JPH0458894A - アントシアニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 この発明は、イチゴ培養細胞によるアントシアニンの製
造方法に係わり、特にイチゴのカルスを用いてアントシ
アニンを大量に製造することのできる方法に関する。

「従来の技術」 アントシアニンは花の色という意味を持ち、花や果実の
赤、紫、青系統の鮮やかな色のほとんどはこのアントシ
アニンによっている。シソ、ブドウ、クロマメ、赤カブ
、バラ、イチゴなどはアントシアニンによりその色を呈
している。

このアントシアニンは着色料や塗料の素材として実用価
値が高いため、大量生産が検討されている。また最近で
はアントシアニンの血圧降下作用“などの研究もなされ
ており、色素以外にも興味深い性質を有している。

従来、アントシアニンの一般的な製法としては、アント
シアニンを含む種々の植物を材料とし、１〜２％の塩酸
酸性メタノールで材料を抽出し、酢酸鉛を加えて塩化鉛
の沈澱をこし分け、次に生じた青色の鉛塩を集める。こ
れを３％メタノール塩酸に再び溶かし、エーテルを加え
て沈澱させ、鉛塩として精製するかあるいはピクリン酸
塩として析出させる。いずれも塩化物に変えて結晶させ
、アントシアニンを得る。

「発明が解決しようとする課題」 しかしながら、このような従来の方法では、栽培植物を
原料とすることから原料コストが高くなり、アントシア
ニンを安価に製造することが不可能であった。

また栽培植物を原料とすると、植物の生長が遅く、栽培
に時間と手間がかかり、アントシアニンの生産効率が悪
い問題があった。

さらにアントシアニンの製造が栽培植物の収穫時期に左
右され、年間を通して平均的にアントシアニンの製造が
出来ない問題もあった。

そして従来、このような栽培植物体からのアントシアニ
ンの製造方法に比べ、アントシアニンの生産効率が高く
、アントシアニンを大量にかつ年間を通して平均的に製
造することが可能な方法として、ニンジン、ブドウ、バ
ラ、リンゴ、キクイモ、ブドウなどから誘導されたアン
トシアニン生産細胞を大量培養し、この培養細胞からア
ントシアニンを抽出する方法が検討されてきている。

しかし現段階では、アントシアニン生産細胞を工業的規
模で大量に培養するまでには至っていない。この主な原
因としては、アントシアニン産生細胞を材料から取り出
し、培養を行う際に、培養細胞をスケールアップして培
養し、増殖させるのが困難であることが挙げられる。

この発明は上記事情に鑑みてなされたもので、アントシ
アニン生産能の高いイチゴ細胞を用い、アントシアニン
を効率良く大量生産することのできる製造方法の提供を
目的としている。

「課題を解決するための手段」 この発明のアントシアニンの製造方法は、イチゴの葉、
茎、果実部、花部および根のいずれかの部位から細胞を
取り出し、この細胞をオーキシンあるいはオーキシンと
サイトカイニンとを添加した固体培地で培養してカルス
を形成し、次いでオーキシンあるいはオーキシンとサイ
トカイニンとを添加した液体培地を用い、照度３０００
　Ｌｕｘ以下の光条件下でカルス細胞の培養を行い、次
いで照度３０００　Ｌｕｘ以上の光条件下で培養して細
胞内にアントシアニンを生成させ、次いでこの細胞から
アントシアニンを抽出することによって上記課題を解消
した。

以下、この発明の詳細な説明する。

本発明者らは、先に、イチゴのランナーから得られる生
長点を用い、この細胞をオーキシンとサイトカイニンと
を添加した固体培地で培養してカルスを形成し、次いで
オーキシンとサイトカイニンとを添加した液体培地を用
い、照度　３０００Ｌｕｘ以下の光条件下でカルス細胞
の培養を行い、次いで照度３０００　Ｌｕｘ以上の光条
件下で培養して細胞内にアントシアニンを生成させ、次
いでこの細胞からアントシアニンを抽出するアントシア
ニンの製造方法について発明し、特願平ｌ−２２４００
０号として特許出願した。この培養方法にあっては、培
養細胞をイチゴのランナーの生長点としたが、本発明者
らは鋭意研究の結果、ランチ−の生長点以外の部位であ
っても、細胞を厳密に選定し、カルス培養における培地
のホルモン組成（オーキシン、サイトカイニン濃度）を
適切に設定することによりアントシアニンの製造が可能
となることを知見し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明では、イチゴの葉、茎、果実部、花部
および根のいずれかの部位から取り出した細胞を用いて
培養を行う。

