JPH03181853A - 酵素免疫測定用カートリツジ、それを用いた測定方法及び測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫反応（抗原−抗体反応）を利用して生体試
料（例えば血液、血清、血漿、尿、髄液など）のような
多成分系に微量含まれる特定の物質を測定するのに適し
た酵素免疫測定用カートリッジ、それを用いた測定方法
及び測定装置に関するものである。本発明は以下臨床検
査における微量生体物質の測定について説明するが、薬
学、生物学、動物学、植物学、農学、化学、検査等を取
り扱う広い分野への適用が可能である。

（従来の技術） 生体の生理活性に関与する物質は概して微量であり、し
かも生体に対して非常に重要な役割を演じるものが少な
くない。したがって、このような微量の生理活性物質を
定量的に測定することは医学、生化学等の生物関連分野
にとって重要であり、そのための種々の測定方法が考案
され、実用化されている。なかでも酵素を標識として用
いる酵素免疫測定法が臨床検査分野で広く利用されてい
る。

かかる測定法では、まず測定対象物質である抗原（また
は抗体）と特異的に結合し得る抗体（または抗原）を固
定化した固相を試料溶液と酵素で標識された第２抗体（
または抗原）と同時、または逐次的に接触させて免疫反
応を行なわせた後、洗浄し、しかる後に該固相上に残存
している酵素標識体の活性を測定することによって試料
溶液中の抗原（または抗体）の量を測定するものである
。

かかる測定方法の代表例として不均一法ＥＩＡ、いわゆ
るＥｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　１ｍ１ｕｎｏ　５ｏｒ
ｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ（ＥＬＩＳＡ）が知られている。

ＥＬＩＳＡにおいては、試料溶液中の測定対象物質を捕
捉するために、測定対象抗原（または抗体）と特異的に
結合する抗体（または抗原）を固定した固相として試験
管、マイクロプレート等が用いられる。それに加えて測
定対象が抗原の場合、サンドイツチ法ＥＬ　Ｉ　ＳＡに
おいては該抗原に結合し得る第２抗体に酵素を標識した
酵素標識第２抗体が、また競合法ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおい
ては測定対象抗原と同一の抗原に酵素を標識した酵素標
識抗原が用いられる。

上記標識として用いられる酵素に対する基質溶液と、そ
してさらに必要ならば発色試薬を固相と接触させる。す
ると基質溶液の分解反応に伴ない基質溶液の光学的性質
が変化するので、その変化を観察する。

基質溶液の光学的性質の変化を観察するには、従来から
いくつかの方法が知られている。そのうち機器を用いる
方法としては、吸光光度計、蛍光光度計、化学発光光度
計などで基質溶液の光学的性質の変化を測定するもので
ある（例えば、石川、回合、宮井、酵素免疫測定法、医
学書院（１９８２）参照）。

また、他の方法として基質溶液と対照基質溶液を対比さ
せて基質溶液の色の違いを肉眼で観察して抗原（または
抗体）の存在を判定するものがある（例えば特開昭６０
−１．２８３６９号参照）。

しかしながら機器を用いたこれらの光学的測定法は安定
な光源、高感度の光度計、精密な光学系増幅回路等を要
するために、高価で、大型の複雑な装置にならざるを得
なかった。また測定するに当り、特殊な技術を必要とす
るため取扱いのための専門の技術者を配置しなければな
らなかった。

一方肉眼で直接観察する方法は、定性的な測定方法であ
り、色の変化のバラツキや観察者の主観が入るので判定
に個人差が生じやすい。さらに、極く微量の物質の測定
の場合には色の変化が少なく判定が困難であった。

本発明者らは、かかる従来の１ｊｌｌ＋定方法のもつ欠
点を改良し、観察者の主観による判定基準の曖昧さを除
去して、基質溶液の分解反応を客観的に、しかも高い検
出精度で測定する方法として基質溶液のｐＨ変化をｐＨ
電極で測定する方法を特開平１−２１２３４７号に提案
した。

（発明が解決しようとする課題） かかる測定方法においては、通常ｐＨ１１極としてｐＨ
感応性電界効果トランジスタ（ｐＨ−ＦＥＴ）、固相と
してピペットチップ形状の細径管の先端部内壁、標識酵
素としてウレアーゼ、また基質として尿素が用いられる
。

ｐＨ電極を用いる酵素免疫測定法は、（１）ｐＨ電極が
従来の光学的測定系に比べて構造がきわめて簡単である
。（２）固相としてピペットチップ形状の細径管を用い
るので試料の希釈から洗浄までのすべての操作を分注手
段で行うことができるなどの利点があるが、上記提案で
はｐＨ電極を利用した実験室規模の酵素免疫測定方法及
び装置を提案したにとどまり、実用的な測定方法及び装
置は未だ提案されていない。

