JPH03181500A - 低濃度尿素を用いたソマトトロピンの可溶化及び再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明必要旨 本発明は低濃度尿素溶液及びアルカリ性水溶液の組み合
わせを用いるソマトトロピンの可溶化及び再生する方法
に関する。本発明の方法を用いることによって高収量の
最終産物が得られる。

発明の背景 本発明はタンパク質の可溶化及び再生方法としてアルカ
リ性水溶液と組み合わせて尿素の低モル濃度水溶液を用
いる利用法に関する。より重要なことに、多くのタンパ
ク質及びポリペプチドの生産を可能とする近年の組み換
えＤＮＡ技術の到来とともに、精製工程でそれらのタン
パク質を効果的にそして効率的に可溶化する方法がこれ
らの生成物の経済的な大規模生産を提供する鍵となって
いる。

タンパク質の可溶化及び再生のための多くの方法が研究
なされている。例えば、米国特許第４５１１５０３には
、凝集した変性ソマトトロピンの顆粒として不溶性の屈
折体がそれらを生産している大腸菌の全体にわたるサイ
トブラズム中に見出されている。遺伝子工学的な目的で
大腸菌の細胞にそのような所望のタンパク質を過剰生産
させる結果、ソマトトロピンのような目的の特定タンパ
ク質を過剰生産し、そのような屈折体が形成される。所
望の生成物（タンパク質）及び大腸菌のタンパク質の両
方の不適当に折れたたまれた構造をとった分子の構造を
ほどき可溶化させるために強力な変性剤またはカオトロ
ピック試薬を用いて屈折体を処理することが唯一の手段
であることが多い。この変性操作に加えて、タンパク質
は生理活性を持つように正しい単量体型に「再生」され
なければならない。この単量体型はソマトトロピンでは
特に重要である。活性タンパク質生成物を得るために塩
酸グアニジンまたは尿素のような強力な変性剤を非常に
高い濃度で用いられることが多かった。

これらの強力な変性剤による方法に加えて、米国特許第
４６７７１９６に開示されたドデシルサルファイドナト
リウム（ＳＤＳ）のようなある種のカオトロピック試薬
または米国特許第４７３１４４０に開示された好ましく
は３から５Ｍのモル濃度で用いる尿素のような弱い変性
剤または米国特許出願第２８５４７７５．１９８８年１
２月１６日に開示されている尿素無添加の方法が用いら
れている。第１図では３種類すべての尿素による方法が
比較されている。

それぞれの方法にはある種の関連した問題がある。塩酸
グアニジンは高価でしかも再生工程で再生が進むにつれ
置換されるはずである。ＳＤＳは効果のある変性剤で塩
酸グアニジンより安価であるが、変性タンパク質に強固
に結合するためタンパク質から完全に除去することが困
難でその工程費用が増大する。尿素は通常弱い変性剤ま
たはカオトロピック試薬として用いられるが、尿素を用
いる方法でさえ最終生成物の混入、操作、保存及び廃棄
物処理等の問題のようなそれに関連した問題がある。そ
れゆえ、低濃度の尿素、タンパク質生成物の正しい単量
体型への回復を促進する助けとなる試薬を用いる方法が
この技術分野で特に必要となる。

さらに、ソマトトロピンの生理的及び生物的活性を持つ
タンパク質生戊物に成るために重要なことは単量体生成
物を得ることである。ソマトトロピン単量体は約１９１
アミノ酸残基から成り分子量は約２２，０００ダルトン
である。単量体は他の同様な単量体分子と会合または非
共有結合的に結合しない。

単量体型に加えて、ソマトトロピンは二量体型として存
在し、これは２つの単量体分子が分子間のジスルフィド
結合を介して共有結合しているかまたは相互に非共有結
合的に会合していることを意味する。二量体タンパク質
分子は単量体の２倍のアミノ酸数及び２倍の分子量から
成り、不幸にも屈折体を可溶化し再生する方法が非効率
的に行なわれることによってＷｌ１２される。言葉をか
えれば、それは微生物細胞内で不活性な封入（屈折）体
から活性のあるタンパク質生成物を得るのに必要な単離
、再生及び精製工程で形成される。

本発明は可溶化試薬として尿素と尿素を用いない水溶液
溶解法に使われる至適再生条件とを効果的に組み合わせ
ることによってタンパク質を可溶化する商業的な可能性
のある方法を提供する。再生にはシスティン結合を形成
するシスティン残基の酸化を含む。非常に低濃度の尿素
を用いることはよって、他の尿素を用いる方法に比べて
収量の点で有利になる。

