JPH03183475A - 遺伝子座間組換えにより創造されたピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の新規株 - Google Patents
遺伝子座間組換えにより創造されたピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の新規株Info
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- JPH03183475A JPH03183475A JP2153837A JP15383790A JPH03183475A JP H03183475 A JPH03183475 A JP H03183475A JP 2153837 A JP2153837 A JP 2153837A JP 15383790 A JP15383790 A JP 15383790A JP H03183475 A JPH03183475 A JP H03183475A
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- pichia pastoris
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は組換えＤＮＡ技術の分野に関する。
１つの態様において、本発明はピキア パストリス（Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株における選択可能
なマーカー遺伝子の再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）
の方法に関する。
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株における選択可能
なマーカー遺伝子の再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）
の方法に関する。
従来の技術
多くの微生物の形質転換のかぎとなるのは選択可能なマ
ーカー遺伝子であり、それにより非常に大多数の非形質
転換細胞の存在下で形質転換細胞を同定し、選択的に増
殖させるのが可能となる。
ーカー遺伝子であり、それにより非常に大多数の非形質
転換細胞の存在下で形質転換細胞を同定し、選択的に増
殖させるのが可能となる。
広範囲にわたって研究されたエシェリキアコリ微生物の
形質転換と異なり、多くの原核および低級真核微生物の
形質転換は制限された少数の選択可能々マーカーに依存
している。マーカー遺伝子を含むベクターによる形質転
換では普通そのマーカーに関連する選択可能な表現型を
永久に失うことになるので、さらに組換えＤＮＡに基づ
いた改変を進めるのは困難である。
形質転換と異なり、多くの原核および低級真核微生物の
形質転換は制限された少数の選択可能々マーカーに依存
している。マーカー遺伝子を含むベクターによる形質転
換では普通そのマーカーに関連する選択可能な表現型を
永久に失うことになるので、さらに組換えＤＮＡに基づ
いた改変を進めるのは困難である。
遺伝学的によく開発されていない微生物においては、利
用可能なマーカー遺伝子の数が制限されていることが非
常な実験上のハンディキャップであろう。新規のマーカ
ーの開発は相当の時間および努力を必要とするので、も
しマーカーを保存たは再生する方法が存在すると都合が
良いであろう。
用可能なマーカー遺伝子の数が制限されていることが非
常な実験上のハンディキャップであろう。新規のマーカ
ーの開発は相当の時間および努力を必要とするので、も
しマーカーを保存たは再生する方法が存在すると都合が
良いであろう。
いくつかの例において、自発的に複製し、マーカーを運
搬しているプラスミド（それは続いて株から矯正される
）による共形質転換を通してゲノム内へマーカーレスＤ
ＮＡ断片を組込むことによりマーカーが保存できる（Ｒ
ｕｄｏＪｆら＋ １９８５；Ｃｒｅｇｇら、 １９８９
）。しかしながら、そのようなマーカーは選択的増殖に
は利用できない。
搬しているプラスミド（それは続いて株から矯正される
）による共形質転換を通してゲノム内へマーカーレスＤ
ＮＡ断片を組込むことによりマーカーが保存できる（Ｒ
ｕｄｏＪｆら＋ １９８５；Ｃｒｅｇｇら、 １９８９
）。しかしながら、そのようなマーカーは選択的増殖に
は利用できない。
マーカーを再生するための方法はＡｌａｎｉら（１９８
７）により記載されている。この方法はマーカーとして
オロチジン−５′ リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（
ＵＲＡ３）を、およびＵＲＡ３の各々の端に置かれた繰
返し配列間の有糸分裂組換えの結果としてＵｒａ−とな
った株を選択するために薬剤、５−フルオロ−オロチン
酸（Ｂｏｅｋｅら。
７）により記載されている。この方法はマーカーとして
オロチジン−５′ リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（
ＵＲＡ３）を、およびＵＲＡ３の各々の端に置かれた繰
返し配列間の有糸分裂組換えの結果としてＵｒａ−とな
った株を選択するために薬剤、５−フルオロ−オロチン
酸（Ｂｏｅｋｅら。
１９８４）を利用する強力な陽性選択スキームを用いる
。しかしながらこの選択スキームはＵＲＡ３−欠損宿主
微生物を必要とし、そのようなものは現在ピキア バス
トリス（Ｐｌｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｌｓ）においては
人手不可能である。現在ピキア（Ｐｉｃｈｌａ）に対し
て利用可能なマーカーを利用するには、切出された生成
物がマーカー表現型の喪失に対するスクリーニングによ
り発見されなければならないが、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ
）における切出しの速度に依存しているのでそのような
方法は時間をとるだけで実を結ばないであろう。その結
果、選択可能マーカーが高頻度で再生できるよりきびし
い方法への改良が本分野の現状態では求められている。
。しかしながらこの選択スキームはＵＲＡ３−欠損宿主
微生物を必要とし、そのようなものは現在ピキア バス
トリス（Ｐｌｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｌｓ）においては
人手不可能である。現在ピキア（Ｐｉｃｈｌａ）に対し
て利用可能なマーカーを利用するには、切出された生成
物がマーカー表現型の喪失に対するスクリーニングによ
