JPH03184998A - ハイブリッド蛋白質，ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、創傷の治癒促進剤などとして用いることので
きる酸性線維芽細胞成長因子（以下、ａＦＧＦと略称す
ることもある。）蛋白質の部分ペプチドと塩基性線維芽
細胞戊長因子（以下、ｂＦＧＦと略称することもある。

）蛋白質の部分ペプチドとを分子中に含む線維非細胞成
長作用を有するハイブリッド蛋白質およびそれを製造す
るための技術に関する。

従来の技術 ａＦＧＦは分子量約１．６万、等電点が５〜７、またｂ
Ｆ　Ｇ　Ｆは分子量約１．７万、等電点が８５〜９５の
共にポリペプチドホルモンである。両者共ヘパリンと強
く結合するという特徴があり、中胚葉山来の殆んど全て
の細胞に対して増殖促進作用を示し、また血管新生因子
として一般に知られている。

天然に存在するＦＧＦは極めて微量で、これを取得する
のは困難であったが、最近遺伝子組換え技術を用いた製
造法が開発された。遺伝子組換え技術を用いたａＦＧＦ
およびｂＦ　Ｇ　Ｆの製造については、Ｂｉｏｔｅｃｌ
ｎｏｌｏｇｙ　５．９６０　（１９８７）　；　Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　２６３＋］　６４７１（］　９８８）；
　ＩＣ３Ｖ　５ｈｏｒｔ　Ｒｅｐｏｒｔｖｏｌｕｍｅ８
　、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ　；　Ｐｒ。

ｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｒ　ｔｈｅ
　Ｉ　９８８　Ｍｉａｍｉ　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　ＷｉｎｔｅｒＳｙｍｐｏｓｉｕｍ、　　Ｉ　ＲＬ
、　Ｐｒｅｓｓ＋　ｐａｇｅｌ　１０＋Ｂｉｏｃｈｅｍ
。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、±４６，
４７０（＋９８７）；　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６３＋
１８４５２（１９８８）；およびＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２
６３．１６２９５（１９８８）などの報告がある。

ＦＧＦムティンに関しては、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓＲｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、±５１，７０１（］
　９８８）、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６３　＋　１８４５
２（１９８８）にＦＧＦに存在するＣｙｓ残基をＳｅｒ
残基に置換したムティンについて記載されている。

発明が解決しようとする課題 ａＦＧＦはヘパリン存在下でのみｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞
増殖促進活性を示すことが知られている。一方、ｂＦＧ
Ｆはヘパリンが存在しなくても細胞増殖促進活性を示す
。ただ、いずれの場合も有効濃度範囲が狭＜、濃度が低
くてもあるいは高ずぎても急激な活性の低下が見られる
。またａＦＧＦはヘパリン非存在下では細胞の形質変化
（トランスフォーメーンヨン）を引き起こさないが、ｂ
Ｆ　Ｇ　Ｆはヘパリンの有無にかかわらずトランスフオ
ーム細胞様形態変化を起こす。この様にどちらの因子も
各々特有の長所を有することが知られている。

そこで本発明者らはａＦＧＦとｂＦＧＦのハイブリッド
蛋白質をつくることにより、広有効濃度。

ヘパリン非依存性、低形態変化誘導活性など各々の分子
の長所を併せもち、また、ｌ？　Ｇ　Ｆの安定性、分子
当りの細胞増殖活性の上昇がなされ、さらに未知の生物
活性の賦活化がなされるであろうと考えた。

課題を解決するための手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技術によりａＦＧＦの部分
ペプチドとｂＦＧＦの部分ペプチドとのハイブリッド蛋
白質であってどちらかの活性中心をもっている蛋白質を
作成したところ、有効濃度範囲の拡大または（および）
細胞形態変化誘導活性の低下がなされることを見い出し
、これに基づいてさらに研究した結果、本発明を完成し
た。

本発明は、（１）ａＦ　Ｇ　Ｆ蛋白質の部分ペプチドと
ｂＦＧＦ蛋白質の部分ペプチドとを分子中に含む線維芽
細胞成長作用を有する／％４ブリッド蛋白質。

（２）、」１記（１）のハイブリッド蛋白質をコードす
る塩基配列を有する組換えＤＮＡ、（３）、上記（２）
の組換えＤＮＡを含むベクター、（４）、上記（３）の
ベクターで形質転換された形質転換体、および（５）、
」１記（４）の形質転換体を培地に培養することを特徴
とする」１記（１）のハイブリッド蛋白質の製造法であ
る。

本発明のハイブリッド蛋白質は、ａＦＧＦの活性中心お
よびｂＦＧＦの活性中心のうち少なくとも一つを有し、
ハイブリッドにすることにより有効濃度範囲の拡大また
はくおよび）細胞形態変化誘導活性の低下をもたらすよ
うに構築される。

本発明のハイブリッド蛋白質の基本となるａＦＧＦ蛋白
質およびｂＦＧＦ蛋白質としては、温血哺乳動物のＦＧ
Ｆのいずれのものでもよい。

その代表例としては、たとえばヒト、ウシ、ラットなど
のＦＧＦが挙げられる。

該ａＦＧＦ蛋白質およびｂＦＧＦ蛋白質としては、それ
ぞれａＦＧＦ活性を有しているムティンおよびｂＦＧＦ
活性を有しているムティンでもよい。

該ＦＧＦムティンとしては、本来元のペプチドあるいは
蛋白質のアミノ酸配列が変異したものであり、したがっ
て該変異としては、アミノ酸の付加、構成アミノ酸の欠
損、他のアミノ酸への置換が挙げられる。

