JPH03181334A

JPH03181334A - 核酸合成用担体の製法

Info

Publication number: JPH03181334A
Application number: JP1321658A
Authority: JP
Inventors: Minoru Fujisaki; 稔藤崎
Original assignee: FUJI DEBUISON KAGAKU KK; Fuji-Davison Chemical Ltd
Current assignee: FUJI DEBUISON KAGAKU KK; Fuji-Davison Chemical Ltd
Priority date: 1989-12-12
Filing date: 1989-12-12
Publication date: 1991-08-07
Anticipated expiration: 2014-10-06
Also published as: JP2958338B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は核酸合成用担体の製法に関するものであり、詳
しくは、核酸の合成効率の高く、合成核酸への不純物混
入量の少ない多孔質体よりなる核酸合成用担体の製法に
関するものである。

（先行技術）固体の粉末などの担体の上で繰り返し反応を起こさせて
高分子量の重合体を得る、今日、固相合成法と呼ばれる
ものは、ペプチドを合成する目的でメリフィールド（Ｍ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　、　１９６２　）により提案され
広く行われるようになった。この目的で当初用いられた
固相担体はポリスチレンとジビニルベンゼンの共重合体
にアミノ基を導入したものであったが、これが核酸の合
成に応用されるにあたって、シリカゲルや多孔質ガラス
の破砕型粉末が用いられるようになっており、今日では
細孔径が５００Ａぐらいの多孔質ガラスの表面にシラン
カップリング剤などを用いてアルキルアミノ基を結合さ
せたものを用いるのが一般的な方法となっている。しか
しながら、今日、通常の方法で製造された担体を使用す
ると、ヌクレオチドが５個あるいは１５個結合した段階
（５７−ないし１５マー〉において、合成効率が急速に
低下し、これにより重合度の高い核酸を得ようとすると
、多量の副生成物が混入する結果になりがちである。

これは、一般に、担体表面において、このような長さの
核酸分子の末端にある反応点が担体表面の化学構造また
は隣接する成長中の核酸分子と接触して、好ましくない
副反応を起こしているのではないか、と考えられている
。このことを避けようとして、より長いアルキル基など
を介してアミノ基を結合させる方法が実施されているが
、これによっては、上記の欠点は殆ど改善されていない
。

これは、使用している担体表面の化学構造というものを
十分に理解していないこと、および、反応容器内での粉
状の担体の挙動に十分な注意が払われていないことによ
る結果であった。

（発明が解決しようとする問題点〉本発明は上記実情に鑑み、核酸合成効率が高く、しかも
、反応中に担体の飛散、付着がなく均一反応を行なうこ
とのできる核酸合成用担体を提供しようとするものであ
る。

（発明を解決するための手段）本発明の目的は、あらかじめ球状に成形された高純゛度
シリカゲル又は多孔質ガラスを用い、しかも、特定の細
孔径と直径をもつ粒状物を十分なる脱水を施した後に、
特定のアミノ基密度となるような条件下で、アルキルア
ミノ基をもつシランカップリング剤と反応させることに
より達成される。

すなわち、本発明の要旨は、二酸化ケイ素９５％以上、
酸化ホウ素５％以下、酸化アルミニウム５％以下、その
他元素５％以下の組成を有し、細孔径９００〜２００Ｏ
Ａで、しかも、直径３０〜２００μの球状に成型された
シリカゲル、又は、スピノーダル分解の原理を利用して
、分相処理とこれに引き続く酸による溶出処理により多
孔化して得た球状の多孔質ガラスを、有機溶媒中又は気
流中において十分に脱水した後、これをフルキルアミノ
基をもつシランカップリング剤と反応させることにより
、アルキルアミノ基を０．３〜２゜５μモル／Ｔｄの割
合でアルコキシシラン基を介して表面の孤立型シラノー
ル基に結合させることを特徴とする核酸合成用担体の製
法に存する。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で対象となるシリカゲル又は多孔質ガラスの組成
としては、二酸化ケイ素９５％以上の高純度のものであ
り、酸化ホウ素５％以下、酸化アルミニウム５％以下、
その他元素５％以下のものである。酸化アルミニウムは
核酸合成用担体として好ましくない影響を与える。従っ
て、本発明では、高純度シリカゲル、又は、高純度のホ
ウケイ酸ガラスを基礎ガラスとして製造されたアルミニ
ウムなどの不純元素を含まない多孔質ガラスあるいはア
ルミニウムを含む多孔質ガラスを酸又はアルカリにより
抽出処理し表面にあるアルミニウムの殆どを除去した多
孔質ガラスが用いられる。なお、本発明における多孔質
ガラスの調製法としては、所謂、スピノーダル分解の原
理を利用して分相処理とこれに引き続く酸による抽出処
理により多孔化する方法が対象となる。