り発見されなければならないが、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ
）における切出しの速度に依存しているのでそのような
方法は時間をとるだけで実を結ばないであろう。その結
果、選択可能マーカーが高頻度で再生できるよりきびし
い方法への改良が本分野の現状態では求められている。
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、その生成物が再生されるべき選択可能
表現型を補足する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ構築物で
形質転換されているピキア パスでの選択可能表現型の
再生の方法を提供する。
表現型を補足する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ構築物で
形質転換されているピキア パスでの選択可能表現型の
再生の方法を提供する。
本発明のこれらおよび他の目的はここに提供された説明
および特許請求の範囲の閲覧により明らかになるであろ
う。
および特許請求の範囲の閲覧により明らかになるであろ
う。
課題を解決するための手段
本発明に従うと、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐ
ａｓｔｏｒｉｓ）秤の突然変異酵母株における選択可能
表現型の座位内組換えによる再生のための方法が開発さ
れており、前記株はその生成物が再生されるべき選択可
能表現型を補足する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ構築物
ですでに形質転換されている。
ａｓｔｏｒｉｓ）秤の突然変異酵母株における選択可能
表現型の座位内組換えによる再生のための方法が開発さ
れており、前記株はその生成物が再生されるべき選択可
能表現型を補足する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ構築物
ですでに形質転換されている。
そのような“再生された”株はその生成物が再生された
選択可能表現型を含む組換え体ＤＮＡ構築物での形質転
換のための行用な宿主である。
選択可能表現型を含む組換え体ＤＮＡ構築物での形質転
換のための行用な宿主である。
説明を明瞭にするため以下の定義を説明する。
定 義
表現型の（ｐｈｃｎｏｔｙｐｉｅ）／表現型（ｐｈｃｎ
ｏｔｙｐｅ）微生物の目に見える性質で、遺伝子型と環
境の相互作用により作り出される。細胞の表現型とは特
定の条件下におけるその外観または振舞いを示す。
ｏｔｙｐｅ）微生物の目に見える性質で、遺伝子型と環
境の相互作用により作り出される。細胞の表現型とは特
定の条件下におけるその外観または振舞いを示す。
ＨＩＳ４細胞の表現型はｈｉｓ４細胞と異なり、前者は
ヒスチジンを利用できるが後者はできない。
ヒスチジンを利用できるが後者はできない。
対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）−遺伝子が１つ以上の形で
存在している場合、各々の形は対立遺伝子と称される。
存在している場合、各々の形は対立遺伝子と称される。
ＨＩＳ４遺伝子の野生型形は１つの対立遺伝子であり、
突然変異型、ｈｉｓ４、は別の対立遺伝子である。
突然変異型、ｈｉｓ４、は別の対立遺伝子である。
１倍体（ｈａｐｌｏｉｄ）−もし細胞が各々の染色体の
１つのコピーのみを含んでいるとそれは１倍体と見なさ
れる；２倍体細胞は各々の染色体の２つのコピーを持っ
ている。
１つのコピーのみを含んでいるとそれは１倍体と見なさ
れる；２倍体細胞は各々の染色体の２つのコピーを持っ
ている。
遺伝子座（ｆｏｃｉ／ １ｏｃｕｓ）−特定の遺伝子ま
たは対立遺伝子の染色体中の位置。各々の遺伝子は染色
体上の特定の位置を占めている；その位置がそれの遺伝
子座である。
たは対立遺伝子の染色体中の位置。各々の遺伝子は染色
体上の特定の位置を占めている；その位置がそれの遺伝
子座である。
減数分裂（Ｑｌｅｉｏｓｉｓ）−染色体の数が半分に減
少する細胞分裂の型で、相同染色体の各々の対の１つが
各々の娘細胞に渡される還元分裂を含んでいる。２倍体
細胞が減数分裂を行うと１倍体細胞が形成される。
少する細胞分裂の型で、相同染色体の各々の対の１つが
各々の娘細胞に渡される還元分裂を含んでいる。２倍体
細胞が減数分裂を行うと１倍体細胞が形成される。
遺伝子座間対立遺伝子（ｉｎｔｅｒｌｏｃｕｓ ａｌｌ
ｅｌｅｓ） −同一遺伝子の２つの対立遺伝子は異った
細胞中の同一の遺伝子座に通常のっているであろう。術
語、遺伝子座間対立遺伝子とは対立遺伝子の位置がその
通常の染色体位置以外にあるような状態を示す。
ｅｌｅｓ） −同一遺伝子の２つの対立遺伝子は異った
細胞中の同一の遺伝子座に通常のっているであろう。術
語、遺伝子座間対立遺伝子とは対立遺伝子の位置がその
通常の染色体位置以外にあるような状態を示す。
遺伝子は現在内在性ＨＩＳ４遺伝子に関して遺伝子座間
に存し、遺伝子座間対立遺伝子と称することができる。
に存し、遺伝子座間対立遺伝子と称することができる。
遺伝子型（ｇｏｎｏｔ）’ｐｏ）／遺伝子型の（ｇｃｎ
ｏｔｙｐｉ ｃ）生物の遺伝学的構築物のすべてまたは
一部。細胞の遺伝子型はそれが持つ特定の対立遺伝子を
表わす。
ｏｔｙｐｉ ｃ）生物の遺伝学的構築物のすべてまたは
一部。細胞の遺伝子型はそれが持つ特定の対立遺伝子を
表わす。
組換え（ｒｅｃｏＩＩｌｂｉｎａｔｌｏｎ）−生物学的
または実験室操作を通して遺伝子、遺伝子の組または遺
伝子の一部を結合して新しい組合せにすること。
または実験室操作を通して遺伝子、遺伝子の組または遺
伝子の一部を結合して新しい組合せにすること。
交配および胞子形成過程の間における減数分裂は２つの
遺伝子座間対立遺伝子間の組換えを刺激し、その結果１
つの対立遺伝子から他の対立遺伝子への情報がしばしば
交換されることが発見され位置（遺伝子座）で存在する
遺伝子の２つの表現型的に異った対立遺伝子を含むなら
ば減数分裂間の遺伝子座間組換えが前に形質転換された
株における選択可能表現型の再生に使用できることも発
見された。Ｌに記載したごとく親株を含む交配後、１つ
の対立遺伝子の表現型および遺伝子型の同一性を決定す
る情報が他の対立遺伝子へ移動していた子または胞子生
成物がしばしば単離された。
遺伝子座間対立遺伝子間の組換えを刺激し、その結果１
つの対立遺伝子から他の対立遺伝子への情報がしばしば
交換されることが発見され位置（遺伝子座）で存在する
遺伝子の２つの表現型的に異った対立遺伝子を含むなら
ば減数分裂間の遺伝子座間組換えが前に形質転換された
