酵素を生産し更にｌ
口ＩＩの菌株（これらの内１０種は本発明中に掲げられ
ている）は高レベル量で酵素を生産する．縦列交差免疫
電気泳動法により、以下の事実が見出された。すなわち
、１８げた全バシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ＩｉｃｈｅｎｉｆｏｒＩｌｉｓ）菌株は、バシ
ラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株Ｃ６００によって生産される
酵素と免疫化学的に同一であるα−アセトラクテート
デカルポキシラーゼ酵素を生産する。
ｓ１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株の内、検出できる
量のαーアセトラクテート デカルポキシラーゼを生産
せず、２ｌ神の菌株は低レヘル量で酵素を生産し更にｌ
口ＩＩの菌株（これらの内１０種は本発明中に掲げられ
ている）は高レベル量で酵素を生産する．縦列交差免疫
電気泳動法により、以下の事実が見出された。すなわち
、１８げた全バシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ＩｉｃｈｅｎｉｆｏｒＩｌｉｓ）菌株は、バシ
ラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株Ｃ６００によって生産される
酵素と免疫化学的に同一であるα−アセトラクテート
デカルポキシラーゼ酵素を生産する。
バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ
）菌株は、振とうフラスコ中三種の異った培地で増殖せ
した。
）菌株は、振とうフラスコ中三種の異った培地で増殖せ
した。
わずか一種の菌株、Ａ ３０３ （ＡＴＣＣ１１０３１
）のみが、全ての三種の培地上でα−アセトラクテート
デカルポキシラーゼ活性を示した。残りの１１種の菌
株は、使用した三種の培地のいずれにおいても検知でき
る量のα−アセトラクテート デカルポキシラーゼ活性
を示さなかった。バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｂｒｅｖｉｓ） Ａ３０３によって生産したαアセ
トラクテート デカルポキシラーゼ酵素は、免疫化学的
性質に関し、バシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株Ｃ６００に
よって生産される酵素と同一でないことが判明した。
）のみが、全ての三種の培地上でα−アセトラクテート
デカルポキシラーゼ活性を示した。残りの１１種の菌
株は、使用した三種の培地のいずれにおいても検知でき
る量のα−アセトラクテート デカルポキシラーゼ活性
を示さなかった。バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｂｒｅｖｉｓ） Ａ３０３によって生産したαアセ
トラクテート デカルポキシラーゼ酵素は、免疫化学的
性質に関し、バシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株Ｃ６００に
よって生産される酵素と同一でないことが判明した。
しかし、異ったバシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株からのα
−アセトラクテート デ力ルポキシラーゼ酵素が免疫化
学的同一性を示すという事実により本発明者は以下の内
容を！り１待ずる。ずなわち、本発明者によって試験さ
れた閑株以外の他のα−アセトラクテ−１・ デカルボ
ートシラーゼ生産バシラス ブレビス（Ｉｌａｃｉｌｌ
ｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）菌株は、バシラス プレビス（Ｉ
ｌａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｃｖｉｓ） Ａ３０３と実質的
に同し酵素を生産する。「免疫化学的同一性Ｊに関し、
Ｎ．｝Ｉ．アケノレセン（Ａｘｅｌｓｅｎ）等による「
八Ｍａｎｕａｌ ｏｆ１１ｕａｎＬｉＬａｔｉｖｅ Ｉ
ｖｗｕｎｏｅｌｅｃＬｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｊ （
オスロ＋９７３）第１０醸を参照されたい。
ｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株からのα
−アセトラクテート デ力ルポキシラーゼ酵素が免疫化
学的同一性を示すという事実により本発明者は以下の内
容を！り１待ずる。ずなわち、本発明者によって試験さ
れた閑株以外の他のα−アセトラクテ−１・ デカルボ
ートシラーゼ生産バシラス ブレビス（Ｉｌａｃｉｌｌ
ｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）菌株は、バシラス プレビス（Ｉ
ｌａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｃｖｉｓ） Ａ３０３と実質的
に同し酵素を生産する。「免疫化学的同一性Ｊに関し、
Ｎ．｝Ｉ．アケノレセン（Ａｘｅｌｓｅｎ）等による「
八Ｍａｎｕａｌ ｏｆ１１ｕａｎＬｉＬａｔｉｖｅ Ｉ
ｖｗｕｎｏｅｌｅｃＬｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｊ （
オスロ＋９７３）第１０醸を参照されたい。
本発明の丈施に対し、バシラス ブレビス（口，］ｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）が、ハシラス リケニフォル
ミス（ｌ＋．ｕ：ｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ）に比較して好ましい。と．；゛うのは、バシラス
ブレビス（Ｂａｃ ｉ ｌ ｌ ｕｓｂｒｃｖｉｓ）
山来のα−アセトラクテート デカルボキシラーゼが、
好ましくない副活性、特に全ての４．Ｋ験されたバシラ
ス リケニフォルミス（Ｂａ（ｉｌｌｕｓ１ｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ）により得られたフエルラ酸（ｆｅｒｒ
ｕｌｉｃａｃｉｄ）デカルボキシラーゼ活性を伴うこと
なく生産されるからである。フエルラ酸デカルボキシラ
一ゼは、発酵中のビール内に存在するフエルラ酸を脱炭
酸し、非常に非風味の化合物４−ビニルグアヤコールと
なる。従って、フェルラ酸デカルポキシラーゼは、回収
過程中バシラス リケニフォルごス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からの培養プロスから
除去されねばならない。
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）が、ハシラス リケニフォル
ミス（ｌ＋．ｕ：ｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ）に比較して好ましい。と．；゛うのは、バシラス
ブレビス（Ｂａｃ ｉ ｌ ｌ ｕｓｂｒｃｖｉｓ）
山来のα−アセトラクテート デカルボキシラーゼが、
好ましくない副活性、特に全ての４．Ｋ験されたバシラ
ス リケニフォルミス（Ｂａ（ｉｌｌｕｓ１ｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ）により得られたフエルラ酸（ｆｅｒｒ
ｕｌｉｃａｃｉｄ）デカルボキシラーゼ活性を伴うこと
なく生産されるからである。フエルラ酸デカルボキシラ
一ゼは、発酵中のビール内に存在するフエルラ酸を脱炭
酸し、非常に非風味の化合物４−ビニルグアヤコールと
なる。従って、フェルラ酸デカルポキシラーゼは、回収
過程中バシラス リケニフォルごス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からの培養プロスから
除去されねばならない。
更に、バシラス プレビスは、バシラス リケニフォル
ミスと比較して好ましい。何故なら、バシラス プレビ
スは、ビール中の２．３−ペンタンジオンの通常の前駆
物質を３−ヒドロキシ−２ペンタノンに変換し、従って
非風味のペンタンジオンの量を許容できる低レベルまで
減少できる。
