JPH03183493A - イチゴ培養細胞によるアントシアニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 この発明は、イチゴ培養細胞によるアントンアニンの製
造方法に係わり、特にイチゴのカルスを用いて高い収率
でアントノアニンを製造することのできる方法に関する
。

「従来の技術」 アントンアニンは花の色素という意味を持ち、花や果実
の赤、紫、青系統の鮮やかな色のほとんどはこのアント
ンアニンによっている。シソ、ブドウ、クロマメ、赤カ
ブ、バラ、イチゴなどはアントンアニンによりその色を
呈している。

このアントンアニンは着色料や塗料の素材として実用価
値が高いため、内外でその大量培養による生産が検討さ
れている。また、最近ではアントンアニンの血圧降下作
用などの研究もなされており、色素以外にも興味深い性
質を有している。

従来、アントンアニンの一般的な製法としては、アント
ンアニンを含む種々の植物を材料とし、１〜２％の塩酸
酸性メタノールで材料を抽出し、酢酸鉛を加えて塩化鉛
の沈澱をこし分け、次に生じた青色の鉛塩を集める。こ
れを３％メタノール塩酸に再び溶かし、エーテルを加え
て沈澱させ、鉛塩として精製するかあるいはピクリン酸
塩として析出させる。いずれも塩化物に変えて結晶させ
、アンドシアニンを得る。

「発明が解決しようとする課題」 しかしながら、このような従来の方法では、栽培植物を
原料とすることから、原料コストが高くなり、アントノ
アニンを安価に製造することか不可能であった。

また、栽培植物を原料とすると、植物の生長が遅く、栽
培に時間と手間がかかり、アントンアニンの生産効率か
悪い問題があった。

さらにまた、アントンアニンの製造が栽培植物の収穫時
期に左右され、年間を通して平均的にアントンアニンの
製造か出来ない問題があった。

そして、従来、このような植物体からのアントンアニン
の製造方法に比べ、アントンアニンの生産効率か高く、
アントンアニンを大量にかつ年間を通して平均的に製造
することが可能な方法として、ニンジン、ブドウ、バラ
などから誘導されたアントンアニン産生細胞を大量培養
し、この培養細胞からアントンアニンを抽出する方法が
検討されてきている。

しかし現段階では、アントンアニン産生細胞を、工業的
規模で大量に培養するまでには至っていない。この主な
原因としては、アントンアニン産生細胞を材料から取り
出し、培養を行う際に、培養細胞をスケールアップして
培養し、増殖させるのが困難であることが挙げられる。

この発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、アント
ンアニン合成能の高いイチゴ細胞を用い、アントノアニ
ンを効率良く大量生産することのできる製造方法の提供
を目的としている。

「課題を解決するための手段」 この発明のイチゴ培養細胞によるアントンアニンの製造
方法は、イチゴのランナーから生長点を取り出し、この
生長点を、オーキシンとサイトカイニンとを添加した固
体培地で培養してカルスを形成し、次いでオーキシンと
サイトカイニンとを添加した液体培地を用い、かつ照度
３０００Ｌｕｘ以下の光条件下でカルス細胞の培養を行
い、次いで照度３０００Ｌｕｘ以上の光条件下で培養し
て細胞内にアントンアニンを生成させ、次いでこの細胞
からアントンアニンを抽出することを、上記課題を解決
するための手段とした。

以下、この発明の詳細な説明する。

この発明において使用されるイチゴの培養細胞は、イチ
ゴのランナーから取り出された生長点が使用される。イ
チゴのランナーから取り出された生長点細胞は、カルス
培養の際に生育が良好で、アントンアニン合成能の高い
カルスが容易Ｊこ得られる。一方、イチゴの葉など他の
部位から取り出された細胞は、カルスの形成が不良であ
り、材料として不適当である。

イチゴのランナーは、果実収穫後に多数発生することか
ら、果実収穫後の時期に材料を得やすく、多数発生した
ランナーのうち生長が良好なものを選別して使用するの
が望ましい。

また材料のイチゴは、特定品種に限定されることなく、
種々の品種から還択して使用することができ、例えば我
国で一般に広く栽培されているオランダイチゴ（Ｆ　ｒ
ａｇａｒｉａ　　ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ　　Ｄ　ｕｃｈ
ｖａｒ、　ａｎａｎａｓｓａ　　Ｂａｉ　ｌ　）などを
材料とすることができる。

