JPH03180178A - 熱安定性ｄｎａポリメラーゼ誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、テルムス“・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）に由来する熱安定性のＤＮＡポリ
メラーゼ誘導体に関する。

本発明のＤＮＡポリメラーゼは、温度循環ＤＮＡポリメ
ラーゼ連鎖反応によって既存の特定の核酸配列から多量
の核酸配列を複製するために特に有用である。

〔従来の技術〕

Ｅ、コ！Ｊ　（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）のような中温微生物
からのＤＮＡポリメラーゼの単離について、広範な研究
が行われてきた。例えば、ベスマン（Ｂｅｓｓｍａｎ）
ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９５７年）、２３３
巻、１７１’−１７７頁およびブチン（Ｂｕｔｔｉｎ）
とコルンベルグ（ＫＯｒｎ−ｂｅｒｇ）　Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、　　（１９６６年）、２４１巻、５４１９
〜５４２７頁を参照されたい。

これとは対照的に、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ　　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のような好熱菌からの
ＤＮＡポリメラーゼの単離と精製については、余り研究
が行なわれていない。カレジン（Ｋａ　ｌｅｄ　ｉｎ）
　　ら、影姑泣鼾）３．　　（１９８０年〉４５巻、６
４４〜６５１頁は、テルムス・アクアチフス（Ｔ、　　
凹懸旦９亘ＹＴＩ株の細胞からのＤＮＡポリメラーゼの
６段階単離および精製法を開示している。これらの工程
は、粗製抽出物の単離、ＤＢＡＥ！−セルロース・クロ
マトグラフィー、ヒドロキシアパタイト上での分別、Ｄ
ＥＡＢ−セルロース上での分別および単一鎮ＤＮＡ−セ
ルロース上でのクロマトグラフィーから或っている。そ
れぞれの段階からのプールは、エンド−およびエクソヌ
クレアーゼの混入についてはスクリーニングされていな
い。精製された酵素の分子量は、モノマー単位当たり６
２．０００ダルトンと報告されている。

テルムス・アクアチフス（Ｔ、ヨ懸旦□紅からのポリメ
ラーゼについての第二の精製法は、エイ・チェノ（Ａ、
Ｃｈｉｅｎ）　　ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　（
１９７６年）、１２７巻、１５５０〜１５５７頁によっ
て記載されている。

この方法では、粗製の抽出物をＤＥＡＢ−セファデック
スカラムにかける。透析下プール分画を次に、ホスホセ
ルロースカラム上での処理に付す。このプールした分画
を透析して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えてポ
リメラーゼの活性の損失を防止ゲル濾過によって分析す
ると分子量は約６３．０００ダルトンであり、スクロー
ス遠心分離によれば約６８、０００ダルトンである。

しかしながら、これらの酵素は作用ｐＨ範囲、貯蔵安定
性等に問題があり、温度循環連鎖反応による核酸の多量
複製・増幅のために用いることはできなかった。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、温度循環連鎖反応による核酸の多量複
製のために使用することができる新規なＮ−末端が短縮
されたＤＮＡポリメラーゼ誘導体を提供するものである
。

〔課題を解決するための手段〕

前記の課題は、核酸の鋳型鎮に相補的な核酸鎖を形式す
るためヌクレオチドトリホスフェートの結合を触媒する
テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉ
ｃｕｓ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する
ことにより解決される。

この酵素は、文献に記載されているテルムス・アクアチ
フス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　７由来の熱安定酵素のｐＨよ
りも広いｐＨ範囲を有し、ｐ）ＩＴではｐＨ８における
場合の５０％より大きな活性を示す。更に、これらの熱
安定酵素は、非イオン性洗剤を含有する緩衝液中に保存
した場合長時間に亙って活性を失わずに安定である。

〔具体的な説明〕

本明細書において用いる用語は次の意味を有する。

「細胞」、「細胞系（セルライン）」および「細胞培養
物」は相互交換可能に用いることができ、これらの名称
は総て子孫を包含する。したがって、「形質転換体」ま
たは「形質転換された細胞」とは、−次細胞およびトラ
ンスファーの回数とは関係なしにその細胞に由来する培
養物を包含する。また、総ての子孫は、人為的または偶
然的突然変異によりＤＮＡ含量が正確には同一ではない
ことがあることも理解される。最初に形質転換された細
胞においてスクリーニングしたのと同じ機能を有する変
異体子孫も包含される。

「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における作
用可能に連結されたコード配列の発現に必要なりＮＡ配
列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えばプロモ
ーター、任意にはオペレーター配列、リボゾーム結合部
位であるが、さらにその他の余り理解されていない配列
も包含することが可能である。真核細胞は、プロモータ
ー、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ−を利用
することが知られている。

「発現系」という用語は、作用可能に連結された所望の
コード配列および制御配列を含むＤＮＡ配列を指し、こ
れらの配列で形質転換された宿主はコードされた蛋白質
を産生ずることができる。

形質転換を行うために、発現系をベクターに含有させて
もよいが、これに続き関連のＤＮＡが宿主染色体に組み
込まれてもよい。

本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、生物活
性を有するポリペプチドまたはその前駆体をコード化す
るＤＮＡ配列を指す。このポリペプチドは、完全な長さ
の遺伝子配列によりまたは酵素活性が保持されているか
ぎりコード配列のいずれかの部分によってコードされて
いてもよい。

「作用可能に連結した」という用語は、成分の正常な機
能を行うことができる併置を指す。例えば、制御配列に
「作用可能に連結した」コード配列は、このコード配列
が制御配列の制御下で発現スことができる配置を指す。

「非イオン性のポリマー性洗剤」とは、イオン性電荷を
持たず、本発明の目的には、約３．５〜約９．５のｐＨ
範囲、好ましくは４〜８．５のｐＨ範囲で酵素を安定化
することができることを特徴とする界面活性剤を指す。

本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチド」という用
語は、２個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはりボ
ヌクレオチド、好ましくは３個以上のものからなる分子
として定義される。その正確な大きさは多くのファクタ
ーによって異り、これらのファクターはオリゴヌクレオ
チドの最終的な機能または用途によって異る。オリゴヌ
クレオチドは、合成的にまたはクローニングによって調
製することができる。

本明細書に用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」およ
び「制限酵素」という用語は、細菌酵素であって、それ
ぞれが特異的ヌクレオチド配列のまたはその付近の二重
鎖ＤＮＡを切断するものを指す。

本明細書に用いられる「ヌクレオチド配列の変化」とい
う用語は、ある種の単一または複数のヌクレオチド置換
、欠失または挿入を指す。

本明細書に用いられる好ましい熱安定酵素は、テルムス
・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ）に由来するＤＮＡポリメラーゼである。その各種の
株も、アメリカン・タイプ・カルチャ・コレクシＢ　ン
（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ）　Ｏ−／クビル、メリーランド、か
ら入手することができ、ティ’デイ’ブ０−７り（Ｔ、
０１Ｂｒｏｃｋ）　、Ｊ、Ｂａｃｔ。

（１９６９年）、９８巻、２８９〜２９７頁、およびテ
ィ・オシ？　（Ｔ、　Ｏｓｈｉｍａ）、Ａｒｃｈ９Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏ１．、　　（１９７８年）、１１７巻、１
８９〜１９６頁に記載されている。これらの好ましい菌
株の一つは、ＹＴ−１株である。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ誘導体に対応する天然酵素
は次の性質を有する。

（１）作用 本酵素は、鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオ
チド又はポリヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にデ
オキシリボヌクレオシド５′−トリホスフェートのα−
ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシ
リボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５′−モノホスフ
ェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する。

（２）基質特異性 本酵素はその十分な活性のために部分的に二本鎖を形成
したＤＮＡ鋳型及び４種類のデオキシリボヌクレオシド
５′−トリホスフェートを必要とする。ここで部分的に
二本鎖を形成したＤＮＡ鋳型とは、例えば単鎖鋳型ＤＮ
Ａ分子に遊離の３′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌ
クレオチドプライマーがアニールしている状態を意味す
る。単鎖ＤＮＡに対しても低い活性を示す可能性がある
。

（３〉最適Ｈ及び安定ｐＨ範囲 最適ｐＨ範囲は、７０℃〜７５℃の温度においてｐＨ８
，０〜８．５である。但し、ｐＨ７，０においても有意
な活性を有する。本酵素は少なくともｐＨ５，０〜ｐＨ
９，４の範囲で比較的安定である。

（４〉作用温度範囲 室温〜８５℃の範囲で活性であり、最適温度は約７５℃
である。３５℃における活性は７５℃における活性の約
１％である。

（５）不活性化 （６）阻害、活性化及び安定化 ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、εＤＴ
Ａ　、ホルムアミド、ＳＤＳ、高濃度の尿素、等により
阻害される。

（７）分子量 本発明の分子量を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、分子量標準としてホスホリラーゼＢ（分
子量９２，０００＞　、ウシ血清アルブミン（分子量６
６．２００）　、オバルブミン（分子量４５．０００）
　、カーボニックアンヒドラーゼ（分子量３１．０００
）　、大豆トリプシンインヒビター（分子量２１、５０
０）及びリゾチーム（分子量１４．０００）を用いて決
定した場合、約８６．０００〜９０．０００ダ７１ｚ）
ンであった。しかし最近の報告によればホスホリラーゼ
Ｂの分子量は約９７．３００ダルトンであるとされてお
り、この分子量に基けば本発明の酵素の分子量は約９４
．０００ダルトンとされる。

なお、本酵素の活性測定法及び力価の定義は実施例４に
記載し、本酵素の精製方法の具体例を実施例１及び４に
記載する。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ誘導体は、該酵素を生産す
る能力を有する組換宿主微生物を培養し、この培養物か
ら採取することができる。例えば、細胞を増殖させた後
、遠心分離によって回収する。

細胞の増殖の後、酵素の単離および生成を６段階で行い
、それぞれの段階は室温より低い温度、好ましくは約４
℃で行う。

第一の段階または工程では、細胞が、凍結している場合
には、解凍し、超音波で破砕し、ｐｔｌが約７．５の緩
衝液に懸濁する。

第二の段階では上澄液を集めて、次いで乾燥硫酸アンモ
ニウムのような塩を加えることによって分別する。適当
な両分（典型的には、４５〜７５％飽和）を集めて、０
．２リン酸カリウム緩衝液、好ましくはｐ）１６．５の
緩衝液に溶解して、同じ緩衝液に対して透析する。

第三の段階では、核酸及びある種の蛋白質を取り除く。

第二の段階からの画分を、上記と同じ緩衝液で平衡化し
たＤＥＡＲ−セルロースカラムにかける。次いで、この
カラムを同じ緩衝液で洗浄し、蛋白質含有画分を溶出し
、２８０ｎｍでの吸収によって測定し、集めて、１０ｍ
Ｍ！Ｊン酸カリウム緩衝液に対して、好ましくは第一の
緩衝液でｐＨを７．５にしたものと同じ成分を有するも
ので透析する。