ミスと比較して好ましい。何故なら、バシラス プレビ
スは、ビール中の２．３−ペンタンジオンの通常の前駆
物質を３−ヒドロキシ−２ペンタノンに変換し、従って
非風味のペンタンジオンの量を許容できる低レベルまで
減少できる。
ハシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｓ＋ｉｓ）菌株はこれらの酵素を生産
しない． 最後に、バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒ
ｅｖｉｓ）菌株は、バシラス リケニフォルくス（［１
ａ（ｉｌｌｕｓ１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒＩｌｉｓ）に比較
して自て分解活性が少ないので精製手順中における全収
率が良好である。
ｃｈｅｎｉｆｏｒｓ＋ｉｓ）菌株はこれらの酵素を生産
しない． 最後に、バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒ
ｅｖｉｓ）菌株は、バシラス リケニフォルくス（［１
ａ（ｉｌｌｕｓ１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒＩｌｉｓ）に比較
して自て分解活性が少ないので精製手順中における全収
率が良好である。
α−アセトラクテート デカルポキシラーゼ活性の決定
１ ／ ホ（ＮＯＶＯ）単位（Ｎｔｌ）は、２０゜Ｃ
でかツｐｌ＋６，Ｑ（ハシラス リケニフォルミス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ１ｉｃｈＩｊｎｉｆｏｒｍｉｓ） 酎素
に対し０．０３モルのシトレー１・／ホスフェート緩衝
液）並びにハシラス ブレビス（口ａｃｉｌｌｕｓ ｂ
ｒｅｖｉｓ）酵素に対し０．０５ＭのＭＥＳ（２（Ｎ−
モルホリノ）一エタンスルホン酸）、０．５ｍＭのＭｇ
Ｃｆｆ．および０．８６ＭのＮａＣ ｌの緩衝システム
）で、酊素含有試験サンプルを次のアッセイにおけるα
−アセトラクテート）Ｓ質と共にインキユヘートするこ
とにより、毎分１μｌＩＩｏｌ を生産ずる酵素の用と
定義される。
でかツｐｌ＋６，Ｑ（ハシラス リケニフォルミス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ１ｉｃｈＩｊｎｉｆｏｒｍｉｓ） 酎素
に対し０．０３モルのシトレー１・／ホスフェート緩衝
液）並びにハシラス ブレビス（口ａｃｉｌｌｕｓ ｂ
ｒｅｖｉｓ）酵素に対し０．０５ＭのＭＥＳ（２（Ｎ−
モルホリノ）一エタンスルホン酸）、０．５ｍＭのＭｇ
Ｃｆｆ．および０．８６ＭのＮａＣ ｌの緩衝システム
）で、酊素含有試験サンプルを次のアッセイにおけるα
−アセトラクテート）Ｓ質と共にインキユヘートするこ
とにより、毎分１μｌＩＩｏｌ を生産ずる酵素の用と
定義される。
友−プし
α−アセトラクテート基質を、使用直前に、αアセトキ
シーα−メチルー酢酸エチルエステルを加水分解するこ
とにより調製した。
シーα−メチルー酢酸エチルエステルを加水分解するこ
とにより調製した。
３０ｔｔｌのジエステル（０． １６５ｓｍｏｌ）、２
４０ｕｌの水および３３０ｄのＩ Ｍ Ｎａ０１１を混
合し次いで１５分間氷上で保存した。次いで５． ４
ｄの水を添加し更に得られた氷解物を試験に対し用いた
。
４０ｕｌの水および３３０ｄのＩ Ｍ Ｎａ０１１を混
合し次いで１５分間氷上で保存した。次いで５． ４
ｄの水を添加し更に得られた氷解物を試験に対し用いた
。
１１１辷仁よ
緩衝液および約０．００６〜０．３ＮＵの酵素活性を有
する試験サンプルを混合し次いで２０゜Ｃで二、三分保
持した（最終量１０．０ｄ）。ＬがＯにおいて、４００
＃の水解物を添加し次いでｌ一の数サンプルを、ｔが３
．６，９．２０および５０分において取り出した。サン
プルを氷上にｔ２置し次いで２００ｐ／のＩ Ｍ Ｎａ
ＯＨを添加することにより酵素反応を停止した。
する試験サンプルを混合し次いで２０゜Ｃで二、三分保
持した（最終量１０．０ｄ）。ＬがＯにおいて、４００
＃の水解物を添加し次いでｌ一の数サンプルを、ｔが３
．６，９．２０および５０分において取り出した。サン
プルを氷上にｔ２置し次いで２００ｐ／のＩ Ｍ Ｎａ
ＯＨを添加することにより酵素反応を停止した。
得られたアセトインの量を、Ｗ．Ｗ．ウェスターフエノ
レド（Ｗｅｓｔｅｒｆｅｌｄ） （八Ｃｏｌｏｒｉｍｅ
ｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ Ｂｌｏ
ｏｄ ＡｃｅＬｏｉｎ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．１６１， ４９５−５０２＋１９４５）に従がい、
０． ５％クレアチン０． ２ ｍａｌおよび２， ５
Ｎ Ｎａ０１Ｉ（新たに調製）に溶解した５％α−ナ
フトール０． ２ ７を、上記サンプル１． ２１ｉ！
に添加することにより測定した。６０分後、反応時間Ｅ
（５２４）を測定した。
レド（Ｗｅｓｔｅｒｆｅｌｄ） （八Ｃｏｌｏｒｉｍｅ
ｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ Ｂｌｏ
ｏｄ ＡｃｅＬｏｉｎ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．１６１， ４９５−５０２＋１９４５）に従がい、
０． ５％クレアチン０． ２ ｍａｌおよび２， ５
Ｎ Ｎａ０１Ｉ（新たに調製）に溶解した５％α−ナ
フトール０． ２ ７を、上記サンプル１． ２１ｉ！
に添加することにより測定した。６０分後、反応時間Ｅ
（５２４）を測定した。
ブランクとして、細胞抽出物の代わりに緩衝液を有する
サンプルを用いた． 標準曲線を、アセトイン０，０．５．２および４ｐｇ
／ ｍｌを用いてプロットする。
サンプルを用いた． 標準曲線を、アセトイン０，０．５．２および４ｐｇ
／ ｍｌを用いてプロットする。
α−アセトラクテート デ力ルポキシラーゼ酵素製品の
製決 本発明のα−アセトラクテート デ力ルポキシラーゼ酎
素を生産し得るバシラス菌株を、適当な発ｆｌ）ｉ給地
中、奸気的条件のもとてその培養前約３０に適５な固体
栄養培地上で通常増殖する。発酵培地は、炭素の同化？
ｊＱ（例えばデ；トストロース）および窄素源として例
えば硫酸アンモニアを含んで，＜（るλ（礎塩組成物を
含有ずる。バシラス リゲニフォル砧ス（Ｂ．Ｉｃｉｌ
ｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒ＋ｗｉｓ）システム中、
，ｆ６収率を得るためには、以下の内容が必要である。
製決 本発明のα−アセトラクテート デ力ルポキシラーゼ酎
素を生産し得るバシラス菌株を、適当な発ｆｌ）ｉ給地
中、奸気的条件のもとてその培養前約３０に適５な固体
栄養培地上で通常増殖する。発酵培地は、炭素の同化？
ｊＱ（例えばデ；トストロース）および窄素源として例
えば硫酸アンモニアを含んで，＜（るλ（礎塩組成物を
含有ずる。バシラス リゲニフォル砧ス（Ｂ．Ｉｃｉｌ
ｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒ＋ｗｉｓ）システム中、
，ｆ６収率を得るためには、以下の内容が必要である。
ずなわら、発酵培地が、α−アセトラクテ−１・ デ
カルポキシラーゼ生産を抑制できる過剰のｉＭ／ｉｆア
ミノ酸を含Ｙｆシないことである。バシラス ブレビス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）システムにおいて
、これは該当しない。発酵は約３０゜Ｃでかつ約ｐｌ＋
７で行なわれ、これは白動的手段によりほぼ一定に保た
れる。通気および攪拌が正の酸素圧を得るためｊＡ整さ
れる。
カルポキシラーゼ生産を抑制できる過剰のｉＭ／ｉｆア
ミノ酸を含Ｙｆシないことである。バシラス ブレビス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）システムにおいて
、これは該当しない。発酵は約３０゜Ｃでかつ約ｐｌ＋
７で行なわれ、これは白動的手段によりほぼ一定に保た
れる。通気および攪拌が正の酸素圧を得るためｊＡ整さ
れる。
発酵後、細胞を遠心分離により集め次いで適当な緩衝液
で洗浄した。細胞を超音波処理、フレンチプレス処理、