該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のＦＧ
Ｆ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。

該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個のＦ
ＧＦ構戊構成ノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。

ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
ィンにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないものである
。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

さらに好ましくは、ＦＧＦと相同性（ホモロジー）が認
められており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配
列の一部あるいはすべてが挙げられる。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が欠損し
ているムティンにおける欠損している構成アミノ酸の数
としては、ＦＧＦの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が別のア
ミノ酸で置換されているムティンにおけ７ る置換される前の少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸
の数としては、ｂＦＧＦの特徴を失わない限り何個でも
よい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システィン
、システィン以外のものが挙げられる。

システィンが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシスティン以外のものとしては、アスパラギン
酸、アルギニン１グリシン、バリンなどが挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、インロ
イシン、チロンン、フェニルアラニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、セリン。

スレオニン、メチオニンなどが挙げられる。特に、セリ
ン、スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギンスレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギ
ニンなどが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニ
ンが好ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン。

スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギ
ン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリングルタミン酸、アル
ギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチ７１−二ン、
アラニン、ロインン、システィン、グルタミン、アルギ
ニン、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニン
が好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロイシン
、プロリン、グリ／ン、リジン、アスパラギン酸などが
挙げられ、特にセリンが好ましい。

置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸、アルギニン、グリシン、セリン、バリンが好まし
い。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セゾ
ン、ロイシンが好ましい。

置換されたムティンの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
最も好ましい。

上記の置換においては、２以」二の置換を同時に行なっ
てもよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換さ
れるのが好ましい。

該ムティンは、上記した付加１欠損、置換の２っ０ または３つが組み合わさったものでもよい。

ａＦＧＦ蛋白質の部分ペプチドの好ましい例としては、
たとえば連続した少くとも１０個のアミノ酸残基よりな
るａＦＧＦ構成ペプチドが挙げられる。これらのペプチ
ドを構成するアミノ酸残基は、もとのアミノ酸残基とは
異なっていてもよい。

さらにまた、ａＦＧＦ蛋白質の部分ペプチドを構成する
アミノ酸残基か、糖鎖結合部位（Ａｓｎ−ＸＳｅｒある
いはＡ　ｓｎ　−Ｘ　−Ｔ　ｈｒ）を有していてもよい
。式中、ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。

ａＦＧＦ蛋白質の部分ペプチドの好ましい例としては、
さらにたとえばＰ　ｈｅ’　−Ｇ　Ｉｎ”、　Ｐ　ｈｅ
Ｔ　ｙｒ６ｚＧ　Ｉｎ６３−　Ａ　ｓｐ”’、　Ｔ　ｙ
ｒ８４−　Ａ　ｓｐ＋４’などが挙げられる。

ｂＦＧＦ蛋白質の部分ペプチドの好ましい例としては、
連続した少なくとも１０個のアミノ酸残基よりなるｂＦ
ＧＦ構成ペプチドが挙げられる。

これらのペプチドを構成するアミノ酸残基は、もとのア
ミノ酸残基とは異なっていてもよい。さらにまた、ｂＦ
ＧＦ蛋白質の部分ペプチドを構成するアミノ酸残基か、
糖鎖結合部位（Ａｓｎ−ＸＳｅｒあるいはＡｓｎ−Ｘ−
Ｔｈｒ）を有していてもよい。式中、Ｘは前記と同意義
を有する。

ｂＦＧＦ蛋白質の部分ペプチドの好ましい例としては、
さらにたとえばＰ　ｒｏ’　−Ａ　ｒｇ”、　Ｐ　ｒ。

Ｔ　ｙｒ７３．　Ａ　ｒｇ”　−Ｓ　ｅｒ１４１１．　
Ｔ　ｙｒ７３−　Ｓ　ｅｔ１′’などか挙げられる。

本発明におけるハイブリッド蛋白質の好ましい例として
は、たとえば、各機能ドメインと考えられているアミノ
酸配列、例えば活性ドメイン（ｂＦＧＦのアミノ酸Ｎｏ
、２５−６８．ａＦＧＦのアミノ酸Ｎｏ、１６−５９）
、受容体結合トメイア（ｂＦＧＦのアミノ酸配列Ｎｏ、
　Ｉ　０３−１２０．ａＦＧＦのアミノ酸Ｎｏ、９４−
１１３）などを保存した形でつくられたものが挙げられ
る。例えばｂＦＧＦのアミノ酸Ｎｏ、　７２とａＦＧＦ
のアミノ酸Ｎｏ、　６４で、あるいはｂＦＧＦのアミノ
酸Ｎｏ、　９０とａＦＧＦのアミノ酸Ｎｏ、　８１で、
各々組み換えを起こしたノ１イブリッド蛋白質が挙げら
れる。

第６図に、ｈａＦＧＦとｈｂＦ　Ｇ　Ｆのアミノ酸配列
を示すが、ハイブリッド蛋白質をつくる際アミノ酸が重
複している箇所を避けてアミノ酸が重複している箇所以
外の箇所で両ＦＧＦを組み換えるのが好ましい。