第四の段階では、上記のようにして集めた分画を、第三
の段階で透析に用いた緩衝液で平衡にしたヒドロキシア
パタイトカラムにかける。次いで、このカラムを洗浄し
、１０ｍＭの２−メルカプトエタノールと５％のグリセ
リンを含むｐＨ７，５の０．０１Ｍ〜０．５Ｍリン酸カ
リウム緩衝液の直線グラジェントで酵素を溶出する。プ
ールした熱安定酵素ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む画分
を、第三の段階で透析に使用したのと同じ緩衝液で透析
する。

第五の段階では、透析した両分を、第三の段階で透析に
使用した緩衝液で平衡化したＤＥＡＢ−セルロースカラ
ムにかける。このカラムを次に洗浄し、第三の段階で透
析に使用した緩衝液中で０．０１〜０．６ＭのＫ（Ｊの
ような緩衝液の直線グラジェントで、酵素を溶出する。

熱安定酵素の活性を有する両分を、適当を方法を用いて
デオキシリボヌクレアーゼ（エンド−およびエキソヌク
レアーゼ）の混入について試験する。例えば、エンドヌ
クレアーゼ活性は、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にイ
ンキュベートした後ファージλＤＮＡまたはスーパーコ
イルプラスミドＤＮＡの分子量の変化から、電気泳動に
よって測定することができる。同様に、エキソヌクレア
ーゼ活性は、数個の部位で開裂する制限酵素を用いて処
理した後、ＤＮＡの分子量の変化から電気泳動によって
測定することができる。

デオキシリボヌクレアーゼ活性を持たないと決定された
両分をプールして、第三の段階で用いたのと同じ緩衝液
で透析する。

第六の段階では、プールした両分を、一定のベツドボリ
ウムを有するホスホセルロースカラムに入れる。このカ
ラムを洗浄して、ｐＨ７，５でリン酸カリウム緩衝液中
０．０１〜０．４　ＭのにＣ１のような緩衝液の直線グ
ラジェントで酵素を溶出する。熱安定なポリメラーゼ活
性を有し、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有しないプ
ールした両分を、ｐＨ８．０の緩衝液で透析する。

透析した生成物の分子量は、蛋白質分子量マーカーを用
いてＳＯ３ＰＡＧＥによる方法等によって決定すること
ができる。

本発明の熱安定酵素は、この酵素をコードする遺伝子を
テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ａｑｕ−
ａｔｉｃｕｓ）ゲノムＤＮＡからクローン化し、組換え
ＤＮＡ技術によって製造することもできる。テルムス・
アクアチフス（Ｔａｑ）　ポリメラーゼの完全なコード
配列は、約１８ｋｂ　（キロベース）のゲノムＤＮＡイ
ンサートフラグメント内に含まれる約３．５ｋｂのＢｇ
ｌ　ｎ　−Ａｓｐ７１８　（部分〉制限フラグメントを
含むバクテリオファージＣ）１３５　：Ｔａｑ　＃　４
−２から誘導することができる。このバクテリオファー
ジは、１９８７年５月２９日にアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、寄託
番号第４０．３３６号を有する。また、この遺伝子は、
プラスミドｐＦＣ８３（ＡＴＣＣ第６７、４２２号、１
９８７年５月２９日寄託）から単離された約７５０塩基
対（ｂｐ）のＢｇｌ　ｌｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ制限フラグ
メントを、プラスミドｐＦＣ８５（ＡＴＣＣ第６７、４
２１号、１９８７年５月２９日寄託）から単離された約
２．８ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ−Ａｓｐ７１８制限フラグメ
ントに連結することによって造成することができる。

ｐＦＣ８５制限フラグメントはＴａｑポリメラーゼ遺伝
子のアミノ末端をコードする部分を有するが、ｐＦＣ８
５からの制限フラグメントはカルボキシ−末端をコード
する部分を有する。したがって、これらの２個のフラグ
メントを、適当な制御配列を有する対応して消化された
ベクターと連結すると、全長Ｔａｑポリメラーゼの翻訳
が得られる。

所望の酵素活性を有する生物学的に活性な遺伝子生成物
を得るためにはＴａｑポリメラーゼ遺伝子の全コード配
列は必要でないことも見出された。

アミノ末端コード部分が欠失しており、コード配列の約
３分のｌが不在であるＤＮＡが、ポリメラーゼ分析にお
いて完全に活性な遺伝子生成物を産生した。

Ｎ−末端の欠失に加えて、Ｔａｑポリメラーゼを構成す
るペプチド鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、
またはその他の誘導体化によって改変されていてもよく
、また蛋白質を開裂して活性を保持するフラグメントを
得ることもできる。活性を破壊しないかかる変更は、遺
伝子の定義からこのような蛋白質をコードするＤＮＡ配
列を除外しない。

したがって、翻訳の間に配列に組み込まれるアミノ酸の
欠失、付加または変更による一次構造自体の改変は、蛋
白質の活性を破壊することなく行うことができる。かか
る置換またはその他の変更は、本発明の範囲に属するＤ
ＮＡによってコードされたアミノ酸配列を有する蛋白質
をもたらす。

本発明の精製されたポリメラーゼで免疫したウサギから
のポリクローナル抗血清を用いて、テルムス・アクアチ
フス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の部分
ゲノム発現ライブラリーをプローブして、下記のように
して適当なコード配列を得た。クローン化されたゲノム
配列は融合ポリペプチドとして発現させたり、それ自体
の制御配列を用いて直接に発現させたり、または酵素の
発現に用いられる特定の宿主に好適な制御配列を用いる
構成によって発現させることができる。

勿論、これらの配列をコードするＤＮＡの入手可能性は
、コドン配列を改変してＤＮＡポリメラーゼ活性をも有
するムティン（ｏ＋ｕｔｅｉｎ）形を得る機会を提供す
る。

例えば、これらの手段は、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ
のための完全なコード配列を提供して、このコード配列
から、各種の宿主系に適用できる発現ベクターを構成し
、そしてコード配列を発現せしめることができる。さら
に、以上のことから、Ｔａｑポリメラーゼコード配列の
部分はプローブとして有用であり、色々な種のその他の
熱安定ポリメラーゼコード配列を回収するためのプロー
ブとして有用であることも明らかである。したがって、
少なくとも６個のアミノ酸をコードするゲノムＤＮＡの
部分をＥ、コ！Ｊ　　（Ｌｃｏｌｉ）　　において複製
しそしてこれを変性してプローブとして使用し、あるい
は少なくとも６個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレ
オチドを合或し、これらを用いて熱安定性ポリメラーゼ
をコードする他のＤＮＡを検索することができる。テル
ムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　凹懸旦□旦に
おけるヌクレアーゼ配列とその他の種類の対応する部分
の配列は正確には一致しないことがあるので、間違った
陽性を排除するのに十分なストリンジエンシー条件下で
ハイブリダイゼーションを行うために６個のアミノ酸ス
トレットをコードする約１８個のヌクレオチドを有する
オリゴマーが必要であろう。６個のアミノをコードする
配列は、かかるプローブのために十分な情報を供給する
であろう。

好適な宿主、制御系および方法 一般的に、組換え形のＴａｑポリメラーゼの製造は、以
下のような工程を含む。

第一に、成熟酵素（この場合、総てのムティンを含む意
味に用いられる）、あるいはＴａｑポリメラーゼとその
活性を破壊しない追加の配列との融合体、または制御さ
れた条件下で（例えば、ペプチダーゼによる処理による
〉開裂して活性蛋白質をもたらすことができる追加の配
列との融合体、をコード化するＤＮＡを得る。配列がイ
ントロンによって中断されていないときには、それは如
何なる宿主における発現にも好適である。この配列は、
切り出し可能で且つ回収可能な形であるべきである。

次に、好ましくは、切り出されたまたは回収されたコー
ド配列を、複製可能な発現ベクター中の好適な制御配列
と作用可能に連結する。このベクターを用いて、好適な
宿主を形質転換し、形質転換された宿主を好ましい条件
下で培養して、組換えＴａｑポリメラーゼを産生させる
。場合によっては、Ｔａｑポリメラーゼを培養液または
細胞から単離するが、ある種の不純物が許容される場合
には、蛋白質の回収および精製は必要でないこともある
。

上記の段階のそれぞれは、各種の方法で行うことができ
る。例えば、所望のコード配列をゲノムフラグメントか
ら得て、適当な宿主に直接用いることもできる。各種の
宿主で作用可能な発現ベクターの造成は、以下のような
適当なレプリコンを用いて行なわれる。好適な制限部位
が通常は利用可能でない場合には、これをコード配列の
末端に加えて切り出し可能な遺伝子を得、これらのベク
ターに挿入することができる。

制御配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子を
発現するのに用いられる宿主細胞の型によって異る。一
般的には、原核細胞、酵母、昆虫または哺乳類細胞が宿
主として現在有用である。

原核宿主は、一般的には組換え蛋白質の産生にとって最
も有効で好都合であり、それ故Ｔａｑポリメラーゼの発
現にとって好ましい。

Ｔａｑポリメラーゼの特定の場合には、組換え条件下お
よび自然条件下のいずれにおいても、蛋白質のＮ−末端
でかなり欠失が起こり、そして蛋白質の活性はなお保持
されたままであることを示す証拠が存在する。単離され
た天然蛋白質は、蛋白質分解による分解の結果であり、
不完全な遺伝子の翻訳の結果ではない。しかしながら、
プラスミドｐＦＣ８５の不完全な遺伝子から産生された
ムティンは、ＤＮＡポリメラーゼの分析で完全な長さを
有する配列をコードするＤＮＡから産生されたムティン
と同様に、完全に活性である。ある種のＮ末端が短縮さ
れた形は活性であることが明らかであるので、用いられ
る遺伝子構成物またはポリメラーゼの発現も、対応する
短縮された形状のコード配列を含むことができる。

制御配列および対応する宿主 原核生物は、最も一般的には、Ｅ、コ！Ｊ　（Ｅ。

ｃｏｌｉ）の各種株によって代表される。しかしながら
、バシルス属、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、各種のシュドモナス（Ｐ
ｓｕｅ−ｄｏｍｏｎａｓ）またはその他の菌株のような
他の微生物株を用いることもできる。かかる原核系では
、宿主と適合性の種に由来する複製部位と制御配列を有
するプラスミドベクターが用いられる。例えば、Ｅ、コ
リ（Ｂ、　　ｃｏｌｉ）は、典型的には、ポリバー（Ｂ
ｏｌｉｖａｒ）　　ら、Ｇｅｎｅ、　１９７７年、２巻
、９５頁によるＥ、コリ　（Ｅ！、ｃｏｌｉ）種に由来
するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形
質転換される。

ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐
性の遺伝子を有し、所望のベクターを造成する際に保持
されまたは破壊される付加的マーカーを提供する。転写
開始を促進し、任意にはオペレーターを有し且つリボゾ
ーム結合部位配列を有する本明細書記載の一般的に用い
られる原核制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリ
ナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）　プロモーター系
〔チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７
年）■９８巻、１０５６頁〕、トリプト７７　ン（ｔｒ
ｐ）プロモーター系〔ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　（１９８Ｑ
年）８巻、４０５７頁〕、およびλ由来のＰＬプロモー
ター〔シマタケ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ）　　ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ　（１９８１年〉２９２巻、１２８頁〕、および
ポータプル制御カセットとして有用なＮ−遺伝子リボゾ
ーム結合部位があり、このポータプル制御カセットは、
ＮｌｌＢ５配列の６ｂｐ３’内での開裂を可能にする少
なくとも１個の制限部位を有する第三のＤＮＡ配列のＮ
ＲＢＳ上流に対応する第二のＤＮＡ配列に操作可能に連
結したＰＬプロモーターである第−ＤＮＡ配列を含んで
戊る。チャン（Ｃｈａｎｇ）　　らの欧州特許出願公開
第１９６．８６４号明細書（１９８６年１０月８日発行
）に記載され、同じ承継人に承継されたホスファターゼ
Ａ　（ｐｈｏＡ）系も有用である。しかしながら、原核
生物に適合性の如何なる利用可能なプロモーターも用い
ることができる。

細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主として用
いることができる。サツカロミセス・セレビシアｚ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
実験室菌株であるパン酵母が最も多く用いられるが、そ
るが〔ブローチ、ジェイ、アール（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ
、Ｒ１）。

Ｍｅｔｈ、εｎＺ、　（１９８３年）１０１巻、３０７
頁〕、酵母の発現に好適な他のプラスミドベクターも知
られている〔例えば、スチンクコンブ（Ｓｔ　ｉｎｃｈ
ｃｏｍｂ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９年）２８２巻
、３９頁、チｓ　ンヘ（Ｔｓｃｈｅｍｐｅ）ら、Ｇｅｎ
ｅ　（１９８０年）１０巻、１５７頁およびクラーク（
Ｃ１ａｒｋｅ）ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、　（１９８３年
）１０１巻、３００頁を参照されたい〕。酵母ベクター
のための制御配列には解糖系酵素の台底のプロモーター
も含まれる〔ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、Ｊ、Ａｄｖ、　ｔ！
ｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　（１９６８年）７巻、１４９頁
、ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）　　ら、Ｂ　ｉｏｔｅｃ
ｈｎｏ−１ｏｇｙ　（１９７８年）１７巻、４９００頁
〕。

その他の当業界に知られているプロモーターには、３−
ホスフォグリセレート・キナーゼ〈ヒッツエマン（）Ｉ
ｉｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　（
１９８０年）２５５巻、２０７３頁〉およびその他の解
糖系酵素、例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート・
デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコ
ース−６−ホスフェート・インメラーゼ、３−ホスホグ
リセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオ
ースホスフェート・インメラーゼ、ホスホグルコースイ
ソメラーゼおよびグルコキナーゼの遺伝子のプロモータ
ーがある。増殖条件により制御される追加の利点を有す
るその他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナー
ゼ２、イソチトクロームＣ１酸性ホスフアターゼ、窒素
代謝に関係する分解酵素およびマルトースおよびガラク
トース利用に関する酵素のプロモーターである〔ホラン
ド（Ｈｏｌｌａｎｄ）同上〕。

ターミネータ−配列は、コード配列の３′末端において
望ましいであろう。かかるターミネータ−は、酵母由来
の遺伝子におけるコード配列に続く３′非翻訳領域に見
出される。例示されるベクターの多くは、エノラーゼ遺
伝子を含有するプラスミドｐｅｎｏ４６　Ｃホランド（
ｆｌｏｌｌａｎｄ、　　Ｍ、Ｊ、）　　ら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　（１９８１年）２５６巻、１
３８５頁〕から、またはＹＥｐ１３から得られるＬＥＵ
２遺伝子〔ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、）ら、Ｇｅ
ｎｅ　（１９７８年）　８巻、１２１頁〕から誘導され
る制御配列を有するが、酵母適合性プロモーター、複製
開始点および他の制御配列を有する如何なるベクターも
好適である。

勿論、多細胞生物に由来する真核宿主細胞培養物におい
てポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることも
可能である。例えば、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１−ｔｕｒｅ
、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ）、クルッ（Ｃｒｕｚ）とバターソン（Ｐａｔｔｅｒ
ｓｏｎ）　　監修（１９７３年）を参照されたい。有用
な宿主細胞系には、ネズミミエローマＮ５１．　Ｖ［Ｅ
ＲＯおよびＨｅ１ａ細胞、並びにチャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞がある。

これらの細胞のための発現ベクターは、通常は、シミア
ンウィルス４０　（ＳＶ４０）からの一般的に用いられ
る前期および後期プロモーター（フィールス（Ｆｉｅｒ
ｓ）　　ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８年〉２７３巻、
　１１３頁）、またはポリオーマ、アデノウィルス２、
ウシパピローマウィルスモジ＜はトリザルコーマウィル
スに由来するようなプロモーター、または免疫グロブリ
ンプロモーターおよびヒートショックプロモーターのよ
うな哺乳類細胞に適合性のプロモーターおよび制御配列
を有する。ＢＰＶをベクターとして用いる哺乳類系にお
けるＤＮＡ発現系は、米国特許第４．４１９．４４６号
明細書に開示されている。

この系の変形は、米国特許第４．６０１．９７８号明細
書に記載されている。哺乳類細胞系の形質転換の一般的
態様は、米国特許第４．３９９．２１６号明細書に記載
されている。「エンハンサ−」領域が、最適な発現にお
いて重要であると思われるが、これらの領域は一級的に
はプロモーター領域の上流に見出される配列である。所
望であるならば、複製開始点をウィルス源から得ること
ができる。しかしながら、真核生物でのＤＮＡ複製では
染色体への組み込みが一般的な機構である。

植物細胞も宿主として利用可能であり、植物細胞に適合
する制御配列、例えばツバリン・シンターゼ・プロモー
ターおよびポリアデニル化シグナル配列〔デピッカ−（
Ｑｅｐｉｃｋｅｒ、　Ａ、）ら、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ａｐｐｅ、　Ｇｅｎ、　（１９８２年）１巻、５６１頁
〕が利用できる。

更に、最近では、バクロウィルス・ベクターによって提
供される制御系を利用する昆虫細胞を用いた発現系も報
告されている〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｄ。

Ｗ、）　　ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｂｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ　（１９８６年）、セトロウ（Ｓｅｔｌｏｗ、　Ｊ、
に、）ら監修、ブレナム・パブリッシング（Ｐｌｅｎｕ
ｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、８巻、２７７〜２９７頁
〕。

これらの系はＴａｑポリメラーゼの産生にも有用である
。

形質転換 用いる宿主細胞に依存して、形質転換はその細胞に適当
な標準的な技術を用いて行なわれる。塩化カルシウムを
用いるカルシウム処理〔コーヘン年）６９巻、２１１０
頁〕が、原核生物またはその他の実質的な細胞障壁を有
する細胞に用いられる。アグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンス（Ａｇｒｏｂａｃ−ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）での感染〔シア９（Ｓｈａｗ、　Ｃ６
Ｈ１）　　ら、Ｇｅｎｅ　（１９８３年）２３巻、３１
５頁〕が、ある種の植物細胞で用いられる。前記のよう
な細胞壁を持たない哺乳類細胞では、グラハム（Ｇｒａ
ｈａｍ）とヴアン・デル・ニブ（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｂ
）のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい（Ｖｉｒｏｌｏ
ｇＹ　（１９７８年）５２巻、５４６頁〕。酵母への形
質転換は、ヴアン・ゾリンアン（Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇ
ｅｎ、　Ｐ、）ら（Ｊ、Ｂａｃｔ、、　　１９７７年、
１３０巻、９４６頁）およびシアオ（Ｈｓｉａｏ、　Ｃ
，Ｌ、）　　ら（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　　１９７
９年、７６巻、３８２９頁〉の方法によって行なわれる
。

λｔｌ１発現ライブうリー〇造成 所望の蛋白質をコードするＤＮＡ、例えばＴａｑポリメ
ラーゼをコードするＤＮＡをバクテリオファージλｇｔ
ｌｌを用いて単離する方法は、次の通りである。ライブ
ラリーは、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　
ａ　ｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡを完全消化しこれをλｇｔ
ｌｌファージのＢｃｏＲＩ部位に挿入することによって
得られるＥｃｏＲＩ部位を両端に有するＡｌｕ　Ｉフラ
グメントから構成され得る〔ヤング（Ｙｏｕｎｇ）　　
とデービス（口ａｖｉｓ）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ。

１９８３年、８０巻、１１９４〜１１９８頁〕。このバ
クテリオファージ中のユニークＢｃｏＲ１部位がβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシ末端に位置している
ので、適当なフレームおよび方向で挿入されたＤＮＡは
、ラクトースオペロンプロモーター／オペレーターの制
御下でβ−ガラクトシダーゼと融合した蛋白質として発
現される。

次に、抗体プラークハイブリダイゼーション法を用いて
ゲノム発現ライブラリーをスクリーニングする。この方
法は「エピトープ選択」と呼ばれ、このファージによっ
てコードされた融合蛋白質配列に対する抗血清を用いて
ハイブリッド形成するプラークを同定するものである。

例えば、この組換えファージのライブラリーを、８６．
０００〜９０．０００ダルトンのＴａｑポリメラーゼを
認識する抗体を用いてスクリーニングして、この蛋白質
の抗原決定基をコードするＤＮＡセグメントを有するフ
ァージを同定することができる。

約２×１０Ｓ個の組換えファージを、全ウサギＴａｑポ
リメラーゼ抗血清を用いてスクリーニングする。この−
次スクリーニングでは、陽性シグナルが検出され、これ
らのプラークの１種以上が、免疫前血清と反応せず且つ
免疫血清と反応する候補プラークから精製され、幾分詳
細に分析される。