材料のイチゴは、特定品種に限定されることなく、種々
の品種から選択して使用することができ、例えば我国で
一般に広く栽培されているオランダイチゴ（Ｆ　ｒａｇ
ａｒｉａ　　ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ　　Ｄ　ｕｃｈ　　
ｖａｒａｎａｎａｓｓａ　　Ｂａ１ｌ　）などを使用で
きる。

イチゴの葉、茎、果実部、花部および根から培養に適し
た細胞を取り出す方法を例示すれば、幼苗の葉、茎ある
いは未成熟の果実部分を、組織培養等において通常に使
用される殺菌剤を用いて殺菌し、次にこれらの材料を薄
刃のナイフ等で裁断して小さな断片とする。また根は、
幼苗から茎部を一部含む根部組織を切り出して用いる。

これらの断片や組織は、組織培養等において通常に使用
される殺菌剤を用いて殺菌する。

次に、摘出した断片や組織を培地に置床してカルス化を
行う。この培養に用いられる固体培地としては、Ｍ　ｕ
ｒａｓｈｉｇｅ＆　Ｓ　ｋｏｏｇ（Ｍ　Ｓ　）培地ある
いはＬ　ｉｎ＆　Ｓ　ｔａｂａ（Ｌ　Ｓ　）培地に、オ
ーキシンあるいはオーキシンとサイトカイニン、炭素源
として３０ｇＩＱ程度のサッカロースおよび０．８〜１
％程度の寒天を添加した固体培地が好適に使用される。

上記オーキシンとしては、２．４−ジクロロフェノキシ
酢酸（以下、２．４−Ｄという）が特に好適に使用され
、またサイトカイニンとしてはベンジルアデニン（以下
、ＢＡという）などが好適に使用される。

これら２．４−ＤおよびＢＡの添加量は、２．４−Ｄが
０．５〜５．０　ｐｐｍ程度、ＢＡが０．０５〜２ｐｐ
ｍ程度の範囲内で設定される。

また断片や組織をカルス化するための培養は、２０〜３
０℃程度の温度で、かつ照度３０００Ｌｕｘ以下の光条
件下とするのが望ましい。カルスの増殖は照度３０００
Ｌｕｘ程度の場合に良好であるが、照度をそれ以上とす
るとカルス細胞の増殖能が低下するとともに、培養時間
の経過に伴ってカルス表面にアントシアニンが生成され
、このアントシアニンが生成されたカルス細胞は、次に
液体培養を行っても細胞の増殖能が低下してしまうこと
から、大量培養用のカルスを形成するには不適当である
。

そして、上述した培養条件で細胞を培養してカルスを形
成し、必要に応じてカルスの継代培養を行い、さらに、
得られたカルスの中からアントシアニン生産能の高いカ
ルスを選抜し、上述した固体培地を用い、温度２０〜３
０℃、照度３０００　ＬＬＩＸ以下の条件下で継代培養
を行って大量培養用のカルスを形成する。

アントシアニン生産能の高いカルスを選抜する方法とし
ては、培養されたカルスを上述の固体培地に置床し、照
度３０００Ｌｕｘ〜８０００Ｌｕｘ程度、温度２０〜３
０℃で培養してカルス表面にアントシアニンを生成させ
、着色度合が強いアントシアニン生産能の高いカルスを
選び出し、このカルス内部の未着色部分を取り出して大
量培養用の細胞として使用し、あるいはこの未着色部分
を取り出して別の固定培地に置床して培養し、新たにカ
ルスを形成する方法などが使用される。