リゾチーム処理、マントン（Ｍａｎ ｔｏｎ）一ガウリ
ン（Ｇａｕｌｉｎ）一処理又はこれらの組合わせにより
破壊する。
で洗浄した。細胞を超音波処理、フレンチプレス処理、
リゾチーム処理、マントン（Ｍａｎ ｔｏｎ）一ガウリ
ン（Ｇａｕｌｉｎ）一処理又はこれらの組合わせにより
破壊する。
遠心分離後、粗抽出物を得、これは以下の節で説明する
桔製工程に委ねられる。
桔製工程に委ねられる。
α−アセトラクテート デ力ルポキシラーゼ酵素の梢製
本発明のα−アセトラクテート カルボキシラーゼ醇素
は、次の工程の１又はそれ以上の組合わせにまり粗抽出
物から梢製できる： ａ）硫酸アンモニウム沈殿、 ｂ）ポリエチレングリコール沈殿、 ｃ）ＤＥ−５２アニオン交換クロマトグラフィーおよび
透析、 ｄ）酸沈殿および透析、 Ｃ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび透
析並びに、 ｆ）凍結乾燥、 Ｒ）フエニス〜セファロースク口マトグラフィｈ）クロ
マトフォー力ッシング 実施例ｌで説明する如く培養されるバシラスリケニフォ
ルミス菌株を培養して得られるα−アセトラクテート
デカルボキシラーゼの精製は次の如く行った： 細胞９４ｔｒ（淘重ａ！）を、ρ１１６．８のＫ−燐酸
塩緩ｆｌｉ？＆２ｏｍＭ中に悲濁させ次いでｌｌｇ／一
のリゾチー１、を川い３７゜Ｃで３０分間リゾチーム処
理し更にブランソン（［ｌｒａｎｓｏｎ）音波発生器Ｂ
ｌ２で超音波処理した。遠心分離後、上澄みをＤＥ５２
アニオン交換樹脂に適用し、これにより酵素を完全に吸
着させた。
は、次の工程の１又はそれ以上の組合わせにまり粗抽出
物から梢製できる： ａ）硫酸アンモニウム沈殿、 ｂ）ポリエチレングリコール沈殿、 ｃ）ＤＥ−５２アニオン交換クロマトグラフィーおよび
透析、 ｄ）酸沈殿および透析、 Ｃ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび透
析並びに、 ｆ）凍結乾燥、 Ｒ）フエニス〜セファロースク口マトグラフィｈ）クロ
マトフォー力ッシング 実施例ｌで説明する如く培養されるバシラスリケニフォ
ルミス菌株を培養して得られるα−アセトラクテート
デカルボキシラーゼの精製は次の如く行った： 細胞９４ｔｒ（淘重ａ！）を、ρ１１６．８のＫ−燐酸
塩緩ｆｌｉ？＆２ｏｍＭ中に悲濁させ次いでｌｌｇ／一
のリゾチー１、を川い３７゜Ｃで３０分間リゾチーム処
理し更にブランソン（［ｌｒａｎｓｏｎ）音波発生器Ｂ
ｌ２で超音波処理した。遠心分離後、上澄みをＤＥ５２
アニオン交換樹脂に適用し、これにより酵素を完全に吸
着させた。
カラムを２０ｍＭの燐酸カリウム緩衝液（ｐｌｌ６．８
）で洗昂し次いでＰｌｌ６．８の燐酸カリウムを用いた
勾配溶出法（２０１１Ｍ〜５００ｍＭ）で溶出した。先
に説明した如くソラソクションを醇素活性に対し分析し
た。
）で洗昂し次いでＰｌｌ６．８の燐酸カリウムを用いた
勾配溶出法（２０１１Ｍ〜５００ｍＭ）で溶出した。先
に説明した如くソラソクションを醇素活性に対し分析し
た。
活性含イｆフラックシゴンを集めた。
燐酸を添加しｐｌ＋を４．５までにすることにより、集
めたフランクションを酸性沈殿化セしめた。遠心分離後
、上澄みをｐｌ＋６．８の２０ｍＭ燐酸カリウムに対し
透析し次いで透析物をヒドロキシアパタイト（ Ｈ Ａ
）カラムに通用し、ｐｌｌ６．ｌｌｌの燐酸カリウム
緩衝液で洗浄後、上記の燐酸カリウム勾配法により該カ
ラムを溶出した． 酵素活性を示すフラックションを集め次いでｐＨ６．８
の２０ｍＭ，９Ｊ酸カリウムに対し一夜透析した。最終
的に、透析物を凍結乾燥した。
めたフランクションを酸性沈殿化セしめた。遠心分離後
、上澄みをｐｌ＋６．８の２０ｍＭ燐酸カリウムに対し
透析し次いで透析物をヒドロキシアパタイト（ Ｈ Ａ
）カラムに通用し、ｐｌｌ６．ｌｌｌの燐酸カリウム
緩衝液で洗浄後、上記の燐酸カリウム勾配法により該カ
ラムを溶出した． 酵素活性を示すフラックションを集め次いでｐＨ６．８
の２０ｍＭ，９Ｊ酸カリウムに対し一夜透析した。最終
的に、透析物を凍結乾燥した。
酵素活性および収率を次表に示す：
酊素の化学的性質
本発明のバシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）一アセトラクテート
デカルボキシラーゼ醇素の活性のｐｌ１に対する依存性
を、上記のα−アセトラクテート デカルボキシラーゼ
冫占ｔ／［の測定方法により２０゜Ｃの０．０３Ｍシト
レート／ホスフエート緩衝液中種々のρ■値でバシラス
リノＪ゛ニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の抽出物について測定した．添付
図面を参照されたい．この図面において、第ｌ図および
第２図は菌株Ａ４４６およびＣ６００からそれぞれ得ら
れたα−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素に
対しプロットされた相対活性を示すグラフである。最適
ｐｌ＋は５ないし６の範囲内にあることが見出された。
ｓ１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）一アセトラクテート
デカルボキシラーゼ醇素の活性のｐｌ１に対する依存性
を、上記のα−アセトラクテート デカルボキシラーゼ
冫占ｔ／［の測定方法により２０゜Ｃの０．０３Ｍシト
レート／ホスフエート緩衝液中種々のρ■値でバシラス
リノＪ゛ニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の抽出物について測定した．添付
図面を参照されたい．この図面において、第ｌ図および
第２図は菌株Ａ４４６およびＣ６００からそれぞれ得ら
れたα−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素に
対しプロットされた相対活性を示すグラフである。最適
ｐｌ＋は５ないし６の範囲内にあることが見出された。
バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ
） ａ−アセトラクテート デ力ルポキシラーゼのｐＨ
および温度依存姓を、０．００５Ｍの開Ｓ（２（２Ｎ一
モルホリノ）一エタンスルホン酸）、０．５ｄの陶ＣＺ
，および０．８６ＭのＮａＣ ｌからなる緩衝液（ｐｌ
ｌ６．０）を用いる点を除く外、上記と同じ手順を用い
バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ
） Ａ３０３の抽出物について測定した． 添付図面を参照されたい。この図面において、第３図は
ｐＨに対しプロットした３０″Ｃでの相対活性を示すグ
ラフであり更に第４図は温度に対しプロットしたｐｉ｛
６での相対活性を示すグラフである．バシラス プレビ
スの最適ｐＨは５〜７の範囲内にあることが判明し、更
に最適温度は３５〜５５゜Ｃの範囲内にあることが判明
した。
） ａ−アセトラクテート デ力ルポキシラーゼのｐＨ
および温度依存姓を、０．００５Ｍの開Ｓ（２（２Ｎ一
モルホリノ）一エタンスルホン酸）、０．５ｄの陶ＣＺ
，および０．８６ＭのＮａＣ ｌからなる緩衝液（ｐｌ
ｌ６．０）を用いる点を除く外、上記と同じ手順を用い
バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ
） Ａ３０３の抽出物について測定した． 添付図面を参照されたい。この図面において、第３図は
ｐＨに対しプロットした３０″Ｃでの相対活性を示すグ
ラフであり更に第４図は温度に対しプロットしたｐｉ｛
６での相対活性を示すグラフである．バシラス プレビ
スの最適ｐＨは５〜７の範囲内にあることが判明し、更
に最適温度は３５〜５５゜Ｃの範囲内にあることが判明
した。
安定性
バシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ１ｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒａ＋ｉｓ）の粗留出物の安定性を、使用
条件のもと、例えばｌＯ℃でかつ発酵せしめたが、Ｐ！
威したビール中で試験した。
ｈｅｎｉｆｏｒａ＋ｉｓ）の粗留出物の安定性を、使用
条件のもと、例えばｌＯ℃でかつ発酵せしめたが、Ｐ！
威したビール中で試験した。
安定性は次の表から明らかに示される．隼−Σし一ｋ
Ａ３０３ １１
