JPH03180179A - 人工ジスルフィド結合を持つ大腸菌リボヌクレアーゼｈ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、還元型変異大腸菌リボヌクレアーゼＨ１該変
異酵素をコードしている遺伝子、該遺伝子を含有し、大
腸菌内で発現可能な発現ベクター該発現ベクターを含有
している形質転換体および該形質転換体を用いて還元型
変異大腸菌リボヌクレアーゼＨを製造する方法、及び還
元型変異大腸菌リボヌクレアーゼＨをグルタチオンレド
ックスバッファーで処理し分子内にＳ−８結合を導入す
ることにより得られる酸化型変異大腸菌リボヌクレアー
ゼＨに関するものである。

大腸菌のリボヌクレアーゼＨ（以下、本明細書では単に
リボヌクレアーゼＨ１またはＲＮａｓｅＨと称する）は
１５５アミノ酸からなる分子量約１７Ｋｄの加水分解酵
素であって、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖の
みを特異的にエンド作用で切断するという基質特異性を
有する。この酵素は、その基質特異性に基づき、下記の
如き様々な用途を有し、極めて利用価値の高い酵素とし
て注目されている。

１）ｃＤＮＡのクローニングの際の鋳型ｍＲＮＡの除去
。

２）ｍＲＮＡのポリＡ領域の除去。

３）ＲＮＡの断片化。

リボヌクレアーゼＨの重要性は遺伝子工学の発展に伴っ
てますます増大すると思われるが、この酵素は、大腸菌
内での産生量が極めて低いことから、組換えＤＮＡ技術
による該酵素の生産が試みられており、既にＢＲＬ、フ
ァルマシアおよび宝酒造等から、組換えＤＮＡ技術によ
り生産されたリボヌクレアーゼＨが供給されている。こ
れらの市販の組換えリボヌクレアーゼＨは、大腸菌を宿
主として生産されるものである。

一般にＲＮＡの構造解析をおこなう時、塩基特異性のあ
るヌクレアーゼで部分消化してＲＮＡの断片を得るが、
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡだけをエンド作用
で切るという特異性を有するＲ　Ｎ　ａｓｅＨにとって
も、反応条件をコントロールできれば、そのようなＲＮ
Ａの断片化が可能となる。ただし、望ましい切断を得る
ためには酵素作用の活性化および不活性化を調節するこ
とが必要となる。なぜなら、反応物を分析している間に
反応が進んでは困るからである。Ｄ　Ｎ　Ａ／ＲＮ　Ａ
ハイブリッドの切断を部分消化でとめるには、現在ＥＤ
ＴＡの添加または加熱処理などがおこなわれている。し
かし、加熱法ではＤ　Ｎ　Ａ／ＲＮ　Ａハイブリッドが
ほどけてしまい、もう−度酵素を添加してそれを切るこ
とが困難となる。又ＥＤＴＡで停止した場合、本酵素は
活性発現にＭ１＋を要求するため、再活性化のために、
加えるＭｇ！＋濃度のコントロールが困難になる。従っ
て、ＥＤＴＡ添加または加熱法にかわる反応停止系の開
発が望まれている。さらに、この反応停止系が可逆的で
あるならば本酵素を再添加することなしに、その環境を
変化させただけで酵素活性の発現および停止を調節でき
るという点で上記部分消化によるＲＮＡの断片化等に極
めて有用となると期待される。

上記の観点から、本発明者らは、ｌｙｓｏｚｙｍｅ（リ
ゾチーム）へのＳＳ結合導入による酵素活性の調節（マ
ツムラ及ヒマシユーズ、サイエンス、２４３．７９２−
７９４、［１９８９］）を参考に、ＲＮａｓｅＨに、Ｓ
−Ｓ結合を導入し、それによって酵素活性を調節するこ
とを目的に、該酵素の遺伝子に部位特異的突然変異を導
入して、アミノ酸置換を有する変異体を調製し、Ｓ−８
結合の導入を試みた。その結果、第４４番目のＡ　ｓｎ
（アスパラギン）がＣｙｓ（システィン）、第６３およ
び第１３３番目のＣｙｓ（システィン）が、Ａｌａ（ア
ラニン）で置換されたアミノ酸配列を有する変異ＲＮａ
ｓｅＨは、還元状態では活性を有し、酸化状態では第３
番目のＣｙｇと第４４番目のＣｙｓとの間にＳ−３架橋
が形成されて活性を失うことを見出し、本発明を完成す
るに至った。