イチゴのランナーは、その先端部を３０〜５０Ｉｌ１ｍ
採取し、肉眼で除ける程度の幼葉は除去しておく。

このように採取されたランナー材料から生長点を取り出
すには、まずランナー材料の表面を組織培養等において
通常に使用される殺菌剤を用いて殺菌し、次に生長点部
分を解剖して生長点を摘出する。この解剖は無菌状態で
行う必要がある。

次に、摘出された生長点を培地に置床し、生長点細胞の
カルス化を行う。この培養に用いられる固体培地として
は、Ｍ　ｕｒａｓｈｉｇｅ＆　Ｓ　ｋｏｏｇ（Ｍ　Ｓ　
）培地あるいはＬ　ｉｎ＆　Ｓ　Ｌａｂａ（Ｌ　Ｓ　）
培地に、生長物質であるオーキノンとサイトカイニン、
炭素源として３０ｇＩＱ程度のサッカロースおよび０．
８〜１％程度の寒天を添加した固体培地が好適に使用さ
れる。

上記オーキシンとしては、２．４−ジクロロフェノキノ
酢酸（以下、２．４−Ｄという）が特に好適に使用され
、またサイトカイニンとしてはベンジルアデニン（以下
、ＢＡという）などが好適に使用される。

これら２．４−ＤおよびＢＡの添加量は、２．４−Ｄが
０．５〜２．０　ｐｐ＋ａ程度、ＢＡが０．０５〜０．
２ｐｐｍ程度の範囲内で設定するのが望ましい。

また生長点細胞をカルス化するための培養は、２０〜３
０℃程度の温度で、かつ照度３０００Ｌｕｘ以下の光条
件下とするのが望ましい。カルスの増殖よｐｕ度３００
０１、ｕｘ程度の場合に良好であるが、照度をそれ以上
とするとカルス細胞の増殖能が低下するとともに、培養
時間の経過に伴ってカルス表面にアントンアニンが合成
され、このアントンアニンが合成されたカルス細胞は、
次に液体培養を行っても細胞の増殖能が低下してしまう
ことから、大量培養用のカルスを形成するには不適当で
ある。

そして、上述した培養条件で生長点を培養してカルスを
形成し、必要に応じてカルスの継代培養を行い、さらに
、得られたカルスの中からアントノアニン合成能の高い
カルスを選抜し、上述した固体培地を用い、温度２０〜
３０℃、照度３０００Ｌｕｘ以下の条件下で継代培養を
行って大量培養用のカルスを形成する。

アンドシアニン合成能の高いカルスを選抜する方法とし
ては、培養されたカルスを上述の固体培地に置床し、照
度３０００Ｌｕｘ　〜８０００１．ｕｘ程度、照度２０
〜３０℃で培養してカルス表面にアントンアニンを合成
させ、着色度合が強いアントンアニン合成能の高いカル
スを選び出し、このカルス内部の未着色部分を取り出し
て大量培養用の細胞として使用し、あるいはこの未着色
部分を取り出して別の固定培地に置床して培養し、新た
にカルスを形成する方法などが使用される。

さらに、このような方法で選抜されるアントンアニン合
成能の高いカルスは、白く柔らかい外観をしており、カ
ルス化の段階で着色してしまったり固いカルスは十分な
アントンアニン合成能が得られないことから、アントノ
アニン合成能の高いカルスを簡易的に選抜する方法とし
て、培地上に形成されたカルスの外観から判断し、白く
柔らかいカルスを選抜して大量培養用のカルスとして使
用することら可能である。

次に、得られたアントノアニン合成能の高い大量培養用
のカルスを、ＬＳ培地あるいはＭＳ培地に２．４−Ｄお
よびＢＡを添加した液体培地内に入れて振とう培養する
。この液体培地中の２．４−ＤおよびＢＡの添加量は、
先のカルス化の際に使用した固体培地と同様に、２．４
−Ｄを０．５〜２　、０　ｐｐｍ程度、ＢＡを０．０５
〜０　、２　ｐｐｍ程度とするのが望ましい。また培養
条件は、温度２０〜３０℃、照度３０００　Ｌｕｘ以下
に設定される。この培１（培養前期）における光条件を
照度３０００　Ｌｕｘ以上とすると、培養時間の経過に
伴って培養細胞の表面にアントノアニンが合成され、そ
の後細胞は褐変し増殖能が低下してしまうことから、培
養細胞を増殖させるには不適当である。