さらに、このような方法で選抜されるアントシアニン生
産能の高いカルスは、白く柔らかい外観をしており、カ
ルス化の段階で着色してしまったり固いカルスは十分な
アントシアニン生産能が得られないことから、アントシ
アニン生産能の高いカルスを簡易的に選抜する方法とし
て、培地上に形成されたカルスの外観から判断し、白く
柔らかいカルスを選抜して大量培養用のカルスとして使
用することも可能である。

次に、得られたアントシアニン生産能の高い大量培養用
のカルスを、ＬＳ培地あるいはＭＳ培地にオーキシンあ
るいはオーキシンとサイトカイニンを添加した液体培地
内に入れて振とう培養する。

この液体培地中の２．４−ＤおよびＢＡの添加量は、先
のカルス化の際に使用した固体培地と同様に、２．４−
Ｄ　（オーキシン）を０．５〜５　、　Ｏｐｐｍ５Ｂ　
Ａ　（サイトカイニン）を０．０５〜２　ｐｐｒｔｒ程
度とする。また培養条件は、温度２０〜３０℃、照度３
０００　Ｌｕｘ以下とする。この培養（培養前期）にお
ける光条件を照度３０００　Ｌｕｘ以上とすると、培養
時間の経過に伴って培養細胞の表面にアントシアニンが
生成され、その後細胞は褐変し増殖能が低下してしまう
ことから、培養細胞を増殖させるには不適当である。

上述の条件で培養を行うことにより、カルス細胞は液体
培地内で増殖し、必要に応じて培養のスケールアップを
行って、所望量の培養細胞を生産する。

次に、液体培地内で増殖した培養細胞を、照度３０００
　Ｌｕｘ以上、好ましくは３０００〜８０００　Ｌｕｘ
の光条件下で培養し、培養細胞をさらに増殖させながら
、培養細胞にアントシアニンを生成させる（培養後期）
。この培養後期の光条件が照度３０００　Ｌｕｘ以下で
あると、培養細胞のアントシアニン生成が不良となり、
また照度８０００Ｌｕｘ以上の光条件下で培養すると培
養細胞の増殖が悪くなるとともに培養細胞のアントシア
ニン生産能も悪くなる。なお、この培養後期においても
、必要に応じて培養のスケールアップを行うことが可能
である。

次に、アントシアニン生成の終了した細胞を液体培地か
ら分離し、この細胞からアントシアニンを抽出、精製し
てアントシアニンを製造する。

培養細胞からのアントシアニンの抽出及び精製方法とし
ては従来既知の方法を用いることができる。すなわち液
体培地から培養細胞を分離し、好ましくは凍結乾燥など
の乾燥処理を行って乾燥細胞とし、この乾燥細胞を、塩
酸酸性メタノールに浸漬し、１〜複数回の抽出を行って
アントシアニンを抽出し、この抽出液に酢酸鉛を加えて
塩化鉛の沈澱をこし分け、次に生じた青色の鉛塩を集め
る。次にこれを塩酸酸性メタノールに再び溶かし、エー
テルを加えて沈澱させ、鉛塩として精製するかあるいは
ピクリン酸塩として析出させ、いずれも塩化物に変え結
晶させる方法などが用いられる。

また、培養細胞からアントシアニンを抽出、精製する方
法はこれに限定されることなく、例えば上記抽出液を減
圧乾固し、水に溶解させた後、イオン交換樹脂にアント
シアニンを吸着させ、塩酸酸性エタノール液で溶出する
方法を用いて分離精製することも可能である。