即ち、本発明の目的の１つは、第４４番目のアスパラギ
ンがシスティンで、第６３および第１３３番目のシステ
ィンがアラニンで置換されたアミノ酸配列を有する還元
型変異りボヌクレアーゼＨを提供するものである。また
本発明は、リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子のＡ　ｓｎ”
をコードしているＡＡＣが部位特異的突然変異によって
ＣｙｓをコードしているＴＧＣに、ｃｙｓ”をコードし
ているＴＧＣがＡｌａをコードしているＧＣＣに、更に
Ｃ７５１３３をコードしているＴＧＴがＡｌａをコード
しているＯＣＴに変換されている、還元型変異りボヌク
レアーゼＨ遺伝子を提供するものである。

更に本発明は、還元型変異りボヌクレアーゼＨを大腸菌
で発現させるための発現ベクターであって、ｔａｃプロ
モーターの支配下に上記変異りボヌクレアーゼＨ遺伝子
を含有しているベクターを提供するものである。本発明
の発現ベクターは、プラスミドｐＵｃ１Ｂ由来の複製起
源を含有しているので、大腸菌内で複製可能である。

また本発明は、上記の発現ベクターで形質転換された、
変異りボヌクレアーゼＨ産生性の形質転換体を提供する
ものである。更に本発明は、該形質転換体を培養するこ
とによって、還元型変異りボヌクレアーゼＨを製造する
方法を提供するものである。

本発明は、また、還元型変異りボヌクレアーゼＨを適当
な方法、例えばグルタチオンレドックスバッファーを用
いて酸化することにより、分子内にＳ−８結合を導入す
ることを特徴とする酸化型変異りボヌクレアーゼＨの製
造方法およびかかる方法により製造される酸化型変異り
ボヌクレアーゼＨを提供するものである。

以上述べたように、本発明はりボヌクレアーゼＩ４をｉ
ｎ　　ｖｉｔｒｏで酸化すると、Ｃｙｓ”−Ｃｙｓ’番
にＳＳ架橋が導入されて酵素は失活し、還元するとＳＳ
架橋がはずれて酵素活性がもどるということを利用し、
本酵素の酵素活性をコントロールする手段を提供するも
のである。これにより、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの
ＲＮＡの理想的な断片化を行なうことが可能である。即
ち、本発明の変異りボヌクレアーゼＨは、酸化、還元の
状態を変化させただけで酵素作用の活性化および非活性
化の調節が可能であり、従って部分消化によるＲＮＡの
断片化等にきわめて有用である。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１　　ｒｎｈ遺伝子のＭ１３ｍｐ１９ＲＦ　ＤＮ
Ａへのサブクローニング ｒｎｈ遺伝子源としてｐｓ　Ｋ　７５０を用いた。プラ
スミドｐｓＫ７５０（１０μｇ）を１００μＱの反応溶
液中、５０ユニツトずつのＰｓｔｌとＥｃｏＲＩにより
、３７°Ｃで１時間消化した。次いで消化物を１．５％
アガロースゲル電気泳動にかけた。ｒｎｈ遺伝子を含む
８２０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片をエレクト
ロエリューション（電気溶出）によりアガロースゲルか
ら抽出した後、ＤＥ−５２カラムクロマトグラフイーに
より精製した。エタ／−ル沈澱により回収された８２０
ｂｐ　ＥｃｏＲ１−Ｐｓｔｌ断片の量は約１μ９であっ
た。一方、プラスミドベク９−ｐＵＣ１９（ＴＯＹＯＢ
Ｏ製）（２μｇ）を５゜μＱの反応溶液中１０ユニツト
ずつのＰｓｔｌとＥｃｏＲＩにより、３７℃で１時間完
全に消化した。