したがって本発明の目的はｐＨ３［！極を用いて酵素免
疫測定を自動的に行う実用的な方法及び装置を提供する
ことである。

さらに上記測定方法及び装置を用いると各種感染症の抗
原や抗体、各種ホルモン、各種ガンマーカ、各種薬物等
多数を測定することができる。しかも一般に酵素免疫測
定法においては、固相、酵素標識体、基質、希釈用緩衝
液（以下希釈液と略記する）、洗浄用緩衝液（以下洗浄
液と略記する）等多くの試薬が用いられる。これらの試
薬のうちいくつかは測定項目毎に異なるために、従来は
これらの試薬は一つのキットとしてまとめた形態で販売
されてきた。すなわちユーザは測定項目が変わるごとに
専用のキットを取りだし、所定の手順で測定を行うこと
になる。一般的にキットのサイズは数十ないし散百検体
分であり、数十ないし数百程度の検体をまとめて１項目
測定するには適しているが、任意の測定項目を任意の順
序で測定するには不適当てあった。

したがって本発明の他の目的は測定項目ｌ検体分の専用
試薬その他をカートリッジ化することにより、任意の測
定項目を任意の順序で測定することを可能とした酵素免
疫測定用カートリッジを提供することである。

（課題を解決するための手段） 本発明は測定されるべき試料を収容するための試料カッ
プと、ピペットチップ形状の希釈用細径管が収容された
希釈カップ及び反応カップが一体に配列された酵素免疫
測定用のカートリッジであって、該反応カップの底部に
凍結乾燥させた酵素標識試薬が収容され、かつ少くとも
先端部内壁に測定対象物質たる抗原（または抗体）と結
合する抗体（または抗原）が固定されたピペットチップ
形状の固相用細径管が、該反応カップ内にその先端が酵
素標識試薬から離間して収容されるとともに、上記各カ
ップの上端開口がシール片で気密に閉塞されたことを特
徴とする酵素免疫測定用カートリッジである。

また本発明は上記酵素免疫測定用カートリッジを用いた
酵素免疫測定方法であって、 （１）希釈カップ内に収容されたピペットチップ形状の
希釈用細径管で試料カップ内の試料および希釈液を希釈
カップ内に注入し、該希釈カップ内で所定の倍率に希釈
された試料液体を調製する工程。

（２）反応カップ内に収容されたピペットチップ形状の
固相用細径管の先端部を希釈カップ内の試料液体中に浸
漬して１次免疫反応を行わせる工程。

（３）反応カップ内に溶解溶液を注入して、該反応カッ
プ内の凍結乾燥された酵素標識試薬を溶解させた後、該
溶解させた酵素標識体溶液中に１次免疫反応が終了した
固相用細径管の先端部を浸漬して２次免疫反応を行わせ
る工程。

（４）２次免疫反応が終了した固相用細径管を洗浄する
工程。

（５）洗浄された固相用細径管を基質溶液で満たされた
測定セル内に設けられたｐＨ電極の感応部に被せて、該
細径管とｐＨ電極の感応部間における基質溶液の分解反
応に伴うｐＨ変化を測定する工程。

からなる酵素免疫測定方法である。

さらに本発明は上記酵素免疫測定用カートリッジを用い
た酵素免疫測定装置であって、酵素免疫測定用カートリ
ッジを操作ステーションへ供給する手段と、 該操作ステーションに設けられた、希釈液入口と溢流液
出口を有する希釈液セルと、該希釈液セルへ希釈液を供
給するポンプを備えた希釈ステーションと、洗浄液入口
と溢流液出口を有する洗浄液セルと、該洗浄液セルへ洗
浄液を供給するポンプを備えた洗浄ステーションと、基
質溶液入口と溢流液出口を有し、かつ基質溶液の流通路
にｐＨ電極の感応部を露出させた測定セルと、該測定セ
ルへ基質溶液を供給するポンプを備えた測定ステーショ
ンと、 該操作ステーションに供給されたカートリッジの希釈カ
ップ及び反応カップ内に収容されたピペットチップ形状
の希釈用細径管及び固相用細径管の上端開口に挿嵌され
るピペットヘッドを一端に有し、他端にチューブを介し
てシリンジが接続された分注手段と、 該ピペットヘッドを昇降させる手段と、該昇降手段を水
平方向に往復移動させる手段と、該ピペットヘッドが挿
嵌された細径管の上端を押し下げて細径管を脱離させる
手段 とを備えた酵素免疫測定装置である。

（実施例） 本発明の酵素免疫測定用カートリッジの一例を図面にて
説明する。第１図はカートリッジの斜視図であり、第２
図は断面図である。該カートリッジ（１）は試料カップ
（２）、希釈カップ（３）及び反応カップ（４）で構成
され、希釈カップ（３）及び反応カップ（４）内にはそ
れぞれピペットチップ形状の希釈用細径管（７）及び固
相用細径管（８）か収容されている。またカートリッジ
の側壁（５）には測定項目を表示するバーコードラベル
（９）が貼着されている。さらに上記各カップ（２）、
（３）、（４）の上端開口にはソール片（１０）が貼着
されて、各カップを気密に閉塞している。第２図に示す
ように反応カップ（４）の底部には凍結乾燥された標識
抗体（または標識抗原）（６）が収納されている。また
反応カップ内に収容された固相用細径管（８）の先端部
内壁（Ｉｔ）には抗体（または抗原）が固定化されてい
る。