発明の要約 本発明は精製ソマトトロピン（組み換え体）の生成のた
めの全工程の一部分としての屈折体可溶化工程において
単量体形成を最適化するために水溶性アルカリ性溶解方
法と組み合わせた低濃度尿素を用いたりマドトロピンの
可溶化及び再生のための方法に関する。本発明方法は屈
折体を可溶化するのに充分な時間（２から２０分）、屈
折体を池１騨十スのｔ−、区亜ｆ；　ｎ　Ｍ　＋−，松
ｌハ丁１ツマ　ｋｋ　百Ｖ・ノ屈折体を低モル濃度尿素
、すなわち１．８から２゜２Ｍ尿素中で分散させ、次に
該溶液を少なくとも３倍の水で希釈し、得られた尿素溶
液が非常に弱い低濃度尿素、すなわち０．４Ｍとなるよ
うにすることから成る。得られた溶液のｐＨはソマトト
ロピンの適当な単量体の折れたたみ構造をとりそして酸
化されるｐＨに維持されそして該単量体が折れたたみ構
造をとりそして酸化されるのに充分な時間維持される。

水溶性アルカリ性溶解法と低モル濃度尿素を組み合わせ
た屈折体、特にソマトトロピンの屈折体を可溶化する方
法を提供することが本発明の目的である。本発明方法に
よって有益で好ましい単量体を形成するだけでなく、こ
の技術分野で開示されている高濃度尿素法及び尿素を用
いない方法のいずれにも勝る収量が得られる。さらに、
本発明の目的は二量体の形成を最小にししかも正しい単
量体を再生することである。本発明のこれらの目的及び
他の目的は以下ここに提供された本発明に関するより詳
細な記載によって明らかになる。

図面の簡単な説明 第１図は高モル濃度尿素法、尿素無添加の方法及び本発
明の方法の比較を図解的に提供する。「封入体」（“Ｉ
ｎｃｈｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓ″）とは「屈折体」（
ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ　ｂｏｄｉｅｓ″）の類似用語で
あり、ここでは換って用いられている。

第２図はエルマン反応または本方法の最初の２０分間を
非還元的５ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたタンパク
質の酸化が全体的に約２％から７％の速度で行われてい
ることを示し、これによって酸化の大部分は米国特許第
４６５２６３０に記載された酸化と比較して希釈した尿
素条件下で行われていることを示している。

第３図は最も高濃度の尿素、すなわち２Ｍ尿素中に屈折
体を５分間保持することでは顕著な酸化が見られないこ
とを示す。

発明の詳細な説明 本発明は約１．８から２．２Ｍ尿素を含む水にソマトト
ロピン屈折体を分散し、可溶化に効果的であるように水
中で屈折体のｐＨを調整し、ソマトトロピンタンパク質
濃度は約２からＬｏｇ／Ｌであり、得られた該溶液を約
２から２０分間そのｐＨ及びその濃度で保持し、水で希
釈し、そして得られた尿素濃度が約０．４Ｍでソマトト
ロピン含量は約０．４から２．０ｇ／Ｌであるようにｐ
Ｈを１１．０から１２．５に調整し、溶液中のソマトト
ロピン内容物が高収量の適当に折れたたまれた構造の単
量体ソマトトロピンから成るように充分な時間（約５か
ら１０時間）、溶液を再調整したｐＨに維持することを
特徴とするソマトトロピンを可溶化し再生する方法に関
する。

ここで用いられる「ソマトトロピン」は、（１）例えば
ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、鳥類にワトリ
、アヒル、ガチョウ、七面鳥）、魚その他のようないか
なる種の動物成長ホルモン、その派生物、類似物及び断
片、（２）成長ホルモンＳ−スルホン化物を例とする還
元（−ＳＨ）Ｉ’ｆｆｌ長ホルモン及びＳ−保護成長ホ
ルモンのような成長ホルモン前駆体、（３）例えばヒト
成長ホルモンの２０に変種、メチオニルヒト成長ホルモ
ン、デルタ７及びデルタ９、ブタ成長ホルモン等を例と
する成長ホルモンのアミノ酸配列を長く及び／または短
く修飾した構造の成長ホルモンまたはその前駆体の変種
、及び（４）例えば１つまたはそれ以上のアミノ酸残基
を欠失または置換することによって成長ホルモンのアミ
ノ酸配列を修飾した構造の成長ホルモンまたはその前駆
体の類似物である。ソマトトロピンの他の型と同様に組
み換え体由来のソマトトロピン及び天然のソマトトロピ
ンの両方は本発明に従って利用される。

