DK171161B1 - Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve - Google Patents

Description

DK 171161 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til multiplikation (amplifikation) af eksisterende nukleinsyre-sekvenser, hvis disse er til stede i en testprøve, og påvisning af dem, hvis de er til stede, under anvendelse af en 5 probe. Nærmere bestemt angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af en hvilken som helst bestemt nukleinsyrese-kvens ud fra en given sekvens af DNA eller RNA i mængder, som er store sammenlignet med den oprindeligt tilstedeværende mængde, således at påvisning af sekvenserne lettes. DNA'et og 10 RNA'et kan være enkeltstrenget eller dobbeltstrenget og kan enten foreligge i relativt ren form eller som en komponent af en blanding af nukleinsyrer. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvender en gentagen omsætning til udførelse af multiplikationen af den ønskede nukleinsyresekvens.

15 Navnlig til diagnostiske anvendelser kan mål-nukleinsyre- sekvensen være blot en lille del af det pågældende DNA eller RNA, således at det kan være vanskeligt at påvise dets tilstedeværelse under anvendelse af ikke-isotopisk mærkede eller ende-mærkede oligonukleotidprober. Der bruges mange kræfter 20 på at forøge sensitiviteten af probedetektionssystemerne, men der er ikke udført megen forskning på at multiplicere målsekvensen, således at den er til stede i mængder, der er tilstrækkelig til let at kunne påvises under anvendelse af de metoder, der for tiden er til rådighed.

25 Flere metoder er blevet beskrevet i litteraturen ved rørende de novo syntese af nukleinsyrer eller syntese af nukleinsyrer ud fra en eksisterende sekvens. Disse metoder er i stand til at frembringe store mængder af en given nukleinsyre med fuldstændig specificeret sekvens.

30 Én kendt metode til de novo syntetisering af nukleinsyrer omfatter organisk syntese af en nukleinsyre ud fra nukleosid-derivater. Denne syntese kan udføres i opløsning eller på et fast bæremateriale. Én type af organisk syntese er phospho-triestermetoden, som er blevet anvendt til fremstilling af 35 genfragmenter eller korte gener. I phosphotriestermetoden fremstilles oligonukleotider, som derefter kan sammenføjes til dannelse af lange nukleinsyrer. For en beskrivelse af denne metode se Narang, S.A. et al., Meth. Enzvmol.. 68, 90 2 DK 171161 B1 (1979) og US patent nr. 4.356.270. I patentet beskrives syntesen og kloningen af somatostatingenet.

En anden type af organisk syntese er phosphodiesterme-toden, som er blevet anvendt til fremstilling af et tRNA-gen.

5 Se Brown, E.L. et al., Meth. Enzymol,. 68. 109 (1979) for en beskrivelse af denne metode. Som i phosphotriestermetoden omfatter phosphodiestermetoden syntese af oligonukleotider, som efterfølgende sammenføjes til dannelse af den ønskede nukleinsyre.

10 Skønt ovennævnte fremgangsmåder for de novo syntese kan anvendes til syntese af lange strenge af nukleinsyre, er de ikke særligt praktiske at anvende til syntese af store mængder af en nukleinsyre. Begge fremgangsmåder er arbejdskrævende og tidsrøvende, kræver dyrt udstyr og dyre reagenser og 15 har en lav samlet effektivitet. Den lave samlede effektivitet kan skyldes ineffektiviteter i syntesen af oligonukleotideme og i sammenføjningsreaktionerne. I syntesen af en lang nukleinsyre eller endog i syntesen af en stor mængde af en kort nukleinsyre vil det være nødvendigt at syntetisere mange 20 oligonukleotider, og der vil være behov for mange sammenføjningsreaktioner. Som følge heraf vil disse metoder ikke være praktiske til syntese af store mængder af en hvilken som helst ønsket nukleinsyre.

Der eksisterer også fremgangsmåder til fremstilling af 25 nukleinsyrer i store mængder ud fra små mængder af den oprindeligt foreliggende nukleinsyre. Disse fremgangsmåder omfatter kloning af en nukleinsyre i et passende værtssystem, hvor den ønskede nukleinsyre indsættes i en passende vektor, som anvendes til transformering af værten. Når værten dyrkes, 30 replikeres vektoren, og således frembringes flere kopier af den ønskede nukleinsyre. For en kort beskrivelse af subklo-ning af nukleinsyrefragmenter se Maniatis T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, s. 390-401 (1982). Se også teknikkerne beskrevet i US 35 patent nr. 4.416.988 og nr. 4.403.036.

En tredie fremgangsmåde til syntetisering af nukleinsyrer, som er beskrevet i US patent nr. 4.293.652, er en hybrid mellem den ovenfor beskrevne organiske syntese og 3 DK 171161 B1 metoder til molekylær kloning. I denne fremgangsmåde bliver et passende antal oligonukleotider til dannelse af den ønskede nukleinsyresekvens syntetiseret organisk og indsat sekventielt i en vektor, som multipliceres ved vækst forud for hver 5 efterfølgende indsætning.

Den foreliggende opfindelse bærer nogen lighed med metoden til molekylær kloning, men den omfatter imidlertid ikke formering af nogen organisme og undgår derved de mulige farer eller upraktiske forhold, som dette medfører. Den foreliggen-10 de opfindelse kræver heller ikke syntese af nukleinsyrese-kvenser, som er ubeslægtede med den ønskede sekvens, og derved undgår man med den foreliggende opfindelse behovet for omfattende oprensning af produktet ud fra en kompliceret biologisk blanding.

15 Opfindelsen ligger i en fremgangsmåde til multiplicering af en eller flere specifikke nukleinsyresekvenser, der er til stede i en nukleinsyre eller en blanding heraf under anvendelse af primere og midler til polymerisering og derefter påvisning af den multiplicerede sekvens. Forlængelsespro-20 duktet af én primer bliver, når den hybridiseres til den anden, en template for produktionen af den ønskede specifikke nukleinsyresekvens og vice versa, og fremgangsmåden kan gentages så ofte som nødvendigt for at producere den ønskede mængde af sekvensen. Denne fremgangsmåde er mere effektiv end 25 de ovenfor beskrevne metoder til dannelse af store mængder nukleinsyre ud fra en mål-sekvens og til produktion af sådanne nukleinsyrer på en ved sammenligning kort tid. Den foreliggende fremgangsmåde er navnlig nyttig til multiplicering af sjældne nukleinsyrer, der er til stede i en blanding af 30 nukleinsyrer, til effektiv påvisning af sådanne sjældne nukleinsyrer.

Nærmere bestemt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen eller fraværet af i det mindste én specifik nukleinsyresekvens i en 35 prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i prøven, hvorhos hver nukleinsyresekvens, der skal påvises, består af to adskilte, komplementære strenge, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den eller de speci- 4 DK 171161 B1 fikke sekvenser (hvis den eller de forekommer) multipliceres ved: (a) at for hver af de to strenge i hver nukleinsyrese-kvens, der skal påvises, behandles prøven med en 5 nukleotidprimer og andre nødvendige komponenter, således at for hver streng i hver sekvens, som skal påvises, syntetiseres der ud fra hver primer et forlaengelsesprodukt, som er komplementært til den nukleinsyrestreng, på hvilken det syntetiseres, idet 10 primerne udvælges således, at de i det væsentlige er komplementære til hver af strengene i hver specifik sekvens og afgrænser enderne af den nukleinsyrese-kvens, der skal multipliceres, således at det forlængelsesprodukt, der syntetiseres ud fra én primer, 15 tjener som template for syntese af et forlængelses- produkt ud fra den anden primer, når det er blevet adskilt fra sit komplement, (b) at produktet fra trin (a) behandles under denatureringsforhold til adskillelse af primerforlængel- 20 sesprodukterne fra deres templater, (c) at produktet fra trin (b) behandles med oligonukleo-tidprimere og de andre nødvendige komponenter i trin (a), således at der under anvendelse som template af hver af de enkeltstrenge, der er frembragt i trin 25 (b), syntetiseres et primerforlængelsesprodukt, som template, og at trin (b) og trin (c) eventuelt gentages mindst én gang, og at den således multiplicerede sekvens eller de multiplicerede sekvenser (hvis de forekommer) påvises.

30 Trinnene (a)-(c) kan udføres sekventielt eller samtidigt.

Desuden kan trin (b) og (c) gentages, indtil det ønskede omfang af sekvensmultiplikation er opnået.

Fremgangsmåden til multiplicering af en nukleinsyrese-kvens, der anvendes i den foreliggende fremgangsmåde til 35 påvisning af en nukleinsyrekvens, er detaljeret afhandlet i DK 1448/86, der har samme prioritetsdato som den foreliggende ansøgning.

5 DK 171161 B1 I J. Mol. Biol., 56 (1971), 341-361, rapporteres der om undersøgelser udført med polynukleotider, hvorved der frembringes reparationsgenparter af kortkædet syntetisk DNA ved katalyse med forskellige DNA-polymeraser. Der er imidlertid 5 intetsteds nogen angivelse af, at man skulle kunne anvende primerforlængelsesprodukter fra den første reaktionscyklus som templater for den næste cyklus, og således er der ingen hentydninger til muligheden for eksponentiel multiplikation af nukleinsyresekvenser.

10 I DK patentansøgning nr. 4220/84 beskrives en fremgangs måde til fremstilling af syntetisk cDNA eller til bestemmelse af nukleotidsekvenser i coronavirus, hvorved der ud fra et mRNA og under anvendelse af en cDNA-primer og revers RNA-transkriptase fremstilles en første cDNA streng, som eventu-15 elt kan anvendes som udgangsmateriale for fremstilling af den hertil svarende komplementære DNA-streng under anvendelse af en anden primer og cDNA-polymerase 1. DK 4220/84 beskriver således en simpel kopieringsproces under anvendelse af to forskellige primere, én til RNA'et og én til DNA'et, og der 20 tales således ikke om eksponentiel multiplikation af hverken RNA eller DNA, og denne mulighed foreslås heller ikke.

Fig.l viser en 94 basepar lang sekvens af human jS-globin, der ønskes multipliceret. Enkeltbasepar-ændringen, som følger med seglcelleanæmi, er angivet under 94-meren.

25 Fig. 2 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende multiplikation af 94-meren, der indeholdes i human vildtype-DNA og i et plasmid, der indeholder et 1,9 kb BamHI fragment af det normale /3-globin-gen (betegnet pBR328:HbA).

30 Fig. 3 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende multiplikation af enhver af de specifikke 94-mere målsekvenser, der er til stede i pBR328:HbA, et plasmid, der indeholder et 1,9 kb BamHI-frag-ment af seglcelleallelen af jS-globin (betegnet pBR328:HbS), 35 pBR328:HbA, hvor sekvensen, der skal multipliceres, er spaltet med Mstll, og pBR328:HbS, hvor sekvensen, der skal multipliceres, er blevet behandlet med, men ikke spaltet med Mstll.

6 DK 171161 B1

Fig.4 viser i detaljer trinnene og produkterne af poly-merasekædereaktionen til multiplicering af den ønskede 94-mere sekvens af human Ø-globin i 3 cyklusser under anvendelse af to oligonukleotidprimere.

5 Fig. 5 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende multiplikation efter 4 cyklusser af en 240-mer sekvens i pBR328:HbA, hvor alikvoterne er fordøjet med Ncol (bane 3), Mstll (bane 4) eller HinfI (bane 5). Bane 1 er molekylvægtsstandarden, og bane 2 inde-10 holder det intakte 240 bp lange produkt.

Fig. 6 viser sekvensen af de normale (]SA) og seglcelle

C

(j3 ) /3-globingener i Ddel og Hinf I restriktionsstedområdet, hvor de enkelte linier for βA markerer positionen af Ddel-stedet (CTGAG) og dobbeltstregerne for β^ og |3S markerer 15 positionen for HinfI-stedet (GACTC).

Fig. 7 viser resultaterne af sekventiel fordøjelse af normal jS-globin under anvendelse af en 40-mer probe og Ddel-restriktionsenzymet efterfulgt af HinfI-restriktionsenzymet.

Fig. 8 viser resultaterne af sekventiel fordøjelse af 20 seglcelle Ø-globin under anvendelse af den samme 40-mere probe som i fig. 7 og Ddel-restriktionsenzymet efterfulgt af HinfI-restriktionsenzymet.

Fig. 9 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende anvendelsen af den samme 40-25 mere probe som i fig. 7 til specifik karakterisering af tilstedeværende beta-globinalleler i prøven af hel human DNA, som er blevet udsat for multiplikation, hybridisering med proben og sekventiel fordøjelse med Ddel og HinfI.

Fig. 10 viser et fotografi af en 6% NuSieve agarosegel 30 visualiseret ved anvendelse af ethidiumbromid og UV-lys.

Dette fotografi demonstrerer multiplikationen af et sub-fragment af et 110-bp multiplikationsprodukt, hvilket sub-fragment er en indre beliggende del af 110-bp fragmentet.

Udtrykket "oligonukleotid" som her anvendt under hen-35 visning til primere, prober, oligomerfragmenter, der skal påvises, oligomerkontroller og umærkede blokerende oligo-merer, er defineret som et molekyle, der består af 2 eller flere deoxyribonukleotider eller ribonukleotider, fortrinsvis 7 DK 171161 B1 mere end tre. Dets eksakte størrelse vil afhænge af mange faktorer, som på sin side anhænger af den ultimative funktion eller anvendelse af oligonukleotidet.

Udtrykket "primer" som her anvendt refererer til et 5 oligonukleotid, hvad enten dette forekommer naturligt, som i en oprenset restriktionsfordøjelse, eller er produceret syntetisk, hvilken oligonukleotid er i stand til at virke som et initieringspunkt for syntese, når den placeres under betingelser, i hvilke syntese af et primerforlængelsesprodukt, som 10 er komplementært til en nukleinsyrestreng, er induceret, dvs. under tilstedeværelse af nukleotider og et middel for polyme-risering, såsom DNA-polymerase, og ved en egnet temperatur og pH. Primeren er for maximal effektivitet ved multiplikation fortrinsvis enkeltstrenget, men kan alternativt være dobbelt-15 strenget. Hvis den er dobbeltstrenget, behandles primeren først til separering af dets strenge, før den anvendes til dannelse af forlængelsesprodukter. Primeren er fortrinsvis et oligodeoxyribonukleotid. Primeren må være tilstrækkelig lang til at prime syntesen af forlængelsesprodukterne under til-20 stedeværelse af polymerisationsmidlet. De eksakte længder af primerne vil afhænge af mange faktorer, inklusiv temperatur og primerkilden. Afhængig af kompleksiteten af målsekvensen indeholder oligonukleotidprimeren f.eks. typisk 15-25 eller flere nukleotider, omend den kan indeholde færre nukleotider.

25 Korte primermolekyler kræver generelt set lavere temperaturer for at danne tilstrækkeligt stabile hybridkomplekser med templaten.

De her omtalte primere udvælges til at være "i alt væsentligt" komplementære til de forskellige strenge af hver 30 specifik sekvens, der skal multipliceres. Dette betyder, at primerne må være tilstrækkeligt komplementære til at hybridi-sere med deres respektive strenge. Primersekvensen behøver derfor ikke at reflektere den eksakte sekvens af templaten.

F.eks. kan et ikke-komplementært nukleotidfragment være 35 tilhæftet til 5'-enden af primeren, medens resten af primersekvensen er komplementær til strengen. Alternativt kan ikke-komplementære baser eller længere sekvenser være anbragt spredt i primeren, forudsat at primersekvensen har tilstræk- 8 DK 171161 B1 kelig komplementaritet med sekvensen af den streng, der skal multipliceres til at hybridisere dermed og derved danne en template for syntese af forlængelsesproduktet af den anden primer.