本発明のハイブリッド蛋白質にあっては、構成する該部
分ペプチドのアミノ末端の上流に、さらにたとえば Ｍｅｔ。

Ｍｅｔ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−ＬｅｕＭｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ
−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ＡｌａＬ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ などのアミノ酸配列や、たとえばｉｎｔ　　２遺伝子産
物（Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ（１９８６）ＥＭＢ
ＯＪ　、　　５９１９　９２４）、ｈｓｔ−１／ＫＳ３
遺伝子産物（Ｔａｉｒａ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ（１９８
７）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８４　：　２９８０　２９８４）、
ＦＧＦ５遺伝子産物（Ｚｈａｎ、　Ｘ、　ｅＬａｌ（１
９８８）Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　　８　：　３４８７−３４９
５）、ＫＧＦ（Ｆｉｎｃｈ、　Ｐ、　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ
（］　９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４５・７５２−７５
５）などのアミノ酸配列やそれら３ の部分を有していてもよい。

本発明のハイブリッド蛋白質にあっては、構成する該部
分ペプチドのカルボキシル末端の下流に、さらにたとえ
ばｉｎｔ　　２遺伝子産物（Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ，ｅＬａ
ｌ（］　９８６）ＥＭＢＯＪ、５　：　９１９−９２４
）。

ｈｓｔ−１／ＫＳ３遺伝子産物（Ｔａｉｒａ、　Ｍ、　
ｅｔ　ａｌ（１９８７）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　　ＵＳ　Ａ　　８４・２９８０−２
９８４）、ＦＧＦ−５遺伝子産物（Ｚｈａｎ、　Ｘ、　
ｅｔ　ａｌＮ　９８８）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ
ｌ、　８３４８７−３４９５　）、　Ｋ　Ｇ　Ｆ　（Ｐ
ｉｎｃｈ、　Ｐ、　１１．　ｅｔａｌ（１９８９）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ　２４５　：　７５２−７５５）などのアミ
ノ酸配列やそれらの部分を有していてもよい。

本発明のハイブリッド蛋白質にあっては、構成する該部
分ペプチドと部分ペプチドとの間に、アミノ酸発明を有
していてもよい。

上記アミノ酸配列としてはたとえば、１ｎｔ−２遺伝子
産物（Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ，ｅｔ　　ａｌ（１９８６）Ｅ
ＭＢＯＪ、５：９］９　９２４）、ｈｓｔ−］／ＫＳ３
遺伝子産物（Ｔａｉｒａ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ（］　９
８７　）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

４ Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　：　２９８０−
２９８４）。

ＦＧｆ−５遺伝子産物（ｌａｎ、　Ｘ、　ｅｔ　ａｌ（
１９８８）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ１４　：　３
４８７　３４９５）、ＫＧＦ　（Ｐｉｎｃｈ、　Ｐ、　
Ｗ、　ｅｔ　ａｌ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５・
７５２−７５５）などのアミノ酸配列やそれらの部分な
どが挙げられる。

また、本発明の／”１イブリツド蛋白質にあっては、ａ
ＦＧＦ蛋白質の部分ペプチドおよび／またはｂＦＧＦ蛋
白質の部分ペプチドは複数個有してＵ）てもよい。

複数個有している場合の例としては、たとえばａＦＧＦ
蛋白質の部分ペプチドを１〜３個およびｂＦ　Ｇ　Ｆ蛋
白質の部分ペプチドを１〜３個有しているのが好ましい
。その具体例としてはたとえばｂＦ　Ｇ　Ｆ　　　　ａ
Ｆ　Ｇ　Ｆ　　　　ｂＦ　Ｇ　Ｆ［１〜５２］−［４４
−９６］−［１０６−川］など力く挙げられる。

本発明のハイブリッド蛋白質としては、ｂＦＧＦ蛋白質
の部分ペプチドのＣ末端にａＦＧＦ蛋白質の部分ペプチ
ドのＮ末端を直接もしく（よアミノ酸配列を介して連結
したものが好ましい。

本発明のハイブリッド蛋白質をコードする構造遺伝子を
製造するためには、たとえば、（ａ）ａＦＧＦおよびｂ
ＦＧＦｃＤＮＡの一方のＦＧＦｃＤＮＡより適当な制限
酵素を用いてＤＮＡ断片を切り出し、他方のＦＧＦｃＤ
ＮＡの適当な部位にＤＮＡリガーゼを用いて結合させれ
ばよい。

この場合読み取り枠を合わすためにオリゴヌクレオチド
を挿入させる場合がある。あるいは、（ｂ）一方のＦＧ
ＦｃＤＮＡより適当な制限酵素を用いてＤＮＡ断片を切
り出し、これを他方のＦＧＦ　ｃＤ　Ｎ　Ａの相同部位
を同じ制限酵素で切断した部分に、ＤＮＡリガーゼを用
いて結合させればよい。