以上の各操作により、アントシアニンが製造される。

この方法では、イチゴの葉、茎、果実部、花部および根
のいずれかの部位から取り出した細胞を、オーキシンあ
るいはオーキシンとサイトカイニンを含む培地で培養し
てカルスを形成し、次いでオーキシンあるいはオーキシ
ンとサイトカイニンをを含む液体培地を用い、かつ照度
３０００　Ｌｕｘ以下の光条件下でカルス細胞の大量培
養を行い、次いで照度３０００Ｌｕｘ以上の光条件下で
培養して細胞内にアントシアニンを生成させ、次いでこ
の細胞からアントシアニンを抽出してアントシアニンを
製造するので、培養のスケールアップを極めて容易に行
うことができる。すなわち、アントシアニン合成能の高
いカルスを、まずフラスコなどの小形培養器内で増殖さ
せた後、増殖された培養細胞を大形タンク培養器にスケ
ールアップして培養し、このタンク内で大量に増殖させ
た後、照度３０００　Ｌｕｘ以上の条件に切換えて培養
し、培養細胞にアントシアニンを生成させることによっ
て、大量のアントシアニンを短期間にかつ容易に得るこ
とができる。

さらに、上記カルスあるいはカルスを液体培地で増殖さ
せた培養細胞を、照度３０００Ｌｕｘ以下の光条件で継
代培養しておくことにより、任意の時期にこれら細胞の
大量培養を開始することができるので、年間を通して平
均的にアントシアニンを製造することができる。

また液体培地を用いたカルス細胞の培養においては、植
物の通常栽培に比べて生産効率が格段に高く、短期間で
大量のアントシアニンを製造することができるので、ア
ントシアニンの生産コストを低減化することが可能とな
る。

さらにまた、固体培地によるカルス培養および液体培地
を用いたカルス細胞の培養においては、細胞の増殖速度
を光の照射条件によって調節することができる。このた
め光の照射条件を適宜調節することによって常に一定の
増殖速度で培養することが可能となり、培養の容易化、
効率化を図ることができる。

以下、実施例によって本発明の効果を明確化する。

「実施例」 （試料の調整） イチゴ（四季酸イチゴ：　Ｆ　ｒａｇａｒｉａＸ　ａｎ
ａｎａｓｓａ）の幼苗、未成熟果実部分および開花前の
孔部分を、５％中性洗剤溶液で１０分間撹拌洗浄した後
、７０％エタノールに入れ３０秒超音波洗浄した。その
後５％ＮａＣｌ０水溶液で約８分間浸漬して滅菌し、各
試料をクリーンベンチ内に入れ、滅菌水で３回洗浄した
。

幼苗は、葉と、茎下部を含む根部分と、残りの茎部分と
に切り分けた。葉、茎部分、果実部分、孔部分の各試料
は、それぞれ細かく裁断して１ＩＩｌｌ〜数■の断片と
した。また根部分はそのまま試料とした。

（カルスの形成） ＭＳ培地にサッカロース（炭素源として）を３０ｇＩＱ
、　　１％の寒天を添加した固体培地を基本培地とし、
これに２．４−Ｄを０．１〜５．０ｐｐｍ、ＢＡを０．
０５〜５　、０　ｐｐｍの範囲で含む各種のホルモン濃
度の異なる培地を用い、各固体培地に各部の断片や組織
を置床し、温度２５℃、照度８００　Ｌｕｘの１６時間
日長の条件で２週間培養し、カルスの形成状態を調べた
。

この結果を第１表に示した。

以下余白 第１表 Ｘ・・・各試料ともカルス形成せず Ｏ・・・各試料ともカルス形成あり △１・・・茎部分、根部分でカルス形成あり△３・・・
茎部分、根部分、葉でカルス形成あり△３・・・茎部分
、葉でカルス形成あり△４・・・茎部分でカルス形成あ
り △５・・・葉でカルス形成あり 第１表から明らかなように、カルス形成用の培地中のホ
ルモン（２，４−ＤとＢＡ）濃度を適切に設定すること
により、イチゴの葉、茎、根などの各部の細胞を用いて
カルスを形成することが可能であった。またカルス形成
培地中の２．４−ＤとＢＡの最適濃度範囲は、２．４−
Ｄが０　、５　ｐｐｍ〜２ｐｐｍＳＢＡが０　、１　ｐ
ｐｍ　〜２　ｐｐｍであった。

上記試料のうち葉と茎部分の断片を用い、２゜４−Ｄ単
独の培地およびＢＡ単独の培地でカルス形成の有無を調
べた。結果を第２表、第３表に示した。

第２表 第３表 第２表および第３表に示したように、ホルモンとして２
４−Ｄを単独とした培地であっても葉および茎部分の断
片試料からカルス化が可能であった。一方、ＢＡを単独
とした培地ではカルス化が不可能であった。