5 Som anvendt her betegner "restriktionsendonukleaser" og "restriktionsenzymer" bakterieenzymer, der hver skærer dobbeltstrenget DNA ved eller nær en specifik nukleotidsekvens.

Som anvendt her betegner "DNA-polymorfisme" det forhold, i hvilket to eller flere forskellige nukleotidsekvenser kan 10 forekomme på et bestemt sted i DNA'et.

Betegnelsen "restriktionsfragmentlængdepolymorfi" ("RFLP") betegner forskellene hos forskellige individer i længderne af restriktionsfragmenter, der dannes ved fordøjelse med en speciel restriktionsendonuklease.

15 Den foreliggende opfindelse er rettet mod en fremgangs måde til multiplikation af enhver af en eller flere specifikke nukleinsyresekvenser, der mistænkes for at være i en nukleinsyre. Fordi store mængder af en specifik sekvens kan produceres ved denne fremgangsmåde, kan den foreliggende 20 opfindelse anvendes til forbedring af effektiviteten af DNA-eller mRNA-kloning og til multiplikation af en målsekvens for at lette påvisningen heraf.

Generelt set omfatter den foreliggende fremgangsmåde en kædereaktion for i eksponentielle mængder i forhold til 25 antallet af de involverede omsætningstrin at producere mindst én specifik nukleinsyresekvens under forsætning af, at (a) enderne af den krævede sekvens er kendt i tilstrækkelige detaljer til at oligonukleotider, som vil hybridisere med dem, kan syntetiseres og (b) at en lille mængde af sekvensen 30 er tilgængelige til initiering af kædereaktionen. Produktet fra kædereaktionen vil være en adskilt nukleinsyreduplex med ender, der svarer til enderne af de anvendte specifikke primere.

Enhver kilde af nukleinsyre kan i oprenset eller ikke-35 oprenset form anvendes som udgangsnukleinsyre eller -syrer, forudsat at den formodes at indeholde den ønskede, specifikke nukleinsyresekvens. Fremgangsmåden kan f.eks. således anvende DNA eller RNA, inklusiv mRNA, hvilket DNA eller RNA kan være 9 DK 171161 B1 enkeltstrenget eller dobbeltstrenget. Desuden kan en DNA-RNA-hybrid, som indeholder en streng af hver, anvendes. En blanding af enhver af disse nukleinsyrer kan også anvendes, eller nukleinsyrerne, der er produceret ud fra en heri tidligere 5 anvendt multiplikationsreaktion, under anvendelse af den samme eller forskellige primere, kan anvendes således. Den specifikke nukleinsyresekvens, der skal multipliceres, kan være blot en fraktion af et større molekyle eller kan være initielt til stede som et særskilt molekyle, således at den 10 specifikke sekvens udgør hele nukleinsyren. Det er ikke nødvendigt, at sekvensen, der skal multipliceres, i begyndelsen er til stede i ren form; det kan være en mindre fraktion af en kompleks blanding, såsom en del af /3-globingenet, der findes i hel human DNA, eller en del af en nukleinsyresekvens 15 på grund af en speciel mikroorganisme, hvilken organisme blot kan udgøre en meget lille del af en speciel biologisk prøve. Udgangsnukleinsyren kan indeholde mere end én ønsket specifik nukleinsyresekvens, som kan være den samme eller forskellig.

Den foreliggende fremgangsmåde er derfor ikke blot anvendelig 20 til produktion af store mængder af en specifik nukleinsyresekvens, men også til samtidig multiplicering af mere end én forskellig, specifik nukleinsyresekvens, der er lokaliseret på samme eller forskellige nukleinsyremolekyler.

Nukleinsyren eller -syrerne kan være opnået fra enhver 25 kilde, f.eks. fra plasmider såsom pBR322, fra klonet DNA eller RNA, eller fra naturlig DNA eller RNA fra en hvilken som helst kilde, inklusiv bakterier, gær, vira eller højere organismer, såsom planter eller dyr. DNA eller RNA kan være ekstraheret fra blod, vævsmateriale, såsom chorion-villi 30 eller amniumceller ved forskellige metoder, såsom den, der beskrives af Maniatis et al., Molecular Cloning. (1982), 280-281.

En hvilket som helst specifik nukleinsyresekvens kan produceres ved den foreliggende fremgangsmåde. Det er kun 35 nødvendigt, at et tilstrækkeligt antal baser ved begge ender af sekvensen er kendt i tilstrækkelige detaljer, således at der kan fremstilles to oligonukleotidprimere, som vil hybri-disere til forskellige strenge af den ønskede sekvens og på 10 DK 171161 B1 relative positioner langs sekvensen, således at et forlængelsesprodukt, der er syntetiseret fra en primer, kan tjene som template, når den er separeret fra dens template (komplement) , for forlængelse af den anden primer i en nukleinsyre 5 af defineret længde. Jo større viden man har om baserne ved begge ender af sekvensen, jo mere specifik kan primeren for målnukleinsyresekvensen gøres og jo mere effektiv kan fremgangsmåden derfor være. Det vil forstås, at betegnelsen "primer", som anvendt her, henviser til mere end én primer, 10 navnlig i det tilfælde, hvor der er nogen tvetydighed i informationen vedrørende endesekvenserne af fragmentet, der skal multipliceres. I tilfældet, hvor en nukleinsyresekvens f.eks. er udledt fra proteinsekvensinformation, vil en samling af primere, der indeholder sekvenser, som repræsenterer 15 alle mulige codonvariationer baseret på degenereringen af den genetiske kode, anvendes for hver streng. Én primer fra denne samling vil være homolog med enden af den ønskede sekvens, der skal multipliceres.

01igonukleotidprimerne kan fremstilles under anvendelse 20 af en hvilken som helst egnet fremgangsmåde, såsom f.eks. de ovenfor beskrevne phosphotriester- og phosphodiestermetoder, eller automatiserede udførelsesformer deraf. I én således automatiseret udførelsesform er diethylphosphoramiditer anvendt som udgangsmateriale og kan syntetiseres som beskre-25 vet af Beaucage et al., Tetrahedron Letters (1981), 22: 1859-1862. Én fremgangsmåde til syntetisering af oligonukleotider på et modificeret, fast bæremateriale er beskrevet i US patent nr. 4.458.066. Det er også muligt at anvende en primer, som er blevet isoleret fra en biologisk kilde (såsom ved 30 en restriktionsendonukleasefordøjelse).

Den specifikke nukleinsyresekvens produceres ved anvendelse af nukleinsyren, der indeholder denne sekvens som en template. Hvis nukleinsyren indeholder to strenge, er det nødvendigt at separere strengene af nukleinsyren, før den kan 35 anvendes som template, enten ved et separat trin eller samtidigt med syntese af primerforlængelsesprodukterne. Denne strenge-separation kan udføres ved en hvilken som helst egnet denatureringsmetode, inklusiv fysiske, kemiske eller enzyma- 11 DK 171161 B1 tiske metoder. Én fysisk metode til separering af strengene af nukleinsyren involverer opvarmning af nukleinsyren, til den er fuldstændig (>99%) denatureret. Typisk varmedena-turering kan omfatte temperaturer i området på fra 80 til 5 105°C i tidsperioder på fra ca. 1 til 10 minutter. Strenge separation kan også induceres med et enzym fra den klasse af enzymer, der kendes som helicaser, eller enzymet RecA, som har helicaseaktivitet, og som ved tilstedeværelse af riboATP vides at denaturere DNA. De egnede omsætningsbetingelser for 10 separering af nukleinsyrestrengene ved hjælp af helicaser er beskrevet af Kuhn Hoffmann-Berling, CSH-Ouantitative Biology. 43.: 63 (1978) og der gives en oversigt over metoderne ved anvendelse af RecA i C.Radding, Ann.Rev.Genetics.. 16: 405-37 (1982) .

15 Hvis den oprindelige nukleinsyre, der indeholder sekven sen, der skal multipliceres, er enkeltstrenget, syntetiseres dens komplementære streng ved at tilføre en eller to oligo-nukleotidprimerne dertil. Hvis en passende enkelt-primer tilsættes, syntetiseres et primerforlængelsesprodukt under 20 tilstedeværelse af primeren, et polymeriseringsmiddel og de 4 nedenfor beskrevne nukleotider. Produktet vil være delvis komplementært til den enkeltstrengede nukleinsyre og vil hybridisere med nukleinsyrestrengen til dannelse af en duplex af strenge med ulige længde, som derefter kan separeres til 25 enkeltstrenge, som beskrevet ovenfor til dannelse af to enkelte, separerede komplementære strenge. Alternativt kan to passende primere tilsættes til den enkeltstrengede nukleinsyre, og omsætningen udføres.

Hvis den oprindelige nukleinsyre udgør sekvensen, der 30 skal multipliceres, vil det producerede primerforlængelses-produkt (de producerede primerforlængelsesprodukter) være fuldstændig komplementært til strengene af den oprindelige nukleinsyre og vil hybridisere dermed til dannelse af en duplex af strenge med samme længde, som kan separeres til 35 enkeltstrengede molekyler.

Når de komplementære strenge af nukleinsyren eller -syrerne er separeret - hvad enten nukleinsyren oprindelig var dobbeltstrenget eller enkeltstrenget - er strengene 12 DK 171161 B1 parate til at blive anvendt som en template for syntesen af yderligere nukleinsyrestrenge. Denne syntese kan udføres ved at anvende en hvilken som helst egnet metode. Generelt set foregår det i en puffret vandig opløsning, fortrinsvis ved et 5 pH på 7-9, mest fortrinsvis ca. 8. Det foretrækkes, at et molært overskud (for klonet nukleinsyre almindeligvis 1000:1 primer: template, og for genomisk nukleinsyre almindeligvis 10^:1 primer: template) af de to oligonukleotidprimere tilsættes til pufferen, der indeholder de separerede template-10 strenge. Det skal imidlertid forstås, at mængden af komplementær streng ikke nødvendigvis, hvis den her angivne fremgangsmåde anvendes til diagnostiske anvendelser, således at mængden af primer i forhold til mængden af komplementær streng ikke kan bestemmes med sikkerhed. Af praktiske grunde 15 vil mængden af tilsat primer imidlertid generelt set være i molært overskud i forhold til mængden af komplementær streng (template), når sekvensen, der skal multipliceres, findes i en blanding af komplicerede, langkædede nukleinsyrestrenge.

Et stort molært overskud foretrækkes til forbedring af frem-20 gangsmådens effektivitet.

Deoxyribonukleosidtriphosphaterne dATP, dCTP, dGTP og TTP tilsættes også til synteseblandingen i tilstrækkelige mængder, og den resulterende opløsning opvarmes til ca. 90-100°C i fra ca. 1 til 10 minutter, fortrinsvis fra 1 til 4 minut-25 ter. Efter denne opvarmningsperiode får opløsningen lov at afkøle til 20-40°C, hvilket er foretrukket for primerhybridi-sering. Til den afkølede blanding tilsættes et polymeri-seringsmiddel, og omsætningen får lov at foregå under betingelser, som er kendte inden for fagområdet. Denne syntese-30 omsætning kan foregå ved fra stuetemperatur op til en temperatur over hvilken polymeriseringsmidlet ikke længere fungerer effektivt. Hvis DNA-polymerasen således f.eks. anvendes som polymeriseringsmiddel, er temperaturen generelt set ikke højere end ca. 45°C. En mængde dimethylsulfoxid 35 (DMSO) er fortrinsvis til stede, hvilket er effektivt til påvisning af signalet, eller temperaturen er 35-40°C. Mest foretrukken er tilstedeværelse af 5-10 volumenprocent DMSO, og temperaturen er 35-40°C. Til visse anvendelser, hvor 13 DK 171161 B1 sekvenserne, der skal multipliceres, er over 110 basepar lange fragmenter, såsom HLA DQ-α- eller -/3-gener, tilsættes en effektiv mængde (f.eks. 10 volumenprocent) DMSO til multiplikationsblandingen, og omsætningen udføres ved 35-40°C for 5 at opnå påviselige resultater eller for at muliggøre kloning.

Polymeriseringsmidlet kan være en hvilket som helst forbindelse eller system, som vil fungere til udførelse af syntese af primerforlængelsesprodukter, inklusiv enzymer.

Egnede enzymer til dette formål indbefatter f.eks. E.coli DNA 10 polymerase I, Klenow fragment af E.coli DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, andre tilgængelige DNA-polymeraser, revers transkriptase og andre enzymer, inklusiv varmestabile enzymer, som vil lette kombinationen af nukleotiderne på en korrekt måde til dannelse af primerforlængelsesprodukter, som 15 er komplementære til hver nukleinsyrestreng. Generelt set vil syntesen blive initieret ved 3'-enden af hver primer og forløbe i 5'-retningen langs templatestrengen, indtil syntesen ender, frembringende molekyler af forskellige længder.

Der kan imidlertid være midler, som initierer syntesen ved 20 5'-enden og forløber i den anden retning under anvendelse af den samme fremgangsmåde som ovenfor beskrevet.

Den nysyntetiserede streng og dens komplementære nukleinsyrestreng danner et dobbeltstrenget molekyle, som anvendes i de efterfølgende trin af fremgangsmåden. I det næste trin 25 separeres strengene af det dobbeltstrengede molekyle under anvendelse af et hvilket som helst af de ovenfor beskrevne procedurer til dannelse af enkeltstrengede molekyler.

Ny nukleinsyre syntetiseres på de enkeltstrengede molekyler. Yderligere inducerende middel, nukleotider og primere 30 kan tilsættes, hvis det er nødvendigt, for at processen kan forløbe under de ovenfor foreskrevne betingelser. Syntesen vil igen blive initieret ved én ende af oligonukleotidprimerne og vil forløbe langs templatens enkelte streng til frembringelse af yderligere nukleinsyre. Efter dette trin vil 35 halvdelen af forlængelsesproduktet bestå af den specifikke nukleinsyresekvens afgrænset af de to primere.

Trinnene vedrørende strengeseparation og forlængelsesproduktsyntese kan gentages så ofte, som det behøves til frem- 14 DK 171161 B1 bringelse af en ønsket mængde af den specifikke nukleinsyre-sekvens. Som det vil blive beskevet i yderligere detaljer nedenfor, vil mængden af den producerede specifikke nuklein-syresekvens akkumulere på eksponentiel måde.

5 Når det ønskes at producere mere end én specifik nuklein- syresekvens ud fra den første nukleinsyre eller blanding af nukleinsyrer, anvendes et passende antal af forskellige oligonukleotidprimere. Hvis f.eks. to forskellige specifikke nukleinsyresekvenser skal produceres, anvendes 4 primere. To 10 af primerne er specifikke for én af de specifikke nukleinsyresekvenser, og de to andre primere er specifikke for den anden specifikke nukleinsyresekvens. På denne måde kan hver af de to forskellige specifikke sekvenser produceres eksponentielt ved den foreliggende fremgangsmåde.

15 Den foreliggende opfindelse kan udføres på trinvis måde, hvor nye reagenser tilsættes efter hvert trin, eller samtidigt, hvor alle reagenser tilsættes i begyndelsestrinnet, eller delvist trinvis og delvis samtidigt, hvor frisk reagens tilsættes efter et givent antal trin. Hvis der anvendes en 20 fremgangsmåde til strengeseparation der, som f.eks. varme, vil inaktivere polymeriseringsmidlet, hvilket er tilfældet med et varmelabilt enzym, er det nødvendigt at tilføre polymeriseringsmidlet igen efter hvert strenge-separationstrin.