すなわち、制限酵素で切り出されるＤＮＡ断片を入れ換
えることになる。いずれの場合も１種あるいは２種の制
限酵素が用いられる。また、ＦＧＦ　ｃＤ　Ｎ　Ａ上に
適当な制限酵素切断部位がない場合は、従来の紐換えＤ
ＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発技術（Ｓｉｔ
ｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が採
用され、切断部位がつくれらる。該技術は周知であり、
アール・エフ・レイザー（Ｌａｔｈｅｒ＋　Ｒ−Ｆ　）
及びシェイ・ピー・レコック（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ、　Ｐ
、　）＋ジェ不ティソク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅ
ｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツクブレス
社（１９８３年）第３１−５０頁、に示されている。オ
リゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス
（Ｓｔｉｔｈ、　　Ｍ、）及びニス・ギラム（Ｇｊｌｌ
ａｍ、　Ｓ、）、ジェネティック・エンジニアリング原
理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻　１−
３２頁に示されている。

オリゴヌクレオチドブライマーの大きさは、突然変異を
導入すべき遺伝子領域へのプライマーの安定な雑種形成
に必要な条件により、また現在利用可能なオリゴヌクレ
オチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌクレオチ
ドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオ
チドを設計するに当たって、考慮すべき因子（例えば全
体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の大きさ）
は、エム・スミス及びニス・ギラム（前掲）によっ７ て記述されている。概して、オリゴヌクレオチドの全長
は、突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成を最
適化するような長さであり、突然変異サイトから５′及
び３′末端までの伸長部分（ｅｘｔｅｎｓ　１ｏｎｓ）
は、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によ
る突然変異の修復をさけるのに十分な大きさとする。

上記したＮ末端にさらにアミノ酸配列を有する場合、Ｃ
末端にさらにアミノ酸配列を有する場合、部分ペプチド
と部分ペプチドとの間にアミノ酸配列を有する場合、構
造遺伝子を製造するためには、上述の組換ＤＮＡ技術と
特定部位指向性変異誘発技術とを用いるのが極めて有効
である。

ＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌
由来のｐＢＲ３２２［シーン（ｇｅｎｅ）、　２　。

９５（１９７７）］、ｐＢＲ３２５［ジーン、４．　＋
　２１（１９７８）］、ｐＵＣ］　２［ジーン、±９．
２５９（１９８２）］、ｐＵＣ］　３［ジーン、１９，
２５９（１９８２）］、枯枯草由由のｐＵＢＩ］ｏ［バ
イオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・フミュ８ ニケーンヨン（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　
　Ｂ　１ｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｃｏ
ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、土工２，６７８（＋９８３
）］などが挙げられるが、その他のものであっても、宿
主内で複製保持されるものであれば、いずれをも用いる
ことができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、Ｔ、　
Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ら、モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ＣＩｏｎｉｎｇ）　　コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　
　　Ｓ　ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）、第２３９頁（１９８２）に記載の方法などが
挙げられる。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベク
ターを得ることができる。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵｃ１２ｐＵｃ１３
）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢｌ　１０、ｐＴ
Ｐ５．ｐｃＩ９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳ　
Ｈｌ　９．ｐＳ　Ｈ１５）、あるいはλファージなどの
バクテリオファージおよびレトロウィルス。

ワクンニアウイルスなどの動物ウィルス、あるいは昆虫
ウィルスなどがあげられる。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしての１
”ＡＡ、ＴＧＡまたはｉ’　Ａ　Ｇを有していてもよい
。さらに該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモー
ターを接続する。本発明で用いられるプロモーターとし
ては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロ
モーターであればいかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である
場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒ
ｅｃＡプロモーター、λＰ　Ｌ　　プロモーターｇｐｐ
プロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチル
ス属菌である場合は、５ＰＯＩプロモーター、５ＰＯ２
プロモーター、　ｐｅｎ　Ｐプロモーターなど、宿主が
酵母である場合は、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロ
モーター、ＧＡＰプロモーターＡＤＨプロモーターなど
が好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア属菌でプロモ
ーターがｔｒｐプロモーターまたはＴ７プロモーターで
あることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙げられ
、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好ましい。

このようにして構築されたムティンをコードする塩基配
列を有する組換えＤＮＡを含むベクターを用いて、該ベ
クターを保持する形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２Ｄ
Ｈ１［Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、　　ＵＳＡ、　　６０＋１６０（１，９６８）］、
ＪＭＩ０３　　［ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ、
　（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　Ａ　ａｉｄｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ）９，３０９（１９８１）］、ＪＡ２２１［ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー１ （Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　
Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０゜５１７（１９７８）］、ＨＢ
１０１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー、４１，４５９（１９６９）コ、Ｃ６００［ジェ不テ
ィックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、３９，４４０（１９５
４）］、ＭＭ２９４［Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａ
ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　７３゜４１７４（
１９７６）］などが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　Ｍ
　１１１４［（ジーン、２４，２５５（１９８３）］、
２０７２１［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（
Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｒ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　）９５＋８７（１９８４）］などが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサッカロマイセスセレビシ
アエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　）ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ３７ｉ１Ａ、ＤＫＩ）−
５Ｄなどが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞Ｃ０８７、Ｖ　ｅ
ｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細
胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

２ 上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、６９゜２　＋　　１０（１９７２）、ジーン、上ユ
、１０７（１９８２）などに記載の方広に従って行なわ
れる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　＆　　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ）。

１６８、］　ｌ　１（１９７９）などに記載の方法に従
って行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばＰ　ｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７５
；１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわれ
る。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジ−（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。