本発明のカートリッジは一体成形することが好ましく、
その材質としてはポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ
塩化ビニル、ポリテトラフロロエチレン、ポリメチルメ
タクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネイト、ポリ
アミド、ポリエステル等、各種のプラスチックが用いら
れろ。３つのカップの上端開口は一枚のシール片（１０
）で閉塞することが望ましいので、各カップの上端開口
は同一平面とすることが好ましい。シール片（１０）は
特に固相用細径管と凍結乾燥された酵素標識体を乾燥状
態に保存するためのらのであるので、アルミニウムラミ
ネートフィルムのような通気性の低い材料が用いられる
。また希釈用細径管（７）および固相用細径管（８）の
材質はガラス等を使用してもよいが通常上記のカートリ
ッジ成形用に列記した樹脂のいずれかが使用される。

試料カップ（２）は試料液体をその中に仕込むためのも
のである。必要な試料液体の容積は通常２００μＱ以下
であるから、試料カップの内容積としては２０〜５００
μＱが好ましい。希釈カップ（３）はその中て前記の試
料液体を所定の倍率に希釈するためのらのである。この
希釈操作には希釈カップ（３）内に収容されている希釈
用細径管（７）が用いられる。希釈操作に用いられた希
釈用細径管（７）は直ちに廃棄される。希釈用細径管（
７）をこのように使い捨てにすることにより、それを共
用にした時に生じる、いわゆるキャリーオーバーを防ぐ
ことができる。希釈カップ（３）はまたその中で固相用
細径管（８）と希釈試料液体との間の第一次免疫反応を
行うためにも使用される。希釈カップ（３）の内容積と
しては通常０．５〜２．０ＩＩ（ｌが好ましい。反応カ
ップ（４）中には固相用細径管（８）と凍結乾燥した酵
素標識体（６）が収納されているが、固相用細径管（８
）は上記のように、まず希釈カップ（３）の中で第一次
免疫反応を行うために使用される。また、溶解溶液、例
えば共通試薬の希釈液または洗浄液を吸引して反応カッ
プに注入して反応カップ（４）中の凍結乾燥標識体（６
）を溶解するためにも使用される。その後絞細径管（８
）の先端部は溶解された標識体溶液中に浸漬されて第二
次免疫反応に供される。反応カップ（４）の内容積は希
釈カップ（３）と同様に０５〜２．０ｍ１２が好ましい
。溶解前の凍結乾燥酵素標識体（６）は反応カップ（４
）の中に固相用細径管（８）と共に収容されるが、その
時標識体（６）と固相用細径管（８）は絶対に接触して
はならない。

そのために、凍結乾燥標識体（６）は反応カップ（４）
の底部に収納され、固相用細径管（８）はその上部に離
間して収容される。

しかし、凍結乾燥標識体（６）を少量の溶解溶液、例え
ば希釈液で再溶解した時に標識体溶液中に固相用細径管
の先端部を浸漬する必要があるので、離間させた凍結乾
燥標識体（６）の上面と固相用細径管（８）の先端部の
距離は可能な限り短くすることが望ましい。通常その距
離は０．２〜２ｍｍ程度である。このような位置に凍結
乾燥標識体を保持するために第２図で示されるように反
応カップ（４）の底部付近にしぼり部（１２）を設ける
ことが好ましい。

本発明の酵素免疫測定用のカートリッジは測定項目固有
の試薬としての固相用細径管と酵素標識体、および測定
項目を表示するバーコードと一検体の測定を行うに必要
な使い捨て品としての試料カップ、希釈カップ、反応カ
ップ、希釈用細径管を備えている。したがって、使用者
は該カートリッジの試料カップの中に試料液体を入れて
、それを後述する装置に装着するのみで測定が自動的に
行われる。

次に上記酵素免疫測定用カートリッジを使用した酵素免
疫測定装置の一実施例を図面にて説明する。第３図は本
発明装置の正面図、第４図は平面図、第５図は本発明装
置の基本構成を示す概略図である。

本発明の酵素免疫測定装置は、上記カートリッジ（１）
を希釈ステーション（Ｂ）、洗浄ステー７ョン（Ｃ）及
び測定ステーション（Ｄ）がこの順序で配列された操作
ステーション（Ａ）へ供給する手段と、該操作ステーシ
ョンにおいて、ピペットチップ形状の希釈用細径管（７
）及び固相用細径管（８）の上端開口に挿嵌されるピペ
ットヘッド（２８）を介して細径管内へ肢体を吸引また
は細径管内に吸引された液体を吐出する分注手段（Ｅ）
と、該ピペットヘッド（２８）を昇降させて細径管を各
カップに挿脱させる昇降手段（Ｆ）と、該昇降手段を水
平方向へ往復移動させる往復移動手段（Ｇ）と、ピペッ
トヘッドに挿嵌された細径管を脱離させる手段（）Ｉ）
を備えている。

カートリッジ供給手段はカートリッジ（１）を操作ステ
ーション（Ａ）へ供給するもので、通常カートリッジを
円周に沿って移動させるターンテーブル機構やカートリ
ッジを直線的に移動させるコンベア機構等が採用される
。第３図〜第５図ではコンベア機構（３１）を使用した
例を示している。また操作ステーション（＾）内をカー
トリッジが移動する間に反応カップの中で免疫反応がお
こなわれる。