上述のシリカゲル又は多孔質ガラスは、その製造過程で
直径３０〜２００μ、好ましくは５０〜１００μの球状
物に成型したものが用いられる。

核酸の自動合成が小型の反応容器で行われ、且つフィル
ターによる濾過の過程が必要であることから球状物の径
があまり大きくても小さくても、核酸合成用担体として
反応に用いた場合に不都合を生じるが、前記範囲のとき
には均一な反応を行なうことができる。多孔質ガラスの
球状化は例えば、公知法により、基礎ガラスの段階で成
型する方法などを採用し得る。なお、成型後の基礎ガラ
スを熱処理により分相したものは球の内部は多孔質化し
ていても表面は緻密な殻状の表皮が被っていることもあ
るので、これを予め、フッ酸などの酸または苛性ソーダ
によって洗浄処理して取り除いておくことが望ましい。

また、シリカゲル又は多孔質ガラスの細孔径は５００〜
２００ＯＡ、好ましくは９００〜１８００Åであり、更
に、表面積は通常、１０〜１００ＴＩｔ／ｑのものが望
ましい。要するに、この範囲の場合に、特に核酸収率が
高く担体として効率的な働きができる上、担体としての
強度も良好で均一な反応を与えることができる。

次に、球状のシリカゲル又は多孔質ガラスの表面に、ア
ルキルアミノ基をもつシランカップリング剤を作用させ
るが、本発明では、これに先だってシリカゲル又は多孔
質ガラスを十分に脱水することを要件とするものである
。この脱水を実施することにより、最終的に核酸合成用
担体として良好な性質をもつ担体を得ることができる。

脱水方法は通常、■トルエンなどの有機溶媒を例えば、
水素化カルシウムや塩化カルシウムなどの脱水剤で含水
量１１００ｐｌ）以下に乾燥した後、これにシリカゲル
又は多孔質ガラスを浸漬し加熱還流処理する方法、又は
、■例えば、シリカゲル、五酸化リン、モレキュラーシ
ーブ、塩化カルシウムまたはこれらの組合せにより乾燥
した空気、窒素、又は酸素などの気流中にシリカゲル又
は多孔質ガラスを置き４００〜７００℃の温度で加熱乾
燥する方法などが挙げられる。そして、この脱水処理は
通常、シリカゲル又は多孔質ガラスの赤外線吸収スペク
トル（球状物を圧搾して薄板状として測定）の吸収が３
７５０ｃｉｉ−’にシャープなピークが得られるまで実
施するのが望ましい。すなわち、シリカゲル又は多孔質
ガラスの場合、シランカップリング剤との結合に必要な
表面化学構造は赤外線スペクトルにおいて３７５０ｃｔ
ｎ−’に吸収を与える孤立型シラノール基と呼ばれる水
酸基のみであり、その他の水！！！基あるいは付着水分
は反応に好ましくない影響を与える。通常のシリカゲル
又は多孔質ガラスの場合、例えば、２個以上の隣接した
水酸基及びこれに付着する水分があり、これらの存在は
赤外線スペクトルにおいて３７００ｃｔｎ”以下の幅広
い吸収を示す。また、シリカゲル又は多孔質ガラス中に
含有されるアルミニウムなどの不純元素の影響によって
も活性な水酸基とこれによる付着水を有する場合がある
。これらの水分の存在はシランカップリング剤との反応
に悪い影響を与え、最終的に核酸合成用担体として望ま
しいものを得ることが難しくなる。

次に、アルキルアミノング剤との反応は、通常、乾燥した有機溶媒例えば、ト
ルエン中などで実施することができる。シリカゲル又は
多孔質ガラスの脱水を有機溶媒中で実施した場合には、
脱水処理後の混合物にシランカップリング剤を加えて引
き続き実施することができる。この反応における反応温
度は、例えば、８０〜１２０℃、好ましくは１００〜１
１０℃であるが、通常、溶媒の沸点近くの温度、すなわ
ち、還流温度で実施するのが好ましい。また、反応時間
は、通常、６〜１２時間程度である。