株における選択可能表現型の再生に使用できることも発
見された。Ｌに記載したごとく親株を含む交配後、１つ
の対立遺伝子の表現型および遺伝子型の同一性を決定す
る情報が他の対立遺伝子へ移動していた子または胞子生
成物がしばしば単離された。
例えば遺伝子の突然変異対立遺伝子の存在のため栄養要
求性である突然変異宿主の選択可能マーカーとして同一
遺伝子の野生型対立遺伝子を含むベクターＤＮＡによる
統合的形質転換後は形質転換宿主はその表現型に関して
は原栄養性である。
求性である突然変異宿主の選択可能マーカーとして同一
遺伝子の野生型対立遺伝子を含むベクターＤＮＡによる
統合的形質転換後は形質転換宿主はその表現型に関して
は原栄養性である。
この原栄養性宿主は、同一の野生株遺伝子を選択可能マ
ーカーとして含むベクターによる第２の形質転換のため
の宿主にはなりえない（なぜなら、陽性形質転換を選択
する方法がない）。しかしながら、遺伝子座間組換えは
、野生型対立遺伝子を突然変異体対立遺伝子と置き換え
ることができ、一方間様に突然変異体遺伝子座に突然変
異体対立遺伝子情報を維持している。それ故、この型の
遺伝子座間組換え後に生じる株は突然変異体対立遺伝子
のみを含み、再び栄養要求性である。そのような株は同
じ選択可能マーカー遺伝子を頼みとするベクターで２度
目の形質転換できる。第２の形質転換後、このマーカー
再生過程を繰り返すことができ同じマーカーを持つベク
ターでの第３の形質転換ができる宿主が調製され、以下
も同様である。それ故、株は同じ選択可能マーカー遺伝
子を持っているベクターを用いて無限回形質転換でき発
現カセットの多くのコピーの挿入に有用であろつＯ 実施例の１つにおいて記載されているごとく、４遺伝子
を用いた組換え発現カセットの組込みのためＡＯＸ２遺
伝子座に存在するＨＩＳ４遺伝子の野生−型対立遺伝子
を持つＨ１ｓ＋親株が正常ＨＩＳ４遺伝子座に存在する
突然変異体ｈｉｓ４対立遺伝子と組換えられた。この遺
伝子座間組換えにより本来のＨＩＳ４遺伝子座同様にＡ
ＯＸ２遺伝子座にも突然変異体ｈｉｓ４対立遺伝子情報
を含む組換え体が発生した。新しい組換え体は全突然変
異体ＨＩＳ４対立遺伝子のみを持つので、それは表現型
的にＨｉｓ−であり、選択に野生−型ＨＩＳ４遺伝子を
用いる組換えＤＮＡにより再び形質転換できる。
ーカーとして含むベクターによる第２の形質転換のため
の宿主にはなりえない（なぜなら、陽性形質転換を選択
する方法がない）。しかしながら、遺伝子座間組換えは
、野生型対立遺伝子を突然変異体対立遺伝子と置き換え
ることができ、一方間様に突然変異体遺伝子座に突然変
異体対立遺伝子情報を維持している。それ故、この型の
遺伝子座間組換え後に生じる株は突然変異体対立遺伝子
のみを含み、再び栄養要求性である。そのような株は同
じ選択可能マーカー遺伝子を頼みとするベクターで２度
目の形質転換できる。第２の形質転換後、このマーカー
再生過程を繰り返すことができ同じマーカーを持つベク
ターでの第３の形質転換ができる宿主が調製され、以下
も同様である。それ故、株は同じ選択可能マーカー遺伝
子を持っているベクターを用いて無限回形質転換でき発
現カセットの多くのコピーの挿入に有用であろつＯ 実施例の１つにおいて記載されているごとく、４遺伝子
を用いた組換え発現カセットの組込みのためＡＯＸ２遺
伝子座に存在するＨＩＳ４遺伝子の野生−型対立遺伝子
を持つＨ１ｓ＋親株が正常ＨＩＳ４遺伝子座に存在する
突然変異体ｈｉｓ４対立遺伝子と組換えられた。この遺
伝子座間組換えにより本来のＨＩＳ４遺伝子座同様にＡ
ＯＸ２遺伝子座にも突然変異体ｈｉｓ４対立遺伝子情報
を含む組換え体が発生した。新しい組換え体は全突然変
異体ＨＩＳ４対立遺伝子のみを持つので、それは表現型
的にＨｉｓ−であり、選択に野生−型ＨＩＳ４遺伝子を
用いる組換えＤＮＡにより再び形質転換できる。
本発明に従うと、その生成物が選択可能表現型を完全に
する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ構築物で形質転換され
たピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ
） ｌｉの酵母の突然変異株は交配過程の間組換えを経
て高頻度で選択可能表現型の反復再生ができ下記の工程
を特徴とする： （ａ） ピキア パストリス（Ｐｌｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ）株の第１および第２の突然変異株をり・ノ
チ培地中一緒に懸濁し、前記第１の突然変異体はピキア
パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の１倍
体ゲノム内の異った位置（遺伝子座）に存在する遺伝子
の２つの表現型的に区別可能な対立遺伝子を含むピキア
パストリス（Ｐｌｃｈｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であ
り、および前記第２の突然変異体は第２の栄養要求性突
然変異を含んでおり、そのため第１および第２の株の交
配で生じる２倍体株は選択される。
する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ構築物で形質転換され
たピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ
） ｌｉの酵母の突然変異株は交配過程の間組換えを経
て高頻度で選択可能表現型の反復再生ができ下記の工程
を特徴とする： （ａ） ピキア パストリス（Ｐｌｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ）株の第１および第２の突然変異株をり・ノ
チ培地中一緒に懸濁し、前記第１の突然変異体はピキア
パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の１倍
体ゲノム内の異った位置（遺伝子座）に存在する遺伝子
の２つの表現型的に区別可能な対立遺伝子を含むピキア
パストリス（Ｐｌｃｈｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であ
り、および前記第２の突然変異体は第２の栄養要求性突
然変異を含んでおり、そのため第１および第２の株の交
配で生じる２倍体株は選択される。
（ｂ） 工程（ａ）に従って調製された前記第１およ
び第２の突然変異酵母株を含む懸濁液を前胞子形成寒天
上に塗布し、プレートを約３０℃に約１２〜４８時間（
好適には約２４時間）保ち； （ｃ） 工程（ｂ）に従って生じた細胞を胞子形成寒