免疫反応は室温で行われることもあるが、通常は一定温
度、たとえば３７℃で行なわれるため、カートリッツ移
動中にカートリッジを一定温度に保持させることが好ま
しい。そのため第４図に示すようにコンベア（３１）を
ヒーティングブロック（２９）上に張設したり、またコ
ンベア機構（３１）を密閉部材で被覆して、その中に加
温された空気を供給してカートリッジ周囲を３７°Ｃに
保持してもよい。

上記コンベア機構には、例えば一定間隔にカートリッジ
把持機構（３１）が設けられて１．該把持機構でカート
リッジの両側端が把持され、コンベアの移動により間欠
的または連続的にカートリッジを移動させる。操作ステ
ーション（Ａ）で測定が終了したカートリッジ（１）は
その時点で把持機構（３０）が解除されてコンベア機構
（３１）の端部に設けられたカートリッジの廃棄容器（
１９）に排出される。

コンベア機構（３１）の操作ステーション入口にはカー
トリッジのＩＩ＋壁に貼着されたバーコードラベル（９
）を読み取るバーコードリーダ（３２）が設けられ、操
作ステーションに供給されるカートリッジのバーコード
を読み取る。

操作ステーション（八）には該ステーションの人口側か
ら順に希釈ステーション（Ｂ）と洗浄ステーション（Ｃ
）及び測定ステーション（Ｄ）が配置されている。

希釈ステーション（Ｂ）には上面に設けられた溝の一端
に開口する希釈液人口と他端に開口する溢流液出口を有
する希釈液セル（３６）が設けられている。希釈液は容
器（４４）からポンプ（４０）によって希釈液セル（３
６）に供給され、該セルの上面に設けられた溝から溢流
し、溢流液出口から後述する洗浄液及び基質溶液ととも
にポンプ（４１）によって廃液容器（４５）に排出され
る。

洗浄ステーション（Ｃ）には上記希釈液セル（３５）と
同一形状の洗浄液セル（３５）が設けられている。

洗浄液は洗浄液容器（４３）からポンプ（３９）によっ
て洗浄液セル（３５）に供給され、該セルの上面に設け
られた溝から溢流し、溢流液出口からポンプ（４１）に
よって廃液容器（４５）に排出される。

試料希釈液および洗浄液を所定温度例えば３７°Ｃで使
用する場合、洗浄液セル（３５）および希釈液セル（３
６）を恒温化する必要があるが、その場合にはこれらの
セルを恒温ヒートブロックとすることが好ましい。かか
るセル（３５）、（３６）には通常アルミニウムなどの
金属が用いられる。

測定ステーション（Ｄ）には基質溶液の入口と溢流液出
口を有し、かつ基質溶液の流通路に感応部を露出させた
ｐＨ電極（１８）が収容された測定セル（３３）が設け
られている。基質溶液は洗浄液と尿素原岐を各に洗浄液
容器（４３）と尿素原演容器（４２）からポンプ（３８
）によってミキサ（３４）に供給し、該ミキサ（３４）
で混合することによって調製され、その後測定セル（３
３）に供給される。該測定セルから溢流した溢流液は溢
流液出口からポンプ（４１）によって廃液容器（４５）
に排出される。

尿素基質溶液としては、濃厚原波を希釈して用いる方式
と、すでに希釈された尿素基質溶液を用いる方法がある
が、すでに希釈された基質溶液を用いるときにポンプ（
３８）は尿素基質溶液のみを送ることとなり、ミキサ（
３４）は不要となる。

第６図は測定セルの詳細断面図であり、該セルは金属製
のブロック（６０）からなり、セルの下部側壁に基質溶
液の入口（６１）、該人口と連通ずる測定室（６２）、
測定室（６２）の上部に設けられた基質溶液溢流口（６
３）、および該セルからの基質溶液出口（６４）を備え
た基質溶液流路を形成している。この測定室（６２）に
はｐＨ電極（６５）がその感応部が基質溶液の流路に露
出するように収容されている。

金属製ブロックからなる測定セル（６０）は基質溶液（
通常尿素が用いられる。）に対して耐腐蝕性を有するも
ので通常チタン、ニッケルが好ましく用いられる。アル
ミニウムなどを用いる場合には基質溶液との接触面を耐
腐蝕性樹脂でコーティングする必要がある。またｐｉ−
を測定を一定の温度で行う場合には金属製ブロック（６
０）に伝熱線を収容するための開孔（９０）を穿設し、
この開孔に伝熱線（９１）を収容して、該ブロックを一
定の温度に加温する。

測定室（６２）内に収容されるｐＨ１を極（６５）とし
ては従来から最も多用されているいわゆるガラス電極の
他に、ｐＨ感応性電界効果トランジスタ（以下ｐＨ−Ｆ
ＥＴという）、酸化パラジウム／パラジウムワイヤ等の
表面酸化金属線タイプのｐＨ電極、プロトン受容体を含
有するポリ塩化ビニルから成るｐＨ感応性高分子膜を金
属線や炭素線にコートしたコーチイドワイヤ型のｐＨ電
極等、各種の微小ｐＨｉ！極を用いることができる。し
かしながらガラス電極型のｐＨ１Ｋ極は、細径化すると
誘導ノイズが増大する傾向がある。表面酸化金属線型ｐ
Ｈ電極は細径化が容易であるが、長期の水中寿命等に難
点がある。コーチイドワイヤ型のｐＨ電極も細径化が容
易であるが、ｐＨ変化に対する直線応答域が狭い、水中
寿命が短いなどの難点がある。そのためこれらのｐＨ電
極を使用する場合には上記問題点を予め解消しておく必
要がある。