上述の条件で培養を行うことにより、カルス細胞は液体
培地内で増殖し、必要に応じて培養のスケールアップを
行って、所望量の培養細胞を得ることができる。

次に、液体培地内で増殖した培養細胞を、照度３０００
　Ｌｕｘ以上、好ましくは３０００〜８０００　Ｌｕｘ
の光条件下で培養し、培養細胞をさらに増殖させながら
、培養細胞の表面にアントンアニンを合成させる（培養
後期）。この培養後期の光条件が照度３０００　Ｌｕｘ
以下であると、培養細胞表面のアントンアニン合成が不
良となり、また照度８０００　Ｌｕｘ以上の光条件下で
培養すると培養細胞の増殖が悪くなるとともに培養細胞
のアントンアニン合成能も悪くなる。なお、この培養後
期においても、必要に応じて培養のスケールアップを行
うことが可能である。

次に、アントンアニン合成の終了した細胞を、肢体培地
から分離し、この細胞からアントンアニンを抽出し、更
に精製してアントンアニンを製造する。

培養細胞からのアントンアニンの抽出及び精製方法とし
ては、従来既知の方法を用いることができる。すなわち
液体培地から培養細胞を分離し、好ましくは凍結乾燥な
どの乾燥処理を行って乾燥細胞とし、この乾燥細胞を、
塩酸酸性メタノールに浸漬し、１〜複数回の抽出を行っ
てアントンアニンを抽出し、この抽出液に酢酸鉛を加え
て塩化鉛の沈澱をこし分け、次に生じた青色の鉛塩を集
める。次にこれを塩酸酸性メタノールに再び溶かし、エ
ーテルを加えて沈澱させ、鉛塩として精製するかあるい
はピクリン酸塩として析出させ、いずれら塩化物に変え
結晶させる方法などが用いられる。

また、培養細胞からアントンアニンを抽出した抽出液か
らアンドシアニンを精製する方法はこれに限定されるこ
となく、例えば上記抽出液を減圧乾固し、水に溶解させ
た後、イオン交換樹脂にアントンアニンを吸着させ、塩
酸酸性エタノール液で溶出する方法などを用いて分離精
製することら可能である。

以上の各操作により、天然イチゴの色素であるＰ　ｅｌ
ａｒｇｏｎｉｄｉｎ　　３−　ｇｌｕｃｏｓｉｄｅが製
造される。

この方法では、イチゴのランナーから取り出した生長点
を、２．４−Ｄ　（オーキシン）とＢＡ（サイトカイニ
ン）とを含む培地で培養してカルスを形成し、次いで２
．４−ＤとＢＡとを含む液体培地を用い、かつ照度３０
００Ｌｕｘ以下の光条件下でカルス細胞の大量培養を行
い、次いで照度３０００Ｌｕｘ以上の光条件下で培養し
て細胞内にアントンアニンを生成させ、次いでこの細胞
からアントンアニンを抽出してアントンアニンを製造す
るので、アントンアニン合成能の高いカルスを液体培地
で培養する際に、まず照度３０００１．ｕｘ以下の光条
件とし、培養細胞にアントンアニンを合成させない状態
で培養することによって、培養細胞の増殖能を低下させ
ることなく細胞を増殖させ、この後に光条件を変えて培
養細胞にアントンアニンを合成させることができ、培養
のスケールアップを極めて容易に行うことができる。

すなわち、アントノアニン合成能の高いカルスを、まず
フラスコなどの小形培養器内で増殖させた後、増殖され
た培養細胞を大形タンク培養器にスケールアップして培
養し、このタンク内で大量に増殖させた後、照度３００
０　Ｌｕｘ以上の条件に切換えて培養し、培養細胞にア
ントンアニンを合成させることによって、大量のアント
ンアニンを短期間にかつ容易に得ることができる。