天上でレプリカ平板法を行い、得られるプレートは約３
０℃に約８〜４８時間（好適には約２４時間）保ち； （ｄ） 工程（Ｃ）に従って生じた細胞を２倍体細胞
の選択に適した寒天培地上でレプリカ平板法を行い、約
２５〜３５℃で１〜５０間またはコロニーが見えるよう
になるまで維持し； （ｅ） 工程（ｄ） ｅ得られた個々の２倍体コロニ
ーをリッチ培地に懸濁し； （ｆ） 工程（ｃ）に従って生成した懸濁液を前胞子
形成寒天上へ塗布し、得られるプレートは約３０℃にて
約１２〜４８時間保ち； （ｇ） 工程（ｆ）に従って生じた細胞を胞子形成寒
天上でレプリカ平板法を行い、得られるプレートは約３
０℃にて３〜５日間保ち； （ｈ） （１）工程（ｇ）に従って生じた４−胞子子
褒を引裂くかもしくは（２）胞子形成プレートから細胞
を除き、リン酸緩衝化培地中に細胞を再懸濁し、懸濁さ
れた細胞は細胞壁分解試薬で徹底的に消化し； （ｉ）１倍体胞子生成物の増殖に必要な栄養を補給した
最少培地上で各々の胞子発芽および増殖させ、約３０℃
に約３時間保ち；およびその後（ｊ） 工程（１）に
従った細胞を胞子生成物表現型を区別するために必要と
される栄養の組合せを補給した最少培地寒天プレート上
でレプリカ平板法を行い、約３０℃にて１日保ち；およ
び（ｋ） 工程（１）に従って生じたコロニーを適当
な組換え生成物でスクリーニングする。
び第２の突然変異酵母株を含む懸濁液を前胞子形成寒天
上に塗布し、プレートを約３０℃に約１２〜４８時間（
好適には約２４時間）保ち； （ｃ） 工程（ｂ）に従って生じた細胞を胞子形成寒
天上でレプリカ平板法を行い、得られるプレートは約３
０℃に約８〜４８時間（好適には約２４時間）保ち； （ｄ） 工程（Ｃ）に従って生じた細胞を２倍体細胞
の選択に適した寒天培地上でレプリカ平板法を行い、約
２５〜３５℃で１〜５０間またはコロニーが見えるよう
になるまで維持し； （ｅ） 工程（ｄ） ｅ得られた個々の２倍体コロニ
ーをリッチ培地に懸濁し； （ｆ） 工程（ｃ）に従って生成した懸濁液を前胞子
形成寒天上へ塗布し、得られるプレートは約３０℃にて
約１２〜４８時間保ち； （ｇ） 工程（ｆ）に従って生じた細胞を胞子形成寒
天上でレプリカ平板法を行い、得られるプレートは約３
０℃にて３〜５日間保ち； （ｈ） （１）工程（ｇ）に従って生じた４−胞子子
褒を引裂くかもしくは（２）胞子形成プレートから細胞
を除き、リン酸緩衝化培地中に細胞を再懸濁し、懸濁さ
れた細胞は細胞壁分解試薬で徹底的に消化し； （ｉ）１倍体胞子生成物の増殖に必要な栄養を補給した
最少培地上で各々の胞子発芽および増殖させ、約３０℃
に約３時間保ち；およびその後（ｊ） 工程（１）に
従った細胞を胞子生成物表現型を区別するために必要と
される栄養の組合せを補給した最少培地寒天プレート上
でレプリカ平板法を行い、約３０℃にて１日保ち；およ
び（ｋ） 工程（１）に従って生じたコロニーを適当
な組換え生成物でスクリーニングする。
本発明の方法で使用するのに適した突然変異体は当業者
には既知である。例えばの例としては（しかしそれに制
限されるわけではない）、ビキして寄託されている）が
第１の親株として、１８０１７として寄託されている）
が第２の親株として挙げられる。
には既知である。例えばの例としては（しかしそれに制
限されるわけではない）、ビキして寄託されている）が
第１の親株として、１８０１７として寄託されている）
が第２の親株として挙げられる。
交配されるべき細胞は第１に例えばＹＰＤ培地のごとき
リッチ培地および当業者にはよく知られている他の類似
の培地に懸濁される。懸濁化細胞はＧＮＡＰのごとき前
胞子形成寒天上に塗布され、約３０℃にて１２から長く
ても４８時間保たれる。
リッチ培地および当業者にはよく知られている他の類似
の培地に懸濁される。懸濁化細胞はＧＮＡＰのごとき前
胞子形成寒天上に塗布され、約３０℃にて１２から長く
ても４８時間保たれる。
前胞子形成寒天上で増殖させたら、細胞は胞子形成寒天
上でレプリカ平板法を行い、続いて約３０℃にて約８〜
２４時間保つ。
上でレプリカ平板法を行い、続いて約３０℃にて約８〜
２４時間保つ。
胞子形成寒天上で増殖した細胞は続いて０．５％メタノ
ールを炭素源とする最少培地（＝倍体の増殖を選択し、
両親の型の細胞の増殖をおさえる培地）上でレプリカ平
板法を行い、約２５〜３５℃にて約３〜５時間発芽させ
る。
ールを炭素源とする最少培地（＝倍体の増殖を選択し、
両親の型の細胞の増殖をおさえる培地）上でレプリカ平
板法を行い、約２５〜３５℃にて約３〜５時間発芽させ
る。
生じるコロニーを例えばＹＰＤのごときリッチ培地（ｒ
ｉｃｈ ａ＋ｅｄｉａ）に懸濁し、前記のごとく前胞子
形成寒天上に塗布し、約３０℃にて約１２〜４８時間保
った後胞子形成寒天上でレプリカ平板法を行い、約３０
℃にて約３〜５時間保つ。生じる４胞子子褒（４−５ｐ
ｏｒｅｄ ａｓｃｉ）は切裂＜ （ｄｉｓｓｅｃｔ）か
または細胞を胞子形成プレートから除き、リン酸緩衝化
培地に再懸濁し細胞壁崩壊試薬で徹底的に消化する。後
者の処理の結果として増殖型細胞は破壊され、非同調胞
子のみが残り発芽され増殖する。後者の方法が迅速な試
料調整には好適であるが、前者の方法（即ち、４−胞子
子褒の切裂き）は分離体の統計的分布が望まれる場合は
好適である。例えばＹＥＰＤ寒天のごときリッチ培地寒
天−Ｌで増殖した１倍体胞子誘導コロニーは表現型を区
別するために必要とされる栄養の組合せを補給した戴少
培地寒天上へのレプリカ平板法により適切な詰現型をス
クリーニングされる。
ｉｃｈ ａ＋ｅｄｉａ）に懸濁し、前記のごとく前胞子
形成寒天上に塗布し、約３０℃にて約１２〜４８時間保
った後胞子形成寒天上でレプリカ平板法を行い、約３０
℃にて約３〜５時間保つ。生じる４胞子子褒（４−５ｐ
ｏｒｅｄ ａｓｃｉ）は切裂＜ （ｄｉｓｓｅｃｔ）か
または細胞を胞子形成プレートから除き、リン酸緩衝化
培地に再懸濁し細胞壁崩壊試薬で徹底的に消化する。後
者の処理の結果として増殖型細胞は破壊され、非同調胞
子のみが残り発芽され増殖する。後者の方法が迅速な試
料調整には好適であるが、前者の方法（即ち、４−胞子
子褒の切裂き）は分離体の統計的分布が望まれる場合は
好適である。例えばＹＥＰＤ寒天のごときリッチ培地寒
天−Ｌで増殖した１倍体胞子誘導コロニーは表現型を区
別するために必要とされる栄養の組合せを補給した戴少
培地寒天上へのレプリカ平板法により適切な詰現型をス
クリーニングされる。
実施例で記載したＫＭ７１２１ｘ Ｐ Ｐ Ｆ １交配
種に対してそのスクリーニング法は、ＹＰＤ培地上艇３
０℃で約２０間の胞子発芽および増殖させ、次に生じる
コロニーをグルコース、ヒスチジン、ア／Ｌギニンを柿