消化物を０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、２．
７ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ断片を８２０ｂｐ断片と
同様に溶出、精製した。回収率はほぼ１００％であった
。

以上のようにして得られた８２０ｂｐ及び２．７ｋｂ　
ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片それぞれ０．１μｙを混
合し、２０μＱの反応溶液中、５ユニツトの７４ＤＮＡ
リガーゼ（ＴＯＹＯＢＯ製）と共に１６℃で３０分間反
応させ、プラスミドの環化を行なった。

次いで環化したプラスミドで大腸菌ＪＭＩ　０９を形質
転換し、形質転換体よりプラスミドｐＳ　Ｋ　８２０を
得た。

次イテ、コノプラスミドｐｓＫ８２０（１０μ９）を１
００μＱ反応溶液中、ｌＯＯユニットのＨｇｉＡＩによ
り３７°Ｃで１時間消化した。フェノール−クロロホル
ム抽出後エタ／−ル沈澱によりＤＮＡを回収した後、２
０μＱの反応溶液中、２．５ユニツトの７４　　ＤＮＡ
ポリメラーゼを加え、３７℃で１５分間反応させた。６
５℃で５分間処理することにより反応を停止した後、反
応溶液を１゜５％アガロースゲル電気泳動にかけ、ｒｎ
ｈ遺伝子を含む８０１ｂｐＨｇｉΔＩ断片を、８２０ｂ
ｐＥｃ。

Ｒ１−Ｐｓｔｌ断片の場合と同様に溶出、精製した。

ＤＮＡの回収量は２μ２であった。一方プラスミドベク
９−ｐＵＣ１８（ＴＯＹＯＢＯ製）（２μｙ）を５０μ
ｇの反応溶液中、ＩＯｌユニットＳｍａｌにより３７°
Ｃで１時間完全に消化し、次いでｌユニットの大腸菌ア
ルカリ性フォスファターゼを加え、更に３０分間３７℃
で反応させた。フェノール−クロロホルム抽出法により
反応を停止した後、ＤＮＡをエタノール沈澱により回収
した。回収率はほぼ１００％であった。

以上のようにして得られた８０１ｂｐ　Ｈｇ１Ａ　１断
片と、Ｓ　ｍａ　Ｉで消化した後、大腸菌アルカリ性フ
ォスファターゼで処理したｐＵｃ１８．それぞれ０．１
μ２を混合し、２０μＱの反応溶液中、５ユニツトのＴ
４　　ＤＮＡリガーゼと共に１６°Ｃで３００分間反応
せ、プラスミドの環化を行なった。

次いで環化したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換し、形質転換体よりプラスミドｐＫＳ８０１を得た。

次いで、このプラスミドｐＫｓ８０１（１０μｇ）を１
００μｇの反応溶液中、５０ユニツトのＥｃ。

ＲＩと５０ユニツトのＰｓｔＩにより３７℃で１時間、
完全消化し、消化物を１．５％アガロースゲル電気泳動
にかけた。ｒｎｈ遺伝子を含む６ｏｏｂｐＥｃｏＲＩ　
−Ｐｓｔ　Ｉ断片を、８２０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓ
ｔＩ断片の場合と同様に溶出、精製した。ＤＮＡの回収
量は約ｌμ９であった。一方、Ｍ１３ｎ＋ｐ１９ＲＦＤ
ＮＡ（タカラ酒造製）２μ２を、２０μＱの反応溶液中
、１０ユニツトのＥｃｏＲＩと１０ユニツトのＰ＋ｓｔ
ｌにより３７℃で１時間、完全に消化した。消化物を０
．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、７．２ｋｂ　Ｅ
ｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を８２Ｏｂｐ　ＥｃｏＲＩ
　−Ｐｓｔ　Ｉ断片と同様に溶出、精製した。ＤＮＡの
回収量は約１．５μ９であった。以上のようにして得ら
れた６００ｂｐ及び７．２ｋｂＥｃｏＲＩ　　Ｐｓｔｌ
断片それぞれ０．１　ｔｔ９を混合し、２０μｇの反応
溶液中、５ユニツトの７４　ＤＮＡリガーゼ（ＴＯＹＯ
ＢＯ製）と共に、１６℃で３００分間反応せ、ＲＦ　　
ＤＮＡの環化を行なった。