また２、４−Ｄを単独とした培地での２．４−Ｄの最適
濃度範囲は、１〜２　ｐｐｍであった。この２゜４−Ｄ
を単独とした培地でのカルス形成培養と、第１表に示し
た２、４−ＤとＢＡの双方を加えた培地でのカルス形成
培養とを比較すると、２．４−ＤとＢＡの双方を加えた
培地の方がカルス化が良好であった。

また２、４−Ｄ以外のオーキシンとして、ナフタレン酢
酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール
酪酸（ＩＢＡ）を０．１〜５　ｐｐｍの１囲で加えた培
地を用い、上記葉と茎部分の断片試料を置床してカルス
化の有無を調べた。結果を第４表に示した。

第４表 Ｘ・・・カルス形成なし △・・・カルス形成不良 第４表に示したように、２．４−Ｄ以外のオーキシン（
ＮＡＡＳ　Ｉ　ＡＡＳ　Ｉ　ＢＡ）を用いてもカルスの
形成が可能であるが、２．４−Ｄに比べこれらのオーキ
シンはカルスの形成が不良であった。

（カルス細胞の一次培養） 上記試験により、２．４−Ｄ　　２ｐｐｍ、　ＢＡ　　
０ｓｐｐ−を含む固体培地で、葉と茎部分の断片試料か
ら得られた白く柔らかいカルスをそれぞれ用い、これら
のカルスを切開して分割し、分割片を５００園ｌフラス
コに入れ、２．４−Ｄ　　ｉｐｐｍ、ＢＡ　　Ｏｌ　ｐ
ｐｍを添加したＬＳ培地（液体培地）ｔｏ（１＋１を入
れ、照度を８００　Ｌｕｘ、　３０００　Ｌｕｘ、　８
０００Ｌｕｘとし、培養温度２５℃、８０　ｒｐｍで振
とう培養し、各条件でのカルスの増殖を調べた。

その結果、葉および茎部分からの双方のカルスとも、光
条件を照度３０００　Ｌｕｘとしたときに最も増殖が良
好となった。しかしこの条件で培養されたカルスは、１
０〜１４日後にアントシアニンが生成され、培養細胞が
褐変して以後の増殖能が低下した。

一方、照度８００　Ｌｕｘで培養した葉および茎部分の
それぞれのカルスは、培養細胞にアントシアニンを生成
することなく高い増殖率を示した。この光条件で培養し
たカルスは、１〜２週間の培養サイクルで継代培養でき
、同一条件でスケールアップ培養して培養細胞を大量生
産することが可能であった。

また８　０００　Ｌｕｘの光条件下で培養したカルスは
、葉、茎部分のカルスとも、培養当初から増殖が不良で
あり、数日で褐変した。

これらの結果より、イチゴの葉、茎部分などの細胞から
誘導したカルスを、照度３０００ＬＬＩＸ以下の照度条
件で液体培養することにより、培養細胞にアントシアニ
ンを生成させることなく増殖させることができ、この光
条件でスケールアップ培養することによって培養細胞の
大量生産が可能であることが判明した。

（カルスの２次培養） 葉、茎部分の細胞から得られたカルスを８００Ｌｕｘの
光条件下で２週間培養した後、この培養細胞２ｇ（湿重
量）を５００ｍ１フラスコに入れ、２．４−Ｄｌｐｐｍ
、ＢＡＯ，ｉｐｐｍを添加したり、Ｓ培地（液体培地）
１００ｍｌを入れ、光条件を３０００　Ｌｕｘ。