組換えファージによって産生される融合蛋白質を検査す
るため、宿主Ｙ１０８９におけるファージの溶原株を得
る。溶原株を誘発し、生成する蛋白質をゲル電気泳動し
た後、それぞれの溶原株が他の溶原株には見られない新
たな蛋白質を産生ずるのを観察することができ、または
重複配列が生じることもある。陽性シグナルを有するフ
ァージを取り出す。ここに記載する例においては１個の
陽性プラークを取り出して更に同定を行ない、低密度で
再プレートして組換体を純化し、純化したクローンをＢ
ｃｏＲＩ制限酵素での消化によるサイズクラスによって
分析する。次に、単離されたＤＮＡ挿入配列からプロー
ブを作り、適当に標識を行い、そしてこれらのプローブ
をマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
Ｍａｎｕａｌ、　１９８２年に記載されている通常のプ
ラークハイブリダイゼーション又はコロニーハイブリダ
イゼーション分析法に用いることができる。

標識したプローブを用いて、シャロン（Ｃｈａｒｏｎ）
３５バクチリオフ１−ジ中に構成された第二のゲノムラ
イブラリーをプローブした〔ウイルヘルマイ７　（Ｗｉ
ｌｈｅｌｍｉｎｅ、　Ａ、　Ｍ、）ら、Ｇｅｎｅ、　　
１９８３年、２６巻、１７１〜１７９頁〕。このライブ
ラリーは、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　
　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ゲノムＤＮＡを３ａｕ３Ａ部分
消化しそしてサイズ分別したフラグメント（１５〜２０
ｋｂ）　をシャロン３５フアージのＢａｍＨＩ部位にク
ローン化することにより作製された。このプローブを用
いて、ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡを含むフ
ァージを単離した。ＣＨ３５：Ｔａｑ＃４−２と命名し
た生成するファージの一つは、全遺伝子配列を有するこ
とが判明した。この遺伝子の部分をコードする部分配列
も単離された。

ベクターの造成 所望のコード配列および制御配列を含有する好適なベク
ターの造成は、当業界で周知の標準的な連結および制限
酵素技術を用いる。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列ま
たは合成されたオリゴヌクレオチドを開裂し、ととのえ
、そして再連結して所望の形状にする。

部位特異的ＤＮＡ開裂は、当業界で周知の条件下で好適
な（１種以上の）制限酵素を用いて処理することによっ
て行ない、その詳細はこれらの市販の制限酵素の製造業
者によって記載されている。

例えば、ニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　、製品カタログ
を参照されたい。一般的には、約ＩＫのプラスミドまた
はＤＮＡ配列を、約２０Ｊ１１の緩衝溶液中で１単位の
酵素で開裂し、本明細書の実施例では、典型的には、過
剰量の制限酵素を用いてＤＮＡ基質を完全に消化するよ
うにしている。約３７℃で約１〜２時間のインキュベー
ション時間が有効であるが、変更を行なうこともできる
。それぞれのインキュベーションの後に、蛋白質をフェ
ノール／クロロホルムで抽出して、次いでエーテル抽出
を行なうことによって除去して、核酸を水性分画からエ
タノール沈殿によって回収することができる。所望なら
ば、開裂フラグメントのサイズ分離を、標準的技術を用
いるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気
泳動によって行なうことができる。サイズ分離の一般的
説明については、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、　１９８０年、６５巻、４９９〜５６０頁に記
載されている。

制限開裂したフラグメントを、５０ｍＭのトリス、ｐＨ
７，６、５０ｍＭのＮａｉ、　１０ｍＭのＭｇＣｌ　２
，１０ｍＭのＤＴＴおよび５０〜１００７／ｌＩＩのｄ
ＮＴＰｓ中で、２０〜２５℃で約１５〜２５分間のイン
キュベーション時間を用いて、４種類のデオキシヌクレ
オチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在でＥ、コリ
（Ｂ、ｃｏｌｉ）　ＤＮＡポリメラーゼエ　（フレノウ
（Ｋｌｅｎｏｗ））　　の大フラグメントで処理するこ
とによって平滑末端にすることができる。フレノウフラ
グメントは５′接着末端をフィルインするが、４種のｄ
ＮＴＰｓが存在していても、突出する３′単一鎖をチュ
ーバック（ｃｈｅｗｓ　ｂａｃｋ）する。所望ならば、
接着末端の性状によって指定される制限内で唯１種のま
たは選択された複数のｄＮＴＰｓを供給することによっ
て選択的修復を行なうことができる。フレノウで処理し
た後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させた。適当な条件下で８１ヌクレアー
ゼを用いて処理すると、単一鎖部分の加水分解が起こる
。

台底オリゴヌクレオチドは、マテウチ（Ｍａｔｔｅｕ−
ｃｃｉ）ら（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　１９８
１年、１０３巻、３１８５〜３１９１頁）のトリエステ
ル法を用いて、または自動合成法を用いて調製すること
ができる。アニーリングの前のまたは標識のための単一
鎖のキナーゼ処理は、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７，６，
１０ｍＭの！ＪｇＣＣ。

５ｍＭのジチオスレイトール、１〜２ｍＭのＡＴＰの存
在下で、１ｎＭの基質に対して過剰量の、例えば約１０
単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いて行なう。この
キナーゼ処理がプローブの標識するためのものであると
きには、ＡＴＰは高比活性のＴ３２ｐを有する。

連結は、下記の標準的条件及び温度で１５〜３０４の容
積で行なう。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　　（ｐＨ７
，５＞　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、　
　３３Ｒ／ｍ！ＢＳＡ、　１０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣ
Ｒｓおよび（「接着末端」の連結には）４０□□□のＡ
ＴＰ、　　０．０１〜０．０２　Ｃワイス（Ｗｅｉｓｓ
）　　３単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ、０℃；または（
「平滑末端」の連結には）１ｍＭのＡＴＰ、　　０．３
〜０．６　Ｃワイス（Ｗｅｉｓｓ）　）単位のＴ４　Ｄ
ＮＡリガーゼ、１４℃。分子内「粘着末端」連結は、通
常は３３〜１００　ｚ／−の総ＤＮＡ濃度（５〜１１０
０ｎの総末端濃度）で行なう。

分子間平滑末端連結（通常は１０〜３０倍の過剰モルの
リンカ−を用いる〉は、１州の総末端濃度で行なう。

「ベクターフラグメント」を用いるベクターの造成では
、ベクターフラグメントを通常は細菌性アルカリホスフ
ァターゼ（ＲＡＰ）で処理して５′ホスフエートを除去
して、ベクターの再連結を防止する。ＢＡＰ消化は、ｐ
Ｈ８で、約１５０ｍＭのトリス中で、Ｎａ＋およびＭ　
ｇ−２の存在で、ベクター１　ｍｇ当たり約１単位のＢ
ＡＰを用いて、６０℃で約１時間行なう。核酸フラグメ
ントを回収するため、調製物をフェノール／クロロホル
ムで抽出し、エタノール沈澱せしめる。また、好ましく
ないフラグメントを追加的制限酵素消化によって二重消
化されたベクターでは、連結は防止することができる。

ＤＮＡ配列の改変 配列の改変を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに
由来するベクターの部分については、部位特異的なプラ
イマー指令変異誘発を用いる。この技術は現在では当業
界で標準的であり、所望の変異を表わす限定されたミス
マツチを除いて変異誘発されるべき単一鎖ファージＤＮ
Ａに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い
て行なわれる。要約すれば、ファージに相補的な鎖の合
成を指令するブライマーとして台底オリゴヌクレオチド
を用い、生成する二本！３１　Ｄ　Ｎ　Ａをファージ支
持性の宿主細菌に形質転換する。形質転換された細菌の
培養液を上層寒天に塗布しファージを有する単一細胞か
らプラークを形成させる。

理論的には、新たなプラークの５０％は変異形を単一鎖
として有するファージを含み、５０％はもとの配列を有
する。プラークをニトロセルロースフィルターに移して
、正確にマツチするハイブリダイゼーションを可能にし
且つもとの鎖とのミスマツチがハイブリダイゼーション
を防止するのに十分であるような温度で、キナーゼ処理
した合成プライマーで「す、フト（１ｉｆｔＳ）　　Ｊ
ハイブリダイゼーションを行なう。次に、このプローブ
とハイブリッド形成するプラークを採取して、培養し、
ＤＮＡを回収する。

造成の証明 以下の造成では、プラスミド造成物の正確な連結を、最
初に連結混合物を用いてＥ、コ＋Ｊ　（Ｅ。

ｃｏｌ　ｉ）　ＭＭ２９４株または他の適当な宿主を形
質転換することによって確かめる。当業界で理解されて
いるように、好結果の形質転換体を、プラスミド造成の
方式に依存してアンピシリン耐性、テトラサイクリン耐
性またはその他の抗生物質耐性によって選択する。次に
、形質転換体からのプラスミドを、クレウｘ　ル（Ｃｌ
ｅｗｅｌｌ、　Ｄ、　Ｂ、　）　　ら、（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９６９年、６２巻、１
１５９頁）の方法により、場合によってはクロラムフェ
ニコール増幅法〔フレウェル（Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、
Ｂ、）、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

１９７２年、１１０巻、６６７頁〕によって調製する。

単離したＤＮＡを、制限処理により分析し、そして／又
はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、）ら（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　１９７７年、７４巻、５４６３頁
）のジデオキシ法であって更にメッシング（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ）　　ら（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、
　１９８１年、９巻、３０９頁）によって記載されてい
る方法、またはマクサム（Ｍａｘａｍ）　　ら（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１９８０年
、６５巻、４９９頁）の方法によって配列決定する。

宿主の例 この発明においてクローニング及び発現に用いられる宿
主菌株は、次の通りである。

クローニング及び配列決定、並びにほとんどの細菌性プ
ロモーターの制御下での造成物の発現には、Ｅ、コリ　
（Ｅ、ｃｏｌｉ）ゲネチック・ストック・センターＧＣ
３Ｇ　＃６１３５から得たＥ、コリ　（Ｂ、ｃｏｌｉ）
株ＭＭ２９４を宿主として用いた。ＰＬＮＩＩＩｌｓプ
ロモーターの制御下での発現には、Ｅ、コ’）　　（Ｂ
、　　ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＣ１００Ｏλ溶原株、ＮＪ
ｓ３ｃ１８５７ＳｕｓＰｓｏ、　ＡＴＣＣ３９５３１を
用いることができる。本明細書では、１９８７年４月７
日にＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ５３６０６）として寄託されて
いるＥ、コリ　（Ｌ　□ｌ１）ＤＧ１１６を用いる。

Ｍ１３ファージ組換体のためには、ファージ感染を受け
やすいＥ、、コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）　、例えばＥ
。

コリに１２株ＤＧ９８を用いる。ＤＧ９８株は１９８４
年７月１３日にＡＴＣＣ寄託され、寄託番号３９７６８
を有する。

哺乳類テノ発現ハＣＯ３−７，ＣＯ３−Ａ２．　ＣＶ−
１およびネズミ細菌で行うことができ、そして昆虫細胞
ではスボドプテラ・フルジペイダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａｆｒｕｇｉｐｅｉｄａ）での発現を基礎とする。