Ａ４４Ｇ ２１
Ｃ６００ １５
Ａ４４６ １１．５ （発酵ビール中で測定）
タレブシエラ・ニューモニュ醇素は、わずか２〜３時間
の半減期しか有しないので、本発明に係る酔素は公知の
酵素と比較してビールを醸造するために使用する条件の
もとて相当に改良された安定性を示す。
タレブシエラ・ニューモニュ醇素は、わずか２〜３時間
の半減期しか有しないので、本発明に係る酔素は公知の
酵素と比較してビールを醸造するために使用する条件の
もとて相当に改良された安定性を示す。
ハシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ
） Ａ３０３酊素の安定ｒＬ↓よ次の第４表および第５
表から明らかである。
） Ａ３０３酊素の安定ｒＬ↓よ次の第４表および第５
表から明らかである。
第−２し一表
種々の温度でインキュベーショ
ンした後の残留活性
（ＮＯ／ａｔ！）
第一１一表
Ｍｇ”濃度を変えて５０″Ｃでインキユベーションした
後の残留活性（ＮＵ／ａｆｆｉ）上記から以下の内容が
明らかにされる．すなわち、バシラス ブレビス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）酵素は、２特間後その活
性を約６０〜９０％保持し、酵素はｐｌ＋４．５で更に
安定である．更に、Ｍｇ〜イオンは活性に関し安定化作
用を有し、一方酵素はＥＤＴＡにより不活性化される。
後の残留活性（ＮＵ／ａｆｆｉ）上記から以下の内容が
明らかにされる．すなわち、バシラス ブレビス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）酵素は、２特間後その活
性を約６０〜９０％保持し、酵素はｐｌ＋４．５で更に
安定である．更に、Ｍｇ〜イオンは活性に関し安定化作
用を有し、一方酵素はＥＤＴＡにより不活性化される。
Ｌ±二皿足
薄層ゲルエレク口フォ力ッシングにより菌株Ａ４４６の
粗留出物についてＰＩを測定し約４．７を得た。
粗留出物についてＰＩを測定し約４．７を得た。
バシラス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ
） Ａ３０３酵素のＰＩを、Ｐ １１ Ａ Ｒ Ｍ八Ｃ
ＩＡ（Ｐｌｌ八ＲＭＡＣＩＡ ＴＥＣＩＩＮＩＣＡＬＢ
ＵＬＬＥＴＩＮ ： ＣＦＩＲＯＭＡＴＯＦＯＣＵＳＩ
ＮＧ ｗｉｔｈ ＰＯＬＹＢＵＦＦＥＲ”ａｎｄ ＰＢ
Ｅ” ； ＰＩＩＡＲＭＡＣＩＡ ＦＩＮＥ ＣＩＩＩ
ＥＭＩＣ＾しＳ）によって記載されたクロマトフォ力ッ
シングによって測定し７．６および７．０であることが
判明した。二種のピークとしてα−アセトラクテート
デカルポキシラーゼ活性を示す活性溶離液は、異ったＩ
） １を持つ二種のタンパクからなる。
） Ａ３０３酵素のＰＩを、Ｐ １１ Ａ Ｒ Ｍ八Ｃ
ＩＡ（Ｐｌｌ八ＲＭＡＣＩＡ ＴＥＣＩＩＮＩＣＡＬＢ
ＵＬＬＥＴＩＮ ： ＣＦＩＲＯＭＡＴＯＦＯＣＵＳＩ
ＮＧ ｗｉｔｈ ＰＯＬＹＢＵＦＦＥＲ”ａｎｄ ＰＢ
Ｅ” ； ＰＩＩＡＲＭＡＣＩＡ ＦＩＮＥ ＣＩＩＩ
ＥＭＩＣ＾しＳ）によって記載されたクロマトフォ力ッ
シングによって測定し７．６および７．０であることが
判明した。二種のピークとしてα−アセトラクテート
デカルポキシラーゼ活性を示す活性溶離液は、異ったＩ
） １を持つ二種のタンパクからなる。
Ｋｍ二叉定
Ａ３０３に対し、非熟成中のビール中のα−アセトラク
テート（ＤＬ）に関し１０゜ＣでＫｍを測定し３．８ｓ
Ｍを得た． 免校庁予月１し律 閑株Ｃ ６００ （バシラス リケニフォルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓＩｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））生産のα
−アセトラクテー．トデカルボキシラーゼのｔ＋’ｆ製
フラックションを、Ｉ１ａｒｂｏｅおよびＩｎｇｉｌｄ
によって記載された方法（Ｎ．Ｉ＋．八ｘ１！Ｉｓｃｎ
： Ｉｌａｎｄｂｏｏｋ ｏ（ Ｉｍｍｕ
ｎｏｐｒｅｃｉｐｉＬａＬｉｏｎ ｉｎＧ（！ｌ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓｌコンドン１
９８３年）に従って家兎を免疫ずるためＧこ川いた。
テート（ＤＬ）に関し１０゜ＣでＫｍを測定し３．８ｓ
Ｍを得た． 免校庁予月１し律 閑株Ｃ ６００ （バシラス リケニフォルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓＩｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））生産のα
−アセトラクテー．トデカルボキシラーゼのｔ＋’ｆ製
フラックションを、Ｉ１ａｒｂｏｅおよびＩｎｇｉｌｄ
によって記載された方法（Ｎ．Ｉ＋．八ｘ１！Ｉｓｃｎ
： Ｉｌａｎｄｂｏｏｋ ｏ（ Ｉｍｍｕ
ｎｏｐｒｅｃｉｐｉＬａＬｉｏｎ ｉｎＧ（！ｌ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓｌコンドン１
９８３年）に従って家兎を免疫ずるためＧこ川いた。
ハシラス リケニフォルミス（Ｂａｃｉ Ｉ Ｉｕｓ１
ｉｃｈｃｎｉｆｏｒｍｉｓ）酊素に対しこのようにして
得られた抗体を、八．Ｏ．ＧｒｕｂｂおよびＪ．Ｋｒｏ
ｌｌによっ゜ζ上記文献中にそれぞれ記載されている如
き交差先疫電気泳動法および縦列免疫電気泳動法を実施
するため使川した。
ｉｃｈｃｎｉｆｏｒｍｉｓ）酊素に対しこのようにして
得られた抗体を、八．Ｏ．ＧｒｕｂｂおよびＪ．Ｋｒｏ
ｌｌによっ゜ζ上記文献中にそれぞれ記載されている如
き交差先疫電気泳動法および縦列免疫電気泳動法を実施
するため使川した。
ｔｊｆｆ Ｅｉは均質でｔ（いので、生産した抗体は多
特異的でありかつ交差免疫電気泳動において１５個のバ
ンドを出現させ、その内の一つはα−アセトラクテー１
・ デカルボキシラーゼ沈降・：『である。この帯を同
定するために、酊素活性を茫にしたオーバレーヤ一手法
が適用された：免疫電気泳動後、プレートを通常の如く
には固定しそして染色せず、直径１４ｃｍのペトリー皿
のふた内で次の混合物３０ｄ中５分間インキユベートし
た： １５０ＩＪ！のエチル−２−アセトキシー２−メチルア
セトアセテート、１２００ＩＩＩのＨ２０、および１６
５０μｌのＩＮＮａＯＨを混合し次いで室温で１５分間
インキユベートした。次いで水を加え３０一とした。
特異的でありかつ交差免疫電気泳動において１５個のバ
ンドを出現させ、その内の一つはα−アセトラクテー１
・ デカルボキシラーゼ沈降・：『である。この帯を同
定するために、酊素活性を茫にしたオーバレーヤ一手法
が適用された：免疫電気泳動後、プレートを通常の如く
には固定しそして染色せず、直径１４ｃｍのペトリー皿
のふた内で次の混合物３０ｄ中５分間インキユベートし
た： １５０ＩＪ！のエチル−２−アセトキシー２−メチルア
セトアセテート、１２００ＩＩＩのＨ２０、および１６
５０μｌのＩＮＮａＯＨを混合し次いで室温で１５分間
インキユベートした。次いで水を加え３０一とした。
インキュベーション後、混合物をプレートに滴下させた
、これをビタラップ（ｖｉｔａｗｒａｐ）プラスチック
箔およびアルミ箔で包みそして室温で３０分間インキユ
ベートした． 次いでプレートを、直径１４ｃ厘のベトリー皿のふた内
に置き、次の混合物で覆った： ３０１ｄｌの２％ＬＳＡアガロース（ＨｚＯ） 、３
ｍｌの１％クレアチンＬＯ、および２． ５ Ｎ Ｎａ
０１１中の５％ナフトール６−を５５゜Ｃで混合した。
、これをビタラップ（ｖｉｔａｗｒａｐ）プラスチック
箔およびアルミ箔で包みそして室温で３０分間インキユ
ベートした． 次いでプレートを、直径１４ｃ厘のベトリー皿のふた内
に置き、次の混合物で覆った： ３０１ｄｌの２％ＬＳＡアガロース（ＨｚＯ） 、３
ｍｌの１％クレアチンＬＯ、および２． ５ Ｎ Ｎａ
０１１中の５％ナフトール６−を５５゜Ｃで混合した。
被覆したプレートを室温で約１時間インキユベートした
．α−アセトラクテート デカルポキシラーゼ沈降物を
有するバンドは、赤色を示し、かつ同定できる。
．α−アセトラクテート デカルポキシラーゼ沈降物を
有するバンドは、赤色を示し、かつ同定できる。
Ｃ６００α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ抗