さらに、上記カルスあるいはカルスを液体培地で増殖さ
せた培養細胞を、照度３０００Ｌｕｘ以下の光条件で継
代培養しておくことにより、任意の時期にこれら細胞の
大量培養を開始することができるので、年間を通して平
均的にアントンアニンを製造することができる。

また液体培地を用いたカルス細胞の培養においては、植
物の通常栽培に比べて生産効率が格段に高く、短期間で
大量のアントンアニンを製造することができるので、ア
ントンアニンの生産コストを低減化することが可能とな
る。

さらにまた、固体培地によるカルス培養および肢体培地
を用いたカルス細胞の培養においては、細胞の増殖速度
を光の照射条件によって調節することができる。このた
め先の月射条件を適宜調節することによって常に一定の
増殖速度で培養することが可能となり、培養の容易化、
効率化を図ることができる。

以下、実施例によって本発明の効果を明確化する。

「実施例」 イチゴ（四季酸イチゴＦ　ｒａｇａｒｉａＸ　ａｎａｎ
ａｓｓａ）のランナーを材料とし、このランナーの先端
部を３０１採取し、表面を殺菌し、さらに無菌状態で生
長点部分を解剖して生長点を摘出した。

次に、摘出した生長点を、ＭＳ培地に２．４−Ｄをｌｐ
ｐｍ、ＢＡを０　、　Ｉ　ｐＩ）ＩＩＩ、サッカロース
（炭素源として）を３０ｇ／Ｑおよび１％の寒天を添加
した固体培地に着床し、温度２５℃、照度８００　Ｌｕ
ｘの条件で培養し、カルスを形成した。

なお、イチゴランナーからの生長点と同様にイチゴの無
菌苗の葉を固体培地に着床し、同様に培養したが、殆ど
が植物体を再生させるか、または褐変して枯れてしまい
、カルスを形成することができなかった。

一方、ランナーの生長点から得られたカルスは、生育が
良好で、白く柔らかなカルスが得られた。

このイチゴランナーの生長点から形成されたカルス細胞
の増殖は、著しく光の影響を受けるため、次の実験によ
ってカルスの生育と光条件との関係を調べた。固体培地
上に形成されたカルスのうち１つを選び出し、これを切
開して分割し、これらの分割片を固体培地に着床し、光
条件を８００．３０００および８０００　ＬＬＩＸに変
え、各条件下での細胞の増殖量を測定した。この結果を
第１図に示す。

第１図に示すように、イチゴカルス細胞の増殖は、光条
件を！Ｉ６度３０００Ｌｕにとしたときに最ら良好であ
った。しかもこの３０００　Ｌｕｘの光条件下で形成さ
れたカルスの表面にはアントンアニンが合成されていた
。またアントンアニンが合成されたカルス細胞は、その
後増殖能が低下し、この細胞のみを肢体培地に移して培
養を行っても増殖が殆ど行なわれなかった。このことか
らカルス細胞の増殖は、アントンアニンの合成が起こら
ない魚皮３０００Ｌｕｘ以下での培養が望ましいことが
判明した。

次に、固体培地に形成されたカルスのうちアントンアニ
ン合成能の高いカルスを選抜し、２．４−ＤＩ　ｐｐｍ
、　ＢＡ　Ｏ、Ｉ　Ｐｌｕｍを添加したＬＳ培地（液体
培地）で継代培養を行った。

次に、この合成能の高いイチゴ細胞を大量に得るため同
じ１：ルモン条件の液体培地で光条件を変え細胞の大量
培養を試みた。

アントンアニン合成は、液体培養細胞０．５ｇ（湿重里
）を５００ｍ１の三角フラスコに入れ、光条件を変え、
２５℃、８０　ｒｐｍで振とう培養し、アントンアニン
の合成を検討した。この結果を第２図に示す。

第２図に示すように、液体培養でも光条件を照度３００
０Ｌｕｘとしたとき最も増殖が良好であった。しかしこ
の条件で培養された細胞は、約１４日後にアントンアニ
ンが合成され、その後細胞は褐変し増殖能が低下した。