新規方法の第一段階はソマトトロピン屈折体を適当な濃
度で低モル濃度の尿素水（好ましくは脱イオン水）に分
散させることである。ソマトトロピンの濃度は本発明の
重要な要因であり、２から１０　ｇ／Ｌになるようにし
なければならない。適当な尿素濃度は約１．８から２．
２Ｍであり、好ましくは約２Ｍである。

濃縮ソマトトロピンのｐＨは約ｐＨ１１，５から約１２
．５の範囲、好ましくは約ｐＨ１２，０から約ｐＨ１２
，２に調整され、水溶性尿素溶液にソマトトロピンを可
溶化させる。強塩基が溶液のｐＨを調整するのに用いら
れる（例えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを
添加する）。

般にこれは比較的短時間で行なわれ、約２から２０分が
代表的である。次にこの溶液を少なくとも３倍の、好ま
しくは５倍の（３から５倍）水、好ましくは脱イオン水
で希釈する。ソマトトロピン濃度は約２ｇ／Ｌから１０
ｇ／Ｉ、であり、４から６ｇ／Ｌが好ましい。

ソマトトロピン屈折体の溶解後、ｐＨを約ｐＨ１１から
約ｐＨ１２，５の範囲に再調整する。

ｐＨを低下させることによって再生速度が増加する。ｐ
Ｈは例えばリン酸を添加するといったような適当な方法
で低下させることができる。再調整の範囲は二量体を最
少にするため好ましくは約ｐＨ１１，３からｐＨ１２，
０である。特に好ましいｐＨは１１．５から１１．７で
ある。

第１図では本方法と尿素無添加の方法（水溶液法）及び
４Ｍ尿素を用いる方法を比較している。

さらに米国特許第４６５２６３０に記載されているよう
に、そこに説明のある高濃度尿素法と本方法が直接比較
され、その特許に記載された方法に反応して水系ではす
みやかな酸化が見られないことが示されている。事実、
本発明方法の酸化速度は毎分約０．３５％または低濃度
尿素に２から２０分の露呈では２％から７％と計算され
る。また第３図では低濃度尿素による溶解時間で生じる
酸化度は必要とされる生理活性をもつ１００％酸化型の
単量体を得る最終目的を考慮すると不充分であることが
確認される。これらの比較によって本発明方法のユニー
クな特徴が明らかにされ、引用した教えにもかかわらず
高収量の最終生成物が得られる。

さらに、β−メルカプトエタノールまたはジチオスレイ
トールのような還元試薬を溶液に添加する。本還元試薬
を用いるのであれば可溶化する前よりむしろ３から５倍
に希釈する段階の直前に添加すべきである。

異なる４研究室で多くのソマトトロピンが本発明の方法
に適応され、結果が表工に与えられている。

表　　Ｉ 洗浄した屈折体の異なるメットを用いた２Ｍ尿素、４Ｍ
尿素及び水による方法の単量体収量の比較へ　　　８８
．５（１００）　　８０．３（９０，７）　　７３Ｊ（
８２，８）８　　　７５．１（１００）　　６７．０（
８９，２）　　５９．６（７９，４）Ｃ７０，２（１０
０）　　５８．３（８３，０）　　５５．８（７９，５
）Ｄ　　　　　７０．７（１００）　　５９．１（８３
，６）　　６２．７（８８，７）本−単量体収量は逆相
ＨＰＬＣで測定した全ソマトトロピン濃度に対するゲル
浸透クロマトグラフィーによって測定した２２にダルト
ンのソマトトロピンの濃度の比として計算される。

−２Ｍ尿素法に標準化した単量体パーセントはカッコ内
にある。

実施例１ ウシソマトトロピン ウシソマトトロピン屈折体（封入体とも言われる）を生
産するように遺伝的に改変した大腸菌細胞を含む醗酵液
を遠心し、細胞を培養液から分離する。ガラリン（Ｇａ
ｕｌｉｎ）ホモジナイザーに８０００　ｐｓｉｇで２回
通すことによって細胞をスラリー化し破砕する。懸濁液
を遠心分離し、沈殿物を再びスラリー化し、３７℃でリ
ゾチーム及びトライトン＼Ｘ−１００界面活性剤で処理
する。懸濁液を遠心分離し、沈殿物を水で２回洗浄し、
洗浄ごとに延伸分離する。