アルキルアミノ基をもつシランカップリング剤としては
、通常、アミノプロプルトリエトキシシラン、アミノプ
ロピルトリメトキシシラン、アミノエチルトリメトキシ
シランなどの０１〜４の低級アルキルアミノ酸で置換さ
れた低級アルコキシシランが挙げられる。また、本発明
においては、これと共にアルキルアミノ基のような反応
性質をもたないシランカップリング剤を併用して用いる
のが好ましい。このシランカップリング剤としては、例
えば、メチルトリメトキシシランなどの公知のものでよ
い。このシランカップリング剤の使用割合は、通常、ア
ルキルアミノ基をもつシランカップリング剤に対して、
１０〜７０モル％、好ましくは２０〜６０モル％である
。そして、本発明では、上記反応条件、及びシランカッ
プリング剤の使用割合などを調節し、後述する所定量の
アルキルアミノ基を導入し表面処理面のアミノ基密度（
アルキルアミノ基がアルコキシシラン基を介して孤立型
シラノール基に結合している割合〉−を制御するもので
ある。また、シランカップリング剤の使用量は導入すべ
きアミノ基量に応じて選定することができる。本発明に
おけるシリカゲル又は多孔質ガラスの表面アミノ基密度
は、０．３〜２、５μモル／ｍ２１好ましくは０．５〜
１．５μモル／尻であることが必要であり、この場合に
、核酸合成用担体として最も優れた効果が発揮される。

なお、表面のアミノ基密度の測定はビー・エフ・ギズイ
ンが１９７２年にアミノ化ポリスチレンついてアナリテ
イカル　シミ力　アクタ誌上（Ｂ．Ｆ．Ｇｉｓｉｎ，Ａ
ｎａｌ　ｉｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａ　　Ａｃｔａ．５８
巻、２４８−２４９頁、１９７２年）に報告した方法で
同様に測定することができる。すなわち、約３０■の多
孔体試料にジクロロメタン中に溶かしたピクリン酸を吸
着させたのち、ジイソプロピルエチルアミンで置換、脱
着せしめ、脱離したピクリン酸の量を波長３５８ｎｍの
紫外光の吸収強度によって定量する。なお、ここで最適
と認められた表面アミノ基密度の上限である１〜２μモ
ル／尻はガラス表面がすべてシラノール基でおおわれて
いるとした場合のその密度に相当するもので、本発明に
おけるアミノ基密度の最適値はガラス表面をすべて規則
正しく反応させてアルキルアミノ化した値を基準とし、
それよりやや小さいものと考えることが出来る。

上述の反応により得られた本発明の核酸合成用担体は常
法によって、分離、洗浄、乾燥し回収することができる
。

この発明の担体を用いて核酸合成を行なう場合には、通
常、ホスホアミダイト法（あるいはホスホアミダイト法
、以下同じ〉、または、ホスフッイト法と呼ばれている
ところの、各種デオキシリボヌクレオシド−３’　−０
（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエチル
ホスホアミダイト（シアノエチル−ホスホアミダイト〉
またはデオキシリボヌクレオシド−３’　−０（Ｎ、Ｎ
−ジイソプロピルアミノ〉メチルホスホアミダイトを用
いる方法により実施することができる。これらの方法は
日本生化学会編、続生化学実験講座１、遺伝子研究法王
、核酸の化学と分析技術、第１章ＤＮＡの化学合成、１
〜３３頁、東京化学同人（１９８６）、またはＭ、Ｊ、
ゲイト編オリゴニュクレオチドシンセシス、第３章（Ｅ
ｄｉｔｅｄ　ｂｙＭ、　Ｊ、　Ｇａ１ｔ、”　Ｑｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｄｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａＥ）
ｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ”、　Ｃｈａｐｔ
ｅｒ　　３．５ｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ　　３ｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌ
ｅｏｔ−ｉｄｅｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　　Ｐｈｏｓｐｈｉｔ
ｅｔｒｉｅｓｔｅｒ　　Ｍｅｔｈｏｄ　。

ｂｙ　Ｔ、　Ａｔｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｓｍ１
ｔｈ、　　Ｉ　ＲＬＰｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　１
９８４　、　）に記載されている方法に準じて行うこと
ができる。ただし、この発明の原理とするところは、リ
ン酸トリエステル法など他の核酸合成法において使用さ
れる担体にも当然適用することが可能である。

