JPH02222697A - ソマトトロピンの可溶化及び熟成法 - Google Patents

ソマトトロピンの可溶化及び熟成法

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JPH02222697A
JPH02222697A JP1322768A JP32276889A JPH02222697A JP H02222697 A JPH02222697 A JP H02222697A JP 1322768 A JP1322768 A JP 1322768A JP 32276889 A JP32276889 A JP 32276889A JP H02222697 A JPH02222697 A JP H02222697A
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somatotropin
ripening
refractory
solution
range
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JP1322768A
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Kevin Michael Mccoy
ケビン・マイケル・マツコイ
Robert A Frost
ロバート・エイ・フロスト
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Original Assignee
American Cyanamid Co
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin

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  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 近年、ＤＮＡ＠み換え技術によって、蛋白質の大規模生
産が可能になった。ソマトトロピン蛋白質の可溶化及び
熟成法については、その幾つかが米国特許の主題となっ
ている。例えば、米国特許（ｔｌ、ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ
）第４．５１１．５０３は、不応体（ｒｅｆｒａｃｉｉ
ｌａ　ｂｏｄｉｅｓ）から蛋白質回収の典型的な方式を
示したものである。不応体は、大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１
）細胞の細胞質中に分布し、位相差顕微鏡下で明るい点
として見え、凝集変性したソマトトロピンの不溶性粒子
である。同不応体は大腸菌グラスミドＤＮＡの遺伝子操
作によって、ソマトトロピンが過剰生産されると生ずる
。不応体は、強力な変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎＬ）又
はカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤で処理す
ることにより、不規則に折り畳まれていた分子が引き伸
ばされ、溶解性になる。こうして得られた蛋白質は再変
性（ｒｅｎａｔｕｒｅｄ）　Ｌなければならない。不応
体はこの分子鎖引き伸ばし、再折り畳み処理を行わない
と、不応体が生物学的に不活性であるために、使用する
ことが出来ない。この方式で最も普通に使用される強力
変性剤はグアニジン塩酸塩であった。
その他の方法では、その他のカオトロピック剤、例えば
ドデシル硫酸ナトリウムを使用したり（例えば米国特許
第４．６７７．１９６号）、又は弱い変性剤例えば尿素
を使用する（米国特許第４，７３１，４４０号）。
これらの方法でソマトトロピンを可溶化、変性する場合
、それぞれ問題がある。グアニジン塩酸塩は非常に高価
であり、変性工程を実施するには、他の試薬と置き換え
なければならない。ドデシル硫酸ナトリウムは非常に効
果的な変性剤であり、グアニジン塩酸塩よりもはるかに
安価であるが、同化合物は、変性した蛋白質とはるかに
強固に結合して問題の蛋白質から完全に分離してしまい
、同時に加工費を増大させる。尿素が普通弱い変性剤又
はカオトロピック剤として使用される。しかし尿素を使
用する方法でも、例えば最終製品の汚染、そして取り・
扱い、貯蔵及び廃棄物処理などの問題を有する。
その他の従来法の問題に加えて、正しく変性した七ツマ
一体は単一製品ではない。ソマトトロピンモノマーは、
ソマトトロピンの性質及び生物学的活性の全てを有する
最小単位である。典型的なソマトトロピンモノマーは、
約１９１のアミノ酸残基からなり、分子量は大体２２．
０００　ｄａｌｔｏｎｓである。
同士ツマー分子はその他の同様な分子と共有的に総合し
ておらず、又非共有的に会合もしていない。
ンマトトロピンダイマーは、共有的に、例えば分子間ジ
スルフィド結合によって結合しているか、又は非共有的
に互いに会合している２個のモノマー分子からなる。ダ
イマー分子は、モノマー分子の倍の数のアミノ酸残基数
からなり、分子量はモノマー分子の倍である。
従来法を使用するとあいにく、ダイマーがいくらか生成
すると同時に、より高分子量の蛋白分子が生成する。生
物学的に有用なのは七ツマ−だけであって、ダイマーで
はない。
従って、技術的に要求されるものは、ソマトトロピンモ
ノマーを高収率で、過剰なダイマーを生成させずに、又
カオトロピック剤を使用せずに、製造する、商業的に実
行可能なソマトトロピン可溶化及び熟成法である。
本発明を要約すれば、アルカリ水溶液を使用して低分子
量のダイマーを形成させ、そして変性剤の使用、又再熟
成工程、更に再熟成剤の使用を不要にしたソマトトロピ
ン可溶化及び熟成法である。
発明の要約 カオトロピック剤を使用しないソマトトロピンの可溶化
及び熟成法と、同方法によって製造されたモノマー状ソ
÷トトロビンを開示する。同方法は、ソマトトロピン不
応体を適当な濃度で水中に分散し、ｐＨを約１１．５な
いし１２．５の範囲に調整し、同ｐ　Ｈ範囲を不応体を
可溶化するのに十分な時間維持し、随時、得られた溶液
のｐＨを約１１ないし１２の範囲に再調整し、そして得
られた溶液を再調整したｐＨ範囲に十分な時間維持して
、溶液中のソマトトロピンが、高収率で適正に熟成した
モノマー状ソマトトロピンからなるようにすることから
なる、ソマトトロピンの可溶化及び熟成法である。
驚くべきことに、本発明は低度のダイマーを形成するの
で、再熟成段階を別に設けたり、あるいは再熟成剤を使
用したりする必要が無くなった。
発明の詳細な説明 本発明は、ソマトトロビン不応体を適当な濃度で水中に
分散し、同不応体の水中ｐＨを可溶化を行う水準に調整
し、同ｐＨ範囲を不応体を可溶化するのに十分な時間維
持し、随時、得られた溶液のｐＨを熟成を行う水準に再
調整し、そして得られた溶液を再調整したｐＨ範囲に十
分な時間維持して、溶液中のソマトトロピンが、高収率
で適正に熟成しＩ；モノマー状ソマトトロピンからなる
ようにすることからなる、ソマトトロピンの可溶化及び
熟成法を指向したものである。
本発明で、ソマトトロピンの用語は、（１）あらゆる種
の、例えばヒト、ウシあるいはブタの動物成長ホルモン
、その誘導体、同族体、（２）成長インスリンの前駆体
、例えば還元（−５Ｈ）成長ホルモン、及びＳ−保護成
長ホルモン、例えば成長ホルモンＳ−スルホネート、（
３）成長ホルモン、又はその前駆体の変種、例えば成長
ホルモンアミノ酸配列を延長及び／又は短縮して改質し
た構造体、例えばヒト成長ホルモンの２０に変種体、メ
チオニル化ヒト成長ホルモン、Δ７及びΔ９ブタ成長ホ
ルモン等、及び（４）成長ホルモン又はその前駆体の同
族体、例えば成長ホルモンアミノ酸配列を、１個又はそ
れ以上のアミノ酸残基で置換改質した構造体を示す。本
発明では、組み替え誘導したソマトトロピン、天然産ソ
マトトロピン並びにその他のいかなる型のソマトトロピ
ンも利用することができる。
新規な方法の第１段階では、ソマトトロビン不応体を水
（好ましくは脱イオン水）中に、適当な濃度で分散する
。全蛋白質の濃度は、本発明の重要な因子である。第１
図が示すように、そツマ−収率は、同蛋白質の全濃度に
依存する。適当な濃度は約５．Ｑｇ／１２以下、好まし
くは帆５　ｇ　／　Ｑないし約５．０　ｇ／Ｑの範囲で
ある。特に好ましくは約２．５ｇ／Ｑの濃度である。濃
度が約５．０ｇ／Ｑ以上に増加すると、結果が悪くなる
傾向がある。
たとえ溶液濃度が約０．５ｇ／Ｑ以下で、七ツマー収率
に関しては良い結果が得られるようであっても、このよ
うな希薄溶液を使用するのは、商業的な面で、例えば貯
蔵及び資本経費が過剰にかかり、装置が大きくなり、更
に過剰な液体を除去する工程で、量が多いために操作段
階を普通より多くせねばならず有利ではない。
ソマトトロピン濃縮液のｐＨは約１１．５ないし１２゜
５に、好ましくは約１２．０ないし１２．２にａ！！Ｌ
、ソマトトロピンを水中に可溶化する。どの強塩基も、
ソマトトロピン溶液のｐＨを調整するのに使用すること
ができる（例えば水酸化ナトリム又は水酸化カリウムを
添加する）、この可溶化は一般に比較的短時間で、典型
的には約２ないし２０分で起こる。同範囲のｐＨで不応
体は目に見えて溶解し、得られた溶液は透明である。ソ
マトトロピン不応体が溶解してから、同ｐＨは維持する
こともできるし、又は下げることもできる。もし維持さ
れれば、ソマトトロピンは徐々に折り畳まれ、適正に（
ｐｒｏｐｅｒｌｙ）熟成された七ツマ−を生ずる。変性
剤を使用しないので、再熟成（ｒｅｎａｔｕｒｉｎｇつ
段階が不要になる。その代わり、アルカリ性環境にして
、熟成型の環境下に可溶化を行う。熟成環境とは、ソマ
トトロピンに本来の分子立体配座を取らせるようにする
物理的及び溶剤の条件を意味する。ソマトトロピンが生
物活性を発揮するのに必要な適正な酸化状態を達成し、
分子立体配座を取るには、同分子を熟成環境に置かなけ
ればならない。熟成型の環境である為に、可溶化した不
応体は徐々に折り畳まれ、適正に熟成した七ツマ−の希
望の最終製品を形成する。このことは、変性剤を使用し
、変性後、再熟成を必要とする従来技術とは著しい対照
を為す。
ソマトトロビン不応体を溶解してから、ｐＨは約１１な
いし約１２の範囲に再調整できる。ｐＨを低くすると熟
成速度が増加する。ｐＨは任意の方法、例えば燐酸を添
加して低くすることができる。再調整範囲は好ましくは
約ｐ　Ｈ１１，３ないし１１．７であり、ダイマー生成
を最小にする。特に好ましくはｐ　Ｈ１１，５である。
驚くべきことに、ｐｉ（を好ましい範囲に下げると、ダ
イマーが減少し、大量のモノマーが形成されることが発
見された。ｐＨを再調整することによってダイマー生成
が減少、そして七ツマー生成が増大することは、生成す
るダイマー又は七ツマ−の割合を同じに維持することが
期待できることになり、驚くべきことである。第２図は
、本発明の好ましいｐＨ範囲を使用することによって、
ダイマー生成が減少した思いがけない結果を示したもの
である。
約１１のｐＨよりも低いｐＨを使用することもできる。
しかし、一般に収率に悪影響がでて、ダイマー生成が増
大する。更にｐＨを大きく下げると、ソマトトロピンが
溶液から沈澱する危険性がある。
反対にｐＨを再調整しないと、熟成工程の時間が長くな
り、分解反応、例えば脱アミド化などが起こってくる。
しかし、ソマトトロピンの型が異なれば（例えば、成長
ホルモンの異なる同族体、誘導体、前駆体、又は変種）
、ｐＨ範囲は当然具なってくる可能性があり、このよう
な変化は本発明の範囲に含まれると考えられる。
溶液は、再調整ｐＨ範囲で、温度を約２０ないし３０℃
にして約５ないし１２時間（好ましくは約１０時間）、
七ツマー量が最大値に達するまで保持する。
最大値に達したかどうかはゲル透過クロマトグラフィで
決定する。第３ないし第７図は、本発明の方法を用いた
際、蛋白質が時間と共に変化する様子を示したものであ
る。第３ないし第７図はモノマー生成経路が、従来から
提案されている、変性剤を使用によって七ツマ一体が直
ちに生成し、分子量は変わらずに（又は増大しながら）
七ツマー体が正しく畳み込まれるか、又は他の蛋白質と
接合するとするとしたモデルではなく、高分子量蛋白質
集合体からモノマ一体が生成するモデルに合っているこ
とを示していることに注目されたい。
第３図は５分間後のゲル透過クロマトグラフィ（ｇｐｃ
）の結果を示しｔ；ものである。３個のビーク、即ち、
横軸０．４５体積単位のピークＡ１約０．６５体積単位
のビークＢｌ及び約０．７７体積単位のビークＢ２が同
定できる。ビークＡは、分子量が１゜０００　、０００
ｄａ　Ｉ　ｔｏｎｓ以上の蛋白質様不純物からなる。
ビークＢｌは蛋白質様不純物、例えばホストの大腸菌か
らの混入物を少し含むソマトトロピン集合体からなる。
ビークＢ２は・モノマー状ソマト１−ロビンである（ビ
ークＢ２にも又モノマー以外に不純物が残っている可能
性がある）。
第４図は、１時間後のｇｐｃの結果を示したものである
。ビークＡ及びビークＢｌの両者は小さ（なり、ビーク
Ｂ２が著しく大きくなっている。
第５図は２時間後のｇｐｃの結果を示したちのである。
ビークＡ及びビークＢｌは更會−小さくなり、ビークＢ
２は更に大きくなっている。
第６図は５時間後のｇｐｃ結果を示したものである。約
０．７体積単位に小さな第４番目のビーク又は肩が現れ
たことに注目されたい。この肩はダイマーが生成したご
とを示している。第６図のこの肩は、本発明の新規な方
法ではダイマー生成が少ないことを示している。大量の
ダイマーが生成する方法では、独立してはつきりしたビ
ークが明確に現れる。
第７図は、１０時間後のｇｐｃ結果を示したものである
。第６図から少ししか変わっていないが、モノマーを表
ずビークＢ２は僅かに増加している。
第３ないし第７図は、本発明が熟成環境を創出したこと
を示している。変性剤を使用せず、そして再成熟段階を
特に設けず、又再成熟剤も使用しなくとも、不応体中の
蛋白分子がほぐれて正しく折り畳まれ、生物学的に活性
なモノマー状ソマトトロピンを生成する。
得られた溶液は、適正に熟成されｔ；モノマー状ソマト
トロピンを好収率で含む。好収率とは、溶解全蛋白質の
約３０％ないし約４５％、又はそれ以上を意味する。全
蛋白質には、あらゆる形のソマトトロピン並びにそれ以
外の全ての非ソマトトロピン蛋白質不純物、例えば宿主
大腸菌からの夾雑物が含まれる。従って、ソマトトロピ
ンだげを基準として計算すると、収率ははるかに高いも
のとなろう。カオトロピック剤を使用した方法の収率は
ほぼ同じである。しかし、本発明はカオトロピック剤を
使用しないので、えられる七ツマー状ソマトトロピンは
、有害な汚染剤、例えばＳＤＳ、グアニジン塩酸塩、又
は尿素などは、痕跡量も含んでいない。本発明を更に下
記実施例によって説明する。但し、本発明はこれらによ
って同等制限されるものではない。
遺伝子操作した大腸菌細胞を発酵させてウシソマトトロ
ピン包含体を生成させ、得られた発酵混合物を遠心分離
にかけ、液状媒体（ｂｒｏｔｈ）から細胞を分離する。
細胞はもう１度スラリーにし、８．０００　ｐｓｉｇの
圧力下にＧａｕｌｉｎホモジナイザーに２回通して粉砕
する。懸濁液を遠心分離し、得られたペレットをもう１
度スラリーにし、３７℃の温度で、リゾチームとＴｒｉ
Ｌｏｎ　　Ｘ−１００洗浄剤を使用して処理する。得ら
れた懸濁液を遠心分離し、ペレットは２回水洗し、洗浄
毎に遠心分離する。得られたペレットは不溶性変性ウシ
ソマトトロピンを含んでおり、それを水に加え、そして
ＮａＯＨでｐＨを１２．１５に調整、合計蛋白質濃度を
約２．５ｇ／αにする。ｐ　Ｈ１２，１５そして２５℃
で２０分間装いてから、得られた透明溶液をｐＨを１１
．５に調整、８時間維持した。溶液を、Ａｍ１ｃｏｎ　
ＨＩＰｌｏｏ−４３分子量１００Ｋ　ｄａｌＬｏｎ以下
を遮断する中空繊維カートリッジで限外濾過する。得ら
れた透過液はＡｍ１ｃｏｎ　ＨＩＰｌｏｏ−４３分子量
１００Ｋ　ｄａＬＬｏｎ遮断中空繊維カートリッジを使
用して濃縮し、約５ｇ／（２とする。
濃縮溶液はｌ　ＮＨＣｌでｐＨ９に調整、樹脂１（２当
たり２０ｇｂＳＴの割合で、１０　ｎ＋Ｍホー酸塩（ｐ
Ｈ９）で平衡させたＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ
ＡＳＴ　ＦＬＯＷアニオン交換体にかける。平衡バッフ
ァー溶液で洗浄後、ｂＳＴは１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、
　１０　ｍＭホー酸塩溶液を使用して、ｐＨ９で溶出さ
せた。ｂＳＴビークを濃縮、Ａｍ１ｃｏｎ　ＨＩＰｌｏ
ｏ−４３中空繊維カートリツジを使用して、稀アンモニ
ア溶液で、透過液の電気伝導度が約１００　ｍｉｃｒｏ
ｓｉｅｍｅｎｓ／ｃｍになるまで脱塩した。濃度が約２
ｇ／Ｑの脱塩溶液を凍結乾燥し、確立された生物及び化
学試験をバスするウシソマトトロピンを得た。
遺伝子操作した大腸菌細胞を発酵させてブタンマドトロ
ピン包含体を生成させ、得られた発酵混合物を遠心分離
にかけ、液状媒体（ｂｒｏｔｈ）から細胞を分離する。
細胞はもう１度スラリーにし、８．０００　ｐｓｉｇの
圧力下にＧａｕｌｉｎホモジナイザーに２回通して粉砕
する。懸濁液を遠心分離し、得られたペレットをもう１
度スラリーにし、３７℃の温度で、リゾチームとＴｒｉ
ｔｏｎ　　Ｘ−１００洗浄剤を使用して処理する。得ら
れた懸濁液を遠心分離し、ペレットは２回水洗し、洗浄
毎に遠心分離する。得られたペレットは不溶性ブタンマ
ドトロピンを含んでおり、それを水に加え、蛋白質総濃
度を約２．５ｇ／Ｑにする。得られたスラリーを良く混
合ながら、５ＮＮａＯＨを添加、ｐＨを１２．２に上げ
る。得られた溶液は、５分以上かかつてゆっくりと透明
になる。溶液は、２０℃で２０分間装いて熟成する。１
Ｍ燐酸でｐ　Ｈを１１．５に下げ、１０時間熟成しｌ；
。ゲル透過クロマトグラフィで測定したところ、熟成の
終点で、１＝０５　ｇ／Ｑであった。
当技術分野の通常の熟達者ならば、本発明に対して、多
くの変法を可能にできるが、それらは先に述べた特許請
求の範囲の中にあると理解されたい。
本発明の主なる特徴及び態様は下記のようである。
■、ンマトトロピンの可溶化及び熟成性において、（ａ
）ソマトトロピン不応体を適当な濃度で水中に分散し、 （ｂ）ｐＨを約１１．５ないし１２．５の範囲に調整し
、（ｃ）同ｐＨ範囲を不応体を可溶化するのに十分な時
間維持し、 （ｄ）得られた溶液のｐＨを約１１ないし１２の範囲に
再調整し、そして （ｅ）得られた溶液を再調整したｐＨ範囲に十分な時間
維持して、溶液中のソマトトロピンが、高収率で適正に
熟成したモノマー状ソマトトロピンからなるようにする ことからなることを特徴とするソマトトロピンの可溶化
及び熟成法。
２、上記第１項において、ダイマー生成が減少すること
を特徴とするソマトトロピンの可溶化及び熟成法。
３、上記第１項において、該ソマトトロピンがウシ又は
ブタソマトトロピンであることを特徴とするソマトトロ
ピンの可溶化及び熟成法。
４、上記第１項において、該ソマトトロピンが遺伝子組
み換えによって誘導されたソマトトロピンであることを
特徴とするソマトトロピンの可溶化及び熟成法。
５、上記第４項において、該ソマトトロピンがウシ又は
ブソマトトロピンであることを特徴とするソマトトロピ
ンの可溶化及び熟成法。
６、上記第１項において、段階（ｂ）のｐＨを約１２．
０ないし１２．２の範囲に調整し、モして段階（ｄ）で
はｐＨを約１１．３ないし１１．７に再調整することを
特徴とするソマトトロピンの可溶化及び熟成法。
７、上記第６項において、段階（ａ）の濃度が約５ｇ　
／　（ｌ以下で、段階（ｃ）の時間が約２分から２０分
間であり、そして段階（ｅ）の時間が、温度約２０ない
し３０℃で、約５ないし１２時間であることを特徴とす
るソマトトロピンの可溶化及び熟成法。
８、上記第７項において、段１！（ａ　）の濃度が約０
゜５ないし５ｇ／１２であることを特徴とするソマトト
ロピンの可溶化及び熟成法。
９、上記第８９ｔにおいて、段階（ａ）の濃度が約２゜
５ｇ／Ｑ％ｐＨが段階（ｄ）で１１．５に再調整され、
そして段階（ｅ）の時間が約１０時間であることを特徴
とするソマトトロピンの可溶化及び熟成法。
１０、ソマトトロピンの可溶化及び熟成法において、（
ａ）ソマトトロピン不応体を水中に分散し、（ｂ）ｐＨ
を約１１．５ないし１２．５の範囲に調整し、そして （ｃ）同ｐＨ範囲を十分な時間維持して、溶液中のソマ
トトロピンが高収率で、適正に熟成したモノマー状ソマ
トトロピンからなるようにすることからなることを特徴
とするソマトトロピンの可溶化及び熟成法。
１１、上記第１Ｏ項において、濃度が約５ｇ／１２以下
であることを特徴とするソマトトロピンの可溶化及び熟
成法。
１２、上記第１０項において、ｐＨが約１２．０ないし
１２．２、濃度が約０．５ないし５ｇ／（２であり、そ
して時間が、温度約２０ないし３０°Ｃで、約５ないし
１２時間であることを特徴とするソマトトロピンの可溶
化及び熟成法。
１３、上記第１１項において、該ソマトトロピンがウシ
又はブタンマドトロピンであることを特徴とするソマト
トロピンの可溶化及び熟成法。
＋４．ソマトトロピンの可溶化及び熟成法において、（
ａ）ソマトトロピン不応体を適当な濃度で水中に分散し
、 （ｂ）不応体の水中ｐＨを、可溶化を引き起こす水準に
調整し、 （ｃ）同ｐＨを、不応体を可溶化するのに十分な時間維
持し、 （ｄ）同溶液のｐＨを、熟成化を引き起こす水準に再調
整し、そして （ｅ）同溶液を再調整したｐＨで十分な時間保持し、溶
液中のソマトトロピンが、高収率で適正に熟成したモノ
マー状ソマトトロピンからなるようにする ことからなることを特徴とするソマトトロピン可溶化及
び熟成法。
１５、上記第１項記載の方法によって製造されたモノマ
ー状ソマトトロピン。
１６、上記第８項記載の方法によって製造されたモノマ
ー状ソマトトロピン。
１７、上記第１Ｏ項記載の方法によって製造されたモノ
マー状ソマトトロピン。
【図面の簡単な説明】
第１図は、モノマー収率の、熟成ｐＨ及び蛋白質濃度へ
の依存性を図式的に示したものである。 第２図は、生成するダイマーの量の、熟成ｐＨ及び蛋白
質濃度への依存性を図式的に示したものである。 第３ないし第７図は、本発明の新規な方法によって得ら
れた生成物のゲル透過クロマトグラフィを時間の経過（
それぞれ５分、１時間、２時間、５時間及び１０時間）
に従って示したものである。 特許出願人　アメリカン・サイアナミド・カンパＩＧ　
２ ・イｉｉ台ｋｉ、寞ｙ町　、イ之び烹もべ　ＰＨ＋ニク
す１ろモノマー１べ ＩＧ　７ ＶＲ８０ 吸収度 ＵＶ　Ｅ８０ 晟収演 １＃２８０ 閥」（度 ＵＶ　Ｚ８０ 鴫収度

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ソマトトロピンの可溶化及び熟成法であつて、 （ａ）ソマトトロピン不応体を適当な濃度で水中に分散
    し、 （ｂ）ｐＨを約１１．５ないし１２．５の範囲に調整し
    、（ｃ）同ｐＨ範囲を不応体を可溶化するのに十分な時
    間維持し、 （ｄ）得られた溶液のｐＨを約１１ないし１２の範囲に
    再調整し、そして （ｅ）得られた溶液を再調整したｐＨ範囲に十分な時間
    維持して、溶液中のソマトトロピンが好収率で適正に熟
    成したモノマー状ソマトトロピンからなるようにする ことを特徴とするソマトトロピンの可溶化及び熟成法。 ２、ソマトトロピンの可溶化及び熟成法であつて、 （ａ）ソマトトロピン不応体を水中に適当な濃度で分散
    し、 （ｂ）ｐＨを約１１．５ないし約１２．５の範囲に調整
    し、そして （ｃ）同ｐＨ範囲を十分な時間維持して、溶液中のソマ
    トトロピンが好収率で、適正に熟成したモノマー状ソマ
    トトロピンからなるようにすることを特徴とするソマト
    トロピンの可溶化及び熟成法。 ３、ソマトトロピンの可溶化及び熟成法において、 （ａ）ソマトトロピン不応体を適当な濃度で水中に分散
    し、 （ｂ）不応体の水中ｐＨを、可溶化を引き起こす水準に
    調整し、 （ｃ）同ｐＨを、不応体を可溶化するのに十分な時間維
    持し、 （ｄ）同溶液のｐＨを、熟成化を引き起こす水準に再調
    整し、そして （ｅ）同溶液を再調整したｐＨで十分な時間保持し、溶
    液中のソマトトロピンが、好収率で適正に熟成したモノ
    マー状ソマトトロピンからなるようにする ことを特徴とするソマトトロピン可溶化及び熟成法。 ４、特許請求の範囲第１項記載の方法によって製造され
    たモノマー状ソマトトロピン。
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