このようにして、ハイブリッド蛋白質をコードする塩基
配列を有する組換えＤＮＡを含むベクターを保持する形
質転換体が得られる。

該形質転換体を培地に培養することにより、ノ＼イブリ
ッド蛋白質を産生させる。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえ
ば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグ
ネシウムなどがあげられる。また、酵母、ビタミン類、
生長促進因子などを添加してもよい。

培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ
、ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキ
ュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　
　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）＋　４３１−４３３．Ｃｏ１ｄ
　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　Ｉ　９７２）］が好ま
しい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせ
るために、たとえば３β−インドリル　アクリル酸のよ
うな薬剤を加えることができる。

宿主がニジ、＋７キア属閑の場合、培養は通常約１５〜
４３°Ｃで約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹
拌を加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒ）最小培地［Ｂ　ｏｓｔｉａｎ、　　Ｋ　、　　Ｌ　
、　　ら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ、７７゜４５０５（１９８０）］が挙げられる。培地
のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常
約２０°Ｃ〜３５°Ｃで約２４〜７２時間行い、必要に
応じて通気や撹拌を加える。

５ 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地［サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）１２２．５０
１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［ヴイロロジ−（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ）、８，３９６（１９５９）］、ＲＰＭＩ
１６４０培地［ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　
　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｍｅｄｉｃ
ａｌＡ　５ｓｏｃｉａｔｉｏｎ）　　土９９，５１９（
１９６７）］。

１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエテ
ィ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　５ｏｃｉｅｔｙ
　　ｆｏｒｔｈｅ　　Ｂｉｏｌｏｇｃａｌ　　Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ）７３，１（１９５０）］などが挙げられる。

ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０
〜４０’Ｃ，培養時間は約１５〜６０時間行い、必要に
応じて通気や撹拌を加える。

上記培養物からハイブリッド蛋白質を分離精製するには
、例えば下記の方法により行うことができる。

６ ハイブリッド蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出す
るに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞
を集め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含
む緩衝液に竪濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる方
法、フレンチプレス、超音波、リゾチームおよび（また
は）凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち
、遠心分離によりハイブリッド蛋白質を得る方法などが
適宜用い得る。とりわけ、リゾチームと超音波処理を併
用する方法が好ましい。

」１記」二層液からハイブリッド蛋白質を精製するには
、自体公知の分離・精製法を適切に絹み合わせて行なう
ことができる。これらの公知の分離、精製法としては、
塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法
、限外ろ過法、ゲルろ過法、および５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利
用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電
の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィ
ーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体ク
ロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等
電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが
挙げられる。

さらに具体的には、上記上澄液をＤＥＡＥセルロースあ
るいはＣＭ全セルースなどを担体としたイオン交換クロ
マトグラフィーにかけることにより、夾雑する核酸や酸
性蛋白質等を除くことかできる。たとえば、中性附近の
トリスなどの緩衝液テ平衡化したＤＥＡＥセルロースカ
ラムあるいはＣＭ全セルースカラムに上澄液をかけ、素
通り画分を集めることは有効である。

また、ヘパリン−セファロースを担体としたアフィニテ
ィークロマトグラフィー法を、ハイブリッド蛋白質の精
製法として、抽出液中のノ・イブリッド蛋白質にも適用
すると好都合である。たとえば中性附近のトリス、リン
酸などの緩衝液で平衡化シタヘパリン・セファロースカ
ラムに、上記溶出液をかけ、十分洗った後、ＮａＣ（！
などの直線勾配溶出を行うことにより）・イブリッド蛋
白質を精製することができる。

特に、高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘパ
リンカラム（たとえばＳ　ｈｏｄｅｘ　Ａ　Ｆ　−ｐａ
ｋＨＲ・８９４．昭和電工製など）は有効である。

」１記ヘパリンセファロースカラムと同様に、中性附近
の緩衝液でサンプルをかけ、十分洗ったのちＮａＣＱな
どの直線勾配溶出を行うと、ハイブリッド蛋白質はほぼ
均一な標品として回収することができる。

この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行い、乾
燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清ア
ルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器へ
の吸着を防ぐことができ好適である。

また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の
共存は、該標品の酸化を防くのに好適である。還元剤と
してはβ−メルカプトエタノール。

ジチオスレイトール、グルタチオンなどが挙げられる。

このようにして製造された本発明のハイブリッド蛋白質
は、たとえば、創傷の治癒促進剤とじて９ 用いることができ、また、神経細胞増殖作用を有するの
で、各種神経障害の治療に有効に利用できる。また、毒
性は低い。

本発明のハイブリッド蛋白質を」１記治療のための医薬
として用いるには、そのまま粉末として、または他の薬
理学的に許容されうる担体、賦形剤。

希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤１錠剤、カプセ
ル剤、液剤、軟膏）として、温血動物（例、ヒト。

マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、犬、ネコ）に対
して非経口的または経口的に安全に投与することができ
る。

」１記の医薬組成物としての製剤化は常法に従って行な
われる。

本発明のハイブリッド蛋白質を上記した医薬として用い
る場合には、たとえば」１記した温血動物に、投与ルー
ト、症状などを考慮して、１日量約１０ｎｇないし１０
１１ｇ／ｋｇの中から適当量を選んで投与される。