Den samtidige metode kan anvendes, når et antal oprensede 25 komponenter, inklusiv et enzymatisk middel såsom helicase, anvendes til strengeseparationstrinnet. I den samtidige fremgangsmåde kan reaktionsblandingen ud over nukleinsyre-strengen (-strengene), der indeholder den ønskede sekvens, også indeholde det strengeseparerende enzym (f.eks. helica-30 se), en passende energikilde for det strenge-separerende enzym, såsom rATP, de fire nukleotider, oligonukleotidprimer-ne i molært overskud og det inducerende middel, f.eks. Kle-now-fragment af E.coli DNA polymerase I. Hvis varme anvendes til denaturering i en samtidig proces kan der anvendes et 35 varmestabilt, inducerende middel, såsom en termostabil polymerase, som vil fungere ved hævede temperaturer, fortrinsvis 65-90°C, afhængig af det inducerende middel, ved hvilken temperatur nukleinsyrer vil består af enkelt- og dobbelt- 15 DK 171161 B1 strenge i ligevægt. For mindre længder af nukleinsyre kan lavere temperaturer på ca. 50°C anvendes. Den øvre temperatur vil afhænge af temperaturen, ved hvilken enzymet vil nedbrydes, eller den temperatur, over hvilken primerhybridi-5 sering vil ske i utilstrækkeligt omfang. Et sådant varmesta-bilt enzym er beskrevet, f.eks. af A.S.Kaledin et al., Bio-khimiva. 45, 644-651 (1980). Hvert trin af processen vil foregå sekventielt uanset den initielle tilstedeværelse af alle reagenserne. Yderligere materialer kan tilsættes om 10 nødvendigt. Efter at en passende tid er forløbet til dannelse af den ønskede mængde af den specifikke nukleinsyresekvens, kan reaktionen standses ved inaktivering af enzymerne på en hvilken som helst kendt måde eller ved separering af komponenterne i reaktionen.

15 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan udføres kontinuerligt. I én udførelsesform af en automatiseret proces kan reaktionen føres i cyklus gennem et denaturerende område, et reagenstiIsætningsområde og et omsætningsområde. I en anden udførelsesform kan enzymet, der 20 anvendes til syntese af primerforlængelsesprodukterne, immo-biliseres i en søjle. De andre omsætningskomponenter kan ved hjælp af en pumpe cirkuleres kontinuerligt gennem søjlen og en varmespiral i serie, og de producerede nukleinsyrer kan således blive denatureret gentagne gange uden inaktivering af 25 enzymet.

Den foreliggende opfindelse demonstreres skematisk nedenfor, hvor dobbeltstrenget DNA, der indeholder den ønskede sekvens [S] bestående af komplementære strenge [S+] og [S ], anvendes som nukleinsyren. Under den første og hver efter-30 følgende omsætningscyklus vil forlængelse af hver oligonukle-otidprimer på den oprindelige template producere ét nyt ssDNA-molekyleprodukt af ikke nærmere bestemt længde, som terminerer med kun en af primerne. Disse produkter, der herefter henvises til som "lange produkter", vil akkumulere 35 på liniær måde, dvs. at mængden, der er til stede efter et vilkårligt antal cyklusser, vil være proportional med antallet af cyklusser.

16 DK 171161 B1

De lange produkter, der således er produceret, vil virke som templater for den ene eller den anden af oligonukleotid-primerne i efterfølgende cyklusser og vil producere molekyler af den ønskede sekvens [S+] eller [S ]. Disse molekyler vil 5 også fungere som templater for den ene eller den anden af oligonukleotidprimerne, frembringende yderligere [S+] og [S ] , og en kædereaktion kan således vedligeholdes, som vil resultere i akkumuleringen af [S] med en eksponentiel hastighed i forhold til antallet af cyklusser.

10 Biprodukter dannet ved andre oligonukleotidhybridisering- er end de tilsigtede er ikke selv-katalytiske (undtagen i sjældne tilfælde) og akkumulerer således med liniær hastighed.

Den specifikke sekvens, der skal multipliceres, [S], kan 15 angives skematisk som: [S+] 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3' [S~] 3' TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5'

De passende oligonukleotidprimere ville være:

20 Primer 1: GGGGGGGGGG

Primer 2: AAAAAAAAAA

således at hvis DNA, der indeholder [S] ...zzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzz...

.. .zzzzzzzzz zTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGz zzzzzzzzz...

25 separeres i enkeltstrenge og dets enkeltstrenge hybridiseres til primere 1 og 2, kan de efterfølgende forlængelsesreaktioner katalyseres ved DNA-polymerase under tilstedeværelse af de fire deoxyribonukleosidtriphosphater: 3' 5' 30 forlængelse <- GGGGGGGGGG primer 1 ____z z z z z z z zAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCz zzzzzzzz____ oprindelig template-streng+ 17 DK 171161 B1 oprindelig template-streng- ....zzzzzzzz TTTTTTTTTTYYYYYYYYYY GGGGGGGGGGzzzzzzzzz....

primer 2 AAAAAAAAAA -> forlængelse 5' 3' 5 Efter denaturering af de to dannede duplexer er produkterne: 3' 5' nylig syntetiseret langt produkt 1 5' 10 ____zzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzz____ oprindelig templatestreng* 3' oprindelig templatestreng" 15 5' 3' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzz____ nylig syntetiseret langt produkt 2

Hvis disse 4 strenge får lov at rehybridisere med primere 1 og 2 i den næste cyklus, vil polymeriseringsmidlet katalysere 20 de følgende reaktioner:

Primer 2 5' AAAAAAAAAA -> forlænges her nyligt syntetiseret langt produkt 1 forlængelse <-GGGGGGGGGG 5' primer 1 25 5'____zzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzz____3' oprindelig templatestreng+

Primer 2 5' AAAAAAAAAA

18 DK 171161 B1 -> forlænges 3 ' . . . zzzzzzzzzΤΤΤΤΤΤΤΊΤΤΥYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzz____5' oprindelig templatestreng forlængelse her <-GGGGGGGGGG 5' primer 1 5 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzz____3' nyligt syntetiseret langt produkt 2

Hvis strengene af de fire duplexer ovenfor separeres, findes følgende strenge: 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3' 10 nyligt syntetiseret [S+] første-cyklus-synthetiseret langt produkt 1 nyligt syntetiseret langt produkt 1 15 5' ____zzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzz____3' oprindelig templatestreng+ 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzz____3 ' nyligt syntetiseret langt produkt 2 3 '____zzzzzzz zTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGz zzzzz____5' 20 oprindelig templatestreng" 3' TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5' nyligt syntetiseret [S-] 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCz zzzzz____3' første-cyklus-syntetiseret langt produkt 2 25 Det ses, at hver streng, som ender med oligonukleotidse- kvensen af én primer og den komplementære sekvens af den anden, er den specifikke nukleinsyresekvens [S], som det ønskes at producere.

19 DK 171161 B1

Trinnene i denne fremgangsmåde kan gentages uendeligt, og er kun begrænset af mængden af primere 1 og 2, polymeri-seringsmidlet og tilstedeværende nukleotider. Antallet af cyklusser anvendt til påvisning er de, der kræves til frem-5 bringelse af et påviselig signal, en mængde, som f.eks. vil afhænge af prøvens natur. Hvis f.eks. prøven er ren eller fortyndet, kan færre cyklusser være krævet, end hvis den er en kompleks blanding. Hvis prøven er human genomisk DNA er antallet af cyklusser fortrinsvis fra ca. 10 til 30.

10 Mængden af oprindelig nukleinsyre forbliver konstant i hele fremgangsmåden, fordi den ikke replikeres. Mængden af de lange produkter forøges liniært, fordi de kun produceres ud fra den oprindelige nukleinsyre. Mængden af den specifikke sekvens forøges eksponentielt. Den specifikke sekvens vil 15 således blive den dominerende. Dette vises i den følgende tabel, som indicerer de relative mængder af de teoretiske typer, der er til stede efter n cyklusser, idet 100% effektivitet antages for hver cyklus:

Antal af dobbeltstrenge 20 efter 0 til n cykler

Specifik

Cvklus antal Template Lange produkter sekvens [S] 0 1 1 110 25 2 1 2 1 3 13 4 5 1 5 26 10 1 10 1013 15 1 15 32.752 30 20 1 20 1.048.555 n ln (2n-n-l) Når en enkeltstrenget nukleinsyre anvendes som templaten dannes kun 1 langt produkt pr. cyklus.

Den heri beskrevne fremgangsmåde til sekvensmultipli-35 cering kan anvendes til kloning af en speciel nukleinsyrese-kvens for indføjelse i en egnet ekspressionsvektor. Vektoren 20 DK 171161 B1 kan derefter anvendes til transformering af en passende værtsorganisme til dannelse af genproduktet af sekvensen ved standardmetoder af rekombinant DNA teknologi.

Normalt vil sådan kloning enten involvere direkte lige-5 ring i en vektor eller tilsætningen af oligonukleotidlinkere efterfulgt af restriktionsenzymspaltning. Begge disse metoder involverer imidlertid den ineffektive stump-endede ligerings-reaktion. Ingen af teknikkerne vil desuden styre orienteringen eller multipliceringen af indføjelsen af det multiplicere-10 de produkt i kloningsvektoren.

Den heri beskrevne multiplikationsproces kan give en blanding af nukleinsyrer, hidrørende fra den oprindelige template-nukleinsyre, de forventede målmultiplikationsprodukter og forskellige ikke-mål-baggrundsprodukter. Det multi-15 plicerede produkt kan også være en blanding, hvis den oprindelige template-DNA indeholder multiple målsekvenser, såsom i et heterozygotisk diploidgenom, eller når der er en familie af beslægtede gener.

De heri beskrevne primere kan være modificeret til at 20 hjælpe til hurtig og specifik kloning af blandingen af DNA, der produceres ved multiplikationsreaktion. I en sådan modifikation er den samme eller forskellige restriktionssteder inkorporeret ved 5'-enderne af primerne, hvilket resulterer i restriktionssteder ved de to ender af det multiplicerede 25 produkt. Når det udskæres med de passende enzymer kan det multiplicerede produkt derefter let indsættes i plasmid-eller virusvektorer og klones. Denne kloning tillader analyse eller ekspression af individuelle multiplicerede produkter, ikke en blanding.

30 Skønt det samme restriktionssted kan anvendes for begge primere, tillader anvendelsen af forskellige restriktionssteder indsætning af produktet i vektoren med en specifik orientering og undertrykker multiple indsætninger såvel som indsætninger, der stammer fra multiplikationer, der kun er 35 baseret på en af de to primere. Den specifikke orientering er nyttig, når der klones i enkeltstrengsekventerende vektorer, når enkeltstrenghybridiseringsprober anvendes eller når det klonede produkt udtrykkes.

21 DK 171161 B1 Én metode til fremstilling af primerne er at vælge en primersekvens, som adskiller sig minimalt fra målsekvensen. Områder, i hvilke hver af primerne skal placeres, bliver screenet for homologi til restriktionssteder, der er passende 5 for den ønskede vektor. Målsekvensen "CAGTATCCGA..." adskiller sig f.eks. med kun en base fra en, der indeholder et BamHI-sted. En primersekvens udvælges til at passe målet præcist ved dets 3' ende og at indeholde den ændrede sekvens og restriktionssted nær dets 5'-ende (f.eks. "CAGgATCCGA...", 10 hvor det lille bogstav symboliserer en enhed, der ikke passer med målsekvensen). Denne minimalt ændrede sekvens vil ikke interferere med primerens evne til at hybridisere til den originale målsekvens og til initiering af polymeriseringen. Efter den første multiplikationscyklus kopieres primeren, 15 bliver selv målet og parrer eksakt med nye primere. Efter multiplikationsprocessen spaltes produkterne med passende restriktionsenzymer, der eventuelt er separeret fra ligationsinhibitorer, såsom nukleotidtriphosphater og salte ved passage over en afsaltende søjle eller molekylvægtkromatogra-20 fisøj le og indsættes ved ligering i en klonende vektor, såsom bakteriofag M13. Genet kan derefter sekventeres og/eller udtrykkes under anvendelse af kendte metoder.

Den anden metode til fremstilling af primerne involverer at tage 3'-enden af primerne fra målsekvensen og tilsætte det 25 ønskede restriktionssted (-steder) til 5'-enden af primeren. For det ovenfor anførte eksempel kunne et Hindlll-sted tilsættes til dannelse af sekvensen "cgaagcttCAGTATCCGA...", hvor små bogstaver er som beskrevet ovenfor. De tilsatte baser ville ikke bidrage til hybridiseringen i den første 30 multiplikationscyklus, men ville passe i efterfølgende cyklusser. De endelige multiplicerede produkter udskæres derefter med restriktionsenzym (-enzymer), klones og udtrykkes som beskrevet ovenfor. Genet, der multipliceres, kan f.eks. være human j3-hæmoglobin eller human HLA DQ, DR eller DP-α og 35 -jS- gener.

Sekvensmultipliceringsfremgangsmåden, der beskrives heri, kan desuden anvendes til in vitro mutagenisering. Oligode-oxyribonucleotidprimerne behøver ikke at være præcis komple- 22 DK 171161 B1 mentære til DNA-sekvensen, som skal multipliceres. Det er blot nødvendigt, at de er i stand til at hybridisere tilstrækkeligt godt til sekvensen til at blive forlænget af polymeraseenzymet eller ved et hvilket som helst andet an-5 vendt inducerende middel. Produktet af en polymerasekædereak-tion, hvor de anvendte primere ikke er præcis komplementære til den oprindelige template vil indeholde sekvensen af primeren snarere end sekvensen af templaten, og derved indføre en in vitro mutation. I yderligere cyklusser vil denne 10 mutation blive multipliceret med en ubegrænset effektivitet, fordi ingen yderligere ikke-parrede primerreaktioner kræves. Den således fremstillede mutant kan indsættes i en passende vektor ved molekylærbiologiske standardteknikker og kan eventuelt overføre mutantegenskaber til denne vektor, såsom 15 produktionspotentialet af et ændret protein.

Fremgangsmåden til fremstilling af en ændret DNA-sekvens som beskrevet ovenfor kan gentages på det ændrede DNA under anvendelse af forskellige primere for således at inducere yderligere sekvensændringer. På denne måde kan en serie af 20 muterede sekvenser gradvis produceres, hvori hver ny tilføjelse til serierne kan adskille sig fra den forrige i ringe grad, men fra den oprindelige DNA-kildes sekvens i stadig større grad. På denne måde kan der i sidste ende laves ændringer, som ikke er mulige i et enkelt trin på grund af den 25 manglende funktionsevne hos en meget alvorlig fejlparrende primer.

Primeren kan desuden som en del af dens sekvens indeholde en ikke-komplementær sekvens, forudsat at en tilstrækkelig mængde af primeren indeholder en sekvens, som er komplementær 30 til strengen, som skal multipliceres. En nukleotidsekvens, som ikke er komplementær til templatesekvensen (såsom f.eks. en promotor, linker, kodende sekvens osv) kan f.eks. blive tilføjet til 5'-enden af en eller begge primerne og derved tilhæftet til produktet fra multiplikationsprocessen. Efter 35 at forlængelsesprimeren er tilsat gennemføres tilstrækkeligt mange cyklusser til opnåelse af den ønskede mængde af ny template, der indeholder den ikke-komplementære nukleotidind-føjelse. Dette tillader produktion af store mængder af de 23 DK 171161 B1 kombinerede fragmenter på relativ kort tid (f.eks. to timer eller mindre) under anvendelse af en simpel teknik.