々の組合せで補給した最少培地り、およびメタノール、
ヒスチジンおよびアルギニンを補充してレプリカ平板法
を行った。
種に対してそのスクリーニング法は、ＹＰＤ培地上艇３
０℃で約２０間の胞子発芽および増殖させ、次に生じる
コロニーをグルコース、ヒスチジン、ア／Ｌギニンを柿
々の組合せで補給した最少培地り、およびメタノール、
ヒスチジンおよびアルギニンを補充してレプリカ平板法
を行った。
グルコース寒天上コロニーを３０℃にて１日インキュベ
ーション後ＡｒｇおよびＨ１ｓ表現型を試験した。
ーション後ＡｒｇおよびＨ１ｓ表現型を試験した。
メタノール寒天上のコロニーは室温で１週間後増殖を試
験した。
験した。
この発明に先立っては１つの遺伝子座の栄養要求性ピキ
ア（Ｐｉｃｈｆａ）株を１度以上栄養要求性を補うマー
カー遺伝子を含むＤＮＡ断片で、または２つの遺伝子座
の栄養要求性ピキア（Ｐｉｃｈｉａ） ｍを２度以上、
各々の回に第１および第２の栄養要求性を補うマーカー
遺伝子を含むＤＮＡ断片で各々形質転換するのは不可能
であった。形質転換細胞を選択するための追加のマーカ
ーなしでは更なる形質転換は不可能であった。しかしな
がら、本発明においてはピキア パストリス（Ｐｉｃｈ
ｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）の１倍体ゲノム内の遺伝子の２
つの表現型的に区別可能な対立遺伝子を含む株が交配し
た場合、異所性部位に存在する野生−型遺伝子が高頻度
で本来の位置の突然変異体対立遺伝子と組換えを起こす
であろう。そのような組換えの通常の結果は本来および
異所性の両方の遺伝子座に突然変異体を持つ株の生成で
ある。生じる株は再び栄養要求性で選択可能マーカーと
して栄養要求性を補う遺伝子を含む他のＤＮＡ断片によ
りさらに形質転換される。
ア（Ｐｉｃｈｆａ）株を１度以上栄養要求性を補うマー
カー遺伝子を含むＤＮＡ断片で、または２つの遺伝子座
の栄養要求性ピキア（Ｐｉｃｈｉａ） ｍを２度以上、
各々の回に第１および第２の栄養要求性を補うマーカー
遺伝子を含むＤＮＡ断片で各々形質転換するのは不可能
であった。形質転換細胞を選択するための追加のマーカ
ーなしでは更なる形質転換は不可能であった。しかしな
がら、本発明においてはピキア パストリス（Ｐｉｃｈ
ｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）の１倍体ゲノム内の遺伝子の２
つの表現型的に区別可能な対立遺伝子を含む株が交配し
た場合、異所性部位に存在する野生−型遺伝子が高頻度
で本来の位置の突然変異体対立遺伝子と組換えを起こす
であろう。そのような組換えの通常の結果は本来および
異所性の両方の遺伝子座に突然変異体を持つ株の生成で
ある。生じる株は再び栄養要求性で選択可能マーカーと
して栄養要求性を補う遺伝子を含む他のＤＮＡ断片によ
りさらに形質転換される。
本発明の新しさは各々の形質転換後にこの再生法を実施
することが可能なため、同一の選択可能マーカー系を用
い、無限にピキア（Ｐｌｃｈｆａ）株を形質転換するこ
とが可能であろう。本方法の応用は、ゲノム内へ更なる
異種遺伝子発現カセットを挿入することである。他の応
用例は生物中の遺伝子構造および機構を深く探究するた
めくり返しの形質転換により創造される多突前変異を持
つ株の構築である。
することが可能なため、同一の選択可能マーカー系を用
い、無限にピキア（Ｐｌｃｈｆａ）株を形質転換するこ
とが可能であろう。本方法の応用は、ゲノム内へ更なる
異種遺伝子発現カセットを挿入することである。他の応
用例は生物中の遺伝子構造および機構を深く探究するた
めくり返しの形質転換により創造される多突前変異を持
つ株の構築である。
本発明は下記の実施例（それに制限されるものではない
）を参照してより詳細に記載されるであろう。
）を参照してより詳細に記載されるであろう。
性であり、ＡＯＸｌおよびＡＯＸ２遺伝子の両方が分裂
させられたためメタノールを利用できなかった株中の選
択可能表現型としてヒスチジン栄養要求性を再生するた
めに遺伝子座間組換えが使用された。メタノール利用欠
陥表現型はＭｕｔ−として示される。異った遺伝子座に
２つのＨｉｓ４の対立遺伝子を運ぶ株はＫＭ７１２１
（ａ ｒ ｇ４ｈｉｓ４ ａｏｘｌ△：５ＡＲＧ４
ａｏｘ２△：：ＰＨＩ Ｓ４ 、ＮＲＲＬ Ｙ〜１
８０１９）であった。この株はＰＰＦＩ株（ａｒｇ４
ｈｉｓ４ＡＯＸＩ ＡＯＸ２．ＮＲＲＬ Ｙ−１
８０１７）を用いて交配された。この交差交配のゴール
は内在性突然変異体ＨＩＳ４遺伝子座およびＡＯＸ２−
由来野生型遺伝子座の間の遺伝子座間組換えを刺激し、
ＫＭ７Ｌ２１に類似しているがＡＯＸ２位に突然変異体
ＨＩＳ４情報を持つ株を生成させることである。この株
は両方のＨＩＳ４遺伝子に欠損をもちおよびそれ故Ｈ１
ｓ であるから、選択可能マーカーとしてＨＩＳ４遺
伝子を含むベクターでさらに形質転換できるであろう。
させられたためメタノールを利用できなかった株中の選
択可能表現型としてヒスチジン栄養要求性を再生するた
めに遺伝子座間組換えが使用された。メタノール利用欠
陥表現型はＭｕｔ−として示される。異った遺伝子座に
２つのＨｉｓ４の対立遺伝子を運ぶ株はＫＭ７１２１
（ａ ｒ ｇ４ｈｉｓ４ ａｏｘｌ△：５ＡＲＧ４
ａｏｘ２△：：ＰＨＩ Ｓ４ 、ＮＲＲＬ Ｙ〜１
８０１９）であった。この株はＰＰＦＩ株（ａｒｇ４
ｈｉｓ４ＡＯＸＩ ＡＯＸ２．ＮＲＲＬ Ｙ−１
８０１７）を用いて交配された。この交差交配のゴール
は内在性突然変異体ＨＩＳ４遺伝子座およびＡＯＸ２−
由来野生型遺伝子座の間の遺伝子座間組換えを刺激し、
ＫＭ７Ｌ２１に類似しているがＡＯＸ２位に突然変異体
ＨＩＳ４情報を持つ株を生成させることである。この株
は両方のＨＩＳ４遺伝子に欠損をもちおよびそれ故Ｈ１
ｓ であるから、選択可能マーカーとしてＨＩＳ４遺
伝子を含むベクターでさらに形質転換できるであろう。
両方の株ともその内在性ＡＲＧ４およびＨＩＳ４遺伝子
に欠陥があった。ＰＰＦＩはさもなくば野生型であった
。ＫＭ７１２１はサツカロミセス セレビシェ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ａ
ＲＧ ４遺伝子の挿入によりＡＯＸｌの分裂を起こした
以前の形質転換のため欠陥ＡＯＸＩ遺伝子を含んでいた
。ＫＭ７１２１はまたＡＯＸ２遺伝子の部分欠損および
ＡＯＸｌおよび野生型ＨＩＳ４遺伝子の挿人を起こす第
２の形質転換のため欠陥ＡＯＸ２遺伝子を含んでいる。
に欠陥があった。ＰＰＦＩはさもなくば野生型であった
。ＫＭ７１２１はサツカロミセス セレビシェ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ａ