（発明の効果）本発明の核酸合成用担体によれば、核酸の合成効率が非
常に良好である。これは、原料となるシリカゲル又は多
孔質ガラスとして特定の細孔径及び直径を有するものを
選定し、また、十分なる乾燥を施した後、アルキルアミ
ノ基をもつシランカップリング剤とアミノ基のないシラ
ンカップリング剤を配合して反応させ核酸合成を行わせ
るのに最も適当な表面アミノ基密度を持った担体として
いるためである。すなわち、その結果、担体物性に優れ
、しかも、副反応が少なく、特定量のアミノ基密度を有
する担体が効果的に製造されるからである。

（実施例〉次に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例の記述
に限定されるものではない。

実施例１（シリカゲルを用いた核酸合成用担体の製造〉
ケイ酸アルカリ溶液と鉱酸を原料とする製法により得た
、細孔径１１９５入、平均直径１００μ、表面積２５．
４Ｔｄ／（ｊの球状シリカゲル（ＳｉＯｚ９５％以上、
その他元素５％以下）１ｑを、水素化カルシウム上で含
水量１０ｐｐｍ以下に乾燥したトルエン１００ｍ１中に
浸漬し、還流下、７時間、煮沸処理し球状シリカゲルの
脱水を行なった。この際の球状シリカゲルの赤外線吸収
スペクトルを測定したところ、３７５０ｍ−１にピーク
があり、３７００ｃａ−’以下のピークは殆んど認めら
れなかった。

次いで、上澄みのトルエンをとり除き、別の乾燥トルエ
ン３０−に７ミノプロビルトリエトキシシラン５ｄ及び
メチルトリエトキシシラン１５ｍを加えた混合液を添加
し、これを加熱して還流下、１２時間、反応を行なった
。

そして、反応後の球状シリカゲルを乾燥剤を経由してア
スピレータ−で減圧乾燥後、真空乾燥することにより、
本発明の核酸合成用担体を得た。

この担体のピクリン酸定量によるアミノ基量は５２．１
μモル／ｑであり、また、表面アミノ基密度は２．１μ
モル／Ｔｄであった。これに５′ジメトキシトリチルア
デノシンの３’　ｐ−ニトロフェンニルコハク酸エステ
ルを作用させ、アミノ化シリカゲルにアデノシンを結合
させた。ジメトキシトリチル基をトリクロル酢酸によっ
て脱離させその脱離量からアデノシンの結合量を求める
と１グラム当たり１８μモルであり、１平方メートル当
たり０．７μモルであった。

実施例２〈高純度ホウ珪酸ガラスを基礎ガラスとする多
孔質ガラスを用いた核酸合成用担体の製造）ホウ珪酸ガラスを熱気流中で表面張力により球状の液滴
とすることにより得たガラス粒子を熱処理して分相させ
、これを塩酸で溶出させて、緻密な殻状の表皮を有する
多孔体を得、次いで、これを１％フッ酸で洗浄すること
により、平均粒径１００μ、細孔径９６０Ａ、表面積３
９．６尻／ｇの多孔質ガラスを製造した。

これを熱した乾燥気流中で十分に脱水した後、この多孔
体に、乾燥トルエン（含水ｍ１ｏｏｐｐｍ以下）３０−
に、アミノプロピルトリエトキシシランを１０−、メチ
ルトリエトキシシランを１０ｒＩｉ１を含む混合液を注
ぎ、これを加熱して還流下、１２時間反応させた。次い
で、吸引濾過した後アスピレータ−で減圧乾燥し、更に
真空下で乾燥することにより、本発明の担体を得た。

この担体のピクリン酸定量によるアミン基量は３６．４
（μモル／ＣＩ）であり、表面アミノ基密度は０．９（
μモル／ホ）であった。

また、これと５′−ジメトキシトリチルアデノシンの３
’　ｐ−ニトロコハク酸エステルを作用させ、アミン基
をニュクレオシド化した後、ジメトキシトリチル基の脱
離量からヌクレオシドの担持量を求めると１グラム当た
り１４．８μモルであり１平方メートル当たり０．４μ
モルであった。

比較例１特公昭６２−２５６１８号の方法に準じて製造された球
状多孔質ガラス、すなわち、分相と酸による溶出処理を
して得られた下記組成を有し、細孔径１０９５Ａ、細孔
容積０．６３ｃｍ３　／（Ｉｌｌ、表面積２３ＴＩｔ／
ｇのアルミニウムを含むガラス１ｇを１Ｎ硫酸４０ｄに
浸漬し、還流下、１１０℃の温度で７時間、抽出処理を
行い、次いで、酸を傾斜し洗液が中性になるまで洗浄し
た後、１１０℃の温度で乾燥した。（この溶出処理で約
５％の重量減少が起った。）表１この多孔質ガラスをシリカゲルおよび五酸化りんの上を
通して乾燥した空気の気流の中で６００　’Ｃに加熱し
、６時間脱水処理を行なった。この際の多孔質ガラスの
赤外線吸収スペクトルを測定したところ、３７５０ｃｍ
”にピークが認められた。