Den her anførte fremgangsmåde til sekvensmultiplicering kan desuden anvendes til at syntetisere et nukleinsyrefrag-5 ment ud fra et eksisterende nukleinsyrefragment, som er kortere end dets produkt (kaldet kernesegmentet) under anvendelse af visse primere, hvis 3'-ender er komplementære til eller i alt væsentligt komplementære til 3'-enderne af enkel tstrengene, som er frembragt ved at separere strengene af 10 de oprindelige, kortere nukleinsyrefragmenter, og hvor 5'-enderne af primerne indeholder sekvensinformation, som skal tilføjes til kernesegmentet. Denne fremgangsmåde til syntetisering af et længere nukleinsyrefragment omfatter: (a) behandling af strengene af det eksisterende fragment 15 med 2 oligonukleotidprimere under sådanne betingelser, at der syntetiseres et forlængelsesprodukt af hver primer, som er komplementær til hver nukleinsyrestreng, og hvor primerne udvælges således, at de i alt væsentligt er komplementære til 3'-enden af hver streng af det eksisterende fragment, således 20 at forlængelsesproduktet, der er syntetiseret fra en primer, når det er adskilt fra dets komplement, kan tjene som en template for syntese af forlængelsesproduktet af den anden primer, og hvor hver primer i dets 5'-ende indeholder en sekvens af nukleotider, som ikke er komplementære til det 25 eksisterende fragment, og som svarer til de to ender af nukleinsyrefragmentet, som skal syntetiseres, (b) adskillelse af primerforlængelsesprodukterne fra templaterne, på hvilke de blev syntetiseret, til frembringelse af enkeltstrengede molekyler, og 30 (c) behandling af de enkeltstrengede molekyler, der frembragtes i trin (b), med primerne fra trin (a) under sådanne betingelser, at et primerforlængelsesprodukt syntetiseres under anvendelse af hver af enkeltstrengene, der er frembragt i trin (b), som en template, for således at frem-35 bringe to intermediære, dobbeltstrengede nukleinsyremoleky-ler, hvori der i hver er blevet inkorporeret nukleotidsekven-sen, der er til stede i 5'-enden af en af oligonukleotid-primerne, og to dobbeltstrengede nukleinsyremolekyler af fuld 24 DK 171161 B1 længde, hvor der i hver af disse er blevet inkorporeret nukleotidsekvensen, der er til stede i 5'-enderne af begge oligonukleotidprimerne, (d) gentagelse af trinnene (b) og (c) et tilstrækkeligt 5 antal gange til frembringelse af de dobbeltstrengede molekyler af fuld længde i en effektiv mængde, (e) behandling af strengene af produktet ifølge trin (d) med to primere for således at forlænge produktet fra trin (d) i begge ender, og 10 (f) gentagelse af trinnene (a)-(d) under anvendelse af produktet fra trin (d) som kernefragmentet og to oligonukleo-tidprimere, som er komplementære eller i alt væsentligt komplementære til 3'-enderne af enkeltstrengene, som er produceret ved at separere strengene af produktet fra trin 15 (d).

Trinnene (b) og (c) gentages så ofte som nødvendigt, almindeligvis mindst 5 gange, til frembringelse af den krævede mængde af det dobbeltstrengede produkt af fuld længde til syntetisering af slutproduktet (dvs. den effektive mæng-20 de). Kemesegmentet kan yderligere opnås som produktet af en tidligere multiplikationscyklus. Produktet frembragt i trin (d) kan oprenses før en ny forlængelses- og multiplikationscyklus eller kan anvendes direkte ved at anvende reaktions-blandingen, der indeholder produktet.

25 Hvis 3'-enderne af primerne ikke er præcis komplementære til 3'-enderne af de enkelte strenge af den oprindelige, kortere nukleinsyre, vil kernefragmentet af produktet ikke være præcis det samme som sekvensinformationen, der er nedlagt i den oprindelige, kortere nukleinsyre. Mutanter af den 30 oprindelige nukleinsyre kan derfor laves ved at anvende primere, som i alt væsentligt er komplementære ved deres 3'-ender til 3'-enderne af enkeltstrengene af den oprindelige, kortere nukleinsyre.

Hvis restriktionsstedlinkere inkorporeres i primerne, kan 35 de multiplicerede, dobbeltstrengede produkter fordøjes med de passende restriktionsenzymer og ligeres direkte i en M13-vektor til hurtig kloning og sekventering. M13-plaques, der indeholder de specifikke multiplicerede målsekvenser, kan 25 DK 171161 B1 identificeres ved at hybridisere plaque-løftefiltrere med en probe, som er specifik for målsekvensen.

Den heri angivne sekvensmultipliceringsmetode kan også anvendes til at muliggøre påvisning og/eller karakterisering 5 af specifikke nukleinsyresekvenser, der er associeret med infektiøse sygdomme, genetiske lidelser eller cellulære sygdomme, såsom kræft, f.eks. oncogener. Multiplicering er nyttig, når den mængde nukleinsyre, der er tilgængelig for analyser, er meget lille, som f.eks. ved prænatal diagnose af 10 seglcelleanæmi under anvendelse af DNA opnået fra føtale celler. Multiplikation er navnlig nyttig, hvis en sådan analyse skal udføres på et lille prøvemateriale under anvendelse af ikke-radioaktive påvisningsmetoder, som måske er iboende insensitiv, eller hvor radioaktive metoder anvendes, 15 men hvor hurtig påvisning er ønskelig.

For denne opfindelses formål kan genetiske sygdomme omfatte specifikke deletioner og/eller mutationer i genomisk DNA fra enhver organisme, såsom f.eks. seglcelleanæmi, cystisk fibrose, a-thalassæmi, β-thalassæmi og lignende. Segl-20 celleanæmi kan let påvises ved oligomerrestriktionsanalyse eller en RFLP-lignende analyse efter multiplikation af den passende DNA-sekvens ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. α-Thalassæmi kan påvises ved fravær af en sekvens, og β-thalassæmi kan påvises ved tilstedeværelse af et polymorft 25 restriktionssted tæt koblet til en mutation, som forårsager sygdommen.

Alle disse genetiske sygdomme kan påvises ved multiplicering af den passende sekvens og analyse af det ved Southern blot teknik uden anvendelse af radioaktive prober. I en sådan 30 fremgangsmåde kan f.eks. en lille prøve af DNA fra f.eks.

amnionvæske indeholdende et meget lavt niveau af den ønskede sekvens multipliceres, skæres med et restriktionsenzym og analyseres med Southern blotting teknik. Anvendelsen af ikke-radioaktive prober lettes ved det høje niveau af det multi-35 plicerede signal.

I en anden udførelsesform kan en lille prøve af DNA multipliceres til et passende niveau, og derefter kan der udføres en yderligere cyklus af forlængelsesreaktioner, hvor 26 DK 171161 B1 nukleotidderivater, som er let påviselige (såsom 32P-mærkede eller biotinmærkede nukleosidtriphosphater) inkorporeres direkte i slut-DNA-produktet, som kan analyseres ved restriktionsanalyse og elektroforetisk separation eller en hvilken 5 som helst anden passende metode. Et eksempel på denne teknik i et modelsystem demonstreres på figur 5.

I endnu en udførelsesform, der er demonstreret i et modelsystem i figur 3, kan nukleinsyren udsættes for en særlig restriktionsendonuklease forud for multipliceringen.

10 Eftersom en sekvens, som er blevet skåret op, ikke kan multipliceres, medfører forekomsten af et multipliceret fragment fraværet af et sted for endonukleasen i den multiplicerede sekvens, på trods af forudgående restriktion af DNA-prøven. Tilstedeværelsen eller fraværet af en multipliceret sekvens 15 kan påvises ved en passende metode.

En praktisk anvendelse af denne teknik kan illustreres ved dets anvendelse til at lette påvisningen af seglcelleanæ-mi ved hjælp af den her og i Saiki et al., Biotechnology 1:1008-1012 (1985) beskrevne oligomerrestriktionsteknik.

20 Seglcelleanæmi er en hæmoglobinsygdom, som er forårsaget af en ændring af et enkelt basepar i den 6. codon af Ø-globinge- net. Figur 6 viser sekvenserne af normale β-globingener og segl celle-jS-gi ob ingener i området for deres polymorf isme, hvor de enkelte streger markerer placeringen af et Ddel-sted. 25 der kun er til stede i det normale gen, og hvor dobbeltstregen markerer placeringen af et Hinfl-sted. som er ikke-poly-morft og således er til stede i både normale alleler og seglcellealleler. Figur 7 viser oligomerrestriktionsprocessen for normal jS-globin DNA under anvendelse af en probe, der 30 spænder over begge restriktionssteder, og som er mærket, hvor der er angivet en stjerne. (Proben er fortrinsvis mærket i den ende, som er færre basepar fra restriktionsstedet end i den anden ende af proben). DNA'et, der er multipliceret som anvist heri, denatureres og anneales til den mærkede probe.

35 Multiplikationen kan udføres ved hævede temperaturer (35-40°C) under tilstedeværelse af dimethylsulfoxid til minimi-sering af dannelsen af sekundær struktur. Enzymet Ddel spalter DNA'et ved det gendannede Ddel-sted og danner en mærket 27 DK 171161 B1 octamer. Under de betingelser, som er anvendt i prøven, er octameren kort nok til at dissociere fra duplexen. En efterfølgende tilsætning af enzymet HinfI har ingen virkning på den nu enkeltstrengede octamer. Figur 8 viser den samme 5 proces anvendt på seglcelleallelet af /3-globin DNA. Enzymet Ddel kan ikke spalte duplexen, der er dannet af det multiplicerede DNA og den mærkede probe, fordi A-A baseparret fejlparrer. Enzymet HinfI begrænser imidlertid hybriden, og der produceres en mærket trimer. I praksis kan metoden diag-10 nosticere DNA'et hos et individ som enten homozytisk for vildtypen, homozygotisk for seglcelletypen eller heterozygo-tisk bærer af seglcelleanlægget, eftersom et specifikt signal er forbundet med tilstedeværelsen af hvert allel. Anvendelse af den ovenfor beskrevne metode til multiplicering af den 15 relevante sekvens tillader hurtig analyse af et gen i enkelt . 32 kopi under anvendelse af en probe med kun et enkelt P- mærke.

Forskellige infektiøse sygdomme kan diagnosticeres ved tilstedeværelsen i kliniske prøver af specifikke DNA-sekvens-20 er, der er karakteristiske for mikroorganismen, der forårsager infektionen. Disse inkluderer bakterier, såsom Salmonella, Chlamydia, Neisseria, virus, såsom hepatitisvirus, og parasitter, såsom Plasmodium, der forårsager malaria. US patent nr. 4.358.535 udstedt til Falkow beskriver anvendelsen 25 af specifikke DNA-hybridiseringsprober til diagnose af infektiøse sygdomme. Et iboende problem i Falkow-proceduren er, at et relativt lille antal pathogene organismer kan være til stede i en klinisk prøve fra en inficeret patient, og at DNA'et, der ekstraheres fra disse, kan udgøre en kun meget 30 lille fraktion af det totale DNA i prøven. Specifik multiplicering af mistænkte sekvenser forud for immobiliserings-og hybridiseringspåvisning af DNA-prøverne kunne i høj grad forøge følsomheden og specificiteten af disse procedurer.

Kliniske rutineanvendelser af DNA-prober til diagnose af 35 infektiøse sygdomme ville blive betragteligt simplificeret, hvis ikke-radioaktivt mærkede prober kunne anvendes som beskrevet i EP 63.879 til Ward. I denne fremgangsmåde påvises biotin-indeholdende DNA-prober med chromogene enzymer, der er 28 DK 171161 B1 koblet til avidin eller biotinspecifikke antistoffer. Denne påvisningstype er bekvem, men relativ ufølsom. Kombinationen af specifik DNA-multiplicering ved den foreliggende fremgangsmåde og anvendelse af stabilt mærkede prober kunne 5 tilvejebringe den nemhed og følsomhed, som kræves for at gøre Falkow- og Ward-fremgangsmåderne nyttige i klinisk rutinearbejde.

Desuden kan proben være en biotinyleret probe, hvori biotinet er påhæftet til en afstandsarm med formlen:

10 H

i -Y(t32)2-0-I(CH2)xO)y-CH2CH2-N- hvor Y er 0, NH eller N-CHO, x er en tal fra 1 til 4, og y er et tal fra 2 til 4. Afstandsarmen er selv påhæftet til en 15 psoralenenhed med formlen: CH. CHo- jfYjTjf oc h3 ch3

Psoralenenheden interkalerer ind i og krydsforbinder en probe med "hullet cirkel" som beskrevet af Courage-Tebbe et al., Biochem. Biophys. Acta (1982) 697. 1-5, hvori det enkelt-20 strengede hybridiseringsområde af den hullede cirkel spænder over området, der er indeholdt i primerne.

Multipliceringsprocessen kan også anvendes til fremstilling af tilstrækkelige mængder af DNA ud fra et humant gen i enkelt kopi, således at påvisning af en simpel ikke-specifik 25 DNA-farvning, såsom ethidiumbromid, kan udføres for således at udføre en DNA-diagnose på direkt måde.

Ud over at påvise infektiøse sygdomme og sygelige ab-normaliteter i genomet hos organismer, kan fremgangsmåden som beskrevet her også anvendes til påvisning af DNA-polymorfis- DK 171161 Bl 29 me, som ikke behøver at være forbundet med nogen sygelig tilstand.

De efterfølgende eksempler illustrerer opfindelsen. I disse eksempler er alle procenter vægtprocenter, hvad angår 5 faste stoffer, og volumenprocenter, hvad angår væsker, og alle temperaturer er i grader Celsius med mindre andet angives .

Eksempel 1

En 25-baseparsekvens med nukletidsekvensen 10 5' CCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCT 3' 3' GGAGCCGTGGCAGTGGGACCTACGA 5' indeholdt på et 47 basepar Fokl-restriktionsfragment af pBR322, som var opnået fra ATCC, blev fremstillet som følger. En Fokl- fordøj else af pBR322 indeholdende det 47 bp lange 15 fragment blev fremstillet ved at fordøje pBR322 med Fokl i overensstemmelse med betingelserne, som er foreslået af leverandøren, New England Biolabs Inc. Primerne, som blev anvendt, var 5' d(CCTCGGCACCG) 3' og 5' d(AGCATCCAGGGTG) 3' og blev fremstillet under anvendelse af traditionelle metod-20 er. De efterfølgende ingredienser tilsattes til 33 μΐ puffer, som bestod af 25 mM kaliumphosphat, 10 mM magnesiumchlorid og 100 mM natriumchlorid ved pH 7,5: 2433 pmol af hver af de ovenfor beskrevne primere, 2,4 pmol af det Fokl-fordøjede pBR322, 12 nmol dATP, 22 nmol dCTP, 19 nmol dGTP og 10 nmol 25 TTP.

Blandingen blev opvarmet til 85°C i 5 minutter og fik lov at afkøle til omgivelsestemperatur. Fem enheder Klenow-fragment af E.coli DNA polymerase I tilsattes, og temperaturen blev holdt i 15 minutter. Efter denne tid blev blandingen 30 igen opvarmet til 85°C i 5 minutter og fik lov at afkøle. Fem enheder Klenow-fragment blev igen tilsat, og reaktionen blev udført i 15 minutter. Opvarmnings-, afkølings- og syntesetrinnene blev gentaget yderligere 11 gange.