それに対してｐＨ−ＰＥＴは（１）細径化が容易である
。（２）細径化した時の誘導ノイズが少ない、（３）Ｉ
Ｃ技術で製造するので、電極間の特性のバラつきが小さ
くでき、かつｐＨ感応面（ゲート部）を微小化すること
ができる。（４）ｐＨ変化に対する応答が極めて速く、
かつ応答曲線にヒステリシスが残らない、（５）ｐＨ変
化に対する直線応答域が広い、（６）水中の保存寿命が
半永久的で、かつｐＨ感度等の特性の経時変化が少ない
、（７）温度検出用のダイオードを基板に取り付けるこ
とができる等の優れた特徴を有しているので測定室（６
２）内に収容されるｐＨ電極として最適である。第６図
はｐＨ−ＰＥＴを使用した例を示している。ｐＨ−Ｆ　
Ｅ　Ｔ　（６５）は外筒（６６）の先端にｐＨ−Ｆ’Ｅ
Ｔの感応部を突出させ、電極に連結させたリード線を外
筒の他端に延在させ、ｐＨ−ＦＥＴの電極部と外筒内壁
間に樹脂を封入し、−かっ外筒を閉塞している。さらに
、該外筒（６６）と比較電極（６７）とをより太い外筒
（６８）に挿通し、先端を樹脂で閉塞している。この太
い外筒（６８）は端部にコネクタ部（７１）を設けたハ
ウジング（６９）内に挿入され、該ハウジング内壁と外
筒（６８）及び比較電極（６７）間は樹脂が封入されて
いる。コネクタＩＩ（７１）にはリード線接続用のピン
が納められており、これにすくなくともｐＨ−ＰＥＴの
ソース、ドレイン、および比較電極の３本のリード線が
接続される。ｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔ　（６５）は外筒（６６
）にチップカプラ（７５）を挿入した後、電極最外筒に
設けられたネジ部（７２）によってセル（６０）の測定
室（６２）の中に挿入され、０リング（７３）とおさえ
ネジ（７４）によって所定のは置に固定される。ｐＨ測
定時には固相用細径管（８）が測定セルの上部から測定
室内に挿入され、チップカブラ（７５）に導かれてｐ　
Ｈ−Ｆ　Ｅ　Ｔ　（６５）に被せられる。

チップカブラ（７５）は固相用細径管（８）をｐＨＦ　
Ｅ　Ｔ　（６５）に被せるためのガイドとしての役割を
有している。該チップカプラは第７図及び第８図（第７
図のＡ−Ａ矢視図）に示すように固相用細径管（８）の
ガイドとしての中空部（８０）の周囲にクローバ−状の
基質溶液流路を形成する４ケの空胴（８１）が設けられ
ている。

細径管内への液体の吸引または細径管内の液体を吐出せ
る分注手段（Ｅ）は細径管の上端開口に挿嵌されるピペ
ットヘッド（２８）と該ピペットヘッドの端部にチュー
ブ（２６）を介して接続されたシリンジ（２５）で構成
されている。（２７）はチューブ（２６）の分岐に取着
されたチューブ開閉弁である。

該ピペットヘッド（２８）はカップ内に細径管を挿脱さ
せる、例えばシリンダなどからなる昇降手段（Ｆ）に連
結されて該昇降手段の作動と連動して昇降する。該昇降
手段（Ｆ）はさらに水平方向移動手段（Ｇ）、例えばＸ
軸駆動アーム（２２）に連結されてＸ方向に往復移動さ
れる。また必要であれば該Ｘ軸駆動アームをＹ軸駆動ア
ーム（２１）に連結するとＹ方向に往復移動させること
ができる。

また昇降手段（Ｆ）には第９図に示すようにピペットヘ
ッド（２８）に挿嵌された細径管の上端を下方へ押圧し
て細径管をピペットヘッド（２８）から脱離させる手段
（Ｉ（）が設けられている。（３７）は希釈操作の終了
した希釈用細径管を廃棄するための容器である。

第１０図は本発明装置の制御回路図であり、上記各部の
作動はコンピュータによって制御される。

ｐＨ３ｌ極出力から測定対象物質の濃度への変換のため
のデータ処理もコンピュータによって行われ、その結果
はデイスプレーもしくはプリンタまたはその両者に表示
される。

またｐＨ電極としてｐＨ−ＦＥＴを使用する場合にはそ
の出力の読み取りとして特開昭６０−４８５１号、同６
０−２２５０５６号などに記載されたソースフォロワ型
の測定回路が用いられる。

次に本発明のカートリッジを用いた酵素免疫測定方法に
ついて、２ステツプサンドイツチアツセイの場合につい
て説明する。下記の説明において固相用細径管には測定
対象抗原（または抗体）を捕捉するための抗体（または
抗原）が固定化されている。また凍結乾燥標識体として
は測定対象物質をサンドイッチするための標識抗体（ま
たは標識抗原）が用いられる。ユーザは所望の測定項目
用のカートリッジを取りだし、カートリッジの上面に貼
着されたシール片（１０）をはがし、試料カップ（２）
の中に２０μＱ程度の試料液体を入れ、これをカートリ
ッジ供給用のコンベア機構（３１）にセットすると第１
０図に示す測定回路ｊこよって以下の各操作が全て自動
的に行われる。