酵素活性の安定化 酵素は、長期間安定にするためには、１種又は複数種の
非イオン性ポリマー性界面活性剤を含む緩衝液中に貯蔵
するのが好ましい。この様な界面活性剤は一般的には分
子量が約１００〜２５０．０００の範囲であり、好まし
くは約４．０００〜２００．０００ダルトンであり、ｐ
Ｈが約３．５〜約９．５、好ましくは約４〜８．５で酵
素を安定化するものである。この様な界面活性剤の例と
しては、マツグ・クチェオン１Ｊｃｃｕｔｃｈｅｏｎ）
のｔｉｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　＆　Ｄｅｔｅｒ　ｅｎｔ
ｓ、北アメリカ版（１９８３年）エムシー・パブリッシ
ング・カンパニー（ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、
）　のマツグ・クチェオン部門発行、１７５．　　ロッ
クロード、グレンロック、ニューシャーシー（米国）、
の２９５〜２９８頁に記載されているものがあり、その
詳細については上記文献を参照されたい。好ましくは、
界面活性剤はエトキシル化した脂肪族アルコールエーテ
ルおよびラウリルエーテル、エトキシル化したアルキル
フェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエタノー
ル化合物、改質オキシエチル化したおよび／またはオキ
シプロピル化した直鎮状アルコール、ポリエチレングリ
コールモノオレエート化合物、ポリソルベート化合物お
よびフェノール性脂肪族アルコールエーテルからなる群
から選択される。更に詳細には、好ましくは、ポリオキ
シエチル化（２０）　　ソルビタンモノラウレートであ
るツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　　ＣＩＣＩ・アメリカ
ス・インコーポレーテド（ＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａｓ　
Ｉｎｃ、）、　　ウイルミントン、　ＤＢ）およびエト
キシル化アルキルフェノール（ノニル）であるイコノー
ル（Ｉｃｏｎｏｌ）　（登録商標’）　ＮＰ−４０（バ
スフ（ＢＡＳＦ）イアンドット・コーポレーション、バ
ーシバニー、ニューシャーシー）である。

以下の実施例Ｉｔ、単に例示のために提供するものであ
り、発明の範囲および特許請求の範囲を限定することを
意図するものではない。これらの実施例において、総て
のパーセンテージは、特に断らないかぎり、固体の場合
には重量％、液体の場合には容積％であり、総ての温度
は摂氏で表わしている。

アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション、　
１２３０１バークラウンドライブ、ロックビル。

ＭＯからＡＴＣＣＮα２５．１０４としてなんら制御な
く人手でＹＴＩ株をフラスコ中で、下記の培地中で増殖
せしめた。

クエン酸ナトリウム　　　　　　１ｍＭリン酸カリウム
ｐＨ７，９５ｍＭ 塩化アンモニウム　　　　　　　１０ｍＭ硫酸マグネシ
ウム　　　　　　０．２ｍＭ塩化カルシウム　　　　　
　　０．１ｍＭ塩化ナトリウム　　　　　　　　１　ｇ
／ｌ酵母エキス　　　　　　　　　　１　ｇ／Ｉｔトリ
プトン　　　　　　　　　　１　ｇ／ｌグルコース　　
　　　　　　　　２　ｇ／Ｉｔ硫酸第一鉄　　　　　　
　　　０．０１ｍＭ（オートクレーブ前にｐＨを８．０
に調整）上記培地中で７０℃にて一夜培養したフラスコ
種母を１０１発酵槽に接種した。種母フラスコからの合
計６００−の種母を１０１の同じ培地に接種した。

ｐＨを水酸化アンモニウムにより８．０に調節し、溶存
酸素を４０％に調節し、温度を７０℃に調節し、そして
攪拌速度を４０Ｏｒｐｍとした。

細胞の増殖の後、最初の５段階についてはＫａｌｅ−ｄ
ｉｎ等、前掲、の方法（わずかに変更を加えて）を用い
、そして第６段階では異る方法を用いて精製を行った。

６段階すべてを４℃にて行った。カラムでの分画速度は
０．５力ラム／時とし、溶出中のグラジェントの容量は
１０カラム容量とした。これに代る好ましい方法を例６
に後記する。

要約すれば、上記培養のＴ、アクアチフス（ｌエフ細胞
天、９時間の培養の後、後期対数期１．４　ｇ乾燥重量
／１の細胞濃度において、遠心分離により集菌した。２
０ｇの細胞を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７
，５）及び０．１ｍＭ　ＢＤＴＡを含む緩衝液８０ｒｒ
ｆ！中に懸濁した。細胞を溶解し、そして溶解物を４℃
のローター中で３５．００Ｏｒｐｍにて２時間遠心した
。

上清を集め（画分Ａ）、そして硫酸アンモニウムの４５
〜７５％飽和の間で沈澱する蛋白質画分を集め、０．２
Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６，５）、　１０ｍＭ　　２−
メルカプトエタノール及び５％グリセリンを含有する緩
衝液中に溶解し、そして最後に同じ緩衝液に対して透析
して画分Ｂを得た。

画分Ｂを、上記の緩衝液で平衡化されたＤＢＡＥ−セル
ロースの２．２　Ｘ３Ｑｃｍカラムに適用した。次に、
このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、そして蛋白質を含有
する両分（２８０ｎｏ＋における吸収により決定する）
を集めた。−緒にした蛋白質画分を、０．０１Ｍリン酸
カリウム（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　２−メルカプトエ
タノール及び５％グリセリンを含有する第二緩衝液に対
して透析して画分Ｃを得た。

画分Ｃを、第二緩衝液で平衡化されたヒドロキシアパタ
イトの２．６　Ｘ２１ｃｍカラムに適用した。次に、こ
のカラムを洗浄し、モしてｌＱａ＋Ｍ　２−メルカプト
エタノール及び５％グリセリンを含有する０、０１〜０
．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，５）緩衝液の直線グラ
ジェントにより酵素を溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ活
性を含有する画分く９０〜１８０ｍＭ　！Ｊン酸カリウ
ム〉を集め、アミコン攪拌セル及びＹＭＩＯ膜を用いて
４倍に濃縮し、そして第二緩衝液に対して透析して画分
りを得た。

画分りを、第二緩衝液で平衡化したＤＥＡＲ−セルロー
スの１．６　Ｘ２ａｃｍカラムに適用した。このカラム
を洗浄し、そして第二緩衝液中０．Ｏｌ〜０．５　Ｍ　
！Ｊン酸カリウムの直線グラジェントによりＤＮＡポリ
メラーゼを溶出した。画分をエンドヌクレアーゼ及びエ
キソヌクレアーゼの汚染について測定した。これは、過
剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした後の
ファージλＤＮＡ又はスーパーコイルプラスミドＤＮＡ
の分子量の変化を電気泳動により検出することにより（
エンドヌクレアーゼについて〉、そしてＤＮＡを幾つか
のフラグメントに開裂せしめる制限酵素による処理の後
に（エキソヌクレアーゼについて）行った。最少のヌク
レアーゼ汚染を有するＤＮＡポリメラーゼ画分（６５〜
９５ｍＭリン酸カリウム）のみをプールした。

このプールにオートクレーブしたゼラチンを２５゜ｎ／
ｍｌの量で添加し、そして第二緩衝液に対して透析を行
って画分Ｅを得た。

画分Ｅをホスホグルコースカラムに適用し、そして２０
ｍＭリン酸カリウム（ｐ）Ｉ　７．５　）中０．０１〜
０．４ＭＫＣ２のグラジェント１００ｍ１！により溶出
した。両分を上記のようにしてエンドヌクレアーゼ／エ
キソヌクレアーゼの汚染について、そしてさらにポリメ
ラーゼ活性について（Ｋａ　ｌｅｄ　ｉｎ等の方法によ
り〉測定した。プールした両分を第二緩衝液に対して透
析し、次に５０％グリセリン及び第二緩衝液に対する透
析により濃縮した。

ポリメラーゼの分子量を５Ｏ３−ＰＡＧ８により決定し
た。マーカー蛋白質はホスホリダーゼＢ　（９２，００
０）、ウシ血清アルブミン（６６、２００）　、オバル
ブミン（４５，０００）、カーボニックアンヒドラーゼ
（３１，０００）、大豆トリプシンインヒビター（２１
，５００）　、及びリゾチーム（１４，４００）であっ
た。

予備的データは、文献（例えばＫａｌｅｄｉｎ等）に報
告されている６２．０００〜６３．０００ダルトンでは
なく、約８６．０００〜９０．０００ダルトンであった
。

コノポリメラーゼを、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　
（ｐ！（６，４及びｐＨ８，０）、　　０．ＩＭＫＣｊ
！、　　１０ｍＭＭｇＣＬ、　　１ｍＭ　　２−メルカ
プトエタノール、ｌＱｎｍｏｌｅずつのｄＧＴＰ　。

ｄＡＴＰ及びＴＴＰ　、及び０．５μＣ１（３Ｈ）ｄｃ
ＴＰ、　　８Ｊ！ｇの“活性化されたウシ”胸腺ＤＮＡ
並びに０．５−５ユニツトのポリメラーゼを含有する混
合物５０ハ中でインキュベートした。“活性化された”
　ＤＮＡは、ＤＮＡの５％が酸−溶解性画分に移るまで
ＤＮａｓｅ　Ｉにより消化して部分加水分解した後のＤ
ＮＡの天然調製物である。この反応は７０℃にて３０分
間行い、そして０．１２５Ｍ　ＢＤＴＡ　　Ｎａ２を含
有するリン酸ナトリウムの飽和水溶液約５０Ｊ１！の添
加により停止せしめた。サンプルをＫａｌｅｄｉｎ等、
前掲に記載されているようにして処理しそして活性を測
定した。

この結果は、ポリメラーゼはｐＨ６，４においてｐＨ８
，０における活性の半分より活性であることを示した。

これに対して、Ｋａｌｅｄｉｎ等は、酸素はｐＨ約７．
０において、ｐＨ３，３における活性の８％を有するこ
とを見出した。従って、本発明の熱安定酵素のｐＨプロ
フィールはＫａｌｅｄｉｎ等の酵素のそれよりも広い。

最後に、ＤＮＡポリメラーゼ測定反応混合物から１種類
のみ又は複数種類のヌクレオチドトリホスフェートを除
去した場合、本発明の酵素を用いて活性がほとんど観察
されず、活性は予想値と一致しており、そして酵素は高
い忠実性を示した。