Efter den sidste gentagelse blev en 5 μΐ delprøve udtaget 35 fra reaktionsblandingen. Denne blev opvarmet til 85°C i 3 minutter og fik lov at afkøle til omgivelsestemperatur. 12,5 32 pmol ce-P -deoxycytidintriphosphat og 5 enheder Klenow-frag- 30 DK 171161 B1 ment blev tilsat, og reaktionen fik lov at forløbe i 15 minutter. De mærkede produkter blev undersøgt ved polyacryl-amidgelelektroforese. Fokl-fordøjelsen blev mærket på lignende måde og tjente som kontrol og molekylvægtmarkører. Det 5 eneste stærkt mærkede bånd, der var synligt efter de 13 cyklusser, var den tilsigtede 25-basepar lange sekvens.

Eksempel 2

Sekvensen, som ønskedes multipliceret, var en 94 basepar lang sekvens, der var indeholdt i det humane /3-globingen og 10 spændte over Mstll-stedet. der er involveret i seglcelleanæ-mi. Sekvensen har den i figur 1 viste nukleotidsekvens.

I. Syntese af primere Følgende to oligodeoxyribonukleotidprimere fremstilledes ved den nedenfor beskrevne metode:

15 5' CACAGGGCAGTAACG 3' Primer A

og

5' TTTGCTTCTGACACA 3' Primer B

Automatiseret synteseprocedure: Diethylphosphoramiditer, der er syntetiseret ifølge Beaucage og Caruthers (Tetrahedron 20 Letters (1981) 22:1859-1862) blev kondenseret sekventielt til et nukleosidderivatiseret styret poreglasbæremateriale under anvendelse af en Biosearch SAM-1. Fremgangsmåden inkluderede detritylering med trichloreddikesyre i dichlormethan, kondensering under anvendelse af benzotriazol som aktiverende 25 protondonor og afdækning (eng: capping) med eddikesyrean- hydrid og dimethylaminopyridin i tetrahydrofuran og pyridin. Cyklustid var ca. 30 minutter. Udbytte ved hvert trin var i alt væsentligt kvantitativt og blev bestemt ved opsamling og spektroskopisk undersøgelse af dimethoxytritylalkohol fri-30 gjort under detritylering.

01igodeoxyribonukleotid-afbeskyttelses- og -oprensningsprocedurer: Den faste bæremateriale blev fjernet fra søjlen og eksponeret til 1 ml koncentreret ammoniumhydroxid ved stuetemperatur i 4 timer i et lukket rør. Bærematerialet blev 35 derefter fjernet ved filtrering, og opløsningen, der indeholdt det delvis beskyttede oligodeoxynukleotid, blev opvarmet til 55°C i 5 timer. Ammoniak blev fjernet, og resten 31 DK 171161 B1 blev påsat en præparativ polyacrylamidgel. Elektroforese blev udført ved 30 volt/cm i 90 minutter, hvorefter båndet, der indeholdt produktet, blev identificeret ved UV-skygning af en fluorescensplade. Båndet blev udskåret og elueret med 1 ml 5 destilleret vand natten over ved 4°C. Denne opløsning blev påført en Altech RP18 søjle og elueret med en 7-13% gradient af acetonitril i 1% ammoniumacetatbuffer ved pH 6,0. Eluatet blev målt ved UV-absorption ved 260 nm, og en passende fraktion opsamledes, kvantificeredes ved UV-absorbans i et fast-10 lagt volumen og inddampedes til tørhed ved stuetemperatur i en vakuumcentrifuge.

Karakterisering af oligodeoxyribonukleotider: Testalikvo- . 32 ter af de oprensede oligonukleotider blev mærket med P med . 32 polynukleotidkxnase og y- P-ATP. De mærkede forbindelse blev 15 undersøgt ved autoradiografi af 14-20% polyacrylamidgeler efter elektroforese i 45 minutter ved 50 volt/cm. Denne fremgangsmåde verificerer molekylvægten. Basesammensætningen blev bestemt ved fordøjelse af oligodeoxyribonukleotidet til nukleosider under anvendelse af gift-diesterase og bakteriel, 20 alkalisk phosphatase og efterfølgende separation og kvantificering af de afledte nukleosider under anvendelse af en HPLC-søjle med omvendt fase og en 10% acetonitril, 1% ammoniumacetat mobil fase.

II. DNA-kilde.

25 A. Ekstraktion af hel, human vildtype-DNA

Human genomisk DNA, der er homozygotisk for normal β-globin, blev ekstraheret fra cellelinien Molt4 (opnået fra Human Genetic Mutant Cell Repository og identificeret som GM2219c) under anvendelse af teknikken beskrevet af Stetler 30 et al., Proc.Nat1.Acad.Sci. (1982), 79:5966-5970.

B. Konstruktion af klonede alobinaener

Et 1,9 kb langt BamHI- fragment af det normale Ø-globingen isoleredes fra cosmidet pFCll og indsattes i BamHI-stedet af pBR328 (Soberon et al., Gene (1980) 9:287-305). Dette frag-35 ment, som omfatter regionen, som hybridiserer til den syntetiske 40-mer probe, inkluderer den første og anden exon, den 32 DK 171161 B1 første intron og de 5'-flankerende sekvenser af genet (Lawn et al., Cell (1978), 15:1157-1174). Denne klon betegnedes pBR328:HbA og blev deponeret under ATCC nr. 39.698 25.maj 1984.

5 Det tilsvarende 1,9 kb lange BgmHI-fragment af seglcelle- allelet af Ø-globin isoleredes fra cosmidet pFC12 og klonedes som ovenfor beskrevet. Denne klon blev betegnet pBR328:HbS og deponeredes under ATCC nr. 39.699 25. maj, 1984.

Hver rekombinantplasmid blev transformeret ind i og 10 opformeret i B.coli MM294 (ATCC nr. 39.607).

C. Fordøjelse af klonede globingener med Mstll

Et total på 100 pg af hver af pBR328:HbA og pBR328:HbS blev individuelt fordøjet met 20 enheder Mstll (New England Biolabs) i 16 timer ved 37°C i 200 μΐ 150 mM NaCl, 12 iriM Tris 15 HC1 (pH 7,5), 12 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT), og 100 μg/ml bovinserumalbumin (BSA). Produkterne blev betegnet PBR328:HbA/MstII henholdsvis pBR328:HbS/Mstll.

III. Polvmerasekædereaktion

Til 100 μΐ buffer bestående af 60 mM natriumacetat, 30 mM 20 Trisacetat og 10 mM magnesiumacetat ved pH 8,0 tilsattes 2 μΐ af en opløsning indeholdende 100 picomol Primer A (med sekvensen d(CACAGGGCACTAACG)), 100 picomol af Primer B (med sekvensen d(TTTGCTTCTGACACA)) og 1000 picomol af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP. Desuden tilsattes en af følgende 25 ovenfor beskrevne DNA-kilder: 10 μg hel, human, vildtype DNA (reaktion I) 0,1 picomol pBR328:HbA (reaktion II).

0,1 picomol pBR328:HbS (reaktion III).

0,1 picomol pBR328:HbA/MstII (reaktion IV).

30 0,1 picomol pBR328:HbS/Mstll (reaktion V).

Intet mål-DNA (reaktion VI)

Hver resulterende opløsning opvarmedes til 100°C i 4 minutter og fik lov at afkøle til stuetemperatur i 2 minutter, hvorefter l μΐ indeholdende 4 enheder Klenow-fragment af 35 E.coli DNA polymerase tilsattes. Hver reaktion fik lov at 33 DK 171161 B1 forløbe i 10 minutter, hvorefter cyklussen med tilsætning af primere, nukleotider og DNA, opvarmning, afkøling, tilsætning af polymerase og reaktion blev gentaget 19 gange for reaktion I og 4 gange for reaktionerne II-VI.

5 Alikvoter på 4 mikroliter af reaktionerne I og II, der var fjernet før den første cyklus og efter den sidste cyklus

af hver reaktion, blev påsat en 12% polyacrylamidgel 0,089 M

i Tris-borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev elektroforesebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, overført til 10 en nylonmembran, der tjente som fast-fase-bæremateriale og 32 probebehandlet med et syntetisk 5'- P-mærket 40 bp langt fragment, der var fremstillet ved standardteknik, med sekvensen: 5' d(TCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG)3' 15 i 30% formamid, 3 x SSPE, 5 x Denhardt's, 5% natriumdodecyl-sulfat ved pH 7,4. Figur 2 er et autoradiogram af den probe-behandlede nylonmembran for reaktionerne I og II. Bane 1 er 0,1 picomol af en 58 bp langt syntetisk fragmentkontrol, hvor 1 streng er komplementær til den ovennævnte probe. Bane 2 er 20 4 /il af reaktion I forud for den første multiplikationscyk lus. Bane 3 er 4 μΐ af reaktion I efter den 20. multiplikationscyklus. Bane 4 er 4 μΐ af reaktion II efter fem multiplikationscyklusser. Bane 5 er en molekylvægtstandard, der består af en FokI (New England Biolabs) fordøjelse af pBR322 25 (New England Biolabs) mærket med ot- P-dNTP'er og polymerase. Bane 3 viser, at efter 20 cyklusser indeholdt reaktionsblanding I en stor mængde af den specifikke sekvens af den passende molekylvægt og ingen andre påviselige produkter. Reaktionsblanding II efter 5 cyklusser indeholdt også dette 30 produkt, såvel som udgangsnukleinsyren og andre produkter, som vist ved bane 4.

Til 5,0 μΐ alikvoter af reaktionerne II-VI efter den 4. cyklus tilsattes 5 pmol af hver af de ovenfor beskrevne primere. Opløsningerne blev opvarmet til 100°C i 4 minutter 35 og fik lov at ækvilibrere til stuetempeatur. 3 pmol af hver af a -3 2 P - dATP, ot-32P-dCTP, ct!-32P-dGTP, a-32P-dTTP og 4 enheder Klenow-fragment blev tilsat. Reaktionen fik i et slut-volumen på 10 μΐ og ved de ovenfor angivne saltkoncentration- 34 DK 171161 B1 er lov at forløbe i 10 minutter. Polymeraseaktiviteten blev afsluttet ved opvarmning i 20 minutter ved 60°C. Alikvoter på 4 μΐ af reaktionerne II-VI blev ladet på en 12% polyacryl-amidgel 0,089 M i Tris-borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i 5 EDTA. Gelen blev elektroforesebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, hvorefter autoradiografi blev udført.

Figur 3 er et autoradiogram af elektroforesen. Bane 1 er en molekylvægtstandard, bane 2 er reaktion II, bane 3 er reaktion III, bane 4 er reaktion IV og bane 5 er reaktion V.

10 En anden bane for reaktion VI som kontrol og uden tilsat DNA havde ingen markeringer i nogen af banerne. Det kan ses ud fra tegningen, at de 94 bp lange fragment, som var forudsagt ud fra mål-DNA, kun var til stede, hvor intakt /3-globin-DNA-sekvenser var tilgængelige for multiplicering, dvs.

15 pBR328:HbA (bane 2), pBR328:HbS (bane 3) og pBR328:HbS/MstII (bane 5). Mstll-fordønelse skærer pBR328:HbA i den 94-mere sekvens, og gør den derved ude af stand til at blive multipliceret, og det 94-mere bånd viser sig ikke i bane 4. I modsætning hertil udskæres den 94-mere sekvens i pBR328:AbS 20 ikke, når plasmidet fordøjes med Mstll. og er således tilgængelig for multiplicering som vist i bane 5.

Figur 4 viser kædereaktionen for 3 cyklusser i multiplicering af den 94 bp lange sekvens. PC01 og PC02 er primere A og B. Tallene på højre side indicerer cyklusserne, hvorimod 25 tallene på venstre side indicerer cyklustallene, i hvilke et specielt molekyle blev produceret.

Eksempel 3

Dette eksempel viser multiplikationen af en 110 bp sekvens spændende over det allele Mstll-sted i det humane 30 hæmoglobingen.

Et total på 1,0 mikrogram hel, human DNA, 100 picomol d(ACACAACTGTGTTCACTAGC) og 100 picomol d(CAACTTCATCCACGTTCACC), hvor primerne var blevet fremstillet ved metoden ifølge eksempel 2, blev opløst i 100 μΐ af en 35 opløsning, som bestod af: 1,5 mM af hver af de fire deoxyribonukleosidtriphosphater 30 mM Trisacetatbuffer ved pH 7,9 35 DK 171161 B1 60 mM natriumacetat 10 mM magnesiumacetat 0,25 mM dithiothreitol.

Opløsningen opvarmedes til 100°C i 1 minut og bragtes 5 hurtigt til 25°C i 1 minut, hvorefter der tilsattes 2,5 enheder Klenow-fragment af DNA-polymerase. Polymerasereak-tionen fik lov at forløbe i 2 minutter ved 25°C, hvorefter cyklussen bestående af opvarmning, afkøling, tilsætning af Klenow-fragment og reaktion blev gentaget så ofte som ønsket. 10 Men en 70% effektivitet ved hver cyklus resulterede 15 cyklusser i syntese af 1,4 femtomol af det ønskede 110 bp fragment af j8-globingenet.

Eksempel 4

Dette eksempel viser multiplikationen af en 240 bp se-15 kvens, der spænder over det allele Mstll-sted i det humane hæmoglobingen. Denne sekvens indeholder Ncol. HinfI og Mstll restriktionsstederne.

Til 100 μΐ af en blanding af 60 mM natriumacetat, 30 mM Tris-acetat og 10 mM magnesiumacetat ved pH 8,0 indeholdende 20 0,1 pmol pBR328:HbA tilsattes 2 μΐ opløsning A, der inde holdt : 100 picomol d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) primer.

100 picomol d(TAACCTTGATACCAACCTGCCC) primer 1000 pmol af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP.

25 De to primere blev fremstillet ved metoden beskrevet i eksempel 2. Opløsningen blev opvarmet til 100°C i 4 minutter og fik lov at afkøle i omgivelsesluft i 2 minutter, hvorefter der tilsattes 1 μΐ indeholdende fire enheder Klenow fragment af E.coli DNA polymerase. Reaktionen fik lov at forløbe i 10 30 minutter, hvorefter cyklussen bestående af tilsætning af opløsning A, opvarmning, afkøling, tilsætning af polymerase og reaktion blev gentaget 3 gange. Til en delmængde på 5,0 μΐ af reaktionerne tilsattes 5 picomol af hver af ovennævnte oligonukleotidprimere. Opløsningen blev opvarmet til 100°C i 35 4 minutter og fik lov at indstille sig til omgivelsestempera- 32 tur, hvorefter 3 picomol af hver af de a- P-mærkede deoxyri- 36 DK 171161 B1 bonukleosidtriphosphater og 4 enheder Klenow-fragment tilsattes. Reaktionen fik i et slutvolumen på 10 μΐ og ved de ovenfor givne saltkoncentrationer lov at forløbe i 10 minutter. Polymeraseaktiviteten blev afsluttet ved opvarmning i 20 5 minutter ved 60°C. 2 μΐ alikvoter blev fordøjet med Ncol.

Msti eller HinfI og sat på en 12% polyacrylamidgel 0,089 M i Tris-Borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev elektroforesebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, og autoradiografi blev udført. Figur 5 viser autoradiogrammet af 10 elektroforesen, hvor bane 1 er den molekylvægtstandard, bane 2 er uden fordøjelse med enzym (240 bp intakt), bane 3 er fordøjelse med Ncol (131 og 109 bp), bane 4 er fordøjelse med Mstll (149 og 91 bp) og bane 5 er fordøjelse med Hinfl (144 og 96 bp). Autoradiogrammet er i overensstemmelse med multi-15 plikationen af den 240 bp lange sekvens.