■上記コンベアによりカートリッジ（Ｌ）が操作ステー
ション（Ａ）へ供給されるとまずバーコードリーダ（３
２）がバーコード（９）から測定項目等を読み取り、そ
れに応じた操作プログラムや検量線が選択される。

■次はカートリッジが希釈ステーション（Ｂ）に送られ
ると昇降手段が作動してピペットヘッド（２８）が希釈
カップ（３）内の希釈用細径管（７）を装着して試料カ
ップ（２）内の試料溶液を所定量（例えば１０μの吸引
し、直ちに希釈液セル（３６）に移動して、所定量の希
釈液（例えば９０μ０を追加吸引する。次いでピペッタ
ヘッドが希釈カップ（３）に戻り、その中に試料と希釈
液の混合溶液（例えば１００μ０を吐出し、さらにその
液の再吸引−再吐出を繰り返して試料と希釈液とを混合
することにより所定の倍率に（例えば１０倍）希釈され
た試料溶液を調製する。上記希釈用細径管は容器（３７
）に廃棄される。

■次にピペッタヘッド（２８）が反応カップ（４）内の
固相用細径管（８）を装着し、これを希釈カップ（３）
内の希釈試料液の中に挿入して所定Ｍ（例えばｌＯμＱ
）の希釈試料液を吸引した後、該細径管（８）を希釈カ
ップ（３）内に離脱静置させ、この状態で所定時間（例
えば１０分間）−次免疫反応を行う。

■−次免疫反応を終えるとカートリッジを洗浄ステーシ
ョン（Ｂ）へ移動させる。そして該ステーションでピペ
ッタヘッドが固相用細径管を再装着し、これを希釈液セ
ル（３６）に移動し、該セルの上面に設けられた溝をオ
ーバーフローしている希釈液を数回吸引−吐出して該細
径管を洗浄する。

そのあと所定量（例えば２０μＱ）の希釈液を吸引し、
ピペッタヘッドをカートリッジの反応カップ（４）に移
動し、その中に吸引した希釈液を吐出して凍結乾燥され
た標識体（６）を溶解させる。標識体をより完全に溶解
するために、反応カップ内で溶解した標識体溶液を数回
吸引−注出して完全に溶解させた後、固相細径管（８）
を反応カップ（４）内に離脱静置させ、この状態で所定
時間（例えば５分間）第二次免疫反応を行った後、カー
トリッジを測定ステーション（Ｃ）へ移動させる。

■第二次免疫反応を終えた固相用細径管（８）をピペッ
タヘッドに再装着し、これを洗浄液セル（３５）に移動
し、該セルの上面に設けられた溝をオーバーフローして
いる液を数回吸引−吐出して、該細径管を洗浄する。そ
のあと該細径管を測定セル（３３）に設けられた測定室
内に挿入し、該測定セル内を流通する尿素基質溶液を吸
引した後、ｐＨ−ＦＥＴに被せ、該細径管とｐＨ−ＦＥ
Ｔの間に封入された基質溶液のｐ）［変化を測定する。

ｐＨ変化測定中に、チューブ（２６）の温度が変化する
と、チューブ内の空気の体積が変化し、これがｐＨ−Ｆ
ＥＴと細径管で形成される間隙に封入された基質溶液の
流動を誘起し、測定誤差を生じる恐れがある。そのため
にｐＨ変化測定中にチューブ開閉弁（２７）を開いて、
チューブ内の圧力を大気圧に解放することが好ましい。

ｐＨ変化はｐＨ−ＦＥＴのソース電位の変化とし読み取
られる。そして、通常細径管がｐＨ−ＦＥＴに被せられ
た後数十秒間のいずれかの時間帯における、ソース電位
の変化速度が算出され、その変化速度があらかじめ求め
られた換算式によって測定対象物質の濃度に換算表示さ
れる。

本発明のカートリッジ、それを用いた測定方法及び装置
はサンドイツチ法および競合法の酵素免疫測定に使用で
きる。また本発明はいわゆる２ステツプサンドイツチ法
および２ステップ競合法について説明しているが、原理
的にはＩステップのサンドイツチ法および１ステツプの
競合法にも適用することが可能である。これら１．ステ
ップ法を用することが可能である。これらＩステップ法
を採用する際には、測定対象物質の濃度が極端に高くな
ったときに検出出力がかえって低下すると言う、いわゆ
るプロゾーン現象を防止するようなアッセイ条件を設定
する必要がある。

（発明の効果） 以上性べてきたように本発明の酵素免疫測定用のカート
リッツ、それを用いた測定方法及び装置は （１）任意の測定項目を任意の順序で測定することがで
きるため少数の検体でも試薬のロスなく、中小規模病院
での検査にも応用できる、（２）簡単なハードウェアで
完全自動化を行うことができる、 といった特徴の他にさらに、 （３）ピペットチップ形状の細径管の先端細径部と言う
微少な領域で免疫反応および酵素反応を行わせるので、
それぞれの反応か極めて速やかであり、反応時間が短く
て、また使用する試料液体の量もわずかでよい、 （４）酵素免疫測定方法においては、一般に固相用細径
管の洗浄が重要で結合体／遊離体分離と称されているが
本発明では、こ−れを分注手段によって行うので洗浄用
の特殊な駆動部を必要としない。