体に対し、全ての掲げられたバシラス リゲニフォルミ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｓｉｓ）
由来の酎素を先に説明した如き縦列交差免疫電気泳動に
委ねた場合、バシラス リケニフオルミス（Ｉｌａｃｉ
ｌｌｕｓ ｌｉｃｂｃｎｉｆｏｒｍｉｓ）酵素は免疫化
学的に同一であることが判明したが、一方バシラス プ
レビス（Ｒａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）由来のα−
アセトラクテ−１・ デカルボキシラーゼはＣ６００α
−アセトラクテート デ力ルポキシラーゼ酵体では沈殿
せず、従ってバシラス リケニフオルミス（Ｂａｃ ｉ
Ｉ Ｉ ｕｓラクテート デ力ルポキシラーゼ醇素を
生産することを示すが、しかし双方ともビール生産にお
いて意図した使用に対しては十分適合する。
体に対し、全ての掲げられたバシラス リゲニフォルミ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｓｉｓ）
由来の酎素を先に説明した如き縦列交差免疫電気泳動に
委ねた場合、バシラス リケニフオルミス（Ｉｌａｃｉ
ｌｌｕｓ ｌｉｃｂｃｎｉｆｏｒｍｉｓ）酵素は免疫化
学的に同一であることが判明したが、一方バシラス プ
レビス（Ｒａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）由来のα−
アセトラクテ−１・ デカルボキシラーゼはＣ６００α
−アセトラクテート デ力ルポキシラーゼ酵体では沈殿
せず、従ってバシラス リケニフオルミス（Ｂａｃ ｉ
Ｉ Ｉ ｕｓラクテート デ力ルポキシラーゼ醇素を
生産することを示すが、しかし双方ともビール生産にお
いて意図した使用に対しては十分適合する。
分１厘
α−アセＩ・ラクテート デ力ルボキシラーゼを、’Ａ
Ｉ−Ｆ条件下、グラジエント ゲル中、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動により他の蛋白質から分離した
．分子量は、ファルマシア ファインケミカルカルズＡ
Ｂ（スフエーデン）市販の分子量マーカーと比較するこ
とによりブリリアン］・ブルー染色ゲルから概算した。
Ｉ−Ｆ条件下、グラジエント ゲル中、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動により他の蛋白質から分離した
．分子量は、ファルマシア ファインケミカルカルズＡ
Ｂ（スフエーデン）市販の分子量マーカーと比較するこ
とによりブリリアン］・ブルー染色ゲルから概算した。
その結果、バシラス ブレビス由来のα−アセトラクテ
ート デ力ルポキシラーゼ酵素の分子量は３５，０００
Ｄ （ＳＤＳＰＡＧＥによる測定）であり、バシラス
リケニフォルミス由来のα−アセトラクテート デカ
ルボヰシラーゼ酵素の分子量は３０，０００ Ｄ （Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥニよる測定）であった。
ート デ力ルポキシラーゼ酵素の分子量は３５，０００
Ｄ （ＳＤＳＰＡＧＥによる測定）であり、バシラス
リケニフォルミス由来のα−アセトラクテート デカ
ルボヰシラーゼ酵素の分子量は３０，０００ Ｄ （Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥニよる測定）であった。
（５）実施例
以下に本発明の実施例を非制限的に説明する。
例１
菌株Ａ４４６（Ｂ． リケニフォルミス、ＮＲＲＬ
Ｂ−３７５１）を、Ｏ Ｄ （４５０） ６まで振とう
フラスコ内で３０’ＣでＴＹ一培地上で増殖させた。
Ｂ−３７５１）を、Ｏ Ｄ （４５０） ６まで振とう
フラスコ内で３０’ＣでＴＹ一培地上で増殖させた。
？Ｙ一培地：
トリプカーゼ ２０ｇ
酊母エキス ５ｇ
ＦａＣ ｌ． ３． ６ｔｌｚＯ ７
１ｍｇＭｎＣｆ ．４ｆｌｚ０ １
ｌｍｇＭＨＳＯａ．７１１ｚ０ １５
■謂留水を加えてｌｏ００ｄとする 振とう培養物１０００ａｄを、１１当たり次の組成を有
する無機塩培地を含有するキラー（Ｋｉｅｌｅｒ）一発
酊器１．５ｌに移す： ＣａＣ ｌ ．２１１２０ ０．５ ｇＭ
ＢＳＯｎ＋ ７１１２０ ０．５ｇκ１
１■ｐＯ４４．０ｇ （Ｎｌｌａ） ｚｓＯａ ２２ ｇ
微増金属ゾル” ３ ｄ プルラニノク ｌｄ デヰストロース １５０ ｇ０微量金属ゾル
： ＬＢＯｓ ５００ｍｇ／ １００ｄＣ
ＬＩＳＯ４，５Ｈｚ０ ６３■／１００ＩＩ
ｉＫｌ １００ｍｇ／１００ｍＰｅ
Ｃ Ｉ！ｘ． ６Ｈｚ０ ３３３１ｇ／ １０
０ｄＭｎＳＯ４， １１２０ ４４８ｍｇ／
１００ｄｌＮａＭｏＯ．， ２１．０ ２００
ｍｇ／ １００ｄＺｎＳＯ４＋ ７Ｈｚ０
７１２ｍｇ／ １００一培養中、水酸化ナトリウムを添
加してｐｌ１を７．０に保った。温度は３０“Ｃであり
更に通気および撹拌を調整し正の酸素圧を得た． Ｏ Ｄ （４５０）３４に相当する細胞密度に達した後
細胞を遠心分離により集めた． 発酵の過程は次の表から明らかである。
１ｍｇＭｎＣｆ ．４ｆｌｚ０ １
ｌｍｇＭＨＳＯａ．７１１ｚ０ １５
■謂留水を加えてｌｏ００ｄとする 振とう培養物１０００ａｄを、１１当たり次の組成を有
する無機塩培地を含有するキラー（Ｋｉｅｌｅｒ）一発
酊器１．５ｌに移す： ＣａＣ ｌ ．２１１２０ ０．５ ｇＭ
ＢＳＯｎ＋ ７１１２０ ０．５ｇκ１
１■ｐＯ４４．０ｇ （Ｎｌｌａ） ｚｓＯａ ２２ ｇ
微増金属ゾル” ３ ｄ プルラニノク ｌｄ デヰストロース １５０ ｇ０微量金属ゾル
： ＬＢＯｓ ５００ｍｇ／ １００ｄＣ
ＬＩＳＯ４，５Ｈｚ０ ６３■／１００ＩＩ
ｉＫｌ １００ｍｇ／１００ｍＰｅ
Ｃ Ｉ！ｘ． ６Ｈｚ０ ３３３１ｇ／ １０
０ｄＭｎＳＯ４， １１２０ ４４８ｍｇ／
１００ｄｌＮａＭｏＯ．， ２１．０ ２００
ｍｇ／ １００ｄＺｎＳＯ４＋ ７Ｈｚ０
７１２ｍｇ／ １００一培養中、水酸化ナトリウムを添
加してｐｌ１を７．０に保った。温度は３０“Ｃであり
更に通気および撹拌を調整し正の酸素圧を得た． Ｏ Ｄ （４５０）３４に相当する細胞密度に達した後
細胞を遠心分離により集めた． 発酵の過程は次の表から明らかである。
第一」Ｌ一表
発酊１，｝間（時） ＮＵ／培養物１ｔｊ！ ＯＤ
（４５０）０ ０
１．３５５ ０
１．６９２１
０．０２２ １９２４
０．０７６ ２８２８
０．４４０ ３４例
２ ハシラス菌株Ａ４４６を増殖させ次いで例ｌと同様に培
養した。但し、発酵培地は１８０ ｇのデキストロース
を含有しており更に細胞は、００（４５０）〜４７に相
当ずる細胞密度に達した時採取した．１１２ｇの細胞（
湿重量）を、ｐＨ６．８の２０一ＭＫ燐酸塩緩衝液中に
懸濁させ次いでｌ■／ｄのリゾチームを用い３７”Ｃで
３０分間リゾチーム処理した。
（４５０）０ ０
１．３５５ ０
１．６９２１
０．０２２ １９２４
０．０７６ ２８２８
０．４４０ ３４例
２ ハシラス菌株Ａ４４６を増殖させ次いで例ｌと同様に培
養した。但し、発酵培地は１８０ ｇのデキストロース
を含有しており更に細胞は、００（４５０）〜４７に相
当ずる細胞密度に達した時採取した．１１２ｇの細胞（
湿重量）を、ｐＨ６．８の２０一ＭＫ燐酸塩緩衝液中に
懸濁させ次いでｌ■／ｄのリゾチームを用い３７”Ｃで
３０分間リゾチーム処理した。
次いで、溶解した細胞を、プランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ
）音波発生器Ｂ１２で超音波処理に委ねた．得られた粗
留出物に２５％の飽和に達するまで硫酸アンモニウムを
添加し次いで混合物を氷上に３０分載置した．遠心分離
後、上澄み中において活性物が見出された． ７０％飽和に達するまで上澄みに硫酸アンモニウムを添
加し次いで混合物を３０分間氷上に載置した．遠心分Ｎ
後、沈殿物中に活性が見出された．沈殿物を２０＋ｍＭ
のＫ−リン酸塩（ρ｝１６．８）に懸濁させ次いで２０
０■／ｄのポリエチレングリコール（分子１６０００）
を添加した。混合物を室温で３０分間放置した．遠心分
離後上澄み中に活性が見出された． 上澄み中のタンパク含量を、ワトマン（１４１１．１
ｔｍａｎ）ＤＥ５２アニオン交換剤に吸収させ次いで２
０−のＫーリン酸塩（ｐＨ６． ８ ）で洗浄し更にｐ
ｌ１６．８のＫ−リン酸塩勾配緩衝液（ ２０ａ＋Ｍ〜
５００ｍＭ）で溶出させた。
）音波発生器Ｂ１２で超音波処理に委ねた．得られた粗