Eksempel 5

Dette eksempel viser anvendelsen af fremgangsmåden beskrevet heri til påvisning af seglcelleanæmi ved sekventiel fordøjelse. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 i

Syntese og phosphorylering af oliaodeoxyribonukleotider 2

En mærket DNA-probe, RS06, med sekvensen: 3 5' * CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG 3' 4 hvor * indicerer mærkningen, og en umærket, blokerende oligo 5 mer, RS10, med sekvensen: 6 3' GACAGAGGTCACCTCTTCAGACGGCAATGACGGGACACCC 5' 7 som har 3 basepar fejlparrede med RS06, blev syntetiseret 8 ifølge fremgangsmåderne, som blev angivet i eksempel 2(1).

9

Proben RS06 blev mærket ved at kontakte 5 pmol heraf med 4 10 enheder T4 polynukleotidkinase (New England Biolabs) og 50 11 pmol y- P-ATP (New England Nuclear, ca. 7200 Ci/mmol) i et 12

40 μΐ reaktionsvolumen indeholdende 70 mM Tris-buffer (pH

13 7,6), 10 mM MgCl2, 1/5 mM spermin og 2,5 mM dithiothreitol i 14 90 minutter ved 37°C. Det totale volumen blev derefter ind 15 stillet til 100 μΐ med 25 mM EDTA og oprenset ifølge frem- 16 gangsmåden af Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), 464-465 over en l ml Bio Gel P-4 spindialysesøjle fra BioRad 37 DK 171161 B1 ækvilibreret med Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-buffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Den mærkede probe blev yderligere oprenset ved elektroforese på en 18% polyacrylamidgel (19:1 acrylamid:BIS, BioRad) i Tris-borsyre-EDTA (TBE) buffer (89 5 mM Tris, 89 mM borsyre, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) i 500 vhr. Efter lokalisering ved autoradiografi blev den del af gelen, der indeholdt den mærkede probe, udskåret, knust og elueret i 0,2 ml TE puffer natten over ved 4°C. TCA-præcipitation af reaktionsproduktet viste, at den specifikke aktivitet var 4,9 10 Ci/mmol, og slutkoncentrationen var 20 pmol/ml.

Den umærkede RS10 blokerende oligomer blev anvendt ved en koncentration på 200 pmol/ml.

Isolering af human genomisk DNA fra cellelinier

Genomisk DNA med høj molekylvægt blev isoleret fra lym-15 foidcellelinierne Molt4, SC-1 og GM2064 under anvendelse af i alt væsentligt den metode, der beskrives af Stetler et al. i PNAS (1982) 7£; 5966-5970 (for Molt4) og Maniatis et al. i Molecular Cloning (1982), 280-281.

Molt4 (Human Mutant Cell Repository, GM2219C) er en T-20 cellelinie, der er homozygot for normal Ø-globin, og SC-1, deponeret hos ATCC 19. marts 1985, er en EBV-transformeret B-cellelinie, der er homozygot for seglcelleallelet. GM2064 (Human Mutant Cell Repository, GM2064) blev oprindeligt isoleret fra en individuel homozygot med arvelig persistens 25 af føtalhæmoglobin (HPFH) og indeholeer ingen beta- eller deltaglobingensekvenser. Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI-1640 med 10% føtal kalveserum.

Isolering af human genomisk DNA fra kliniske blodprøver En klinisk blodprøve, betegnet CH12, fra en kendt segl-30 cellebærer (AS) blev opnået fra Dr. Bertram Lubin fra Children's Hospital i Oakland, Californien. Genomisk DNA blev fremstillet ud fra "buffy-coat"-fraktionen, som primært er sammensat af perifer blod-lymfocytter, under anvendlese af en modifikation af fremgangsmåden, som er beskrevet af Nunberg 35 et al. i Proc.Nat.Acad.Sci. 75. 5553-5556 (1978).

38 DK 171161 B1

Cellerne blev resuspenderet i 5 ml Tris-EDTA-NaCl (TEN) buffer (10 mM Tris buffer pH 8, 1 iriM EDTA, 10 mM NaCl) og indstillet til 0,2 mg/ml proteinase K, 0,5% SDS, og inkuberet natten over ved 37°C. Natriumperchlorat blev derefter tilsat 5 til 0,7 M, og lysatet blev forsigtigt rystet i 1-2 timer ved stuetemperatur. Lysatet blev ekstraheret med 30 ml phe-nol/chloroform (1:1), derefter med 30 ml chloroform og efterfulgt af ethanolpræcipitering af nukleinsyreme. Pelleten blev resuspenderet i 2 ml TE-buffer og RNase A blev tilsat 10 til 0,005 mg/ml. Efter fordøjelse i 1 time ved 37°C blev DNA'et ekstraheret en gang med hver af lige volumener phenol, phenol/ chloroform og chloroform og blev ethanolpræcipiteret. DNA'et blev resuspenderet i 0,5 ml TE-puffer, og koncentrationen blev bestemt ved absorbtion ved 260 nm.

15 Polymeasekadereaktion til selektiv multiplicerinq af fl-crlo-binsekvenser

To mikrogram genomisk DNA blev multipliceret i et initi-elt 100 μΐ reaktionsvolumen indeholdende 10 mM Tris-puffer (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 150 pmol Primer A med 20 sekvensen d(CACAGGGCACTAACG) og 150 pmol af Primer B med sekvensen d(CTTTGCTTCTGACACA) og dækket med ca. 100 μΐ mineralolie for at forhindre fordampning.

Hver DNA-prøve undergik 15 multiplikationscyklusser, hvor en cyklus er sammensat af 3 trin: 25 1) denaturering i et varmebloksæt ved 95°C i 2 minutter, 2) umiddelbar overføring til et varmebloksæt ved 30°C i 2 minutter for at tillade primere og genomisk DNA at anneale, 3) tilsætning af 2 μΐ af en opløsning indeholdende 5 enheder Klenow-fragment af E.coli DNA-polymerase I (New 30 England Biolabs), 1 nmol af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP i en puffer, der er sammensat af 10 mM Tris (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM MgClj og 4 mM dithiothreitol. Denne forlængelses-reaktion fik lov at forløbe i 10 minutter ved 30°C.

Efter slutcyklussen blev reaktionen afsluttet ved op-35 varmning ved 95°C i 2 minutter. Mineralolien blev ekstraheret med 0,2 ml chloroform og bortkastet. Slutreaktionsvolumenet var 130 μΐ.

39 DK 171161 B1

Hybridisering/fordøielse af multipliceret, genomisk DNA med prober og Ddel/Hinfl 45 μΐ af det multiplicerede, genomiske DNA blev ethanol-præcipiteret og resuspenderet i samme volumen TE-buffer. 10 5 μΐ (indeholdende den præ-multiplicerede ækvivalent til 154 ng af genomisk DNA) blev overført til et 1,5 ml Microfuge-rør og 20 fil TE-buffer til et slutvolumen på 30 fil. Prøven blev dækket med mineralsk olie og denatureret ved 95°C i 10 minutter. 10 μΐ 0,6 M NaCl indeholdende 0,02 pmol mærket R206-10 probe blev tilsat til røret, blandet let og straks overført til en 56°C varm varmeblok i 1 time. Fire mikroliter umærket RS10-blokerende oligomer (0,8 pmol) blev tilsat, og hybridi-seringen fortsattes i yderligere 10 minutter ved samme temperatur. 5 μΐ 60 mM MgCl2/0,l% BSA og 1 μΐ Ddel (10 enheder, 15 New England Biolabs) tilsattes, og det reannealede DNA blev fordøjet i 30 minutter ved 56°C. 1 μΐ HinfI (10 enheder, New England Biolabs) blev derefter tilsat og inkuberet i yderligere 30 minutter. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 4 μΐ 75 mM EDTA og 6 μΐ sporfarve til et slutvolumen på 61 μΐ.

20 Mineralolien blev ekstraheret med 0,2 ml chloroform og 18 μΐ af reaktionsblandingen (45 ng genomisk DNA) blev sat på en 30% polyacrylamid-minigel (19:1, Bio Rad) i et Hoeffer SE200 apparat. Gelen blev elektroforesebehandlet ved ca. 300 volt i 1 time, indtil bromphenolblå-farvefronten var vandret 3,0 cm 25 fra påsætningsstedet. De øverste 1,5 cm af gelen fjernedes, og den resterende gel blev eksponeret i 4 dage med en inten-sificeringsskærm ved -70°C.

Diskussion af fotografi (fin.9)

Hver bane indeholder 45 ng multipliceret, genomisk DNA.

30 Bane A indeholder Molt4 DNA; bane B, CH12; bane C, SC-1 og bane D, GM2064. Molt4 repræsenterer genotypen af et normalt individ med 2 kopier af β^-genet pr. celle (AA), CH12 er en klinisk prøve fra en seglcellebærer med et β^ - og et /3®-gen pr. celle (AS), og SCI repræsenterer genotypen for et segl- c 35 celleindivid med to kopier af β -genet pr. celle (SS).

GM2064, som ikke indeholder beta- eller deltaglobinsekvenser, er tilstede som en negativ kontrol.

40 DK 171161 B1

Som det ses på fotografiet er den Ddel - spaltede. |SA-specifikke octamer kun tilstede i de DNA'er, der indeholder ffi-genet (baner A og B) og den Hinf I - spaltede. j8S- specifikke

G

trimer er kun tilstede i de DNA'er, der indeholder β -genet 5 (banerne B og C). Tilstedeværelsen af både trimer og octamer (bane B) er diagnostisk for en seglcellebærer og kan skelnes fra et normalt individ (bane A) med octameren alene og fra et seglcelleplaget individ (bane C) med trimer alene.

Gentagelsen af det ovenfor beskrevne forsøg under an-10 vendelse af ikke-multipliceret, genomisk DNA viste til sammenligning at multiplikationen forøgede påvisningsfølsomheden mindst 1000 gange.

Eksempel 6

Dette eksempel illustrerer direkte påvisning af et fuld-15 stændigt uoprenset, enkeltkopigen i hel, human DNA på geler uden behov for en mærket probe.

Under anvendelse af den i eksempel 3 beskrevne metode blev et 110 bp langt fragment fra en sekvens i det første exonområde af betaglobingenet multipliceret ud fra 10 mikro-20 gram hel, human DNA efter 20 cyklusser. Dette 110 bp fragment, der var frembragt efter 20 cyklusser, kunne let ses på geler, der var farvet med ethidiumbromid.

Sekvensen multipliceredes ikke, når det først var skåret med restriktionsenzymet Ddel. undtagen, som i beta-globin-S-25 allelen, hvis sekvensen ikke indeholdt restriktionsstedet som enzymet genkender.

Eksempel 7 A. Et total på 100 fmol pBR328, der indeholdt et 1,9 kb langt indsat stykke fra det humane beta-globin A allel, 50 30 nmol af hver af a- P-dNTP ved 500 Ci/mol og 1 nmol af hver af primerne, der anvendtes i eksempel 3, blev opløst i en opløsning indeholdende 100 μΐ 30 mM Tris-acetat ved pH 7,9, 60 mM natriumacetat, 100 mM dithiothreitol og 10 mM magnesiumacetat. Opløsningen bragtes til 100°C i 2 minutter og 35 afkøledes til 25°C i 1 minut. Et total på 1 μΐ indeholdende 4,5 enheder Klenow-fragment af E.coli DNA polymerase I og 41 DK 171161 B1 0,09 enheder uorganisk pyrophosphatase tilsattes for at forhindre den mulige ophobning af pyrophosphat i reaktions-blandingen, og reaktionen fik lov at forløbe i 2 minutter ved 25°C, hvorefter cyklussen med opvarmning, afkøling, enzymtil-5 sætning og reaktion blev gentaget 9 gange. 10 /il delprøver udtoges og tilsattes til 1 μΐ 600 mM EDTA efter hver syntesecyklus. Hver blev analyseret på en 14% polyacrylamidgel i 90 mM Tris-borat og 2,5 mM EDTA ved pH 8,3 og 24 volt/cm i 2,5 timer. Den færdige gel blev opblødet i 20 minutter i den 10 samme puffer med tilsætning af 0,5 /zg/ml ethidiumbromid, vasket med det oprindelige puffer og fotograferet i UV-lys under anvendelse af et rødt filter.

Det fremstillede 110 bp lange fragment blev udskåret fra 32 gelen under ultraviolet lys, og det inkorporerede P måltes 15 ved Cerenkov-bestråling. Et forsøg på at indpasse resultater-ne i ligningen med formen:pmol/10 μΐ = 0,01 [(1+y) - yN - 1] , hvor N angiver antallet af cyklusser og y er fraktionsudbyttet pr. cyklus, var optimal med y = 0,619. Dette indicerer, at en signifikant multiplicering opnåedes.

20 B. Det ovenfor angivne forsøg gentoges med undtagelse af, at 100 nmol af hver dNTP tilsattes til en 100 μΐ reaktion, ingen radioaktiv mærkning blev anvendt og delprøver blev ikke fjernet ved hver cyklus. Efter 10 cyklusser afsluttedes reaktionen ved kogning i 2 minutter og rehybridiseringen blev 25 udført ved 57°C i 1 time. Sekvensen af det 110 bp lange produkt blev bekræftet ved at udsætte 8 μΐ delprøver for restriktionsanalyse ved tilsætning af 1 μΐ bovinserumalbumin (25 mg/ml) og 1 μΐ af det passende restriktionsenzym (HinfI. Mnll. Ms til. Ncol) og ved omsætning ved 37°C i 15 timer. PAGE 30 blev udført som ovenfor beskrevet.

Eksempel 8

Dette eksempel illustrerer anvendelsen af forskellige primere til multiplicering af forskellige fragmenter af pBR328 og 322.

35 A. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 7A, blev gentaget med undtagelse af, at der anvendtes følgende primere: d(TTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC) og 42 DK 171161 B1 d(GCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACC) til fremstilling af et 130 bp langt fragment af pBR328.

B. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 7A, blev gentaget med undtagelse af, at der anvendtes følgende pri- 5 mere: d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) og d(TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG) til fremstilling af et 262 bp langt fragment af pBR328. Omsætningstiden var 20 minutter pr. cyklus.

C. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 8A, blev gentaget med undtagelse af, at 100 fmol af en Mstll- fordøj el- 10 se af pBR328 indeholdende et 1,9 kb langt indskud fra det humane beta-globin S allel blev anvendt som initiel template. Dette plasmid blev spaltet flere gange med Mstll. men ikke indeni sekvensen, der skulle multipliceres. Desuden var de anvendte primere følgende: 15 d (GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) og d (TAACCTTGATACCAACCTGCCC) til dannelse af et 240 bp langt fragment.

D. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 7B, blev gentaget med undtagelse af, at 100 fmol af en Nrul- fordøj else af pBR328 blev anvendt som template, 200 nmol af hver dNTP

20 blev anvendt i 100 μΐ omsætningen og primerne var: d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og d(CTTCCCCATCGGTGATGTCG) til dannelse af et 500 bp langt fragment fra pBR328. Omsætningstider var 20 minutter pr. cyklus ved 37°C. Slut-rehybridisering var 15 timer ved 57°C. Elektroforese var på en 4% agarosegel. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Eksempel 9 2

Dette eksempel illustrerer fremgangsmåden ifølge opfind 3 elsen, hvorved en in vitro mutation introduceres i det multi 4 plicerede segment.