これに対して、Ｋａｌｅｄｉｎ等、前掲、を用いて観察
された活性は予想値と一致しておらず、そしてヌクレオ
チドトリホスフェートの間違った導入が示唆される。

Ｔａｑ　ｐｏｌ遺伝子のための特異的ＤＮＡ配列プロー
ブを、λｇｔ１１発現ライブラリーの免疫的スクリーニ
ングにより得た。Ｔ、アクアチフスのＤＮＡをＡｌｕ　
Ｉにより完全消化し、ＢｃｏＲＩ　　１２−マーリンカ
−（ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ　、ニューイングランド
バイオラプス）と連結し、ＢｃｏＲＩで消化し、モして
ＢｃｏＲＩ−消化され脱リン酸化されたλｇｔｌｌ　Ｄ
ＮＡ　（プロゲマ・バイオチク）と連結した。連結され
たＤＮＡをパッケージしくジガパックプラス、ストラテ
ジーン〉、モしてＥ、コリに一１２株Ｙ１０９０　（Ｒ
，Ｙｏｕｎｇより入手）にトランスフェクトした。

２Ｘ１０５プラークの最初のライブラリー　を、精製さ
れたＴａｑポリメラーゼ（実施例１及び実施例４を参照
のこと〉に対するラビットポリクローナル抗血清のｌ：
２０００稀釈物を用いてスクリーニングした（　Ｙｏｕ
ｎｇ、　ＲｌＡ、及びＲＪ、Ｄａｖｉｓ　（１９８３）
Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２２２　ニア７８−７８２）　、候
補プラークを限界稀釈で再プレートし、そして均一にな
るまで（約３サイクル）再スクリーニングした。免疫前
血清と反応せずそして免疫血清と反応する候補プラーク
からファージＡ精製した。

候補ファージを用いてＥ、コリＹ−１２株Ｙ１０８９（
Ｒ，Ｙｏｕｎｇ）を溶原化した。溶原菌を、Ｔａｑポリ
メラーゼ抗血清と反応するＩＰＴＧ誘導性融合蛋白質（
β−ガラクトシダーゼより大）の産生についてスクリー
ニングした。固相のサイズ分画された融合蛋白質を用い
て、全ポリクローナル抗体からエピトープ特異的抗体を
アブィニティー精製したＣ　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｌ
、Ｓ、Ｂ、等（１９８６）　Ｊ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ。

１０２　：　２０７６−２０８７’］。

今度は、“つり上げられた”エピトープ−選択された抗
体をウェスタン分析において用いて、Ｔａｑポリメラー
ゼに特異的なりＮＡ配列をコードしているλｇｔｌｌフ
ァージ候補を同定した。λｇｔ：１と称する１つのλｇ
ｔｌｌファージ候補が、全ラビットポリクローナルＴａ
ｑポリメラーゼ抗血清からの精製されたＴａｑポリメラ
ーゼ及びＴａｑポリメラーゼを含有する粗抽出画分の両
者と特異的に反応する抗体を、特異的に選択した。この
ファージλｇｔ：１を使用してさらに検討した。

テルムス・アクアチフスＤＮＡの約１１５ｂｐのＢｃｏ
ＲＩ−適合Ａｌｕ　Ｉ断片をラベルしくＭａｎｉａｔｉ
ｓ等、前掲）て、Ｔａｑポリメラーゼ特異的プローブを
形成した。このプローブをサザン分析において、及びＴ
、アクアチフスＤＮＡランダムゲノムライブラリーをス
クリーニングするために用いた。

λフアージシャロン３５　（Ｗｉｌｈｅｌｍｉｎｅ、　
Ａ、Ｍ、等、前掲）をその接着末端を介してアニールし
そして連結し、ＢａｍＨＩにより完全消化し、そしてア
ニールされたアームをスタファ−（ｓｔｕｆｆｅｒ）　
　フラグメントから、酢酸カルシウム密度勾配超遠心（
Ｍａｎｉ−ａｔｉｓ等、前掲〉　により精製した。Ｔ、
アクアチフスのＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分分解し、そし
て１５〜２０ｋｂサイズの両分をシェークロース密度勾
配超遠心により精製した。標的ＤＮＡフラグメント及び
ベクターＤＮＡフラグメントを１：１のモル比で連結す
ることによりランダムゲノムライブラリーを遺戒した。

ＤＮＡをパッケージし、モしてＥ、コリに一１２株ＩＪ
３９２又はに８０２にトランスフェクトした。９９％以
上の組換体を含有する２０．０００以上の最初のファー
ジのライブラリーをＥ、コ’ＩＫ−１２株ＬＥ３９２上
で増幅した。

λｇｔｌｌ　：　１の放射性ラベルされたＢｃｏＲＩ挿
入部によりＣ）１３５　Ｔａｑゲノムファージライブラ
リーをスクリーニングした（マニアチス等、前掲）。特
異的にハイブリダイズする候補ファージプラークを精製
し、そしてさらに分析した。ＣＨ３５：：　４−２と称
する１つのファージが、旧ｎｄｌＩＩによる消化の後に
４個以上のＴ、アクアチフスＤＮＡフラグメントを放出
した（約８．０　、４．５　、０．８　、０．５８ｋｂ
）。

４種類の旧ｎｄＩＩ［Ｔ、　　アクアチフスＤＮＡフラ
グメントを、旧ｎｄｌｌＩで消化したプラス２１８３Ｍ
１３十（３，２ｋｔ＋、　ヘタ９−９０−ニングシステ
ムズ、サンジエゴ）に連結し、そしてそれぞれＥ、コリ
に一１２株ＤＧ９８　を形質転換してクローン化した。

Ｃ）１３５：：　４−２からの約ｇ、Ｑｋｂの旧ｎｄＩ
［［ＯＮ＾フラグメントをプラスミドｐＦＣ８２（１１
，２ｋｂ）中に単離し、他方ＣＨ３５：：　４−２から
の４．５ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ　ＤＮＡ７５グメントを
プラスミドｐＦＣ８３（７，７ｋｂ）中に単離した。

ｐＦｃ８２を含有するＥ、コ’Ｊ　ＤＧ９８株は熱安定
性高温ＤＮＡポリメラーゼ活性を含有することが示され
た（第１表）。さらに、この細胞は、免疫的にＴａｑ　
ＤＮＡポリメラーゼと関連する新たな約６０ｋｄの分子
量のポリペプチドを台底した。

８、Ｏｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ口ＮＡフラグメントのＴａ
ｑポリメラーゼコード領域をさらに処理し、８．０ｋｂ
　ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの２．８ｋｂのＨｉｎｄ
　ｍ−虫７１８部分を１ａｓ−プロモーターの近位に位
置付けた。この領域をサブクローニングしてプラスミド
ｐＦＣ８５（６，０ｋｂ）を得た。ＩＰＴＧと共にイン
キエベートした後、プラスミドｐＦｃ８５を含有するＥ
、コＩＪＤＧ９８細胞は、もとの親クローン（ＩＩＦＣ
８２／ＤＧ９８）　に比べて１００倍までの熱安定性Ｔ
ａｑポリメラーゼ関連活性を台底する（第１表）。ｐＰ
ｃ８５を含有する細胞は有意量の熱安定ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を台底するが、Ｔａｑ　ｐａｌ　ＤＮＡ配列の
一部分のみが翻訳され、約６０ｋｄのＴａｑポリメラー
ゼ関連ポリペプチドの蓄積が起こる。

、第　１　表 Ｅ、コリ（＃）　における熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活
性の発現 ８５Ｍ１３／ＤＧ９８−　　　　　　　　　　　　０．
０２ｐＦＣ８２／口Ｇ９８　　　　　　　　　２，２　
　　　　　　　　　２．７（＃）細胞は後期対数期まで
増殖せしめ（＋／−ＩＰＴ６　、１０ｍＭ）　、集菌し
、音波処理し、７５℃にて２０分間加熱し、遠心し、そ
して透明な上清を７０℃にてＤＮＡポリメラーゼ活性に
ついて測定した。

（本）１ユニット＝３０分間にｌ　ｎＭ　ｄＣＴＰの取
り込み。

実施例３゜ この発明の熱安定酵素の遺伝子は種々の細菌発現ベクタ
ー、例えばＤＧ１４１（ＡＴＣＣ３９５８８）及びＩ）
ＰＬＮＲＢＳ　ＡＴＧ中で発現せしめることができる。

これらの宿主ベクターの両者はｐＢＲ３２２の誘導体で
あって、トリプトファン・プロモーターオペレーター及
びＡＴＧ開始コドンと作用可能に連結されたりボゾーム
結合部位（ＤＧ１４１）　、又はλＰｔプロモーターを
含む配列及びＡＴＧ開始コドンに作用可能に連結された
遺伝子Ｎ結合部位（ｐＰＬＮｕｌｌｓ　ＡＴＧ）を有す
る。これらの宿主ベクターのいずれか一方をＳａｃ　Ｉ
により制限酵素処理し、そしてＫｌｅｎｏｗ又はｓ１ヌ
クレアーゼにより平滑末端化して、Ｔａｑポリメラーゼ
遺伝子を後で挿入するための便利な部位を作ることがで
きる。

次の様にして、プラスミドｐＦｃ８３及びｐＦ（’８５
にサブクローニングされたＤＮＡ挿入フラグメントから
完全な長さのＴａｑポリメラーゼ遺伝子を造成した。ベ
クターＢＳＭ１３”　（ベクタークローニングシステム
ス、サンジエゴ、　ＣＡから市販されている）をユニー
ク旧ｎｄｍ部位において消化し、Ｋｌｅ−ｎｏｗ及びｄ
ＮＴＰにより修復し、そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼを用
いて角ｌＩＩオクタヌクレオチド≠≠リンカ−５’　−
ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３’に連結し、モしてＥ、コリＤＧ
９８株に形質転換した。ＡｍｐｌｌｌａｃＺ、＋形質転
換体からプラスミドを単離した。クローンの１つをＢｇ
ｌ　ＩＩ及びＡｓｐ７１８により消化し、そして大ベク
ターフラグメ４）をゲル電気泳動により精製した。

次に、プラスミドｐＦＣ８３をＢｇｌ　ＩＩ及びＨｉｎ
ｄ■で消化し、そして約７５０ｂｐのフラグメントを単
離した。プラスミドｐＦＣ８５をＨｉｎｄＩＩ［及びＡ
ｓｐ７１８で消化し、そして約２．８ｋｂのフラグメン
トを単離し、そして３片連結によりｐＦＣ８３からの約
７５０ｂｐのＢｇｌ　ｌｌ−１罰ｄＩ［１フラグメント
及び８３Ｍ１３＋のＢｇｌＩＩ−か４７１８ベクターフ
ラグメントと連結した。この連結混合物を用いてＥ、コ
リＤＧ９８株（１９８４年７月１３日に寄託のＡＴＣＣ
Ｎ（Ｌ３９．７６８）を形質転換し、これからＡｍ　ｐ
　Ｒコロニーを選択し、そして約６．７５ｋｂのプラス
ミド（ｐＬｓＧｌ）を単離した。ｐＬｓＧｌを含有する
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
により誘導されたＤＧ９８細胞は、Ｔ、アクアチフスか
ら単離された天然酵素と区別できないサイズのＴａｑ　
ＯＮ＾ポリメラーゼを合成した。次に、プラスミドｐＬ
ｓＧ１ヲ用いて、ベクタークロー二、ングシステムズに
より推奨される方法に従って単鎖ＤＮＡ鋳型を形成する
ことができる。