次いで、環化したＲＦ　　ＤＮＡで大腸菌ＴＧ−１を形
質転換し、形質転換体より、Ｍ１３＋＋＋ｐ１９ＲＦ　
ＤＮＡにｒｎｈ遺伝子が挿入されたＭ１３ｍｐ１９（ｒ
ｎｈ）ＲＦ　　Ｄ　Ｎ　Ａを得た（第１図参照）。

実施例２ｐＳＳ１３の構築 ＲＮａｓｅＨは１３．６３、および１３３３３番目つの
遊離（ｆｒｅｅ）のｃｙｓを持つが、目的の位置のＳ−
８結合の架橋を他のＣｙｓが妨害しないように、まずす
べてのＣｙｓをＡｌａに変換し、その後、目的の位置の
アミノ酸をＣｙｓに変換した。方法としては、Ｍｌ　３
ｍｐｌ　９（ｒｎｈ）ＲＦ　ＤＮＡを、点突然変異によ
って、３つのＣｙｓをＡｌａに変換したＭ１３ｍｐｌ　
９（ｒｎｈ　−１３，６３，Ｌ　３３Ａ）を作製し、こ
のＲＦ　ＤＮＡを用いて、１３番目のＡｌａをＣｙｓ。

４４番目のＡｓｎをＣｙｓに変換した。こうして得られ
たＭｌ　３ａ＋ｐｌ　９（ｒｎｈ−４４Ｃ，６３，１３
３Ａ）から変異ＲＮａｓｅＨ遺伝子を含むＤＮＡフラグ
メントを切り出し、発現用プラスミドｐＤＲ６００（全
容ら、特開平１−２０２２８４）に組み込み、変異型Ｒ
Ｎ　ａｓｅＨの発現プラスミドｐｓｓ１３を得た。実際
には実施例１で得たＭ　ｌ　３　ｍｐ　１９　（ｒｎｈ
）ＲＦ　　ＤＮＡで形質転換した大腸菌ＴＧ−１の培養
上清からの一本鎖ＤＮＡの調製、オリゴヌクレオチドの
リン酸化およびｒｎｈ遺伝子への点突然変異の導入は、
いずれも、アマ−ジャムから市販されているキット（オ
リゴヌクレオチド　ブイレフテッド　インビトロ　ミュ
ータゲネシス　システム）を用い、添付の説明書に正確
に従って行なわれた。各プライマーは第２図に示した。

ブライマーＮｏ、４を用いて第６３番目のＣｙｓのコド
ンＴＧＣをＡｌａのＧＣＣに改変して調製した変異型リ
ボヌクレアーゼＨ遺伝子を含有するＲＦ　　ＤＮＡＭｌ
　３ｍｐｌ　９（ｒｎｈ−６３Ａ）を作成した。次に、
このＭｌ　３ａｐｌ　９（ｒｎｈ−６３Ａ）とプライ７
−Ｎｏ。

１および５を用いて、第１３番目のＣｙｓのコドンＴＧ
ＴをＡｌａのＧＣＣに、又１３３番のＣｙｓのコドンＴ
ＧＴをＡｌａのＧＣＴに改変して調製した変異型ＲＮａ
ｓｅＨ遺伝子を含有するＲＦ　　ＤＮＡ、Ｍ１３ｍｐ１
９（ｒｎｈ−１３，６３，１３３Ａ）を得た。