留出物に２５％の飽和に達するまで硫酸アンモニウムを
添加し次いで混合物を氷上に３０分載置した．遠心分離
後、上澄み中において活性物が見出された． ７０％飽和に達するまで上澄みに硫酸アンモニウムを添
加し次いで混合物を３０分間氷上に載置した．遠心分Ｎ
後、沈殿物中に活性が見出された．沈殿物を２０＋ｍＭ
のＫ−リン酸塩（ρ｝１６．８）に懸濁させ次いで２０
０■／ｄのポリエチレングリコール（分子１６０００）
を添加した。混合物を室温で３０分間放置した．遠心分
離後上澄み中に活性が見出された． 上澄み中のタンパク含量を、ワトマン（１４１１．１
ｔｍａｎ）ＤＥ５２アニオン交換剤に吸収させ次いで２
０−のＫーリン酸塩（ｐＨ６． ８ ）で洗浄し更にｐ
ｌ１６．８のＫ−リン酸塩勾配緩衝液（ ２０ａ＋Ｍ〜
５００ｍＭ）で溶出させた。
酵素活性を有するフラックションをプールし次いで２０
ｓＭ Ｋ−リン酸塩（ρｏ６．８）に対し透析した。
ｓＭ Ｋ−リン酸塩（ρｏ６．８）に対し透析した。
最後に透析物を凍結乾燥した．
精製手順の過程は、第７表から明らかである。
例３
菌株Ａ３０３ （バシラス プレビス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｂｒｅｖｉｓ）、ＡＴＣＣＩＩ０３１ ）を、細胞
がミッドーロガリスミック（舶４一旦か這輿連坏）層内
に存するまで、振とうフラスコ中３６℃でＴＶ培地（例
１参照）上で増殖させた。この培養物６００ｄを、以下
の組成を有する培地８ｌを含有するバイオテック（Ｂｉ
ｏｔｅｃ）一発酵器内に移した。
ｕｓｂｒｅｖｉｓ）、ＡＴＣＣＩＩ０３１ ）を、細胞
がミッドーロガリスミック（舶４一旦か這輿連坏）層内
に存するまで、振とうフラスコ中３６℃でＴＶ培地（例
１参照）上で増殖させた。この培養物６００ｄを、以下
の組成を有する培地８ｌを含有するバイオテック（Ｂｉ
ｏｔｅｃ）一発酵器内に移した。
（ＮＩ１４） ｚｓＯ４２． ５ ｇ ／ ｆＫ．ＨＰ
Ｏ， Ｉ ＮａｌｌｚＰＯｎ． ２ｔｌｚ０ １ＮａＣ
／！ ０．２５ｌｎｓＯａ， ７１ｈ
Ｏ Ｏ，１２５門ｇｓＯ４． ７ｔｈ０
０．１２５ −微量金属ゾル”
０．７ｄ＃！ 醇素エキス ６ ｇ／ｌ プルラニック ０．１３ｄ／ｊ！デキストロース
３１．２５ ｇ ／ １１）例ｌに記載されてい
る意味に同じ 培養中、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．０に保
った．温度は３０℃であり更に通気および攪拌を調整し
正の酵素圧を得た。
Ｏ， Ｉ ＮａｌｌｚＰＯｎ． ２ｔｌｚ０ １ＮａＣ
／！ ０．２５ｌｎｓＯａ， ７１ｈ
Ｏ Ｏ，１２５門ｇｓＯ４． ７ｔｈ０
０．１２５ −微量金属ゾル”
０．７ｄ＃！ 醇素エキス ６ ｇ／ｌ プルラニック ０．１３ｄ／ｊ！デキストロース
３１．２５ ｇ ／ １１）例ｌに記載されてい
る意味に同じ 培養中、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．０に保
った．温度は３０℃であり更に通気および攪拌を調整し
正の酵素圧を得た。
最適時に細胞を遠心分離により集めた．発酵の過程は次
の表から明らかである。
の表から明らかである。
発酵時間（時） ＮＯ／培養物１ｄ１
０．００５ ２ ０．０１ ３ ０．０２ ４ ０． １８ ５ ０．４７ ６ ０．４１ ７ ０．１７ ８ ０． １３ ４ 菌株Ａ ３０３ （バシラス ブレビス〉を増殖させ、
次いで例３で説明した如く増養した．細胞を、ＯＤ４，
。＝８．０の際に採取した。
０．００５ ２ ０．０１ ３ ０．０２ ４ ０． １８ ５ ０．４７ ６ ０．４１ ７ ０．１７ ８ ０． １３ ４ 菌株Ａ ３０３ （バシラス ブレビス〉を増殖させ、
次いで例３で説明した如く増養した．細胞を、ＯＤ４，
。＝８．０の際に採取した。
細胞を、２０−ＭのＫ一燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）中
ＯＤ４ｓｏ ２．４ ４．１ ７．５ １５．３ １７．５ ２２．２ ２４．０ ２４．０ 例 にｇ＜させ、次いで約４００バールの圧力でマントンー
ガウリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｎｌｉｎ）タイプのホモ
ジナイザー内を通過させた。硫酸アンモニウムを用いた
活ｔ’ｌ物の分別沈殿は例２で説明した如く行った。
ＯＤ４ｓｏ ２．４ ４．１ ７．５ １５．３ １７．５ ２２．２ ２４．０ ２４．０ 例 にｇ＜させ、次いで約４００バールの圧力でマントンー
ガウリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｎｌｉｎ）タイプのホモ
ジナイザー内を通過させた。硫酸アンモニウムを用いた
活ｔ’ｌ物の分別沈殿は例２で説明した如く行った。
沈殿物を含イＴずる活性物を、先に述べたＫ−燐酸塩緩
衝液に溶解し、該緩衝液に対し透析し次いでアミコン（
Ａｍｉｃｏｎ）加圧透析セル中で約１０ｔａｇ／ｍｌの
クンバク濃度に最終的に濃縮した。
衝液に溶解し、該緩衝液に対し透析し次いでアミコン（
Ａｍｉｃｏｎ）加圧透析セル中で約１０ｔａｇ／ｍｌの
クンバク濃度に最終的に濃縮した。
この抽出物の１５０ｄは、第９表に示す如く次の桔製手
続に対する出発物質であった。
続に対する出発物質であった。
２０＋＋＋ＭのＫ一燐酸塩緩衝液（ｐｌｌ６、８）中で
平衡化し予備循環させたＤＥ５２イオン交換体１５０ｄ
を抽出物に添加した。
平衡化し予備循環させたＤＥ５２イオン交換体１５０ｄ
を抽出物に添加した。
スラリーをブフナー漏斗でろ過した。活性物はろ液中に
在し、これを２５＋＋＋Ｈのヒスチジンー｝ＩＣｆｆｉ
緩衝液（ｐＨ ６． ２ ）に対し透析した。
在し、これを２５＋＋＋Ｈのヒスチジンー｝ＩＣｆｆｉ
緩衝液（ｐＨ ６． ２ ）に対し透析した。
この抽出物に、先に説明したヒスチジン（ｌＩｉｓＬｉ
ｄｉｎｅ） １１衝液中で平衡化した４０−のＰＢ６９
４（ファルマシア、クロマトフォーカッシング剤）を添
加した。スラリーをブフナー漏斗でろ過した．活性物は
る液中に存し、これを２０ｄのＫ一燐酸塩（ｐＨ６．
８ ）に対し透析し、硫酸アンモニウムで２０％に飽和
する。該緩衝液中で平衡化した２００ｄのフェニルセフ
ァロースでカラムを充填した。透析したろ液中に存する
活性物をカラムに適用し次いで硫酸アンモニウム２０％
飽和から０％飽和に変化させ並びにエチレングリコール
０％から５０％に変化させながら２０ｍＭのＫ一燐酸塩
（ρ１１６．８）中勾配法により溶出した。
ｄｉｎｅ） １１衝液中で平衡化した４０−のＰＢ６９
４（ファルマシア、クロマトフォーカッシング剤）を添
加した。スラリーをブフナー漏斗でろ過した．活性物は
る液中に存し、これを２０ｄのＫ一燐酸塩（ｐＨ６．
８ ）に対し透析し、硫酸アンモニウムで２０％に飽和
する。該緩衝液中で平衡化した２００ｄのフェニルセフ
ァロースでカラムを充填した。透析したろ液中に存する
活性物をカラムに適用し次いで硫酸アンモニウム２０％
飽和から０％飽和に変化させ並びにエチレングリコール
０％から５０％に変化させながら２０ｍＭのＫ一燐酸塩
（ρ１１６．８）中勾配法により溶出した。
活性物のピーク部分を見出し、プールし、濃縮し、次い
で２０ｍＭのＫ一燐酸塩（ｐｌｌＥｉ．８）に対し透析
し、更に凍結保存した。
で２０ｍＭのＫ一燐酸塩（ｐｌｌＥｉ．８）に対し透析
し、更に凍結保存した。
第１図および第２図は菌株Ａ４４６およびＣ ６００か
らそれぞれ得られたα−アセトラクテート デ力ルポキ
シラーゼ酵素に対しプロットされた相対活性を示すグラ
フであり、 第３図はｐｌ＋に対しプロットした３０゜Ｃでの相対活
性を示すグラフであり、 第４図は温度に対しプロントしたｐｌｌ６での相対活性
を示すグラフである。
らそれぞれ得られたα−アセトラクテート デ力ルポキ
シラーゼ酵素に対しプロットされた相対活性を示すグラ
フであり、 第３図はｐｌ＋に対しプロットした３０゜Ｃでの相対活
性を示すグラフであり、 第４図は温度に対しプロントしたｐｌｌ６での相対活性
を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、至適ｐＨ５〜６、ｐＩ４．７および分子量３０，０
００Ｄ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）を有することを