８０００　Ｌｕｘの連続光照射とし、培養温度２５℃、
８０ｒｐｍで振とう培養した。

照度３０００　Ｌｕｘとしたものでは、葉、茎部分のそ
れぞれの試料とも細胞の増殖が認められ、１０〜１４日
で培養細胞内にアントシアニンが生成された。

照度８０００　Ｌｕｘとしたものでは、葉、茎部分のそ
れぞれの試料とも細胞の増殖がわずかであり、１〜数日
で培養細胞内にアントシアニンが生成された。

この結果、照度３０００　Ｌｕｘ以下で１次培養した後
に、照度３０００　Ｌｕｘ以上として２次培養すること
により、培養細胞内にアントシアニンを生成させること
ができ、特に照度３０００　Ｌｕｘ〜８０００　ＬＬＩ
Ｋで培養することにより、培養細胞を増殖させながらア
ントシアニンを生産することが可能であった。

（アントシアニンの分離） 上記２次培養において、照度３０００　Ｌｕｘとして２
週間培養した培養サンプルを用い、培養液から培養細胞
をこし分け、アントシアニン系色素の定性分析を行った
。培養液より分離した培養細胞を５分間煮沸した後、培
養細胞を吸引ろ過し、ろ液をｐｖｐ（ポリビニルピロリ
ドン）に吸着させ、メタノールで洗浄し、その後１％Ｈ
Ｃｌ−メタノールで溶出し、吸光度を測定するとともに
、ＴＬＣにより分析した。これら分析の結果、培養細胞
から得られたアントシアニンは、天然イチゴの色素であ
る　ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ−３−ｇｌｕｃｏｓｉｄ
ｅやｃｙａｎｉｄｉｎ３−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅであるこ
とが判明した。

以上の培養結果から、アントシアニンを生成させるため
の前段階であるカルスの大量培養は、暗所か８００　Ｌ
ＬＩＫの光条件下で行い、−皮細胞を増殖させた後に３
０００　Ｌｕｘ以上の照度として培養することにより、
イチゴの培養細胞を用いてアントシアニンの大量生産が
可能であることが判明した。

「発明の効果」 以上説明したように、この発明はイチゴの葉、茎、果実
部、花部および根部のいずれかの部位から細胞を取り出
し、オーキシンあるいはオーキシンとサイトカイニンを
添加した固体培地で培養してカルスを形成し、得られた
カルスを照度３０００　Ｌｕｘ以下で液体培養してカル
ス細胞の大量培養を行い、次いで照度を３０００Ｌｕｘ
以上として細胞内にアントシアニンを生成させ、次いで
この細胞からアントシアニンを抽出してアントシアニン
を製造することにより、アントシアニンが合成される前
の培養時に培養のスケールアップを極めて容易に行うこ
とができ、培養をスケールアップすることによって大量
の培養細胞を容易に得ることができ、アントシアニンを
大量生産することができる。

また上記カルスあるいはカルスを液体培地で増殖させた
培養細胞を、照度３０００ＬＬＩＸ以下の光条件で継代
培養しておくことにより、任意の時期にカルス細胞の大
量培養を開始することができるので、年間を通して平均
的にアントシアニンの製造を実施することができる。

また液体培地を用いたカルス細胞の培養においては、植
物の通常栽培に比べて生産効率が格段に高く、短期間で
大量のアントシアニンを製造することができるので、ア
ントシアニンの生産コストを低減化することができる。

さらにまた、固体培地によるカルス培養および液体培地
を用いたカルス細胞の培養においては、細胞の増殖速度
を光の照射条件によって調節することができる。このた
め光の照射条件を適宜調節することによって常に一定の
培養速度で培養を行うことが可能となり、培養の容易化
、効率化を図ることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 イチゴの葉、茎、果実部、花部および根のいずれかの部
   位から細胞を取り出し、 この細胞をオーキシンあるいはオーキシンとサイトカイ
   ニンとを添加した固体培地で培養してカルスを形成し、 次いでオーキシンあるいはオーキシンとサイトカイニン
   とを添加した液体培地を用い、かつ照度３０００Ｌｕｘ
   以下の光条件下でカルス細胞の培養を行い、 次いで照度３０００Ｌｕｘ以上の光条件下で培養して細
   胞内にアントシアニンを生成させ、 次いでこの細胞からアントシアニンを抽出することを特
   徴とするアントシアニンの製造方法。