このようにして、Ｃｙｓ不含のＲＦ　　ＤＮＡを作成し
たのち、目的の１３および４４位にＣｙｓを導入するた
めにブライマーＮｏ、２および３を使用し、１３番目の
ＡｌａのコドンＧＣＣをＣｙｓのＴＧＴに、４４番目の
ＡＳＮのコドンＡＡＣをＣｙｓのＴＧＣに改変して調製
した変異ＲＮａｓｅＨ遺伝子を含有するＲＦＤＮＡ　Ｍ
１３ｍｐ１９（ｒｎｈ−４４Ｃ，６３゜１３３Ａ）を作
成した。このようにして得られたＭ１３ｎ＋ｐ１９（ｒ
ｎｈ−４４Ｃ，６３，１３３Ａ）とｐＤＲ６００を、そ
れぞれＸｂａＩおよび５ｓｔＩＩで、３７℃、約１時間
消化した。Ｍ　１３ａｐｌ　９（ｒｎｈ　−４４Ｃ，６
３，１３３Ａ）の消化物を１．５％アガロースゲル電気
泳動にかけて、５００ｂｐのＸｂａｌ−ＳｓｔＩＩフラ
グメントを切り出し抽出した。またＰＤＲ６００も同様
に、消化物を０．７％アガロースゲル電気泳動にかけて
、３．１ｋｂのＸｂａＩ−３ｓｔｎフラグメントを切り
出し抽出した。このようにして得られた５００ｂｐ　Ｘ
ｂａｌ−８ｓｔＩＩフラグメント０．０２５　μ９と、
３．　ｌｋｂ　Ｘｂａｌ　−５ｓｔＩＩフラグメント０
．０５μ９を混合し、ＤＮＡライゲーション・キット（
宝酒造）を用いて、添付の説明書に正確に従って、プラ
スミドを環化した。この環化したプラスミドで大腸菌Ｊ
ＭＩ　０９を形質転換し、形質転換体よりプラスミドｐ
ｓｓ１３を得た（第３図参照）。

上記のようにして得られた形質転換菌ニジエリシア・コ
リ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１０９／ｐＳ　Ｓ　１３は
、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（
微工研菌寄第１１１４０号、受託日：平成元年１２月５
日）。

実施例３　　ＲＮａｓｅＨ（Ｓ　Ｓ　１３）の大腸菌に
おける生産と精製 １、形質転換体ＪＭ１０９／ｐＳＳ、１３の培養形質転
換体ＪＭ１０９／ｐｓｓ１３を、８０μ９のアンピシリ
ンを含むＬＢ培地ｌｅ中、３７℃で振盪培養した。培養
液の濁度がクレット値で１００前後まで生育した時点で
、Ｉ　ＰＴＧを、最終濃度１１１１Ｍとなるように添加
し、更に４時間振盪を続けた後、集菌した。この時のク
レット値は約２００、菌体の湿重量は約１．５９であっ
た。

２、菌体からのりボヌクレアーゼＨ（Ｓ８１３）の抽出
、精製 得られた菌体を０．１ｍＭＥＤＴＡを含む１０５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ＴＥＸｐＨ７，５）３０村に懇濁した後
、水中で超音波処理により菌体を破砕した。ｌ　５．　
ＯＯＯｒｐｍで３０分間、４°Ｃで遠心して得た遠心上
清（粗抽出液）を、ＴＥ（ｐＨ７，５）５１２に対して
４℃で透析した。同緩衝液で平衡化したＤＥ−５２カラ
ム（４１１１２）およびＰ−１１カラム（２１のにこの
順序で通した。この条件下、変異型リボヌクレアーゼＨ
（ＳＳ１３）は、ＤＥ−５２カラムを素通りし、Ｐ−１
１カラムに吸着する。ＴＥ（ｐＨ７，５）４ｘ（７、次
いでＯ，ＬＭ　ＮａＣｌ２を含むＴ　Ｅ（ｐＨ７，５）
４１１１２を流した後、ＮａＣＱ濃度を０．５Ｍまで直
線的に上昇させることによりＰ−１１カラムから変異型
リボヌクレアーゼＨ（ＳＳ１３）を溶出させた。変異型
リボヌクレアーゼＨ（ＳＳ１３）を含むＰ−１１溶出画
分を約２ｙｔＱに濃縮した後、さらに０．１Ｍ　ＮａＣ
ｌ２を含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５
）で平衡化したセファクリルＳ−３００（スーパーファ
イン）カラム（φ１．８ｘ９０ｃｍ）にかけることによ
り、変異型リボヌクレアーゼＨ（ＳＳ１３）を精製した
。精製標品は１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与
え、逆相ＨＰＬＣでも単一ピークを示した。精製収量は
８１９／（ｌ培養液であった。これは菌体粗抽出画分に
存在するタンパク質量の約８０％に相当する。精製標品
の同定は、アクロモバクタ−プロテアーゼ■により消化
して得られるペプチドフラグメントを逆相ＰＬＣでマツ
ピングして各フラグメントピークの溶出位置を確認する
とともに、１３．４４位のアミノ酸を含むペプチドを分
取後アミノ酸配列分析により行った。