不溶性の変性したウジソマトトロピン（ｂＳＴ）を含む
得られた沈殿物を２５℃で脱イオン水に分散させる。水
の量は尿素添加後ソマトトロピンの濃度が５ｇ／Ｌとな
るように選ばれる。固体尿素を尿素濃度が２Ｍとなるま
で添加する。得られたスラリーを２５℃に加熱し、尿素
の吸熱を補う。

ＩＮ水酸化ナトリウムを添加することによってｐＨを１
２．０に調整すると封入体が分離してくるのが見られる
。２０分後、溶液を４倍量のｐＨ１１，５の脱イオン水
中に希釈し、７時間熟成させる。４倍量のｐＨ１１，５
の水に希釈した後のソマトトロピン濃度は１　ｇ／Ｌで
ある。

熟成の終わりに溶液のｐＨを１Ｍリン酸を用いて１０．
８に低下させる。溶液をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）＼Ｈ
２６Ｐ１００−４３のような排除分子量１００にダルト
ンのホロファイバーカートリッジで限外濾過及び透析濾
過する。透過物をコツホ（Ｋｏｃｈ）＼に一１３１Ａの
ような排除分子ｊ１５にダルトンのラセン巻きカートリ
ッジを用いて濃縮する。

濃縮溶液を１Ｍリン酸を用いてｐＨ９に調整し、１０ｍ
Ｍホウ酸、ｐＨ９で平衡化したＤＥＡＥセファロースフ
ァーストフローのような陰イオン交換体樹脂１リツトル
に対して１５ｇのｂＳＴを注ぐ。平衡化緩衝液で洗浄し
た後、１００ｍＭ　　Ｎａｃ！、１０ｍＭホウ酸溶液、
ｐＨ９でｂＳＴを溶出する。ミリポアペリコン（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃ。

ｎ）＼のような排除分子量１０にダルトンのカセットが
付いた限外濾過を用いてｂＳＴのピークを濃縮しアンモ
ニア溶液で脱塩し、透過物の伝導性が３００マイクロシ
ーメンス／　ｃ　ｍ以下となるようにする。約１００ｇ
／Ｌの脱塩溶液を凍結乾燥し、既に確立した生物的及び
化学的検査にパスするウシソマトトロピン（ｂＳＴ）が
得られる。凍結乾燥ウシソマトトロピンの収量は醗酵液
の４８％である。

実施例２ ブタソマトトロピン ブタソマトトロピン（ｐＳＴ）封入体を生産するように
遺伝的に改良された大腸菌細胞を含む醗酵液を遠心して
培養液から細胞を分離した。

不溶性の変性したブタソマトトロピン（ｐＳＴ）を含む
得られた沈殿物を２５℃で脱イオン水に分散させる。尿
素添加後ソマトトロピンの濃度が５ｇ／Ｌとなるように
水の量を選ぶ。尿素濃度が２Ｍとなるまで固体尿素を添
加する。実施例１のようにスラリーを２５℃に加熱して
尿素の吸熱を補う。ＩＮ水酸化ナトリウムを添加するこ
とによってｐＨを１２．０に調整すると封入体が分離し
てくるのが見られる。２０分後、溶液を４倍量のｐＨ１
１，５の脱イオン水に希釈し、７時間熟成させる。熟成
の終わりに溶液のｐＨを１Ｍリン酸を用いて、１０．８
に低下させる。４倍量のｐＨ１１，５の水に希釈した後
のソマトトロピン濃度はＩｇ／Ｌである。溶液をアミコ
ン（Ａｍｉｃｏｎ）＼Ｈ２６Ｐ１００−４３排除分子量
１００にダルトンのホロファイバーカートリッジで限外
濾過及び透析濾過する。透過物をコツホ（Ｋｏｃｈ）＼
に一１３１Ａ排除分子量５にダルトンのラセン巻カート
リッジ限外濾過を用いて濃縮する。

濃縮溶液を１Ｍリン酸を用いてｐＨ９に調整し、１０ｍ
Ｍホウ酸、ｐＨで平衡化したＤＥＡＥセファロースファ
ーストフロー陰イオン交換体樹脂１リットルに対して１
５ｇのｐＳＴを注ぐ。平衡化緩衝液で洗浄した後、１０
０ｍＭ　　ＮａＣ］、１０ｍＭホウ酸溶液、ｐＨ９でｐ
ＳＴを溶出する。