という優れた効果を有している。

実験例１ 本発明の酵素免疫測定用カートリッジを、第３図に示す
測定装置に適用して、アルファフェトプロティン（ＡＦ
Ｐ）の測定を行った。この場合、固相用細径管には抗Ａ
ＦＰ抗体を固定し、反応カップの底部に抗ＡＦＰ抗体の
ウレアーゼ標識体の凍結乾燥体を収納した。

また測定項目によらない共通試薬としては次のものが用
いられた。

希釈液：　０．０９１５Ｍリン酸水素２ナトリウム＋０
、ＯＮ５Ｍリン酸ナトリウム（ｐ　Ｈ７，８）洗浄ｔ　
：　０．１Ｍ塩化アンモニウム＋０．１５４Ｍ塩化ナト
リウム 基質液：　０．１Ｍ塩化アンモニウム＋０．１５４Ｍ塩
化ナトリウム＋０．１Ｍ尿素 ＡＦＰ測定用のカートリッジを取り出し、シール片を開
いた後、その試料カップの中に２０μｇの血清試料を入
れた。次に該カートリッジを測定装置に装着し以下の順
序で測定を行った。

ａ）分注器が、希釈カップの中に収納されている希釈用
細径管を装着し、試料カップ中の試料を１０ｕ（ｌと希
釈液セルの希釈液９０μｅとを吸引し、これを希釈カッ
プ中に吐出し、１０倍希釈された試料溶液を調製した。

その後希釈用細径管は廃棄用ボトルの中に廃棄された。

ｂ）分注手段により、反応カップ中に収納されている固
相用細径管を装着し、これを上記１０倍希釈試料溶液の
中に離脱することにより、第１次免疫反応が開始された
。その後この状態で希釈カップ内の細径管は３７℃で１
０分間温置された。次し）で再び分注手段が、該細径管
を装着して、これを希釈液セルに移動し、希釈液を吸引
−吐出することにより洗浄がおこなわれた。

Ｃ）分注手段が固相用細径管を装着したまま、該希釈液
を３０μｅ吸引し、これを反応カップ中に吐出し、吸引
−吐出をくりかえすことにより該カップ底部にある凍結
乾燥標識体を溶解した。その後絞チップを該カップ中に
離脱させることにより、第２免疫反応が開始された。こ
の状態でカップ内のチップは３７℃で５分間装置された
。

ｄ）分注手段が該固相用細径管を再装着し、該細径管を
洗浄液セルに移動させ、そこで洗浄液を吸引−吐出する
ことにより該細径管を洗浄し、洗浄液を吐出した後、細
径管をｐＨ測定セルの中に挿入しながら、基質溶液（ｌ
素および塩化アンモニウム溶液）を細径管中に吸引した
。次いでｐＨ測定セルの中に細径管を収納して、該細径
管の先端をｐＨ−ＦＥＴに被せた。

ｅ）　　ｐ　Ｈ−Ｆ　Ｅ　Ｔの出力（ソース電位）を２
０秒間読み取り、測定開始後１０秒から２０秒の間１０
秒間の出力の変化速度の平均値を求めた。

ｆ）ｐＨ測定セルの中に基質溶液をポンプで１０秒間送
入してセル内の基質溶液を新鮮なものに置換し、次の測
定に備えた。

このようにして測定されたｐＨ−ＰＥＴの出力の変化速
度とＡＦＰの濃度との関係を表１に示した。

ＡＦＰｌｋＫ　　　ｐＨ−ＰＥＴ 出力変化速度 ３．９ ７．９ １５．６ ３１．３ ６２．５ Ｌ２５．Ｑ ５０　０ ５００．０ １０００．０ ０．０２４ ０．０８０ ０．１４９ ０．２４５ ０．４４５ ０　、７６８ １．４０４ ２．５６８ ４．０６５ ６．６７６ 実験例２ 実験例Ｉと同様にしてフェリチンの測定を行った。この
場合固相用細径管には抗フェリチン抗体を固定し、反応
カップの底部に抗フェリチン抗体のウレアーゼ標識体の
凍結乾燥体を収納した。

実験例１と全く同様の操作手順で測定を行った結果を表
２に示した。

出力変化速度 ３．９ ９ １５．６ ３１．３ ６２．５ １２５．０ ２５０．０ ５００．０ ０．０２１ ０．０３１ ｏ、ｉｏｇ 　１７５ ０．４８８ ０．８７９ １．７３７ ３．３３１ 実験例３ 実験例１と同様に、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定を行
った。この場合固相用細径管には抗ＣＥＡ抗体を固定し
、反応カップには抗ＣＥＡ抗体のウレアーゼ標識体の凍
結乾燥体を収納し、以下の順序で測定を行った。