次に、オリゴヌクレオチド−指令変異誘発（Ｚｏｌｌｅ
ｒ及びＳｍ１ｔｈ、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
　（１９８２）　１０：６４８７−６５００　〕を用い
てＡＴＧ開始コドンの部分としてＳｐｈ　Ｉ制限部位を
導入することができる（Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子のコ
ード配列中の内部量ｎｄＩＩＩ部位の上流に）。同様に
して、遺伝子のカルボキシ末端の後（Ａｓｐ７１８部位
から約０．７ｋｂ上流）にＢｇｌ　ＩＩ　部位を導入し
て発現ベクターへのＴａｑポリメラーゼ遺伝子のサブク
ローニングを容易にすることができる。部位特定変異誘
導を終った後、遺伝子を８３Ｍ１３”ベクターから約３
．２ｋｂのＳｐｈ　Ｉ−ＢｓｔＥ　Ｕ制限フラグメント
上に単離し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント及び４種類すべ
てのｄＮＴＰにより処理し、モしてＴ４ＤＮＡ’Ｊガー
ゼを用いて（平滑末端条件）あらかじめＳａｃ　Ｉで消
化し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰにより修復しそしてウ
シ腸ホスファターゼで処理して脱リン酸化平滑末端を形
成しておいた前記の発現ベクターに挿入することができ
る。この連結混合物を用いてＥ、コ！Ｊ　ＤＧ１１６を
形質転換し、そして得られる形質転換体をＴａｑポリメ
ラーゼの産生についてスクリーニングする。酵素の発現
は、ウェスタンイムノプロット分析及び活性分析により
確言忍することができる。

プラスミドｐＦＣ８５の約２．８ｋｂの旧ｎｄ　ＩＩＩ
　−Ａｓｐ７１８フラグメント中に含有されるＴａｑポ
リメラーゼ遺伝子のさらに大きな部分を、例えばプラス
ミド！’ＰＬ　ＮＲＢＳ　ＡＴＧを用いて、Ｔａｑ　ｐ
ａｌ遺伝子をコードするアミノ−末端ＨｉｎｄＩＩＩ制
限部位をＡＴＧ開始コドンに連結することにより、発現
せしめることができる。この融合体の発現生成物は約６
６、０００〜６８、０００ダルトンの端が切り取られた
ポリメラーゼをもたらす。

この特定の造成は、プラスミドｐＦＣ８５を旧ｎｄｌｌ
Ｊで消化し、そしてｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ及びｄＣＴ
Ｐの存在下でＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理すること
により行うことができる。生じたフラグメントを８１ヌ
クレアーゼでさらに処理することにより単鎖延長部を除
去し、そして生じたＤＮＡをＡｓｐ７１８で消化し、そ
して４種類すべてのｄＮＴＰの存在下でにｌｅｎｏｗフ
ラグメントにより処理する。回収された断片を、Ｔ４Ｄ
ＮＡ　　！Ｊガーゼを用いて、あらかじめＳａｃ　Ｉに
より消化しそしてｄＧＴＰの存在下でＫｌｅｎｏｗフラ
グメントで処理してＡＴＧ平滑末端を形成しておいた脱
リン酸化プラスミドｐｐＬＮｌｌｎｓ　ＡＴＧに連結す
ることができる。次に、この連結混合物を用いてＥ、コ
リＤＧ１１６を形質転換し、そして形質転換体をＴａｑ
ポリメラーゼの産生についてスクリーニングする。

やはり、ウェスタンイムノプロット分析及び活性分析に
より発現を確認することができる。

実施例４．精製 熱安定性ポリメラーゼは、前に記載した例に従って、テ
ルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　皿憇−ｔｉ
ｃｕｓ）の培養物から直接精製する方法に粗抽出物の調
製において必要なわずかな変更を加えて、組換生産され
た酵素を含有する細菌培養物から精製することができる
。

遠心分離により集菌した後、６０ｇの細胞を５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣＩｌ　（ｐＨ８，１）及び１ｍＭ　ＢＤＴ
Ａを含有する緩衝液７５ｒｎｌ中に懸濁した。細胞をフ
レンチプレス中で１４．０００〜１６．０ＯＯＰＳＩ　
にて溶菌し、この後４容積（３００ｒｎｌ）の追加のＴ
ｒｉｓ−ＢＤＴＡを加えた。緩衝液Ａ（β−メルカプト
エタノールを５ｍＭに、そしてＮＰ−４０及びトウィー
ン２０をそれぞれ０．５ｖ／ｖ％に）を添加し、そして
この溶液を冷却しながら十分に音波処理した。得られる
均質懸濁液を緩衝液入によりさらに稀釈して最終容量が
出発細胞重量の７．５〜８倍となるようにした。これを
画分■と称する。

画分Ｉ及び上清画分中のポリメラーゼ活性を、０、０２
５Ｍ　ＴＡＰＳ−ＨＣ１（ｐＨ９，２、２０℃）、　０
．００２Ｍ　ＭｇＣｊ２２゜０．０５Ｍ　Ｋｉ、　１ｍ
Ｍ　２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭずつのｄＧ
ＴＰ　、　ｄＡＴＰ　、　ＴＴＰ　、　０．１ｍＭ　ｄ
ＣＴＰ　Ｃａ−３２Ｆ、　０．０５Ｃｉ／ｍＭ）　、　
１２．５ｘ“活性化された″サケ精子ＤＮＡ及び０．０
１〜０．２ユニツトのポリメラーゼ（１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，５０ｍＭ　ＫＣｌ、　　１　ｍ
ｇ／−のオートクレーブされたゼラチン、０．５％ＮＰ
−４０、０，５％トウィーン２０及び１ｍＭ　　２−メ
ルカプトエタノール中に稀釈）を含んで戒る５０ハの混
合物中で測定した。１ユニツトは３０分間中１０ｎＭの
生成物に相当する。“活性化された”ＤＮＡは、ＤＮＡ
の５％が酸可溶性画分に変るまでＤＮａｓｅ　Ｉにより
部分加水分解された後のＤＮＡの天然調製物である。反
応を７４℃にて１０分間行い、そして次に４０ハを２ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ中５０ＪＩｇ／ｍ１のキャリヤーＤＮＡ溶
液１．０ｍ！（０℃）中に移した。同容量（１，０ｍＭ
りの２０％ＴＣＡ及び２％ピロリン酸ナトリウムを加え
た。０℃にて１５〜２０分間の後、サンプルをワットマ
ンＧＦ／Ｃディスクを通して濾過し、そして冷５％ＴＣ
Ａ−１％ピロリン酸塩により十分に洗浄し、次に冷９５
％エタノールで洗浄し、そして乾燥し、計数した。

画分■を、ベックマンＴｌ４５０°−ター中で３５．０
０Ｏｒｐｍにて２時間、２℃にて遠心し、そして集めた
上滑を画分■とした。

活性の９０〜９５％を沈澱せしめるのに必要なポリミン
（Ｐｏｌｙｍｉｎ）　　Ｐの最少量（この量は一般に最
終容量の０．２５〜０．３％であることが見出された）
を決定した後、ポリミンＰ　（ＢＰＬ、　　ガイセルブ
ルグ。

ＭＤ）　（１０ｖ／ｖ％、ｐＨ７，５に調整しそしてオ
ートクレーブしたもの）によりＴａｑポリメラーゼ活性
を沈澱せしめた。

０℃にて１５分間にわたり攪拌しながら、適当なレベル
のポリミンＰを画分■に徐々に添加した。

この溶液を０℃にてベックマンＪ＾１４０−ター中テ２
０分間にわたり１３．００Ｏｒｐｍにて遠心した。上清
の活性を測定し、そしてペレットを１７５容量の０．５
×緩衝液Ａ（水で１：２に稀釈したもの〉に再懸濁した
。この懸濁液を再遠心分離し、そしてペレットを１／４
容量の緩衝液Ａ　（０，４Ｍ　ＫＣ！！を含有〉に再懸
濁した。この懸濁液を十分にホモジナイズし、そして４
℃に一装置いた。このホモジネートを前記のように遠心
し、そして集めた上清を画分■と命名した。

蛋白質画分を硫酸アンモニウムの７５％飽和での“沈澱
″により集め、遠心分離しく２７．００Ｑｒｐｍ　。

５１１１２７０−ター、３０分間）そして浮上した薄膜
を５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、　１ｍＭ
　ＥＤＴＡ中に再懸濁した。

これらの段階を反復し、そして蛋白質懸濁液を８０ｍＭ
　　にＣｆを含有するＰ−ｃｅｌｌ緩衝液Ｃ２０ｍＭ　
ＫＰＯ，。

ｐＨ７，５，０，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　５ｍＭ　β−
メルカプトエタノール、５　ｐｓ／ｖ％グリセロール、
０．５Ｖ／Ｖ％ＮＰ−４０及びトウィーン２０〕により
十分に透析した。

透析物を遠心ビンに移し、これに、８０ｍＭＫ（’Ｉ！
を含有するＰ−ｃｅｌｌｌＪ［ｉ液ですすがれたサック
から回収されたすべての蛋白質を加えた。遠心を２０、
０００　Ｘ　ｇにて行い、そして時間は１５分間に短縮
した。上清を貯蔵し、そして残ったペレットをＰ−ｃｅ
ｌｌ緩衝液及び８０ｍＭ　ＫＣｌにより洗浄・抽出し、
そして再遠心した。次に上清を一緒にして画分■と命名
した。

画分■を、８０ｍＭＫ１を含有するｐ−ｃｅｌｌ緩衝液
で平衡化したホスホセルロースの２．２　Ｘ２２Ｃｍの
カラムに適用した。このカラムを同じ緩衝液で洗浄しく
カラムの２．５〜３倍容量〉、そしてＰ−ｃｅｌｌ緩衝
液中８０〜４００ｍＭ　Ｋｌの直線グラジェントを用い
て蛋白質を溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ活性を含有す
る画分く約０．１８〜０．２０Ｍ　ＫＣ１）をプールし
、そしてアミコン攪拌セル及びＹＭ３０膜上で３〜４倍
濃縮した。このセルを、ＫＣＩを含有しないＰ−ｃｅｌ
ｌ緩衡液ですすぎ、そして画分濃縮物（０，１５Ｍ　Ｋ
Ｃｌ最終容量調整）に加えて画分Ｖとした。