得られた精製標品のＯ，ＩＭ　ＮａＣｌ２を含むｌ○ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）中における２０
０〜２６０ｎｍでのＣＤスペクトルは天然型と同一であ
り、ＣＤスペクトルで検出できるような２次構造の変化
は見られなかった。

実施例４　　ＳＳ結合の導入 実施例３で得た精製標品は、そのままの状態ではジスル
フィド結合を持たなかったので、グルタチオンレドック
スバッファー（ＥＲＩＮＫ、Ｐｅｔｅｒｓ、Ｋｉｍ、、
　サイエンス、２４３，５３８−５４１（１９８９））
により、ジスルフィド結合を導入した。レドックスバッ
ファーは１ｍＭ酸化型グルタチオン、１ｍＭ還元型グル
タチオン、０．ＩＭＴ　ｒｉｓ（ｐＨ９、０）、ｌｎ＋
Ｍ　ＥＤＴＡ、０．２Ｍ　ＫＣＱを含み、ここにＲＮａ
ｓｅＨ（Ｓ　Ｓ　１３）を３４μＭ添加し、３０℃で４
〜５時間放置する。その後ＰＤ−１０で脱塩し、バッフ
ァーをＯ，１ＭのＮａＣＱを含む１０ｍＭＡＢ（ｐＨ５
，５）に交換した。このような処理を行った酵素につい
て、前述と同様にペブタイドマッピングを行ったところ
、Ｃｙｓ１３およびＣｙｓ４番を含むピークが消失し、
かわって新しいピークが検出された。このピークを分取
し、アミノ酸配列分析を行ったところＣｙｓ”およびＣ
ｙｓ“を含むそれぞれのフラグメントが１対ｌで得られ
た。またこの消化物にＤＴＴを添加するとＣｙ　ｓ　ｌ
　３およびＣｙｓ４４を含むそれぞれのピークが再び出
現した。このようにしてＲＮａ５ｅＨ（Ｓ　Ｓ　１３）
にＳＳ結合が導入されたことを確認した。以後、精製後
のＳＳ架橋がかかっていない酵素を還元型５８１３、レ
ドックスバッファー処理によりＳＳ架橋が導入された酵
素を酸化型５Ｓ１３と命名し実験を行った。実施例４で
示した還元型および酸化型５８１３について、酵素活性
を以下の実験例の如くにして行い評価した。

１［ｆ＋　　還元型および酸化型５Ｓ１３の酵素活性の
比較 活性は、［’Ｈ］−Ｍ１３ＤＮＡ−ＲＮＡを基質として
用い、３７℃、１５分間に１　ｎｍｏｌのＣＭＰを遊離
する酵素活性を１ユニツト（Ｕ）と定義した。

タンパク量は変異型リボヌクレアーゼＨと天然型リボヌ
クレアーゼＨとが同じ吸光係数を持つといおける吸光度
を測定することにより求めた。また、第１表で示すよう
に、酵素活性の測定用溶液中のＤＴＴの濃度を変えて各
溶液で測定を行った。