一方、暗所（ＯＬｕに）または８００　Ｌｕｘの光条件
下で培養した細胞は、アントンアニンの合成は見られな
いが安定した増殖を示し、継代培養が可能であった。

また８０００Ｌｕｘの光条件下で培養した細胞は、培養
当初から増殖が不良であった。

次に、先の実験で使用した８　００　Ｌｕｘの光条件下
で培養した試料を、光条件を３０００　Ｌｕｘに変えて
培養した。

モして培養細胞にアントンアニンが合成された時点で培
地から培養細胞をこし分け、アントノアニン系色素の定
性分析を行った。この定性分析は、取り出した培養細胞
を５分間煮沸した後、細胞を吸引濾過し、ろ液をＰＶＰ
（ポリビニルピロリドン）に吸肴させ、メタノールで洗
浄し、その後１％Ｉ（ＣＩ−メタノールで溶出し、吸光
度を測定するとと乙にＴＩ、Ｃにより分析した。これら
の分析の結果、液体培養により得られたアントノアニン
は、天然イチゴの色素である　Ｐ　ｅｌａｒｇｏｎｉｄ
ｉｎ　　３ｇ１ｕｃｏｓｉｄｅであることが判明した。

以上の培養結果から、アントンアニンを合成させるため
の前段階である細胞の大量培養は、暗所か８００　Ｌｕ
ｘの光条件下で行い、−皮細胞を増殖させた後に３００
０　Ｌｕｘの光条件下で培養することにより、イチゴ培
養細胞からアントンアニンの大量生産が可能であること
が判明した。

「発明の効果」 この発明は、イチゴのランナーから生長点を取り出し、
２．４−ＤなどのオーキシンとＢＡなどのサイトカイニ
ンとを添加した固体培地で培養してカルスを形成し、次
いでオーキシンとサイトカイニンを添加した肢体培地を
用い、かつ照度３０００Ｌｕｘ以下の光条件下でカルス
細胞の大量培養を行い、次いで照度３０００Ｌｕｘ以上
の光条件下で培養して細胞内にアントノアニンを生成さ
せ、次いでこの細胞からアントンアニンを抽出してアン
トンアニンを製造することにより、肢体培養の際に、Ｊ
ｌｑ度３０００Ｌｕｘ以下の光条件とし、培養細胞にア
ントノアニンを合成させることなく増殖させ、その後に
光条件を変えてアントンアニンを合成させることができ
るので、アンドシアニンが合成される前の培養時に培養
のスケールアップを極めて容易に行うことができ、培養
をスケールアップすることによって大量の培養細胞を容
易に得ることができることから、大量のアントンアニン
を容易に得ることができる。

さらに、上記カルスあるいはカルスを液体培地で増殖さ
せた培養細胞を、照度３０００　Ｌｕｘ以下の光条件で
継代培養しておくことにより、任意の時期にカルス細胞
の大量培養を開始することができるので、年間を通して
平均的にアントンアニンの製造を実施することができる
。

また液体培地を用いたカルス細胞の培養においては、植
物の通常栽培に比べて生産効率が格段に高く、短期間で
大量のアントンアニンを製造することができるので、ア
ントンアニンの生産コストを低減化することができる。

さらにまた、固体培地によるカルス培養および液体培地
を用いたカルス細胞の培養においては、細胞の増殖速度
を光の照射条件によって調節することができる。このた
め光の照射条件を適宜調節することによって常に一定の
培養速度で培養を行うことが可能となり、培養の容易化
、効率化を図ることかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、この発明の実施例における培養
結果を示すグラフであって、第１図は固体培地でのイチ
ゴカルスの生育量を示すグラフ、第２図は光条件による
液体培養細胞の生育量を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 イチゴのランナーから生長点を取り出し、 この生長点を、オーキシンとサイトカイニンとを添加し
   た固体培地で培養してカルスを形成し、次いでオーキシ
   ンとサイトカイニンとを添加した液体培地を用い、かつ
   照度３０００Ｌｕｘ以下の光条件下でカルス細胞の培養
   を行い、 次いで照度３０００Ｌｕｘ以上の光条件下で培養して細
   胞内にアントンアニンを生成させ、 次いでこの細胞からアントンアニンを抽出することを特
   徴とするイチゴ培養細胞によるアントンアニンの製造方
   法。