ＲＧ ４遺伝子の挿入によりＡＯＸｌの分裂を起こした
以前の形質転換のため欠陥ＡＯＸＩ遺伝子を含んでいた
。ＫＭ７１２１はまたＡＯＸ２遺伝子の部分欠損および
ＡＯＸｌおよび野生型ＨＩＳ４遺伝子の挿人を起こす第
２の形質転換のため欠陥ＡＯＸ２遺伝子を含んでいる。
ＡＯＸ遺伝子座での挿入は遺伝子座における分子構造の
変化を起こすので、サザンブロットハイプリダイゼーシ
ョン実験でのその大きさにより物理的に４つのＡＯＸ遺
伝子座区別するのが可能であった。ＥｃｏＲＩで消化し
、ＡＯＸプローブで明らかにさせた場合その大きさは：
ＰＰＦ１において、ＡＯＸＩ、５．５ｋｂおよＰＨＩ
Ｓ４．８．９ｋｂ 。
変化を起こすので、サザンブロットハイプリダイゼーシ
ョン実験でのその大きさにより物理的に４つのＡＯＸ遺
伝子座区別するのが可能であった。ＥｃｏＲＩで消化し
、ＡＯＸプローブで明らかにさせた場合その大きさは：
ＰＰＦ１において、ＡＯＸＩ、５．５ｋｂおよＰＨＩ
Ｓ４．８．９ｋｂ 。
突然変異株は以下のごとくして交配させた：各々の株の
約５×１０７の細胞を混合し、ＧＮＡＰ寒天プ寒天プレ
ー塗上した。ＧＮＡＰプレートは３０℃にて約２４時間
インキュベートした後、胞子形成寒天上でレプリカ平板
法を行った。
約５×１０７の細胞を混合し、ＧＮＡＰ寒天プ寒天プレ
ー塗上した。ＧＮＡＰプレートは３０℃にて約２４時間
インキュベートした後、胞子形成寒天上でレプリカ平板
法を行った。
このプレートは３０℃にて約２０時間インキュベートし
、２橋体選択プレートＬでレプリカ平板法を行った。Ｋ
Ｍ７１２１はＡｒｇ およびＨｉｓ であったがメ
タノールを利用することができず（Ｍｕｔ）、およびＰ
ＰＦＩはＡｒｇ−およびＨｉｓ−であったがメタノール
を利用することができた（Ｍｕｔ ）ので、メタノー
ル〈０，５％）を唯一の炭素およびエネルギー源とする
最少培地寒天からなる寒天選択培地上で増殖できるその
能力で寒天培地上、２倍体細胞が選択された。
、２橋体選択プレートＬでレプリカ平板法を行った。Ｋ
Ｍ７１２１はＡｒｇ およびＨｉｓ であったがメ
タノールを利用することができず（Ｍｕｔ）、およびＰ
ＰＦＩはＡｒｇ−およびＨｉｓ−であったがメタノール
を利用することができた（Ｍｕｔ ）ので、メタノー
ル〈０，５％）を唯一の炭素およびエネルギー源とする
最少培地寒天からなる寒天選択培地上で増殖できるその
能力で寒天培地上、２倍体細胞が選択された。
選択寒天プレート上で５日後、約２００のコロニーカ咄
現した。Ａｒｇ” Ｈｉｓ” Ｍｕｔ＋株の２倍体性は
そのＡＯＸ遺伝子座のサザンプロット実験により確認さ
れた。ＤＮＡを分離し、ＥｃｏＲＩで消化し、ＡＯＸｌ
およびＡＯＸ２ＤＮＡに特異的なりＮＡ断片で明らかに
された。２倍体は予期されるごと＜５．５および７．８
ｋｂの両方のＡＯＸＩ対立遺伝子および７．０および８
．９ｋｂの両方のＡＯＸ２対立遺伝子を含んでいた。
現した。Ａｒｇ” Ｈｉｓ” Ｍｕｔ＋株の２倍体性は
そのＡＯＸ遺伝子座のサザンプロット実験により確認さ
れた。ＤＮＡを分離し、ＥｃｏＲＩで消化し、ＡＯＸｌ
およびＡＯＸ２ＤＮＡに特異的なりＮＡ断片で明らかに
された。２倍体は予期されるごと＜５．５および７．８
ｋｂの両方のＡＯＸＩ対立遺伝子および７．０および８
．９ｋｂの両方のＡＯＸ２対立遺伝子を含んでいた。
これらの２倍体株の１つ（Ｍ Ｃ１００）を胞子形成さ
せ、組換えを刺激し交雑種からの１倍体胞子生成物を得
た。２倍体株の約１ｘＬ０６細胞をＧＮＡＰプレート上
に塗布し、交配法で前に記載したごとく処理した（ただ
し胞子形成プレートは２倍体の胞子形成を完全にするた
めに３０℃で４日インキュベートした）。プレートを洗
浄して胞子を集め、グルスラーゼおよびチモラーゼで徹
底的な処理にかけ、その後０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐｌ
＋７．０中４℃にて一夜保存した。増殖性細胞は使用さ
れた細胞壁分解試薬にはるかに感受性であるのでこの処
理により胞子だけが生き残れる。胞子調製試料は続いて
希釈し、非選択的培地寒天（ＹＥＰＤ培地寒天）上に塗
布した。これらは３０℃にて２日間インキュベートした
。各々の寒天プレートは＝１〉１％グルコース；２）１
％グルコースおよび５０μｇ／ｍＩヒスチジン；３）１
％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌアルギニン；４〉１
％グルコース、５０Ｒ／ ｍｌのアルギニンおよびヒス
チジンの両方；および５）０．５％メタノール、５０μ
ｇ／ｍｌのアルギニンおよびヒスチジンの両方を補給し
た一連の最少培地寒天プレート上でレプリカ平板法を行
った。３０℃にて１０インキユベートした後、グルコー
ス寒天上のコロニーのＡｒｇおよびＨ１ｓ表現型が試験
された。
せ、組換えを刺激し交雑種からの１倍体胞子生成物を得
た。２倍体株の約１ｘＬ０６細胞をＧＮＡＰプレート上
に塗布し、交配法で前に記載したごとく処理した（ただ
し胞子形成プレートは２倍体の胞子形成を完全にするた
めに３０℃で４日インキュベートした）。プレートを洗
浄して胞子を集め、グルスラーゼおよびチモラーゼで徹
底的な処理にかけ、その後０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐｌ
＋７．０中４℃にて一夜保存した。増殖性細胞は使用さ
れた細胞壁分解試薬にはるかに感受性であるのでこの処
理により胞子だけが生き残れる。胞子調製試料は続いて
希釈し、非選択的培地寒天（ＹＥＰＤ培地寒天）上に塗
布した。これらは３０℃にて２日間インキュベートした
。各々の寒天プレートは＝１〉１％グルコース；２）１
％グルコースおよび５０μｇ／ｍＩヒスチジン；３）１
％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌアルギニン；４〉１
％グルコース、５０Ｒ／ ｍｌのアルギニンおよびヒス
チジンの両方；および５）０．５％メタノール、５０μ
ｇ／ｍｌのアルギニンおよびヒスチジンの両方を補給し
た一連の最少培地寒天プレート上でレプリカ平板法を行
った。３０℃にて１０インキユベートした後、グルコー
ス寒天上のコロニーのＡｒｇおよびＨ１ｓ表現型が試験
された。
メタノール寒天上のコロニーは室温で１週間後にその増
殖を試験した。
殖を試験した。
このＰ Ｐ Ｆ １ ｘ ＫＭ７１２１交配物からの対
立遺伝子の独立した分離から本発見に先立って期待され
た４つの胞子生成物の遺伝子型が間約に第１図に示され
ている。それに加え、遺伝子座間組換えの結果である１
つの別の胞子生成物が第１図に示されている。２つの期