5 A. Et total på 100 fmol pBR322 lineariseret med Nrul. 1 6 nmol af hver af primerne: d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) og 7 d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) udformet til frembringelse af et 75 8

bp langt fragment, 100 nmol af hver af dNTP, i 100 μΐ 40 mM

9

Tris ved pH 8, 20 mM i MgCl2, 5 mM i dithiothreitol og 5 10 mg/ml bovinserumalbumin blev kombineret. Blandingen blev 11 bragt til 100°C i 1 minut, afkølet i 0,5 minutter i et vandbad ved 23°C, hvorefter 4,5 enheder Klenow-fragment og 0,09 enheder uorganisk pyrophosphatase blev tilsat, og en omsæt- DK 171161 Bl 43 ning fik lov at forløbe i 3 minutter. Cyklussen med opvarmning, afkøling, tilsætning af enzymer og omsætning blev gentaget 9 gange. Den 10. omsætningscyklus blev afsluttet ved nedfrysning og en 8 μΐ delprøve af reaktionsblandingen blev 5 sat på en 4% agarosegel visualiseret med ethidiumbromid.

B. Forsøget som er beskrevet i eksempel 9A blev gentaget med undtagelse af, at de anvendte oligonukleotidprimere var: d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) og 10 d (AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGAGGCCCT)

Disse primere er udformet til at producere et 101 bp langt fragment, hvoraf 26 nucleotider (i den primer, der er angivet som nummer to), ikke er til stede i pBR322. Disse nukleotider repræsenterer sekvensen i T7-promotoren, som blev 15 tilføjet til den 75 bp lange sekvens fra pBR322 ved at anvende primeren med 20 komplementære baser og en 26 base lang 5'-forlængelse. Proceduren krævede mindre end 2 timer og producerede to picomol af det relativt rene 101 bp lange fragment fra 100 fmol af pBR322.

20 T7-promotoren kan anvendes til at initiere RNA-tran- skription. T7-polymerase kan tilsættes til det 101 bp lange fragment til frembringelse af enkeltstrenget RNA.

C. Forsøget som er beskrevet i eksempel 8D blev gentaget med undtagelse af, at de anvendte oligonukleotidprimere var 25 som følger: d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og d(CCAGCAAGACGTAGCCCAGC) til frembringelse af et 1000 bp langt fragment fra pBR322.

D. Forsøget som er beskrevet i eksempel 9C blev gentaget 30 med undtagelse af, at de anvendte oligonukleotidprimere var som følger: d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og d (AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGAGGCCCT) for således at frembringe et 1026 bp langt fragment, hvoraf 35 26 nukleotider (i den primer, der er angivet som nummer to) ikke er til stede i pBR322 og repræsenterer den ovenfor beskrevne T7-promotor. Promotoren er blevet indføjet naboliggende til et 1000 bp langt fragment fra pBR322.

44 DK 171161 B1

Resultaterne indicerer, at en primer, som ikke er en perfekt parring til templatesekvensen, som ikke desto mindre er i stand til at hybridisere tilstrækkeligt til at blive enzymatisk forlænget, producerer et langt produkt, som inde-5 holder sekvensen af primeren snarere end den tilsvarende sekvens af den oprindelige template. Det lange produkt tjener som template for den anden primer til introducering af en in vitro mutation. Denne mutation multipliceres i yderligere cyklusser med en uformindsket effektivitet, fordi ingen 10 yderligere fejlparrede priminger kræves. I dette tilfælde blev en primer, som bærer en ikke-komplementær forlængelse på dets 5'-ende anvendt til indføjelse af en ny sekvens i produktet, der er naboliggende til templatesekvensen, der kopieres .

15 Eksempel 10

Dette eksempel illustrerer anvendelsen af indskudte sæt af primere for at nedsætte baggrunden i multiplikationen af enkeltkopigener.

Hel, human DNA, som er homozygotisk for vildtype j8-glo-20 binallelet, blev udsat for 20 multiplikationscyklusser på følgende måde: Ialt 10 ^g DNA, 200 pmol af hver af primerne: d (ACACAACTGTGTTCACTAGC) og d (CAACTTCATCCACGTTCACC) og 100 nmol af hver dNTP i 100 μΐ af 30 mM Tris-acetat pH 7,9, 60 mM natriumacetat, 10 mM dithiothreitol og 10 mM magnesiumacetat 25 blev opvarmet til 100°C i 1 minut, afkølet til 25°C i 1 minut og behandlet med 2 enheder Klenow-fragment i 2 minutter. Cyklussen med opvarmning, afkøling og tilsætning af Klenow-fragment blev gentaget 19 gange. En delprøve på 10 μΐ blev fjernet fra reaktionsblandingen og udsat for yderligere 10 30 multiplikationscyklusser under anvendelse af hver af primerne: d(CAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTG) og d(CCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCC), hvilket multiplicerer et 58 bp langt fragment indeholdt i det ovenfor fremstillede 100 35 bp lange fragment. Disse sidste 10 multiplikationscyklusser blev udført ved at fortynde 10 μΐ delprøven i 90 μΐ frisk Tris-acetatpuffer beskrevet ovenfor indeholdende 100 nmol af 45 DK 171161 B1 hver dNTP og 200 pmol af hver primer. Reaktionsbetingelserne var som ovenfor anført. Efter 10 cyklusser blev en 10 μΐ delprøve (svarende til 100 ng af det oprindelige DNA) påsat en 6% NuSieve (FMC Corp.) agarosegel og blev visualiseret 5 under anvendelse af ethidiumbromid.

Figur 10 illustrerer denne gel belyst med UV-lys og fotograferet gennem et rødt filter, hvilket er kendt inden for fagområdet. Bane 1 er molekylvægtsmarkører. Bane 2 er en delprøve af den ovenfor beskrevne reaktions. Bane 3 er en 10 delprøve af en reaktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at det oprindelige vildtype-DNA blev spaltet med Ddel forud for multiplikationen. Bane 4 er en delprøve af en reaktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at human DNA homozygot for seglcellebeta-15 globinallelet blev behandlet med Ddel før multiplikationen (seglcelleallelet indeholder ikke et Ddel-restriktionssted i det fragment, som bliver multipliceret her). Bane 5 er en delprøve af en reaktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at laksesperm-DNA blev anvendt i stedet 20 for human DNA. Bane 6 er en delprøve af en reaktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at delprøven blev behandlet med Ddel efter multiplikation (Ddel skulle omdanne det 58 bp lange vildtypeprodukt til 27 og 31 bp lange fragmenter). Bane 7 er en delprøve af materialet fra bane 4 25 behandlet med Ddel efter multiplikation (det 58 bp lange seglcelleprodukt indeholder intet Ddel-restriktionssted).

Påvisning af et 58 bp langt fragment, som er repræsentativt for et enkeltkopigen, fra 1 mikrogram human DNA under anvendelse af udelukkende ethidiumbromidfarvning af en agaro-30 segel kræver en multiplikation på ca. 500.000 gange. Dette blev opnået ved at anvende de to indskudte sæt af oligonu-kleotidprimere beskrevet her. Det første sæt multiplicerer det 110 bp lange fragment og det i det indre indskudte sæt multiplicerer et subfragment af dette produkt op til et 35 niveau, som er hensigtsmæssigt til påvisning, som vist i figur 10. Denne fremgangsmåde med at anvende primere, som multiplicerer en lille sekvens indeholdt i den sekvens, som er multipliceret i den tidligere multiplikationsproces og som f DK 171161 B1 46 er indeholdt i forlængelsesprodukter af de andre primere, gør det muligt at skelne vildtypen fra seglcelleallelet ved j8-globinlocusset uden at ty til hverken radioisotopiske eller ikke-radioisotopiske probehybridiseringsmetoder, såsom be-5 skrevet af Conner et al., PNAS (USA), £2.:278 (1983) og Leary et al., PNAS (USA), £2:4045 (1983).

Eksempel ii

Det forventes, at den foreliggende fremgangsmåde er nyttig til i en DNA-prøve fra en patient at påvise en speci-10 fik sekvens associeret med en infektiøs sygdom, såsom f.eks. Chlamydia under anvendelse af en biotinyleret hybridiserings-probe, som spænder over den ønskede multiplicerede sekvens og under anvendelse af den i beskrivelsen til USA 4.358.535, se ovenfor, beskrevne fremgangsmåde. Den biotinylerede hybridi-15 seringsprobe kan fremstilles ved interkelering og bestråling af et delvis dobbeltstrenget DNA med en 4'-methylensubstitu-eret 4,5'-8-trimethylpsoralen knyttet til biotin via en afstandsarm med formlen:

H

20 I

-Y(CH2)2-0- [(CH2)x0]y-CH2CH2-N- hvor Y er 0, NH eller N-CHO, x er et tal på fra 1 til 4 og y er et tal på fra 2 til 4. Påvisning af biotinylgrupper på proben kan opnås ved at anvende et streptavidin - sur phos-25 phatase - kompleks, som kan opnås korranercielt fra Enzo Bio-chem Inc., under anvendelse af de påvisningsmetoder, som foreslås af leverandøren i dennes brochure. Den hybridiserede prøve ses som en plet af udfældet farve på grund af bindingen af påvisningskomplekset og den efterfølgende reaktion kataly-30 seret af sur phosphatase, hvilket frembringer en udfældelig farve.

Eksempel 12 I dette eksempel anvendes stort set den i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåde til at multiplicere et 119 basepar 47 DK 171161 B1 langt fragment på det humane β-hæmoglobingen under anvendelse af primerne: 5' -CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC-3' (GH18) 5'-CACaAgCTTCATCCACGTTCACC- 3' (GH19) 5 hvor små bogstaver betegner fejlparringer i forhold til vildtypesekvensen for at frembringe restriktionsenzymsteder. Det fulde skema vises i tabel I. Tabel I illustrerer et diagram af primerne GH18 og GH19, som anvendes til kloning og sekventering af et 119-basepar langt fragment af det humane 10 /3-globingen, og som er udformet til at indeholde indre restriktionssteder. Startcodonnet ATG er understreget. GH18 er et 26 baser langt oligonukleotid, som er komplementær med den negative streng, og som indeholder et indre Pstl-sted. GH19 er et 23 base langt oligonukleotid, som er komplementært til 15 plusstrengen, og som indeholder en indre HindiII-genkende!-sessekvens. Pile angiver forlængelsesretningen for DNA-poly-merase I. De indrammede sekvenser angiver restriktionsenzymets genkendelsessekvenser på hver primer. Disse primere blev udvalgt ved først at screene områderne på genet for 20 homologi til PstI og Hindlll restriktionssteder i bakteriofag Ml3. Primerne blev derefter fremstillet som beskrevet i tidligere eksempler.

+ I

DK 171161 Bl 48 g 1 i 11 i

I 1 I

$ i § 1 i 6 s 6 y δ u i i tt L)

Q U

δ q 11 υ δ q δ 5 q i i o o U tt υ δ g q

P S

o u

ί E

H 3 6 . δ u ^ s i § s $ δ d u ^ μ υ δ o· •SI B 3 α> u

Dl 4 Η Λί 0)

tt q C S

U tt iH n a g a & q tt k αι tt q w a H ft ω β tt. D β -η o q 0) i-η §< > I H 0) Q oo q δ η -π d tt Λ tt js d q crx

6 S m X

5 f ° U tt tt rn δ i 6 yp bu S δ 6 a

U tt q U

tt U O Η H

g b g tt P

§ I g g g

Pas 4 2 g g S 13 3 g § g gq tt ss cn

d 6 ° S P

^ tt ^ P <? < f> O) q « ϋ o λ e< i δ g b a B 6 I 8

P % P

qUO in in 49 DK 171161 B1

Multiplikation og kloning

Efter 20 multiplikationscyklusser med 1 mikrogram human genomisk DNA isoleret fra cellelinien Molt 4 som beskrevet i eksempel 2 blev 1/14 af reaktionsproduktet hybridiseret til 5 den mærkede Ø-globin specifikke, oligonukleotid probe, RS06, med sekvensen 5'-CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG-3' under anvendelse af de ovenfor beskrevne metoder til oligomer restriktion. Efter opløsningshybridisering blev reaktions-blandingen behandlet med Ddel under restriktionsfordøjeises-10 betingelser, som beskrevet ovenfor, til frembringelse af et 8-basepar langt oligonukleotid. Mængden af dette 8-basepar lange produkt er proportionalt med mængden af frembragt multipliceret produkt. Fordøjelsesprodukterne blev separeret på en 30% polyacrylamidgel og visualiseret ved autoradiogra-15 fi.

Analyse af autoradiogrammet afslørede, at multiplikationen var sammenlignelig i effektivitet med multiplikationen af primeren PC03 (5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3') ogPC04 (5'-CCACTTGCACCTACTTCAAC- 3') , som er komplementære med den nega-20 tive henholdsvis den positive streng i vildtype /3-globin.

Det multiplicerede produkt blev ethanolpræcipiteret for at afsalte og koncentrere prøven, blev genopløst i en restriktionspuffer af 10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 mM NaCl og blev samtidig fordøjet med PstI og Hindlll.

25 Efter fordøjelsen blev prøven afsaltet med en Centricon 10 koncentrator og ligeret natten over ved 12°C ved 0,3 mikrogram af den PstI/ Hindlll-fordøjede vektor Ml3mpl0w, som er offentlig tilgængelig fra Boehringer-Mannheim.

Hele ligeringsblandingen blev transformeret i E.coli 30 stamme JM103, som er offentlig tilgængelige fra BRL i Bethes-da, MD. Den fremgangsmåde, som blev fulgt til fremstilling af den transformerede stamme, er beskrevet i Messing, J. (1981) Third Cleveland Symposium on Macro-molecules: Recombinant DNA. red. A.Walton, Elsevier, Amsterdam, 143-153.

35 Transformationsblandingen blev udpladet på x-gal medie til screening ved hjælp af plaquehybridisering med nylon-filtere. Filtrene blev proberet med en /3-globinspecifik oligonukleotidprobe RS24 med sekvensen 5'- 50 DK 171161 B1 CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAG- 3' for at bestemme antallet af β-globinindføjeiser. Filtrene blev derefter reproberet med primeren PC04 for at bestemme det totale antal af indføjelser.

5 Udpladnincr oa screening

Tabel II opsummerer udpladnings- og plaquehybridiserings-resultater. Filtrene blev proberet med primeren PC04 for at bestemme procent indføjelse resulterende fra multiplikationen og kloningen; 1206 klare plaque (90% af det totale antal 10 klare plaque) hybridiserede med primeren. 15 plaque hybridi-serede med den Ø-globinspecif ikke probe RS24. Procentdelen af /3-globinpositive plaques blandt de multiplicerede primerpositive plaques er ca. 1%.

Tabel II

15 Blå Ingen jff-Globin-

Plade nr. plaques indføjelser* Indføjelser** indføjelser 1 28 25 246 1 2 29 18 222 2 3 11 26 180 0 20 4 24 20 192 5 5 22 27 185 5 6 39 21 181 3

Total 158 132 1206 15 % plaque indeholdende multiplicerede sekvenser, som inde-25 holder β-globinindføjelse = 15/1206 x 100 = 1,24%.

% total plaque, som indeholder β-globinindføjelse = 15/1496 x 100 = ca. 1%.

% total plaque, som indeholder multiplicerede sekvenser = 1206/1496 x 100 = ca. 0,8%.