また、このようにして精製された本発明ハイブリッド蛋
白質は、細胞培養を促進させるための試０ 薬として用いることかできる。この場合、本発明のハイ
ブリッド蛋白質を好ましくは、培地１１２あたり約０．
１〜１０μｇとなるように培地に加えることが好ましい
。

なお、本発明のハイブリッド蛋白質において、活性中心
を複数含む場合は、上記の投与量・使用量を、その数に
応じて減少させてもよい。たとえば、活性中心を２個含
む場合には、投与量・使用量を１７２としてもよい。

後述の参考例１において得られたｒｈａＦ　Ｇ　Ｆを生
産するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ　ＭＭ　２
９４　（Ｄ　Ｅ　３　）／ｐｌ、ｙｓＳ、ｐＴ　Ｂ　９
７５．後述のｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆの製造に用いられるＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２　Ｄ　Ｈｌ
　／ｐＴ　Ｂ　６６９および後述の実施例１で得られた
形質転換体は、財団法人発酵研究所（Ｉ　ＦＯ）に寄託
され、また、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所（ＦＲＩ）にブダペスト条約に基づく寄託として寄託
され保存されている。受託番号および受託臼を次の第１
表に示す。

１ ２ ３ 本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣＩ　Ｕ　Ｂ　　Ｃｏ
ｍｍｉｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｎ　ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記
する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＮＡ ＤＮＡ ＤＴＡ Ｇｌｙ、Ｇ ｌａ　　Ａ Ｖａｎ、　　Ｖ Ｌｅｕ、　　Ｌ １１ｅ、１ ：デオキシリボ核酸 ：相補的デオキシリボ核酸 アデニン ：チミン ：グアニン ：シトシン ：エチレンジアミン四酢酸 ゛グリシン アラニン バリン ：ロインン イソロイシン ４ ５ｅｒＳ：セリン ＴｈｒＴ：スレオニン Ｃｙｓ、Ｃニジスティン Ｍｅｔ、　Ｍ　　：メチオニン Ｇｌｕ、Ｅ：グルタミン酸 Ａｓｐ、Ｄ　　　アスパラギン酸 Ｌｙｓ、に：リジン Δｒｇ、Ｒ：アルギニン Ｈｉｓ　　Ｈ：ヒスチジン Ｐｈｅ、Ｆ：フェニールアラニン Ｔｙｒ、Ｙ：チロシン Ｔｒｐ、　Ｗ　　＋　トリプトファン Ｐｒｏ、Ｐニブロリン Ａｓｎ、Ｎ：アスパラギン Ｇｌｎ、Ｑ：グルタミン 以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明（メこれらに限定されるものではない。

なお、以下の実施例においてコントロールとして用いら
れたｒｈａＦ　Ｇ　Ｆは、後述の参考例１の方法で製造
されたものである。また、以下の実施例においてコント
ロールとして用いられたｒｈｂＦＧＦは、形質転換体Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　１　’；２　　
Ｄ　Ｈ］／ｐＴＢ６６９を用いてヨーロッパ特許出願公
開第２３７，９６６号公報に記載の方性で製造されたも
のである。

参考例１　　（ａＦＧＦの製造） （ａ）　　発現プラスミドの構築 化学合成されたヒ）ａＦＧＦのｃＤ　Ｎ　Ａ　（第１図
）をｐＵ　Ｃｌ　８　［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、土用１２０−７８　（１９８３）］に
組み込んたプラスミドｐＴＢ９１７をＢｓｐＭＩで切断
し、ｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔの反応によりこの部
位を平滑末端にした後ＢａｍＨＩで消化して０．４５Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を調製した。

ベクターＤＮＡにはＴ７フアージのφ１０プロモーター
を保持するｐＥ　Ｔ　３　ｃ（５Ｌｕｄｉｅｒ、　Ｐ、
　Ｗ、らＪＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ上８９　：　１１３−１
３０（１９８６））を用い、ｐＥＴ３ｃをＮｄｅｌで切
断し、ｌａｒｇｅ　　ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑末端とし
た後Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによりＮｃｏｌリンカ−５’
−ＣＣＡＴＧＧ−３’を結合させた。このプラスミドを
Ｎ　ｃｏ　Ｉで切断し、その部位をＤＮＡポリメラーゼ
ｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した後Ｂａ
ｍＨＩで切断してＳＩＯの配列を除き、そこに先の０　
、４５　Ｋｂ　ｂｌｕｎｔ　Ｂ　ｓｐＭ　ＩＢａｍＨＩ
断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて組み込んでｐＴ　Ｂ
　９７５を得た（第２図）。

（ｂ）　　ヒトａＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａの大腸菌で
の発現次に大腸菌ＭＭ２９４株にＴ７フアージのＲＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ　３　
（Ｓｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、Ｗ、らＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、　ｌ　８９　：　１１３−　］　３０　（１９８６）
）を溶原化させ、ざらにＴ７フアージのリゾチーム遺伝
子をもつプラスミドｐＬｙｓ　５（Ｓｔｕｄｉｅｒ、　
Ｐ、　Ｗ、らＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　ｌ　８９　：　
Ｉ　ｌ　３］　３０　（１９８６））を導入し、大腸菌
ＭＭ２９４（ＤＥ３　）／　ｐＬｙｓ　Ｓ株を作製した
。この大腸菌株にｐＴＢ９７５を導入し、大腸菌ＭＭ２
９４（ＤＥ３）／ｐ］、ｙｓｓ、ｐＴＢ９７５（ＩＦＯ
１４９３６，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５９９）をつくった
。この閑を３５μｇ／−アンピシリン、ＩＯμｇ／ｄク
ロラムフェニコールを含む培地で３７°Ｃで培養し、濁
度が７ Ｋｌｅｔｔ　１７０になったときイソプロピルβ−Ｄチ
オガラクトシド（ｌ　ＰＴＧ）を最終ａ度が０．５ｍＭ
になるように加え更に３時間培養を継続した。菌体を遠
心により集め、水冷したＰＢＳで洗った後、再集菌し使
用時まで一２０’Ｃに保存した。