待された胞子型は親株、ＰＰＦＩおよびＫＭ７１２１と
同一であり、現型と称されている。２つの他の胞子型は
親株の混合物であり、非親型と称されている。
立遺伝子の独立した分離から本発見に先立って期待され
た４つの胞子生成物の遺伝子型が間約に第１図に示され
ている。それに加え、遺伝子座間組換えの結果である１
つの別の胞子生成物が第１図に示されている。２つの期
待された胞子型は親株、ＰＰＦＩおよびＫＭ７１２１と
同一であり、現型と称されている。２つの他の胞子型は
親株の混合物であり、非親型と称されている。
予期された非親型胞子生物型の１つはＡｒｇＨｉｓ
Ｍｕｔ であり、この型の胞子由来株からのＡＯＸ遺
伝子座のサザンプロットパターンはその表現型から予想
されたごとく野生型ＡＯＸＩ遺伝子座およびＰＨＩＳ４
−分裂ＡＯＸ２遺伝子座を示した。非親胞子生成物型に
対し他の予期および観察された表現型はＡｒｇ” Ｈｉ
ｓ−Ｍｕｔ＋／−であった。これらＡｒｇ” Ｈｌｓ−
Ｍｕｔ＋／−非親胞子生成物のすべでからのＡＯＸ遺伝
子座のサザンプロットパターンは５ＡＲＧ４−分裂ＡＯ
ＸＩ遺伝子座および野生型ＡＯＸ２遺伝子座を示した。
Ｍｕｔ であり、この型の胞子由来株からのＡＯＸ遺
伝子座のサザンプロットパターンはその表現型から予想
されたごとく野生型ＡＯＸＩ遺伝子座およびＰＨＩＳ４
−分裂ＡＯＸ２遺伝子座を示した。非親胞子生成物型に
対し他の予期および観察された表現型はＡｒｇ” Ｈｉ
ｓ−Ｍｕｔ＋／−であった。これらＡｒｇ” Ｈｌｓ−
Ｍｕｔ＋／−非親胞子生成物のすべでからのＡＯＸ遺伝
子座のサザンプロットパターンは５ＡＲＧ４−分裂ＡＯ
ＸＩ遺伝子座および野生型ＡＯＸ２遺伝子座を示した。
望まれる遺伝子座間組換えの結果である胞子生成物に予
想される表現型はＡｒｇ Ｈｉｓ″″Ｍｕｔ−であっ
た。試験された１８０の胞子形成コロニーのうち１０が
この表現をを持っており、遺伝子座間組換えの生成物と
しては高頻度であった。これらの組換え一生成物株の２
つのＡＯＸ遺伝子座のサザンプロット分析はこれらの株
は親株の１つであるＫＭ７１２１のものと同一のＡＯＸ
ｌおよびＡＯＸ２の両方での分裂を含んでいた。特にＨ
ＩＳ４からのＤＮＡ断片によるＡＯＸ２の分裂が存在し
た。これらの株はＨｉｓ であるので、内在性突然変
異ＨＩＳ４対立遺伝子の１つおよびＡＯＸ２の野生型対
立遺伝子間の遺伝子座間組換えの結果である。組換えに
より内在性遺伝子座からＡＯＸ２遺伝子座への突然変異
体ＨＩＳ４情報の転送が起こったことになるこれらの遺
伝子座間組換え胞子生成物の１つはＭ Ｃ１００−３と
称された。
想される表現型はＡｒｇ Ｈｉｓ″″Ｍｕｔ−であっ
た。試験された１８０の胞子形成コロニーのうち１０が
この表現をを持っており、遺伝子座間組換えの生成物と
しては高頻度であった。これらの組換え一生成物株の２
つのＡＯＸ遺伝子座のサザンプロット分析はこれらの株
は親株の１つであるＫＭ７１２１のものと同一のＡＯＸ
ｌおよびＡＯＸ２の両方での分裂を含んでいた。特にＨ
ＩＳ４からのＤＮＡ断片によるＡＯＸ２の分裂が存在し
た。これらの株はＨｉｓ であるので、内在性突然変
異ＨＩＳ４対立遺伝子の１つおよびＡＯＸ２の野生型対
立遺伝子間の遺伝子座間組換えの結果である。組換えに
より内在性遺伝子座からＡＯＸ２遺伝子座への突然変異
体ＨＩＳ４情報の転送が起こったことになるこれらの遺
伝子座間組換え胞子生成物の１つはＭ Ｃ１００−３と
称された。
使用された培地の例を下記に示した。
ＹＥＰＤ寒天 ２％デキストロース
２％ペプトン
１％酵母抽出液
２％寒 天
前胞子形成寒天（ＧＮＡＰ）
５％デキストロース
２％ペプトン
１％酵母抽出物
０．５％寒 天
１．５％栄養寒天
胞子形成寒天 ０，５％酢酸ナトリウム１％ＫＣρ
２％デキストロース
２％寒 天
最少培地 ２％デキストロース
（無水）
０．８７５％酵母窒素塩基
（アミノ酸を除く）
２％寒 天
ＹＰＤ培地 １％バクトー酵母抽出物２％バクトーペ
プトン ２％デキストロース ２倍体選択寒天 ０．６７５％酵母窒素塩基（アミノ酸
を除く） ０．５％メタノール ２％寒 天 実施例は単に本発明の実施を例示するために提供されて
きたが本発明または付随する特許請求の範囲をいかよう
にも制限するものとして読んではならない。
プトン ２％デキストロース ２倍体選択寒天 ０．６７５％酵母窒素塩基（アミノ酸
を除く） ０．５％メタノール ２％寒 天 実施例は単に本発明の実施を例示するために提供されて
きたが本発明または付随する特許請求の範囲をいかよう
にも制限するものとして読んではならない。
本発明の本質および精神から離れないかなりの変法およ
び改変も希望および請求された特許請求の範囲内である
と考えられる。
び改変も希望および請求された特許請求の範囲内である
と考えられる。
第１図は、４つの胞子生成物の遺伝子型および遺伝子座
間組換えの結果得られた別の胞子生成物を示す模式図で
ある。 」 （外４名） ρρＦｌ ｋ Ｍ’７１２１ Ａｒｇｏ ＨＩ５’ １１７１’ ＦＩＧ、 １ ａｏｒ２Δ １
間組換えの結果得られた別の胞子生成物を示す模式図で
ある。 」 （外４名） ρρＦｌ ｋ Ｍ’７１２１ Ａｒｇｏ ＨＩ５’ １１７１’ ＦＩＧ、 １ ａｏｒ２Δ １
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、選択可能な表現型を持つ￥ピキア パストリス￥（
￥Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）の細胞を生成す
る方法で、前記細胞はその生成物が選択可能表現型を示
す遺伝子の野生型対立遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ構築
物で形質転換された株であり、その方法は￥ピキア パ
ストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）の
形質転換株である第１の突然変異体株および第２の株（
前記第２の株は前記第１および第２の株の交配で生じる
２倍体の選択を可能にするため栄養要求性突然変異を含
む￥ピキア パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏ
ｒｉｓ￥）の突然変異株である）を一緒に混合し（前記
混合は２つの株間の交配を可能にする条件下で行なわれ
）；前記交配で生じる２倍体細胞の個々のコロニーを分
離して胞子形成培地上で培養し；そのようにして得られ
た胞子を回収し、次に各々の胞子を発芽および増殖させ
その後望まれる選択可能表現型を持つ細胞を分離するこ