画分Ｖを、ｐ−ｃｅｌｌ緩衡液及び０．１５Ｍ　ＫＣＪ
で平ｌ化したヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂカラム
（ファルマシア）５ｍＭに適用した。カラムを０．１５
ＭＫＣｊ２緩衝液（３〜４カラム容量）により洗浄し、
そしてＰ−ｃｅｌｌ緩衡液中０．１５〜０．６５Ｍ　Ｋ
Ｃｆの直線グラジェントにより蛋白質を溶出した。ＳＯ
３二ＰＡＧＥ分析のためにゼラチンを含まない稀釈剤へ
の１：■０稀釈を行い、そして酵素の測定に使用するた
め１■／ｍｌのゼラチンを含有する稀釈剤への９続いて
の１＝２０稀釈を行った。活性画分く約０．３ＭＫＣＡ
で溶出〉を、スーパーコイルＤＮＡ鋳型上で特異的及び
非特異的エンドヌクレアーゼ／トポイソメラーゼについ
て、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートし
た後のスーパーコイルプラスミドＤＮＡの分子量の変化
を電気泳動により検出することによって測定した。少量
の線状ＤＮＡフラグメントとのインキュベーションの後
エキソヌクレアーゼの汚染が検出された。ピーク画分中
、約８８ｋｄ蛋白質が主たるバンドであることが見出さ
れた。画分■と称する主要画分は、このプールを約３〜
５ポリメラーゼユニツト／　６００ｎｇ　ＤＮＡで５５
℃にて３０分間測定した場合、最少の検出可能なエンド
ヌクレアーゼ活性を伴って最高のポリメラーゼ活性を有
していた。

画分■を、１０ｍＭ　ＫＰＯ４（Ｉ］８７．５）、５ｍ
Ｍ　β−メルカプトエタノール、５％グリセロール、０
．２％ＮＰ−４０及び０．２％トウィーン２０（ＨＡ緩
衝液〉に対して透析した。この透析されたサンプルを、
ヒドロキシアパタイトの３ｍＭのカラムに適用し、モし
てＨＡ緩衝液中１０〜２５０ｍＭ　ＫＰＯ４（ｐＨ７，
５）の直線グラジェントにより酵素を溶出した。ポリメ
ラーゼ活性は７５ｍＭ　ＫＰＯ４において溶出し始め、
１００ｍＭ　ＫＰＯ４においてピークを示した。活性ピ
ーク画分を１：１００〜１：３００稀釈で測定した。前
のクロマトグラフィー段階におけるように、５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＥ分析のため、ゼラチンを含まない稀釈剤中１：１
０の稀釈物を調製した。５ポリメラーゼユニツトで５５
℃において有意なエンドヌクレアーゼ又は二本鎖エキソ
ヌクレアーゼ活性を有しない画分をプールし、そして画
分■と命名した。

画分■を、２５　ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）　
、５％グリセロール、５ｍＭ　β−メルカプトエタノー
ル、Ｑ、１ｍＭ　ＩＥＤＴＡ　、　０．１％ＮＰ−４０
及び０．１％トウィーン２０の溶液に対して透析し、室
温においてｐＨ５に調整した。透析されたサンプルを、
あらかじめ平衡化した２−のＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓ−Ａｃ
ｒｙｌ　−Ｍ（ＬＫＢ）カラムに適用し、そして次に同
じ緩衝液で洗浄した。カラムに付着しなかったポリメラ
ーゼ活性を含有する画分をプールし、そして同じ緩衝液
中５０ｍＭ　ＮａＣＥに調整し、画分■を得た。

画分■を、同じ緩衝液（２５ｍＭ酢酸す）　ＩＪウム、
５０ｍＭ　ＮａＣｆ　、　５％グリセロール、０．１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ　。

０．１％ＮＰ−４０及び０．１％トウィーン２０）で平
衡化された２−のＣＭ−Ｔｒｉｓ−Ａｃｒｙｌ　−Ｍ（
ＬＫＢ）カラムに適用した。このカラムを、４〜５カラ
ム容量の同じ緩衝液で洗浄し、そして酵素を酢酸ナトリ
ウム緩衝液中５０〜４００ｍＭ　　ＮａＣＩｔの直線グ
ラジェントにより溶出した。ポリメラーゼ活性のピーク
は約０．１５〜０．２０Ｍ　　ＮａＣ１において溶出さ
れた。ポリメラーゼ活性を、５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析のた
めにゼラチンを含有しない稀釈剤中にまず１：ｌＯで稀
釈し、１：３００〜１：５００稀釈において測定した。

７４℃にてＤＮＡポリメラーゼアッセイ塩（２５ｍＭ　
ＴＡＰＳ−ＨＣＲ。

ｐＨ９，４，２，ＯｍＭ　ＭｇＣｊ！　２及び５０＋ｙ
＋ＭＫＣｆ）を用いて特異的及び非特異的エンドヌクレ
アーゼ／トポイソメラーゼについてスーパーコイルＤＮ
Ａ鋳型に対する活性ピークにわたる測定を行い、さらに
Ｍ１３ｓｓＤＮＡ及びｐＢＲ３２２フラグメントに対す
るヌクレアーゼの測定も行った。検出可能なヌクレアー
ゼを含有しない活性画分をプールし、そして銀染色５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧｔ！　ミニゲル上を泳動せしめた。

実施例５゜ 実施例４に記載したようにして精製されたＴａｑポリメ
ラーゼは、Ｔａｑエンドヌクレアーゼ活性及びＴａｑエ
キソヌクレアーゼ活性により汚染されていないことが見
出された。さらに、Ｔａｑポリメラーゼは好ましくは、
使用される各非イオン性洗剤約０．１〜約０．５ｖ／ｖ
％を含有する貯蔵緩衝液中に貯蔵される。さらに好まし
くは、貯蔵緩衝液は５０ｖ／ｖ％グリセロール、１００
ｍＭ　ＫＣｉ、　２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ２　（ｐＨ
８，０）、　０．１ｍ１−チレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）、１ｍＭジチオスレイトール、０．５ｖ／ｖ％Ｎ
Ｐ−４０，０，５ｖ／ｖ％トウィーン２０及び２０　ｎ
　／　ｍｌゼラチンからなり、そして好ましくは一２０
℃で貯蔵される。

メラーゼを先行する例において記載したようにして貯蔵
のために製剤化した。但し、非イオン性ポリマー洗剤を
使用しなかった。その例において記載したようにして活
性を測定した場合、この酵素貯蔵混合物は不活性である
ことが見出された。貯蔵緩衝液にＮＰ−２０及びトウィ
ーン２０を添加した場合、十分な酵素活性が保存されて
おり、酵素製剤の安定のために非イオン性洗剤が必要で
あることが示された。

下記のバクテリオファージ及び細菌株がシタス・マスタ
ー・カルチュア・コレクション（Ｃｅｔｕｓ　Ｍａｓ−
ｔｅｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＣｏｌｌＣｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ）（Ｃ、米国カリホル二ア、エメリーピル、　　１４
００．　５３ストリート、及びアメリカン・タイプ・カ
ルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）、　　米国マリ−
ラント、ロックビル、１２３ｏ１パークラウンドライブ
、に寄託された。これらの寄託は、特許手続のための微
生物の寄託の国際的承認についてのブタペスト条約及び
それに基く規則（ブタペスト条約）の規定のもとに行わ
れた。

微生物　　ＣＭＣＣＮαＡＴＣＣＮα　寄託臼ＣＨ３５
：　Ｔａｑ　＃　４−２　３１２５　４０．３３６　１
９８７年５月２９臼Ｅ、コリＤＧ９８／ｐＦＣ８３３１
２８６７、４２２１９８７年５月２９日

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラス２１８３Ｍ１３＋中にサブクローニン
グされた約４，５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ　Ｔ、　　アク
アチフスＤＮＡ挿入部を含有するプラスミドｐＰｃ８３
の制限地図である。 第２図は、プラス２１８３Ｍ１３＋中にサブクローニン
グされた約２．８ｋｂの旧ｎｄ　ｍ　−Ａｓｐ７１８　
Ｔ、アクアチフスＤＮＡ挿入部を含有するプラスミドｐ
ＦＣ８５の制限地図である。 第３図は本発明の酵素誘導体に対応する天然酵素のアミ
ノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を示す。この図
中、本発明の酵素は第６２０位の塩基を含むＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位から第２５００位の塩基の近傍の翻訳終止コド
ン（Ｅｎｄ）の前までのアミノ酸配列を含んで戒る。 ４．５ｋｂ ２．ｇｋｂ ６０ ４０ ２０ ０ ０ ０ ００ ４０ ６０ ００ ２０ ６０ ８０ 第 図 （その１） ０ ２０ ８０ ４０ ００ ８０ ００ ４０ ６０ ６０ ８０ 図（その２〉 ２０ ８０ ００ ６０ ８８０ ５ｔＸＸ ００ ２０ ４０ ６０ ８０ ０００ ０２０ ０４０ ０６０ ０８０ ＡｌａＬｅｕＡｒｇＡｓｐＬｅｕＬｙｓＧｌｕＡ工ａＡ
ｒｇＧｌｙＬｅｕＬｅｕＡｌａＬｙｓＡｓｐＬｅｕＳｅ
ｒＶａｌＬｅｕＡｌａ１００ １２０ １４０ １６０ １８０ ２００ ２２０ ２４０ ２６０ ２８０ ３００ ３２０ ３４０ ３６０ ５２０ ５４０ ６４０ ６６０ ７００ ７２０ 第 図 （その４） ３８０ ５６０ ６８０ ７４０ ８８０ ９００ ０００ ０２０ １２０ １４０ １８０ ２００ 第 図（その５） ９２０ ０４０ １６０ ２２０ ２４０ ２６０ ３００ ３２０ ４２０ ４４０ ４８０ ５００ 第 図 （その６） ２８０ ３４０ ４６０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質： （１）鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチド
   又はポリヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にデオキ
   シリボヌクレオシド５′−トリホスフェートのα−ホス
   フェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ
   核酸にデオキシリボヌクレオシド５′−モノホスフェー
   トを鋳型依存的に導入する反応を触媒し； （２）対応する天然酵素に比して 短縮されており；そして （３）第２図に示すプラスミドｐＦＣ８５（ＡＴＣＣＮ
   ｏ．６７，４２１）中の挿入領域のＨｉｎｄIII部位か
   ら下流方向に連続する１個のコード領域によりコードさ
   れており且つ約６０Ｋダルトンの分子量をもたらすアミ
   ノ酸配列、を含んで成る； を有することを特徴とする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
   。