特徴とする、α−アセトラクテートデカルボキシラーゼ
酵素。 ２、バシラスリケニフォルミス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥
￥ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ￥）から産生できる特許
請求の範囲に第１記載のα−アセトラクテートデカルボ
キシラーゼ酵素。 ３、至適ｐＨ５〜６、ｐＩ４．７および分子量３０，０
００Ｄ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）を有することを
特徴とするα−アセトラクテートデカルボキシラーゼ酵
素の製造方法であって、炭素および窒素源並びに無機塩
を含有する適当な栄養培地中で、α−アセトラクテート
デカルボキシラーゼ生産バシラスニケルフォルミス（￥
Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥￥ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ￥）
菌株を培養し、しかる後培地中、細胞からα−アセトラ
クテートデカルボキシラーゼ酵素を回収することを含ん
でなる、前記方法。 ４、前記バシラスリケニフォルミス菌株が、ＡＴＣＣ１
２７５９、ＡＴＣＣ１２７１３、ＡＴＣＣ１１９４６、
ＡＴＣＣ２７３２６、ＮＲＲＬＢ−３７５１、ＮＣＴＣ
２１２０、ＮＣＴＣ８７２１、ＮＣＩＢ６８１６、ＮＣ
ＩＢ８５３７、ＮＣＩＢ１１８６８並びにα−アセトラ
クテートデカルボキシラーゼ酵素を生産するそれらの突
然変異体および変異体からなる群から選ばれる、特許請
求の範囲第３項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK2524/83 | 1983-06-03 | ||
| DK2524/83A DK252483D0 (da) | 1983-06-03 | 1983-06-03 | Alpha-acetolactate decarboxylaseemzymprodukt og fremstilling deraf |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59112230A Division JPS6070076A (ja) | 1983-06-03 | 1984-06-02 | α−アセトラクテ−トデカルボキシラ−ゼ酵素およびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03172180A true JPH03172180A (ja) | 1991-07-25 |
| JPH0518557B2 JPH0518557B2 (ja) | 1993-03-12 |
Family
ID=8112977
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59112230A Granted JPS6070076A (ja) | 1983-06-03 | 1984-06-02 | α−アセトラクテ−トデカルボキシラ−ゼ酵素およびその製造方法 |
| JP2234616A Granted JPH03172180A (ja) | 1983-06-03 | 1990-09-06 | α―アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素およびその製造方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59112230A Granted JPS6070076A (ja) | 1983-06-03 | 1984-06-02 | α−アセトラクテ−トデカルボキシラ−ゼ酵素およびその製造方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4617273A (ja) |
| EP (1) | EP0128714B1 (ja) |
| JP (2) | JPS6070076A (ja) |
| CA (1) | CA1215661A (ja) |
| DE (1) | DE3479592D1 (ja) |
| DK (1) | DK252483D0 (ja) |
| FI (1) | FI83885C (ja) |
| IE (1) | IE57708B1 (ja) |
| MX (1) | MX7643E (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996025483A1 (fr) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Suntory Limited | Procede de production de biere |
| US6013288A (en) * | 1995-02-17 | 2000-01-11 | Suntory Limited | Process for manufacturing beer |
| JP2009542238A (ja) * | 2006-07-13 | 2009-12-03 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | 改良醸造方法 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0614865B2 (ja) * | 1985-12-13 | 1994-03-02 | 麒麟麦酒株式会社 | α―アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質転換された酵母 |
| US5043276A (en) * | 1988-04-22 | 1991-08-27 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | DNA strand coding for alpha-acetolactate decarboxylase and yeast transformed with the DNA strand |
| US5096720A (en) * | 1988-08-31 | 1992-03-17 | National Starch And Chemical Investment Holding Corporation | Method for enhancing desirable physical and organoleptic properties of food products |
| DK194990D0 (da) * | 1990-08-16 | 1990-08-16 | Novo Nordisk As | Aldc-derivat og anvendelse deraf |
| CN100343385C (zh) | 2004-11-19 | 2007-10-17 | 上海爱普香料有限公司 | 一株高产3－羟基丁酮的短小芽孢杆菌 |
| DE102011003383A1 (de) | 2011-01-31 | 2012-08-02 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol |
| ES2616917T3 (es) | 2011-12-22 | 2017-06-14 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y método para producirlos |
| MX2015002099A (es) | 2012-08-22 | 2015-05-11 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Variantes que tienen actividad glucoamilasa. |
| ES2929531T3 (es) * | 2015-05-22 | 2022-11-30 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Acetolactato descarboxilasa |