（ｃ）　　ヒトａ’Ｆ　Ｇ　Ｆの精製 １１ｉｔｅｒ培養から集めた菌体を１００ｍの水冷１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ　
ＥＤＴＡ、０．６Ｍ　Ｎｄｅｌ、１０％シヨ糖、　　０
．２５ｍＭＰＭｓＦに懸濁し、卵白リゾチームを０．５
ｍｇ／ｍとなるように添加した。１時間水中に放置後３
７°Ｃで５分間インキュベートし、水冷下で超音波処理
（２０秒間、２回）を行い、遠心（ＳＯＲＶＡＬＬ。

］　８　Ｋｒｐｍ、　３０　ｍｉｎ、　４°Ｃ）して上
清を得た。コノ上清を２００ｄの水冷２０　ｍＭ　Ｔ　
ｒｉｓ　−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，４）、１ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａと混和し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆｆ（ｐｆ（７，
４）、］ｍＭ　ＥＤＴＡｏ、２ＭＮａＣ１！で平衡化し
たヘパリンセファロースカラム（径２．５Ｘ４ｃｍ）に
かけた。カラムを１５０ｍの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（！（＋）Ｈ７，４）、１８ ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　ＮａＣｌ２で洗った後、
２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，４）、　　
ＩｍＭ　　ＥＤＴＡｌ、５ＭＮａＣｌ２で蛋白を溶出し
た。溶出液を６ｄ毎に分画し、ｏＩ）ｔｅａをモニター
して２番目のピーク画分（８−１１番、計　２４ｄ）を
集めた（第３図）。この両分２２ｄに対して等量の２０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，４）、１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、２Ｍ（Ｎ　Ｈ、）、Ｓ　Ｏ、を混和し、２０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，４）、ｌ＋ｎＭ　ＥＤ
ＴＡ、ＩＭ（ＮＨ，）、Ｓｏ。

テ平衡化したフェニルセファロースカラム（径２．５Ｘ
８ｃｍ）にかけた（流速　０　、５　ｄ／ｍｉｎ、　）
。

２０ｄの同じ緩衝液でカラムを洗った後、ＩＭからＯＭ
の硫酸アンモニウム直線的濃度勾配（流速０．５ｄ／ｍ
ｉｎ、、勾配時間２００分）をかけ、溶出された画分４
０−５５を集め（第４図）、精製ヒトａＦＧＦとした。

（ｄ）　　逆相Ｃ４ＨＰＬＣ 精製ヒトａＦ　Ｇ　Ｆ　１．２ｍｇ／ｍ溶液を０．２Ｆ
ｌ！の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と混合し、
逆相Ｃ４カラム（ＶＹＤＡＣ）＋ニアブライし、０．１
％ＴＦＡ存在下に０％から９０％アセトニトリルの直線
的濃度勾配をかけ溶出パターンを調べた。流速１ｄ／ｍ
ｉｎ、、勾配時間６０分で行った（第５図）。

（ｅ）　　生物活性 ヒトａＦＧＦの活性は佐々田らの方法（Ｓａｓａｄａら
、　　Ｍｏ１．　　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、８　：　５
８８　５９４（＋９８８））に従い、マウスＢＡＬＢ／
ｃ３Ｔ３細胞のＤＮＡ合或誘起を［３Ｈ］チミジンの取
り込みを指標として側窓した。検体添加時、必要に応し
て培地中および検体中にヘパリン（ＳＩＧＭＡ　　Ｇｒ
ａｄｅ　Ｉ　）溶液を混合した。

参考例２　（プラスミドｐＴＢ１０１５の構築）プラス
ミドｐＥ　Ｔ　３　ｃ（Ｓｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、　　Ｗ
、　　ら　Ｊ、　　Ｍｏ１Ｂｉｏ１．１８９　：１１３
−１３０（＋９８６＞）をＮｄｅｌで切断し、Ｍｕｎｇ
　Ｂｅａｎ　Ｓ　１ヌクレアーゼ処理により末端を平滑
化した後ＢａｍＨＩで切断し、ベクターＤＮＡ断片を調
製した。プラスミドｐＴ　Ｂ　６６９（Ｉｗａｎｅ、　
Ｍ、らＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、
　Ｃｏｍｍｕｎｌ　４６　：　４７０−４７７　（１９
８７）、ヨーロッパ特許出願公開第２３７，９６６号公
報）をＥｃｏＲＩで切断し、この末端をＭｕｎｇ　Ｂｅ
ａｎ　Ｓ　ｌヌクレアーゼにより平滑化した後、Ｂｇｌ
ＩＩで切断しｂＦＧＦｃＤＮＡ断片を調製した。次に上
記の２種のＤＮＡ断片をＴ４　　ＤＮＡリガーセにより
結合し、プラスミドｐＴＢＩｏ］５を構築した。（第７
図）参考例３　（ウシａＦＧＦ部分ペプチドおよびそれ
に対する抗体の製造） （１）　　Ｈ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−０■（ウシａＦ　Ｇ　Ｆ
　［１３：ｔ−＋４０］、ペプチド（■））の製造 アプライド・バイオシステムズ社４３０Ａ型全自動ペプ
チド合戊機を用い、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ２）−Ｐ
ＡＭ樹脂０　、５　ｍｍｏｌｅより出発し、以下のアミ
ノ酸を順次、縮合及び脱Ｂｏｃ反応に付した。