このように、還元型５Ｓ１３ではＤＴＴの濃度をかえて
もコンスタントに天然型ＲＮａｓｅＨに対して３０〜５
０％の活性を有している。これに対して、酸化型５Ｓ１
３はＤＴＴ非存在下では、天然型に対して０．３％でほ
とんど失活しており、ＤＴＴの濃度を上げていくと、１
０ｍＭＤＴＴで０．７％、１００＋＋Ｍでは３０％活性
がもどる。これは還元型の５５％に達している。ＤＴＴ
を希釈段階で、添加しておくと、還元型の約７６％の活
性が回復する。このように５３１３は、酸化型で不活性
化、還元型で活性化されることが明らかになった。つま
り、本酵素は酸化・還元状態を調節するだけで酵素活性
の発現および停止を調節することができる。

第１表 活性は、［’Ｈ］−Ｍ１３ＤＮＡ−ＲＮＡを基質として
用いて測定した。比活性は、酵素量（ユニット）をタン
パク量（１９）で割ったもので、タンパク量は０９１％
水溶液の２８０ｎｍにおける紫外吸収が２．０として計
算した。

【図面の簡単な説明】

第１図はｒｎｈ遺伝子のＭｌ　３ｍｐＲＦ　　ＤＮＡへ
のサブクローニングの概略を示す模式図である。第２図
は、部位変異導入に用いたオリゴヌクレオチドの配列を
示す模式図である。第３図はプラスミドｐＳＳ１３の組
立て模式図である。 １↑

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌リボヌクレアーゼＨのアミノ酸配列において
   、第４４番目のアスパラギンがシステインで、第６３番
   目および第１３３番目のシステインがアラニンで置換さ
   れたアミノ酸配列を有する還元型変異大腸菌リボヌクレ
   アーゼＨ。 ２、請求項１に記載の還元型変異大腸菌リボヌクレアー
   ゼＨをコードしている変異大腸菌リボヌクレアーゼＨ構
   造遺伝子。 ３、大腸菌リボヌクレアーゼＨをコードしている構造遺
   伝子において、対応するアミノ酸配列の第４４番目のア
   スパラギンをコードするＡＡＣコドンがシステインをコ
   ードするＴＧＣコドンに、第６３番目のシステインをコ
   ードするＴＧＣコドンが、アラニンをコードするＧＣＣ
   コドンに、第１３３番目のシステインをコードするＴＧ
   ＴコドンがアラニンをコードするＧＣＴコドンに部位特
   異的突然変異によって変換された請求項２に記載の変異
   大腸菌リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子。 ４、ｔａｃプロモーターの支配下に請求項２または３に
   記載の変異大腸菌リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子を含有
   している、大腸菌内で複製および発現可能な発現ベクタ
   ー。 ５、選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を含有
   している請求項４に記載の発現ベクター。 ６、プラスミドｐＳＳ１３である請求項５に記載の発現
   ベクター。 ７、請求項４〜６のいずれかに記載の発現ベクターで形
   質転換された形質転換体。 ８、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＳＳ１３である請求項７に記
   載の形質転換体。 ９、請求項７または８に記載の形質転換体をリボヌクレ
   アーゼＨ遺伝子の発現に適した条件下で培養し、得られ
   た培養液から還元型変異大腸菌リボヌクレアーゼＨを回
   収することからなる還元型変異大腸菌リボヌクレアーゼ
   Ｈの製造方法。 １０、大腸菌リボヌクレアーゼＨのアミノ酸配列におい
   て、第４４番目のアスパラギンがシステインで、第６３
   番目および第１３３番目のシステインがアラニンで置換
   されたアミノ酸配列を有する酸化型変異大腸菌リボヌク
   レアーゼＨ。 １１、請求項１に記載の還元型変異大腸菌リボヌクレア
   ーゼＨをグルタチオンレドックスバッファーで処理する
   ことからなる請求項１０に記載の酸化型変異大腸菌リボ
   ヌクレアーゼＨの製造法。