と、を特徴とする方法。 ２、￥ピキア パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ￥）の株において選択可能表現型を再生する
ための特許請求の範囲第１項記載の方法であって、前記
株はその生成物が再生されるべき選択可能な表現型を示
す遺伝子の野生型対立遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ構築
物ですでに形質転換されており、その方法は： （ａ）第１および第２の突然変異株（前記第１の突然変
異株は￥ピキア パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａｐａｓ
ｔｏｒｉｓ￥）の１倍体ゲノム内の異った位置に存在す
るマーカー遺伝子の２つの表現型的に区別可能な対立遺
伝子を含む￥ピキア パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａｐ
ａｓｔｏｒｉｓ￥）の形質転換された株であり、前記第
２の株は前記第１および第２の株の交配で生じる２倍体
の選択を可能にする栄養要求性突然変異を含む￥ピキア
パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ￥
）の突然変異体株である）をリッチ（ｒｉｃｈ）培地中
に一緒に懸濁し； （ｂ）工程（ａ）に従って調製された第１および第２の
突然変異体酵母株を含む懸濁液を前胞子形成寒天上に塗
布し、得られたプレートを１２〜４８時間３０℃に保ち
； （ｃ）工程（ｂ）に従って生じた細胞を胞子形成寒天上
へのレプリカ平板法を行い、得られたプレートは約８〜
４８時間約３０℃に保ち； （ｄ）工程（ｃ）に従って生じた細胞を２倍体細胞の選
択および増殖に適した最少培地上にレプリカ平板法を行
い、１〜５日間２５〜３５℃に保ち； （ｅ）工程（ｄ）から得られた個々の２倍体コロニーを
リッチ培地に懸濁し： （ｆ）工程（ｅ）に従って生成された懸濁液を前胞子形
成寒天上に塗布し、得られたプレートは１２〜４８時間
約３０℃に保ち； （ｇ）工程（ｆ）に従って生じた細胞は胞子形成寒天上
にレプリカ平板法を行い、３〜５日間約３０℃に保ち； （ｈ）（１）工程（ｇ）に従って生じた４−胞子子褒を
引裂くか；もしくは （２）胞子形成プレートから細胞を除去し、細胞をリン
酸緩衝化培地中に再懸濁し、細胞壁分解試薬で懸濁され
た細胞を徹底的に消化し； （ｉ）１倍体胞子生成物の増殖に必要な栄養素を補給し
た最少培地上で各々の胞子を発芽および増殖させ、２日
間３０℃に保ち； （ｊ）工程（ｉ）に従った細胞を胞子生成物表現型を区
別するのに必要な栄養素の組合せを補給した複数の組の
最少培地寒天プレートの上でレプリカ平板法を行い、１
日間約３０℃に保ち； （ｋ）工程（ｉ）に従って生じたコロニーを適当な組換
え体生成物でスクリーニングすること、を特徴とする方
法。 ３、前記第２の突然変異体酵母株のヒスチジン生合成経
路が欠損している特許請求の範囲第１項または第２項記
載の方法。 ４、前記第２の突然変異体酵母株のヒスチジノールデヒ
ドロゲナーゼをコードしている遺伝子のための正常遺伝
子座に欠損がある特許請求の範囲第１項または第２項記
載の方法。 ５、前記第１の突然変異体酵母株のヒスチジノールデヒ
ドロゲナーゼをコードしている遺伝子のための正常遺伝
子座、およびヒスチジノールデヒドロゲナーゼをコード
している遺伝子のための任意の非天然遺伝子座で野生型
が欠損している特許請求の範囲第１項ないし第４項のい
ずれか１項に記載の方法。 ６、前記非天然遺伝子座がメタノール利用経路中の遺伝
子である特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、前記非天然遺伝子座が￥ＡＯＸ２￥である特許請求
の範囲第５項記載の方法。 ８、前記第１の突然変異体が￥ピキア パストリス￥（
￥Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）株ＫＭ７１２１
であり、前記第２の突然変異体が￥ピキア パストリス
￥（￥Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＰＦ１である
特許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記
載の方法。 ９、本質的には以下の実施例の任意の１つに記載される
ごとき、特許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/365,072 US5122465A (en) | 1989-06-12 | 1989-06-12 | Strains of pichia pastoris created by interlocus recombination |
| US365072 | 1989-06-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03183475A true JPH03183475A (ja) | 1991-08-09 |
Family
ID=23437359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2153837A Pending JPH03183475A (ja) | 1989-06-12 | 1990-06-12 | 遺伝子座間組換えにより創造されたピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の新規株 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5122465A (ja) |
| EP (1) | EP0402847A1 (ja) |
| JP (1) | JPH03183475A (ja) |
| AU (1) | AU5680790A (ja) |
| CA (1) | CA2016121A1 (ja) |
| FI (1) | FI902921A7 (ja) |
| HU (1) | HUT54203A (ja) |
| NO (1) | NO902591L (ja) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
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-
1989
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-
1990
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