30 * Klare plaque, som ikke hybridiserer med primer PC04 ** Klare plaque, som hybridiserer med primer PC04.

Restriktionsenzymanalvse og Southern Blot Analyse DNA fra fag-DNA minipræparation af 3 Ø-globinpositive og 2 j8-globinnegative (men PC04 primerpositive) plaques blev 35 analyseret ved restriktionsenzymanalyse. Mstil- fordøj else af DNA fra M13-kloner indeholdende det multiplicerede β-globin- 51 DK 171161 B1 fragment skulle frembringe et karakteristisk 283 bp langt fragment. Efter Mstll-fordøjelse producerede de tre Ø-globin-positive kloner alle det forudsagte 283 bp lange fragment, medens de to kloner, som kun var positive med primeren, 5 producerede større fragmenter.

Gelen fra denne analyse blev overført til et MSI-nylon-filter og hybridiseret med en radioaktiv mærket, nick-trans-lateret jS-globinprobe fremstillet ved nicktranslationsstan-dardmetoder, som beskrevet af Rigby et al., J.Mol.Biol.

10 (1977), 113:237-51. De eneste bånd, som hybridiserede til β- globinproben, var de tre j8-globinpositive kloner. De to andre kloner havde indføjelser, som ikke hybridiserede til j8-glo-binproben.

Sekvensanalyse 15 10 j8-giobinpositive kloner, som ved restriktionsenzymana lyse blev vist at indeholde (8-globinindf øj elsen, blev sekven-teret under anvendelse af M13-dideoxysekventeringsmetoden. Ud af de 10 kloner var 9 identiske med jff-globinvildtypesekven-sen. Den anden klon var identisk med μ-globingenet, som er 20 blevet vist at være multipliceret alene i en lille udstrækning af /3-globinprimerne.

Som konklusion var de modificerede linkerprimere næsten lige så effektive som de ikke-modificerede primere til at multiplicere /3-globinsekvensen. Primerne var i stand til at 25 lette indføjelsen af multipliceret DNA i kloningsvektorer. På grund af multipliceringen af andre segmenter af genomet indeholdt kun 1% af klonerne hæmoglobinsekvenser.

9 ud af de 10 kloner blev fundet at være identiske med den publicerede jS-globinsekvens, hvilket viser, at metoden 30 multiplicerer genomisk DNA med stor nøjagtighed. En klon blev fundet at være identisk med den publicerede μ-giobinsekvens, hvilket bekræfter, at primerne er specifikke for Ø-globinge-net på trods af, at de har en signifikant sekvenshomologi med δ-globin.

35 Når kloningen blev udført med et 267 bp langt fragment af /8-globin-genet, var kloningen kun effektiv, når dimethylsulf- 52 DK 171161 B1 oxid var tilstede (10 volumen% ved 37°C) i multiplikations-proceduren.

Restriktionsstedmodificerede primere blev også anvendt til at multiplicere og klone og delvis sekventere det humane 5 N-ras oncogen og til at klone de 240 bp lange segmenter af HLA DQ-α og DQ-0 generne. Alle disse multiplikationer blev udført i nærværelse af 10 volumenprocent dimethylsulfoxid ved 37°C. Primerne til multiplikation af HLA DQ-α og DQ-/3 generne var meget mere specifikke for deres beregnede mål end /3-globin-10 og DR-β-primerne, hvilket i stedet for at give adskilte bånd på en ethidiumbromidfarvet agarosegel blot gav et smear. Ydermere frembragte HLA DQ-α primerne op til 20% kloner med multiplicerede indføjelser, som indeholdt det ønskede HLA målfragment, hvorimod 1% af jS-globinklonerne indeholdt målse-15 kvensen. HLA DQ-α- og DQ-jS-genkloningen er kun effektiv, når DMSO var til stede, og temperaturen var hævet.

Eksempel 13

Dette eksempel illustrerer anvendelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til at fremstille TNF-genet med 494 base-20 par startende fra 2 oligonukleotider på hver 74 basepar.

Primere

De anvendte primere blev fremstillet ved den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde og er identificeret neden for som hver værende 74 merer.

53 DK 171161 B1 (TN10) 5'-CCTCGTCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCGACTATGTGCTCCTCA-CCCACACCGTCAGCe-3' (TNI1) 5'-GGCAGGGGCTCTTGACGGCAGAGAGGAGGTTGACCTTCTCCTGGTAGGAGATGGCGAAG-CGGCTGACGGTGTGG-3' (LL09) 5'-CCTGGCCAATGGCATGGATCTGAAAGATAACCAGCTGGTGGTGCCAGCAGATGGCCTGT-ACCTCGTCTACTCCC-3' (LLl?) 5'-CTCCCTGATAGATGGGCTCATACCAGGGCTTGAGCTCAGCCCCCTCTGGGGTGTCCTTC-GGGCAGGGGCTCTTG-3' (TN08) 5'-TGTAGCAAACCATCAAGTTGAGGAGCA'GCTCGAGTGGCTGAGCCAGCGGGCCAATGCCC-TCCTGGCCAATGGCA-3' (TN13) 5'-GATACTTGGGCAGATTGACCTCAGCGCTGAGTTGGTCACCCTTCTCCAGCTGGAAGACC-CCTCCCTGATAGATG-31 (LL07) 5‘-CCTTAAGCTTATGCTCAGATCATCTTCTCAAAACTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATG-TTGTAGCAAACCATC-3‘ (TN14) 5'-GCTCGGATCCTTACAGGGCAATGACTCCAAAGTAGACCTGCCCAGACTCGGCAAAGTCG-AGATACTTGGGCAGA-3'

Samlet procedure I. 10 cyklusser af den neden for anførte protokol blev udført under anvendelse af primerne TN10 og TN11, som vekselvirker som vist på diagrammet nedenfor, trin (a).

5 II. Et total på 2 μΐ af reaktionsblandingen fra afsnit I

ovenfor blev tilsat til primerne LL09 og LL12. Den nedenfor beskrevne protokol blev udført i 15 cyklusser, således at primerne vekselvirkede med produktet fra afsnit I som vist i diagrammet nedenfor, trin (b).

10 III. Ialt 2 mikroliter af reaktionsblandingen fra afsnit II ovenfor blev tilsat til primerne TN08 og TN13. Den nedenfor beskrevne protokol blev udført i 15 cyklusser, således at primerne vekselvirkede med produktet fra afsnit II, som vist i diagrammet nedenfor, trin (c).

15 IV. Ialt 2 mikroliter af reaktionsblandingen fra afsnit III ovenfor blev tilsat til primerne LL07 og LL14. Den nedenfor beskrevne protokol blev udført i 15 cyklusser, således at DK 171161 Bl 54 primerne vekselvirkede med produktet fra afsnit III som vist i diagrammet nedenfor, trin (d).

Protokol

Hver reaktion indeholdt 100 μΐ af:

5 2 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP

3 μΜ af hver af primerne anvendt på dette trin 1 x polymerasepuffer (30 mM Tris-acetat, 60 mM natriumacetat, 10 mM Mg-acetat, 2,5 mM dithiothreitol).

Hver cyklus bestod af: 10 1) 1 minut i kogende vand.

2) 1 minut afkøling ved stuetemperatur 3) tilsætning af 1 μΐ (5 enheder) af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase 4) mulighed for at polymeriseringsreaktionen forløb i 2 15 minutter.

For næste cyklus start igen ved trin 1.

Diagram a) 5' TN10 -> <- 5' TN11 20 i -> xxxxxxx produkt fra afsnit 1 xxxxxxxxxxxx <- b) 5' LL09 -> xxxxxxxxx<- 5' TN11 25 + 5' TN10 ->xxxxxxxx <- 5' LL12 + 5' LL09 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxx 30 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' TN11 intermediær tilstand + 5' TN10 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' LL12 * kun sekvensen mellem 5' af LL09 35 og 5' af LL12 vil være fuld længde. Strengene, som indeholder TN10 og TNll, har ikke voksende 5'-ender. På denne måde...

5' LL09 55 DK 171161 B1 ->χχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχ xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' LL12

Dette er produktet fra afsnit II.

c) 5' TN08 -> 5 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' LL12 + 5'LL09 xxxxxxxxxxxxxxxx ^ <- 5' TN13 i samme intermediære skema som (b) 10 5' TN08 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx χχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχ<- 5 ' TN13

Dette er produktet fra afsnit III.

d) 5' LL07 -> xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' TN13 15 + 5' TN08 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx <- 5' TN14 i samme intermediære skema som (b) og (c) 20 5' LL07 ->xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<- 5' TN14 (TNF-genet)

Deponeringer af materialer

Cellelinien SC-1 (CTCC nr. 0082) blev deponeret 19. marts 25 1985 hos American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Park- lawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA med ATCC deponeringsnummer CRL nr. 8756. Deponeringen af SC-1 var underlagt en kontrakt mellem ATCC og assignatar for den foreliggende ansøgning, Cetus corporation. Kontrakten med ATCC giver 30 offentligheden en permanent mulighed for, at afkom af denne cellelinie er tilgængelig ved udstedelse af det US patent, som beskriver og identificerer deponeringen, eller ved offentliggørelse eller fremlæggelse af en hvilken som helst US eller fremmed patentansøgning, hvad der nu kommer først, og 35 for at afkom af denne cellelinie er tilgængelig for en person, der af US Commissioner of Patents and Trademarks er udpeget til at være berettiget til dette ifølge 35 CFR §122 og Commissioners regler i medfør heraf (inklusiv 37 CFR §1,14 med speciel henvisning til 886 OG 638) . Assignatar for den 40 foreliggende ansøgning har accepteret, at hvis cellelinien,

Claims (21)

1. Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve, hvorhos hver nukleinsyresekvens, der skal påvises, består af to adskilte, komplementære strenge, 20 kendetegnet ved, at den eller de specifikke sekvenser (hvis den eller de forekommer) multipliceres ved (a) at for hver af de to strenge i hver nukleinsyrese kvens, der skal påvises, behandles prøven med en nukleotidprimer og andre nødvendige komponenter, 25 således at for hver streng i hver sekvens, som skal påvises, syntetiseres der ud fra hver primer et forlængelsesprodukt, som er komplementært til den nukleinsyrestreng, på hvilken det syntetiseres, idet primerne udvælges således, at de i det væsentlige er 30 komplementære til hver af strengene i hver specifik sekvens og afgrænser enderne af den nukleinsyresekvens, der skal multipliceres, således at det forlængelsesprodukt, der syntetiseres ud fra én primer, tjener som template for syntese af et forlængelses- DK 171161 B1 produkt ud fra den anden primer, når det er blevet adskilt fra sit komplement, (b) at produktet fra trin (a) behandles under denatureringsforhold til adskillelse af primerforlængel- 5 sesprodukterne fra deres templater, (c) at produktet fra trin (b) behandles med oligonukleo-tidprimere og de andre nødvendige komponenter i trin (a), således at der under anvendelse som template af hver af de enkeltstrenge, der er frembragt i trin 10 (b), syntetiseres et primerforlængelsesprodukt, som template, og at trin (b) og trin (c) eventuelt gentages mindst én gang, og at den således multiplicerede sekvens eller de multiplicerede sekvenser (hvis de forekommer) påvises.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at trin (b) udføres ved varmede-naturering.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l eller 2, kendetegnet ved, at de andre nødvendige komponen- 20 ter omfatter et induceringsmiddel for polymerisering samt de forskellige nukleotider.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at induceringsmidlet for polymerisering er udvalgt blandt E. coli DNA-polymerase I, Kle- 25 now-fragmentet fra E. coli DNA-polymerase I, T4 DNA-polymera-se, varmestabilt enzym eller revers transcriptase.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den specifikke nukleinsyrese- 30 kvens, der skal multipliceres, er indeholdt i en større sekvens. DK 171161 B1

5 Opsummerende fremgår det, at der med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til påvisning af sekvenser i nukleinsyrer ved først at multiplicere en eller flere specifikke nukleinsyresekvenser under anvendelse af en kædereaktion, hvorved primerforlængelsesprodukter frembring-10 es, som efterfølgende kan fungere som templater for yderligere primerforlængelsesreaktioner. Fremgangsmåden er især anvendelig til påvisning af nukleinsyresekvenser, som i begyndelsen kun er til stede i meget små mængder.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at den specifikke nukleinsyrese-kvens, der skal multipliceres og påvises, er DNA eller RNA, 5 herunder budbringer-RNA, hvilket DNA eller RNA kan være enkeltstrenget eller dobbeltstrenget, eller er en DNA-RNA-hybrid.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, 10 kendetegnet ved, at den specifikke nukleinsyrese-kvens, som skal multipliceres og påvises, er opnået fra en enkeltstrenget nukleinsyre ved behandling af denne streng med en eller to primere og andre nødvendige komponenter, således at der af den ene primer syntetiseres et forlængelsesprodukt, 15 som er komplementært til strengen, idet den ene primer vælges således, at den i det væsentlige er komplementær til strengen, medens den anden primer, hvis den forekommer, er udvalgt således, at den i det væsentlige er komplementær til primerforlængelsesproduktet af den første primer, og at primerfor-20 længelsesproduktet adskilles fra det template, på hvilket den er blevet syntetiseret, til frembringelse af enkeltstrengede molekyler.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den specifikke nukleinsyrese-25 kvens, som skal multipliceres og påvises, er genomt DNA.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at den specifikke nukleinsyrese-kvens, der skal multipliceres og påvises, er indeholdt i en 30 blanding, som er produktet af en forudgående multiplikations-proces, der er udført ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, DK 171161 B1 kendetegnet ved, at mindst én af de benyttede primere er forskellig fra den, der blev benyttet i den foregående multiplikationsproces.

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 5 1-10, kendetegnet ved, at mængden af anvendt primer er i stort molært overskud i forhold til mængden af template.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at forholdet mellem primer og 10 template almindeligvis er mindst ca. 1000:1.

13. Fremgangsmåde ifølge krav li eller 12, kendetegnet ved, at forholdet mellem primer og template almindeligvis er mindst ca. 10^:1.

14. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 15 1-13, kendetegnet ved, at der for hver specifik nuklein-syrestreng, der skal multipliceres og påvises, anvendes en samling af primere, blandt hvilke mindst én er i alt væsentligt komplementær til strengen.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-14, kendetegnet ved, at primerne indeholder fra ca. 15 til 25 nukleotider eller mere.

16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 25 1-15, kendetegnet ved, at mindst én af primerne indeholder en ikke-komplementær nukleotidsekvens, som er bundet til 5'-enden.

17. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 30 1-15, DK 171161 B1 kendetegnet ved, at mindst én af primerne er sammenflettet med ikke-komplementære baser eller en ikke-komplementær nukleotidsekvens.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 16 eller 17, 5 kendetegnet ved, at den ikke-komplementære nukleotidsekvens er en promotor, en linker eller en kodende sekvens .

19. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-15, 10 kendetegnet ved, at hver benyttet primer indeholder et restriktionsted, som er det samme eller er forskellig fra et restriktionssted på en anden primer.

20. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-19, 15 kendetegnet ved, at påvisningen af den eller de multiplicerede sekvenser (hvis den eller de forekommer) udføres ved (d) at der til produktet i trin (c) for hver sekvens, der skal påvises, sættes en mærket oligonukleotid- 20 probe, som er i stand til at hybridisere til sekven sen, og (e) at det afgøres, om denne hybridisering har fundet sted.

21. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 25 1-20, kendetegnet ved, at sekvensen, der skal multipliceres og påvises, er associeret med en genetisk, cancerøs eller infektiøs sygdom.