この多孔体に、乾燥トルエン３０ｍにアミノプロピルト
リエトキシシランを３ｄ、メチルトリエトキシシランを
９ｄを含む混合液を注ぎ、これを加熱し、還流下、１２
時間反応させた後、吸引濾過し、アスピレータ−で減圧
乾燥し、更に油回転真空ポンプで真空乾燥することによ
り担体を得た。この担体のピクリン酸定量によるアミノ
基量は２７．７μモル／ｑであり、表面アミン基密度は
１．２μモル／ＴＩｉであった。また、この担体に結合
したヌクレオシド量は１グラム当たり４．０マイクロモ
ルであり、表面密度は１平方メートル当たり０．１７μ
モルであった。

比較例２細孔径９６０Ａ平均粒子径１００μの高純度ホウ珪酸ガ
ラスより製造した球状の多孔体１ｏに、３−７ミノプロ
ピルトリエトキシシラン１５ｄを精製トルエン３５−に
溶かした溶液を加え、還流下、１１０℃の温度で３０分
反応させたのち、水０．１ｄを加えその後、１１時間遠
流を続け、次いで、冷却、濾過、洗浄、乾燥することに
より担体を製造した。この担体のアミン基の定量を行な
ったところ、４１４．９μモル／ｇであり、この表面ア
ミノ基密度は１０．５μモル／Ｔｄであった。

５′水酸基をジメトキシトリチル基で保護したアデニン
ヌクレオシドを結合させた後、ジメトキシトリチル基の
脱離量でヌクレオシド担持量を測定すると、１グラム当
たり４７．９μモル、表面密度は１平方メートル当たり
１．２μモルであった。

く核酸の合成例〉合成例１日本ゼオン製造の自動ＤＮＡ合成装置ＧｅｎｅｔＡＩＩ
ｌを用い、５′ジメトキシトリチルβ−シアノエチルホ
スホールアミダイトをテトラゾールを縮合剤として、上
記実施例１で製造した本発明の担体であるアミン化シリ
カゲルに結合させ、ヨードを用いて酸化してホスホール
基をヌクレオチドとする通常の方法で１５マーのオリゴ
ヌクレオチドを合成した。このときに用いた塩基配列は
５゛ＧＧＣＴＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＡ３’であった。

シリカゲル上に結合したヌクレオシド量を１００として
各ステップ毎に回収されるジメトキシトリチル基の量を
図１に示す。１５７−の最終収率は７７％であった。

合成例２担体として、上記実施例２で製造した本発明の多孔質ガ
ラスよりなる担体を用いて合成例１と同様な塩基配列の
１５マーを合成したところ、１５マーの最終収率は８７
％であった。また、合成経過について図２に示す。

合成例３比較例１で得た、アルミニウムを含む組成の多孔質ガラ
スから熱酸によりアルくニウムを出来るだけ抽出したの
ち本発明の方法によって表面にアルキルアミノ基を結合
させた担体を用いて合成例１と同じ塩基配列の核酸を同
じようにして合成した結果、図３の合成経過であり、最
終収率は７６％とかなり良好な結果を得た。

合成例４比較例２で得たアミノアルキル基を過剰に結合させた担
体を用いて合成例１と同じ塩基配列の核酸を合成した結
果、図４に示すような合成経過であり、５７−付近まで
急速に収率が低下した。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は合成例１〜４における各々の核酸合成
の合成経過を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）二酸化ケイ素９５％以上、酸化ホウ素５％以下、
酸化アルミニウム５％以下、その他の元素５％以下の組
成を有し、細孔径９００〜２０００Åで、しかも、直径
３０〜２００μの球状に成型された、シリカゲル、又は
スピノーダル分解の原理を利用して、分相処理とこれに
引き続く酸による溶出処理により多孔化して得た多孔質
ガラスを、有機溶媒中又は乾燥気流中において十分に脱
水した後、これをアルキルアミノ基をもつシランカップ
リング剤と反応させることにより、アルキルアミノ基を
０．３〜２．５μモル／ｍ＾２の割合でアルコキシシラ
ン基を介して表面の孤立型シラノール基に結合させるこ
とを特徴とする核酸合成用担体の製法。