| CN122139030A (zh) * | 2023-09-01 | 2026-06-02 | 国际营养与健康丹麦有限公司 | 用于降低啤酒浑浊与双乙酰的蛋白酶和aldc酶 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4844494A (ja) * | 1971-10-11 | 1973-06-26 | ||
| JPS57501114A (ja) * | 1980-08-07 | 1982-07-01 |
-
1983
- 1983-06-03 DK DK2524/83A patent/DK252483D0/da unknown
-
1984
- 1984-06-01 MX MX84924U patent/MX7643E/es unknown
- 1984-06-01 FI FI842203A patent/FI83885C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-06-01 US US06/616,191 patent/US4617273A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-01 CA CA000455709A patent/CA1215661A/en not_active Expired
- 1984-06-01 IE IE1378/84A patent/IE57708B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-06-01 DE DE8484303710T patent/DE3479592D1/de not_active Expired
- 1984-06-01 EP EP84303710A patent/EP0128714B1/en not_active Expired
- 1984-06-02 JP JP59112230A patent/JPS6070076A/ja active Granted
-
1990
- 1990-09-06 JP JP2234616A patent/JPH03172180A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4844494A (ja) * | 1971-10-11 | 1973-06-26 | ||
| JPS57501114A (ja) * | 1980-08-07 | 1982-07-01 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996025483A1 (fr) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Suntory Limited | Procede de production de biere |
| US6013288A (en) * | 1995-02-17 | 2000-01-11 | Suntory Limited | Process for manufacturing beer |
| JP2009542238A (ja) * | 2006-07-13 | 2009-12-03 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | 改良醸造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0518557B2 (ja) | 1993-03-12 |
| CA1215661A (en) | 1986-12-23 |
| MX7643E (es) | 1990-05-30 |
| IE841378L (en) | 1984-12-03 |
| FI83885B (fi) | 1991-05-31 |
| EP0128714B1 (en) | 1989-08-30 |
| FI83885C (fi) | 1991-09-10 |
| US4617273A (en) | 1986-10-14 |
| EP0128714A3 (en) | 1986-07-23 |
| FI842203L (fi) | 1984-12-04 |
| IE57708B1 (en) | 1993-03-10 |
| JPS6070076A (ja) | 1985-04-20 |
| DK252483D0 (da) | 1983-06-03 |
| FI842203A0 (fi) | 1984-06-01 |
| EP0128714A2 (en) | 1984-12-19 |
| JPH0349554B2 (ja) | 1991-07-29 |
| DE3479592D1 (en) | 1989-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TW526268B (en) | Method for producing a fermented milk product | |
| US4617273A (en) | Alpha-acetolactate decarboxylase enzyme and preparation thereof | |
| CN107354106A (zh) | 一种用于培养高密度乳酸菌的培养基及其制备方法 | |
| CA1133410A (en) | Enzymes and processes utilising enzymes | |
| CN103614313A (zh) | 一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法 | |
| KR950006812B1 (ko) | 알콜성 음료의 품질 향상 방법 | |
| US4710470A (en) | Process for producing neuraminidase | |
| US5281527A (en) | Process for producing pullalanase | |
| JPH0783706B2 (ja) | 酒類の品質改良法 | |
| Ayers et al. | Extracts of pure dry yeast for culture media | |
| JPS6018394B2 (ja) | 微生物によるラクタ−ゼの製造法 | |
| Atwa et al. | Lactic acid bacteria | |
| JPS5843079B2 (ja) | 抗葉酸剤に対する細菌の感受性試験用組成物 | |
| RU2061037C1 (ru) | Питательная среда для наращивания биомассы бифидобактерий и лактобактерий | |
| CN120098835B (zh) | 一株高产酸性蛋白酶的淀粉液化芽孢杆菌及其应用 | |
| DK150496B (da) | Alpha-acetolactat-decarboxylase samt fremgangsmaade til fremstilling deraf | |
| JPS58152482A (ja) | 耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンｉおよびその製造法 | |
| JP2026006377A (ja) | グルコースイソメラーゼの製造法 | |
| SU993901A1 (ru) | Штамм SтRертососсUS DIасетILастIS 9/8,используемый в заквасках дл маргарина и кисломолочных продуктов | |
| JPH0370472B2 (ja) | ||
| JPS6248379A (ja) | セフアロスポリンｃアシラ−ゼの製造法 | |
| AYERS | Dry yeast has been extensively used for the preparation of media in these laboratories for the past five years with excellent | |
| JPS63313583A (ja) | セルラ−ゼの製造法 | |
| JPH01240184A (ja) | 耐熱性酸性プロテアーゼ | |
| JPS61181391A (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |