PT96058B - Metodo para a solubilizacao e naturacao de somatotropinas utilizando uma concentracao baixa de ureia - Google Patents
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Description
presente invento diz respeito ao uso' de uma baixa concentração aquosa molar de ureia em combinação com uma solução aquosa alcalina como um método de solubi1ização e naturação para as proteínas» nais impor caotemente, com o advento nos anos recentes da tecnologia DNA recombinante, responsável pela produção da muitas proteínas e polipeptfdeos, os métodos para solubi— lisar efectiva e sticientemente tais protí durante o pr os reTinaçâo sao a cuave para íornsc«r uma pruoução económica em
Muitos métodos para a solubilizaçSo e naturação de proteínas t’ã’m sido estudados. Por exemplo, na Patente US 4511003, os corpos refractáveis insolúveis como oranulos de somatotropina desnaturada agregada são encontrados no citoplasma do microorqanismo global, E.__Co1i , nos quais eles são produzidos. Estes corpos- refractáveis são formados por sobreprodução da proteína, de interesse especificada, tal como somatotropina, como resultado da célula E.Coli geneticamente engendrada para intencionalmente sobreproduzir a proteína desejada. Muitas vezes, o único mecanismo com que se podem tratar os- corpos refractáveis é com um forte agente tiesnaturante ou caótico afim de originar as moléculas impropriamente dobradas de ambos os produtos desejados (proteína) )o 11 para se desdobrarem e se tornarem ms-olú—
I* I i ΐΤ ty* *t[ V ?··» f? J j-t e as proteína veis» Além de originar esta oesnacuração, . H seguir Tenacurar na forma laonosiêrica apropriada afim de ser biológicamente activa. Esta forma monomsrica é espeeialmente importante para a somatotropina.. Muitas vezes, afim de obter o produto proteína, activo, temos- usado desnaturantes fortes tal como hiorocloreto de guanioma ou. ureia com concentrações muito eievadas.
agentes? caotrópicos tal como dodecilsuifato de sódio ÍSDS) como divulgado na Patente US 4677196 ou desnaturantes fracos tal como ureia usados de preferência com concentrações molares de 3 a 5 molares tal como divulgado na Patente US 473144© ou em que não se usa qualquer ureia como na Aplicação da Patente US 2854775 de 16 de Dezembro de 1988. A Figura 1 compara todos estes três processos da ureia.
Cada u® dos métodos tem certos problemas associados com eles» 0 hidrocloreto de guanidina é caro e deve ser substituido durante o processo de naturação afim de ocorrer a naturação» 0 SDS é um denaturante eficaz e menos caro do que o hidrocloreto de guanidina, mas liga—se com a proteína denaturada tão -apertadamente que torna difícil a remoção completa da proteína e aumenta os custos processuais» A ureia é normalmente usada como um agente denaturante ou caotrópico mais fraco., mas mesmo os métodos que utilizam ureia têm problemas associados com eles, tal como problemas de contaminação dos produtos- finais, manuseamento, armazenagem e tratamento de efluentes» Portanto, qualquer método que use baixas concen trações de ureia, um -agente que ajuda a melhorar a recuperação da forma monomérica própria do produto proteína, ê especificamente necessário na arte»
Aléffi disso, é a obtenção deste produto monómsro que é importante para chegar às proteinas produto que tem as activida— des fisiológicas _ e biológicas das somatropinas» 0 monómsro somatropina consiste de aproximadamente 19Í resíduos amino ácidos e tem o peso molecular de aproximadamente 22.0Θ© daltons» 0 monómero não está ligado ou não covalentemente ligado a outras moléculas monómero análogas»
Além da forma monóniero, as soinatotropinas podem existir na forma dimérics o que significa que duas moléculas monómero são cova len temer? te ligadas através de liqaçSes intermoleculares disulfureto ou nao covalentemente associadas uma com a outra. A molécula proteína tíímero consiste em dobrar o número de aminoàci-dos e dobrar o peso molecular do monómsro e forma-se5 infelismente3 pelas ineficiências de processos usados para solubilizar e renatursr os corpos refractáveis. Por outras palavras,· forma-se pelo processo de isolamento^ naturação e purificação necessário para obter o produto activo proteína a partir da inclusão insctiva de corpos (refractáveis) combinados dentro do microorganismo celular„
O presente invento fornece um processo ccmercialmente possível para a solubílização de proteínas por combinação efectiva do uso da ureia como um agente- solubílizante com óptimas condições de naturação usadas em processos ds dissolução aquosos que não utilizam a ureia. A naturaçao incluí a oxidação de resíduos ds cistina para formar ligações cistsina. 0 uso de concentrações molares muito baixas de ureia ocasiona vantagens de rendimento quando em comparação com outros -processos de ureia.
Β£§υΗ0_ΡΡ·..1Μ.ΝΤ0 presente invento diz respeito ao processo para a solubilização e naturação de somatotropinas através do uso de baixas concentrações de ureia em conjunto com um processo ds dissolução aquosa alcalina afim de maximizar a formação de monómero na etapa de solubi1ização do corpo refractével. como parte de um processo global para a produção de somatotropina purificada (recombinante). Este- método compreende a dispersão de corpos refractáveis de somatotropina numa, concentração molar
Ο-3.ΧΧ3 £30 U.reX-St q X aO a dS X q tá -H suficiente para solubilízar as 20 minutes), cora um pH necessário para solver as referidas carpas retractáveis e a seguir diluir a referida solução pela menos tr'ê's vezes com água de tal modo que a solução ureia resultante é uma concentração ds ureias muito fraca? i»e« 0,= 4 molar,, pH da solução resultante é mantido a um pH para permitir a, dobragem e oxidação monomenca própria da sostatotropina ε durante um tempo suficiente par ocorrer a referida dobragem e oxidação monomérica« έ portanto* um objectivo do presente invento, um processo para a solufailização de corpos re
Tornecer especial os ds soinatotropina, por combinação de um orocesso de dissolução aquosa alcalina com uma baixa concentração aquosa de ureia. Este resultado é não só benéfico e preferido para a Tormação do monómero mas hem vantagens sobre ambos os- processos
| divu | '1 gados | na, arte | elSVedo.5 tete·· St-tfíl t FíxU-Oe—· de Li | reia ou | |
| ftl Íí?» •~J —- — | π «lo | m ureia» | Hiêfô dlSSO r, ίΑϊΤϊ ohí J SBC TL Í VO CrQ prOSeíl 05 | invento | |
| ê o | de ti | Γί i Π X | mi car a | formação de dímeros e ainda permitir a | natura- |
| ÇS.O | pi' | do HiOnãmercl·. Estes e outros- ubjeutivus do | invento |
tornar se—áo aparentes peia assuriçac mais oetainaoa cto invente fornecida a seguir.
BREVE DESCRIõaD DAS FISURAS
A Figura entre um processo com alta concentração de ureia ureia e o processo do presente invento» Qs um termo análogo ao de corpos- refractáveis e pode ser aqui usado in termu tave1men te» iornete esquemaciuamente uma comparação * um processo sem orpos de inclusão” é
coma r b
A Figura 2 indica quí medida pela reacção de Ellman ou pela não redução de SDS-ΡΑΒΕ nos primeiros vinte minutos do presente processo tem lugar com uma velocidade total de cerca de 27 a 72, indicando assim que a maior parte da oxidação tem lugar numa condição diluida de ureia em comparação com a oxidação divulgada na Patente US 4652630.
A Figura 3 é uma indicação de que no minuto 5 de conservação dos corpos refractáveis a uma das mais altas concentrações de ureia, i.e. 2 molar ds ureia, não ocorre qualquer oxidação significante,
DESeRI®^™^AM_DGUÍsOIfi □ presente dis respeito a um método para a soludilização e naturação de somatotropinas compreendendo a dispersão de corpos refractáveis de somatotropina em água contendo cerca de 1,8 a 2,2 M de ureias o ajuste do pH dos corpos refractáveis em água até um nível para efectuar a solubilisaçãos de tal modo que a concentração da proteína somatotropina é cerca de 2 a 10 g/Ls. mantendo a referida solução resultante àquele pH e àquela concentração durante cerca de 2 a 2S minutos, diluição com águas e ajuste do pH de ί1,© a 12,5, com uma concentração resultante de ureia de cerca de ©,4 molar e um teor de somatotropina de cerca de 0,4 a 2,0 g/L| mantendo a solução ao pH reajustado durante tempo suficiente para fazer com que o teor de somatotropina em solução seja composto de- somatotropina monomérica apropriadamente dobrada com bom rendimento (aproximadamente 5 a 10 horas).
ft somatotropina conforme aqui usada indica (1) hormona de crescimento de animais, derivados, análogos e fragmentos de quaisquer espécies, por exemplo, humana, bovina, porcina.
ovina.5 caprina, equina, -de aves (galinha, pato, ganso, perú), peixe e outros? C2) percursores da hormona, de cregcimentc, tal como hormona de crescimento reduzida C-SH) e hormona de cresci- mento S-protegida, por exemplo., hormona de crescimento S—s-ulfonada? C3) variantes de hormona de crescimento ou seus percursores, por exemplo, estruturas que foram modificadas para aumentar e/ou encurtar a sequência amino ácido da hormona de crescimento, por exemplo a variante Ξ0Κ da hormona de crescimento humano, hormona metionilo de crescimento humano, hormona porcina de crescimento delta 7 e delta ‘7 e análogas? e C4) análogos de hormona de crescimento ou seus percursores, por exemplo estruturas nas quais a sequência amino ácido da hormona· de crescimento foi modificada por retirada ou substituição de um ou mais resíduos amino ácido» Ambas as somatotropinas recombinantemente derivadas e de ocorrência derivada, bera como qualquer outro tipo de somatotropina, podem ser utilizadas de acordo com o presente invento»
A primeira etapa na novo método é a dispersão dos corpos de somatotropina refractáveis numa baixa concentração molar de ureia em água, (de preferência água desionizada) com uma concentração apropriada» A concentração de somatotropina é um factor importante do presente invento e deve ser vigiada para· cair entre 2 e 1Θ g/L» Uma concentração apropriada de ureia é de cerca, ds 1,8 a 2,2 M e de preferência cerca de '2 M» pH da somatotropina concentrada é ajustado a uma gama de cerca de pH 11,5 a cerca de pH 12,5, de preferência cerca de pH 12,0 a cerca de PH 12,2 para solubilizar a somatotropina numa solução aquosa de ureia» Podemos usar qualquer base forte para ajustar o pH da solução (e»g„ a adição de hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio)» Isto tem lugar em geral num período de tempo relativaments curto, cerca de dois a vinte minutos é típico» A seguir, esta solução é diluída com água, de preferência
água desionicada, pelo menos tripla., de preferência quíntupla. Ctrês a cinco vezes),, A concentração ds somatotropins é agora de cerca de 2 q/L a í€> q/L, sendo preferido 4
Ηφί ss terem dissolvioo os corpos de sumatotropinas pH pode er reajustado a uma gamai de cerca de pH lí s. cerca de pH pri aumentei velocidade de nslurai-Bo» 0
Hr pH pode ser diminuído por qualquer método apropriado.
exemplo pela adição de ácido fosfórico» A gama reajustada é ds prefet 's’h~ :erca da dH 1í
a. oK para, mirtintizaçâo d«
5_£ x Π; ti: O «
Especialmente preferido é um pH de 11»5 a 11,7»
A tigura 1 comparai o presente processo com um processo sem ureia . yr uuBisSu
US 4652630=, ε o presente processo e mostra-se, que ao um processo com ureia 4!Ί« Além disso, faz-se a comparação directa entre um processo representativo com alta concentração de ureia5 como reivindicado na Patente contrário do que é afirmado naquela patente, o presente sistema não ocasiona a oxidação rápida» De facto., a velocidade ds oxidação do presente processo é calculada como sendo cerca de 0,35% por minuto ου. 27 a 77 para uma exposição de dois a vinte minutos de baixa concentração de ureia» Também, a Figura 3 confirma que o grau de oxidação tem lugar no período de dissolução da ureia, de baixa concentração, é insignificante considerando & necessidade final de precisar de monómero oxidado a 100% o qual é biologicamente activo» Estas comparações fornecem evidência das características únicas do presente processa, em que obtivemos bons; rendimentos do produto final, apesar dos ensinamentos das refef~’§nc XclS s
Além disso, podemos adicionar um agente tal como beta—mercaptoetanol ou ditiotreitol s a es»ta o usarmos, este agente de redução, deve ser ds redução., 50 J. UÇão » Ss
-adicionado
vez oe ser aiít-esj· οβ ^oxuoilizaçao.
Quatro diferentes lotes, laboratoriais de soiaatotropina são expostos ao processo do presente invento, e os resultados são fornecidos na Ta.oeia i.
Comparação entre os- Rendimentos em Monómero dos- Processos com Ureia. 2M? Ureia. 4M e Aquosos de Vários· Corpos
Ref rac t-áveis- Lavados
Rendimento em Monómero, 2
Lote ID
Ureia 4ri rtguubO b8,5 £ í%%) 75, í <1005 f 1 fS.*A '1
Esft, 3 £ 80 ? /) 67s© £89s25 58,3 £83,05 scj n a (79 zí. '
59, 1
| 0 rendimento | do monómero é | L.S. 1 LU 1 ·30υ UUiTlQ | a proporção | ||
| entre a 1 | c on c sn t r £?€ζ So | de soma to t ropi n a. | coro 22K dalton | medido por | |
| c r orna, tog | Γ T .1 d 5 p Γ ts | eação ylc e a con | i J_J L.’_i t.-H X | de somato— |
tropina medida, por rp-Hh’LU, ri peruenuagefn de sionofflsro normalizado no processo de ureia 2M está entre parêntesis.
SOMATOTROPINA BOVINA
| A | farelada | rfg? |
| TctíTí | geneti | (Ξ S ifí Sí |
| Í. £ | de soma | tetr* |
| é | centrifu |
I -O i 3.
inclusão) é centrifLigada para separar as células do caldo. As células são ds novo empapadas e desfeitas usando duas passaqsns a. 80Θ© psig através ds um homogenizador de Baulin» A suspensão ê centrifugada e os grânulos empapados de novo e tratados com lisozima e detergente Triton/x-100 a 37°C. A suspensão é centrifugada ε os grânulos são lavados duas vezes com agua e são centrifugados após cada lavagem.
Os grânulos resultantes? contendo a somatofropina bovina desnaturada insolúvel <bST)3 são dispersos em água desionizada a 25OC» 0 volume de água é escolhido ds tal modo que após a adição da ureia. -a concentração de somatotropina é de 5 g/L„ Juntamos a. ureia sólida a.té a concentração ds ureia ser 2M. A papa resultante é aquecida a 25°C para anular a ureia endotérmi™ ca. 0 pH é a. sequir ajustado a Í2., © por adição de hidróxido ds sódio 1M originando a dissolução visível dos corpos de inclusão. Após vinte minutos.. a solução é a sequir diluída· em quatro volumes de água desíonxzaoa a pri ϊι5o e envelhecida durante sbxe horas» Após a diluição em quatro volumes de água desionizada. a. oH 1Íj5j a concentração ds somatotropina é ds i g/L.,
No fim do envelhecimento o pH da solução diminuído até 10,8 usando ácido fosfórico ΪΜ. A solução é ultrafiltrad;
diafiltrada num cartucho de fibra, oca. cortada, com 10@K dalton tal como um Amicon/ H2&P10Ô-43, 0 permeato é a sequir concentrado
fosfórico ÍM e aplicada a 1 f o i equ i 1 i b r a d o c om bora t d tampão de equilíbrio? o NaCl 100 mMs borato 10 mM? desalinisado com uma soluçã cassetes cortadas com 10K d
| rada | é ajustada | a pH | 9 usando -ácido |
| 5g de | bBT por L | 0 St Γ£Ξ-ί | na a um permu- |
| já * | faross de | Cauda; 1 | Rápido/ o qual |
| 10mf | a pH 9' = | Após | í -5 VS.G(shVl CQCO. O |
| í | é sluído | usando | uma solução |
a condutividade do permeado solução desalinizada com a pa bí.
na
-a obtermos >a somatotropina bovina í siógicos e químicos estabelecidos. 0 bovina liofilizada é de 48% a partir a pH 9= 0 pico bBT ê concentrado e o de aiiiánia usando um ultra, filtro com alton tal como Millipore PelliconZ até ser inferior a 3feíí5- fflicrosiSBiens/cm· κ proximadamente ISO g/L s liofilízada bói) a qual passa ti rendimento de somatot' do caldo de fermentai ’Sopl — ;So»
EXEMPLO
SOMATOTROPINA RORCINA
A farelada de fermentação contendo células E.
quais foram geneticamente modificadas pa? u prudu^ir :orpos de inclusão de somatotropina porcina (pST) é centrífuqada para separar ss células flo caldo.
Os grânulos resultantes^ contendo a somatotropina porcina desnaturada ins-olúvel (pST), são dispersos em -água 25 °C» 0 volume de água é escolhido de tal modo que adição da ureia:
ncentração de somatotropina & de g/L. Juntamos* a ureia sólida até a concsntracão de ureia ser 2M.
A papa resultante έ aquecida a 25°C para, anular a ureia endotérmica do Exemplo í« D pH e a seguir ajustado a 12,0 por adição de hxdròxxdo de sódio ÍN originando a dissolução vxsívsl dos corpos de inclusão» Após vinte minutos, a solução é a seguir diluída em quatro volumes de áqua. desionizada a pH 11,5 e envelhecida durante sete horas. Após a diluição em quatro volumes de água desionizada a pH 11. .-.5., a. concen tração de somatotropina é de 1 g/L»
A solução é ultrafiltrada e diaTiitrada num cartucho de fibra oca cortada, com 100« dalton tal como um Amicon/ H26P100—43» D permeado e a seguir concentrado usando um cartucho ultraíiitrante ds espiral enrolada cortada com 5K dalton tal como Koch/ K—1-31 A.
h solução co»iCwntrada & ajustada a pH fosfórico 1M e aplicada a 15q de pST por L de resina a uns permu— tador aniónico tal como DEAE-Sefarose de Caudal Rápida/ o qual foi equilibrado com borato 10mMs a pH 9 = Após lavagem com o pST é eluído usando uma solução ai pH 9. 0 pico oST ê concentrado e tampão de equilíbrio^ o
NaCI IO® mt*15 borato 10 mo3 » desalinizada com uma solução de amónia diluída usando um ultra filtro com cassetes cortadas com Í0K dalton tal como Millipore Pel licor»/ até a condutividade do permeato ser inferior a 30© microsiemens/cm. .A solução desalinizada com aproximadamente IO® g/L e liofilízada para obtermos a qual passa testes biológicos e químicos estabelecidos·
Claims (7)
- lã„ - Processo para a solubilização & naturação ds somatotropinas, caracterizado por compreenders a dispersão e naturação de corpos retrácteis de somatotropinas numa solução aquosa ds ureia de cerca de i=S a 2.,2 M com um pH ε o tempo suficiente para dissolver os referidos corpos refráctsis e a seguir a diluição da referida solução pelo menos tris vezes com água com um pH s o tempo suficiente para resultar em somatot.ropina monomérica convenientemente dobrada.
- 2â„ - Processo de acordo com a Reivindicação í, caracterizado por o referido tempo para solubilizar os referidos corpos refráctsis ser de cerca de 2 a 2® minutos? por o referido pH ser de cerca de 11,® a 12,5? por o referido tempo suficiente para resultar em somatotropina monomsrica convenientsmente dobrada ser de 5 a 1® horas? e por a referida somatotropina ser humana, bovina, porcina, ovina, equina, caprina, de peixe ou de ave «
- 3â» - Processo de- acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por a referida somatotropina ser somatotropina bovina ou por a referida somatotropina ser somatotropina porcina.
- 4â„ - Processo de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por compreender adicionalmentes a adição & solução de ureia, antes da diluição com pelo menos o triplo de água, de um agente de reduçãoc
- 5ã. - Processo de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por o referido agente de redução ser fcata-msrcaptoetanol, ditioireitol ou suas combinaçSes.terizado por a referida somatotropina ser humana, bovina, porcina 3 ovina, equina, caprina, de peixe ou de ave.
- 7â» - Processo de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por a referida somatotropina ser somatotropina bovina ou porcina»
- 8a» - Processo para o isolamento e purificação de somatotropina recombinantemente produzida, caracterizado por compreenders- a lavagem dos corpos retrácteis contendo a referida somatotropina e outras proteínas com águas a dissolução dos referidos corpos refrácteis a um pH de li,® a 12,5 sm cerca de 1,8 a 2,2 M de ureia -ds tal modo que a concentração da proteína somatotropina seja cerca de 2 a i® g/l§ a manutenção da referida solução resultante àquele pH durante cerca de dois a. vinte minutos? a diluição da referida solução pelo menos três vezes- com -água? e ajustamento do pH da. referida solução de 11,3 a 12,0, de tal modo que a concentração de ureia seja, cerca ds ®,4 molar e a concentração de somatotropina seja de cerca de ®,4 a 2,© g/1? e a manutenção da referida solução durante S a 1® horas» vã, - Processo de acordo com a Reivindicação tí, carcaterizado por a referida somatotropina ser humana, bovina, porcina, ovina, equina, caprina, de peixe ou ds ave» l©a„ - Processo de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por a referida somatotropina ser somatotropina bovina ou porcina? e por o referido tempo ser de 7 a 8 horas»
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