排除分子量１０にダルトンのカセットが付いたミリポア
ペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ）＼
限外濾過器を用いてｐＳＴのピークを濃縮し、アンモニ
ア溶液で脱塩し透過物の伝導性が３００マイクロシ一ナ
ンス／ｃｍ以下となるようにする。約１００ｇ／Ｌの脱
塩溶液を凍結乾燥し、既に確立した生物的及び化学的検
査にパスするブタソマトトロピンが得られる。

本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。

１、ソマトトロピン屈折体をあるｐＨの約１０８から２
，２Ｍ尿素水溶液中で充分な時間分散し、該屈折体を可
溶化し、次に該溶液をあるｐｈの少なくとも３倍の水で
希釈し適当に折れたたまれた構造の単量体のソマトトロ
ピンを得る工程から成ることを特徴とするソマトトロピ
ンを可溶化し再生する方法。

２、該屈折体を可溶化する時間は約２から２０分であり
、該ｐＨは１１．０から１２，５であり、適当に折れた
たまれた構造の単量体ソマトトロピンが得られる充分な
時間は５から１０時間であり、該ソマトトロピンはヒト
、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、魚または鳥類ソマ
トトロピンである第１項記載の方法。

３、該ソマトトロピンはウシソマトトロピンであるかま
たは該ソマトトロピンはブタソマトトロピンである第２
項記載の方法。

４．さらに少なくとも３倍の水で希釈する前に、尿素溶
液に還元試薬を添加することを特徴とする第２項記載の
方法。

５、該還元試薬はβ−メルカプトエタノール、ジチオス
レイトールまたはそれらの組み合わせである第４項記載
の方法。

６、該ソマトトロピンはヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウ
マ、ヤギ、魚または鳥類ソマトトロピンである第５項記
載の方法。

７、該ソマトトロピンはウシまたはブタソマトトロピン
である第６項記載の方法。

８、ソマトトロピン及び他のタンパク質を含有する屈折
体を洗浄し、ソマトトロピンの濃度が約２から１０　ｇ
／Ｌとなるように該屈折体をｐＨ１１，０から１２．５
の約１．８から２．２Ｍの尿素に溶解し、該溶液を該ｐ
Ｈにおいて約２から２０分間放置し、該溶液を少なくと
も３倍の水で希釈し、尿素濃度が約０．４Ｍでソマトト
ロピン濃度が約０．４から２．０　ｇ／Ｌである該希釈
溶液のｐＨを１１．３から１２．０に調整し、該溶液を
５から１０時間放置する工程から成ることを特徴とする
ソマトトロピン組み換え鉢土産物を単離及び精製する方
法。

９、該ソマトトロピンはヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウ
マ、ヤギ、魚または鳥類ソマトトロピンである第８項記
載の方法。

１０、該ソマトトロピンはウシまたはブタソマトトロピ
ンであり、時間は７から８時間である第９項記載の方法
。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明方法と他の公知の方法との工程を比較
した図である。 第２図は、本発明方法によるタンパク質の酸化と時間と
の関係を示すものである。 第３図は、２Ｍ尿素中に屈折体を５分間保持した場合の
酸化の状態を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ソマトトロピン屈折体をあるｐＨの約１０８から２
   ．２Ｍ尿素水溶液中で充分な時間分散し該屈折体を可溶
   化し、次に該溶液をあるｐＨの少なくとも３倍の水で希
   釈し、適当に折れたたまれた構造の単量体のソマトトロ
   ピンを得る工程から成ることを特徴とするソマトトロピ
   ンを可溶化し再生する方法。 ２、ソマトトロピン及び他のタンパク質を含有する屈折
   体を洗浄し、ソマトトロピンの濃度が約１０ｇ／Ｌとな
   るように該屈折体をｐＨ１１．０から１２．５の約１．
   ８から２．２Ｍの尿素に溶解し、該溶液を該ｐＨにおい
   て約２から２０分間放置し、該溶液を少なくとも３倍の
   水で希釈し、尿素濃度が約０．４Ｍでソマトトロピン濃
   度が約０．４から２．０ｇ／Ｌである該希釈溶液のｐＨ
   を１１．３から１２．０に調整し、該溶液を５から１０
   時間放置する工程から成ることを特徴とするソマトトロ
   ピン組み換え体生産物を単離及び精製する方法。