ａ）分注手段が希釈カップ中に収納された希釈用細径管
を装着し、試料カップ中の血清試料１０μＱと希釈液２
０μＱとを吸引し、これを希釈カップに吐出し、３倍希
釈された試料溶液を調製した。その後希釈用細径管は廃
棄された。

以下実験例１のｂ）〜ｅ）と同様の操作を行った結果を
表−３に示した。

以下余白 出力変化速度 ０．０　　　　　　　　　　　０．００７１．２５　　
　　　　　　　　０．１２ｇ２．５　　　　　　　　　
　　０．２５５５．０　　　　　　　　　　　０．５１
０１０．０　　　　　　　　　　０．９９５２０、Ｑ　
　　　　　　　　　　１．９１６４０．０　　　　　　
　　　　３　４３０ｇｏ、ｏ　　　　　　　　　　　５
．９１８１６０．０　　　　　　　　　　９　３７５

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素免疫測定用カートリッジの斜視図
であり、第２図は該カートリッジの断面図である。第３
図は本発明の測定装置の正面図であり、第４図は平面図
であり、第５図は本発明装置の基本構成を示す概略図で
あり、第６図は測定セルの詳細構造を示す断面図であり
、第７図はチップカブラの構造を示す断面図であり、第
８図は第７図のＡ−Ａ矢視図であり、第９図は昇降手段
を示す正面図であり、第１０図は本発明装置の制御回路
図である。 Ａ　・・・操作ステーション Ｂ　・・・希釈ステーション Ｃ・・・先浄ステーション Ｄ　・・・測定ステーション Ｅ・・・分注手段、Ｆ・・・昇降手段 Ｇ　・・・往復移動手段、Ｈ・・・脱　離　手　段Ｉ・
・・カートリッジ、２・・・試料カップ３・・・希釈カ
ップ、４・・・反応カップ６・・・凍結乾燥標識体、 ７・・・希釈用細径管、８・・・固相用細径管１０・・
・シール片、３３・・・測定セル３５・・・洗浄セル、
３６・・・希釈セル６５・・・ｐＨ電極。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、測定されるべき試料を収容するための試料カップと
   、ピペットチップ形状の希釈用細径管が収容された希釈
   カップ及び反応カップが一体に配列された酵素免疫測定
   用のカートリッジであって、該反応カップの底部に凍結
   乾燥させた酵素標識試薬が収容され、かつ少くとも先端
   部内壁に測定対象物質たる抗原（または抗体）と結合す
   る抗体（または抗原）が固定されたピペットチップ形状
   の固相用細径管が、該反応カップ内にその先端が酵素標
   識試薬から離間して収容されるとともに、上記各カップ
   の上端開口がシール片で気密に閉塞されたことを特徴と
   する酵素免疫測定用カートリッジ。 ２、請求項１記載の酵素免疫測定用カートリッジを用い
   た酵素免疫測定方法であって、 （１）希釈カップ内に収容されたピペットチップ形状の
   希釈用細径管で試料カップ内の試料および希釈液を希釈
   カップ内に注入し、該希釈カップ内で所定の倍率に希釈
   された試料液体を調製する工程。 （２）反応カップ内に収容されたピペットチップ形状の
   固相用細径管の先端部を希釈カップ内の試料液体中に浸
   漬して１次免疫反応を行わせる工程。 （３）反応カップ内に溶解溶液を注入して、該反応カッ
   プ内の凍結乾燥された酵素標識試薬を溶解させた後、該
   溶解させた酵素標識体溶液中に１次免疫反応が終了した
   固相用細径管の先端部を浸漬して２次免疫反応を行わせ
   る工程。 （４）２次免疫反応が終了した固相用細径管を洗浄する
   工程。 （５）洗浄された固相用細径管を基質溶液が満たされた
   測定セル内に設けられたｐＨ電極の感応部に被せて、該
   細径管とｐＨ電極の感応部間における基質溶液の分解反
   応に伴うｐＨ変化を測定する工程。 からなる酵素免疫測定方法。 ３、請求項１記載の酵素免疫測定用カートリッジを用い
   た酵素免疫測定装置であって、 酵素免疫測定用カートリッジを操作ステーシヨンへ供給
   する手段と、 該操作ステーションに設けられた、希釈液入口と溢流液
   出口を有する希釈液セルと、該希釈液セルへ希釈液を供
   給するポンプを備えた希釈ステーションと、洗浄液入口
   と溢流液出口を有する洗浄液セルと、該洗浄液セルへ洗
   浄液を供給するポンプを備えた洗浄ステーションと、基
   質溶液入口と溢流液出口を有し、かつ基質溶液の流通路
   にｐＨ電極の感応部を露出させた測定セルと、該測定セ
   ルへ基質溶液を供給するポンプを備えた測定ステーショ
   ンと、 該操作ステーションに供給されたカートリッジの希釈カ
   ップ及び反応カップ内に収容されたピペットチップ形状
   の希釈用細径管及び固相用細径管の上端開口に挿嵌され
   るピペットヘッドを一端に有し、他端にチューブを介し
   てシリンジが接続された分注手段と、 該ピペットヘッドを昇降させる手段と、 該昇降手段を水平方向に往復移動させる手段と、 該ピペットヘッドが挿嵌された細径管の上端を押し下げ
   て細径管を脱離させる手段 とを備えた酵素免疫測定装置。