Ｂｏｃ−８ｅｔ（Ｂｚｆｆ）−０８ Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚ（り−０Ｈ Ｂｏｃ−Ｖａｎ−ＯＨ Ｂｏａ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｂｏａ−Ｉ、ｅｕ−Ｏｆｆ ＢｏＣ−Ｐｒｏ−ＯＨ １ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏｌｌ 斯くして、Ｂｏａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−８ｅｔ（Ｂｚｌ２）Ｓｅｔ（Ｂｚｌり−Ａｓｐ
（ＯＢｚｌり−ＰＡＭ樹脂１．１０ｇを得た。

このうち５００ｍｇをアニソール０．６ｄ及びジメチル
スルフィド０．６ｄを含む弗化水素６．Ｏｄ中で０°Ｃ
１６０分間処理した後、弗化水素を減圧留去し、残留物
をエチルエーテルで洗浄後、目的物をＩＮ−酢酸４０ｄ
で抽出し、アンバーライト■ＲＡ−４００（酢酸型）の
カラム（２Ｘ５ｃｍ）でイオン交換し、溶出液を凍結乾
燥した。これをＩＮ酢酸５ｄにとかし、セファデックス
Ｌ　Ｈ−２０（ファルマシア社製；カラム：　２．５Ｘ
　］　２５ｃｍ；溶出液：ＩＮ酢酸）によるゲルろ過に
て精製して目的物を得た。

収量　１２０ｍｇ Ｒｆ　　Ｏ，４３（酢酸エチル：ブタノール：酢酸：水
−１・１　：　１　：　１） アミノ酸分析値：Ａｓｐ　１．００；　　Ｓｅｒ　１．
９５；　　Ｐｒ。

２．０６；　　Ｍａｌ　Ｏ，９８；　　Ｌｅｕ　２．０
１（２）　トＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−ＯＨ２ ［ペプチド（■）］に対する抗体の製造ペプチド（ＩＩ
Ｉ）４ｍｇおよびＢＴＧ１２ｍｇを０１１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，３）１．５ｄに溶解し、１％ゲルタールア
ルデヒド水溶液を０．５ｄ加えて室温で３時間撹拌後、
４℃で透析（生理食塩水２Ｑ×２）し、生理食塩水にて
８ｊ１１２としてＩｄずつ分注して凍結保存した。この
ペプチド（ＩＩＩ）−ＢＴＧｔ１６合体溶液１ｄにフロ
イントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ　ｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）　］　ｄを加えてよ
く混和し、乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内
、両後肢掌皮下および背部皮下数ケ所に注射した。以上
の操作を４週おきに５回行い最終免疫後１週間で採血し
、遠心分離して抗血清を得た。

次いで抗血清を０．１５Ｍ　ＮａＣｌ２を含む０．０２
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）で１０倍に希釈し、ペプ
チド（ＩＩＩ）を結合したセファロース４Ｂカラム（直
径１．２ｃｍ、長さ４　ｃ＋ｎ）に付した。０．１５Ｍ
ＮａＣＱを含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）
にてカラムを洗浄し、次いで０．１Ｍグリシン塩酸緩衝
液（１）８２．０＞で溶出することによって、ペプチド
（Ｉｆｆ）に対する抗体へＦＣＩＤを得た。

実施例１　ハイブリッド蛋白質ａ−ｂＦ　Ｇ　Ｆ　ａｂ
６３／７３およびｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／　６４
の調製 （ａ）発現プラスミドの構築 ２種のプライマー５’−ＴＧＣＡＧＴＡＧＡＧＣＣＧＣ
ＴＴＧ−３’及び５’−ＣＣＡＧＧＴＡＣＣＴＧＴＴＡ
ＧＣＡ−３’を用いた部位特異的突然変異により、Ｍ２
Ｓ−ｂＦＧＦ（Ｍ、　５ｅｎｏｅｔａｌ（＋９８８）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ
ｍｕｎ、　Ｉ　５１＋７０１−７０８）のｃＤＮＡより
Ｒｓａ１部位を消去し、別な位置に新たなＲｓａ１部位
を導入した。このｃＤＮＡよりＡｖａｌ　−ＢａｍＨＩ
断片を調製後、Ｒｓａｌで切断しｂＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　
Ｎ　ＡのＡｖａ［−Ｒｓａｌ断片及びＲｓａｌ　−Ｂａ
ｍＨｒ断片を得た。参考例Ｉ（ａ）に記載の方法で製造
されたプラスミドｐＴＢ９１７をＡｖａｌ　−ＢａｍＨ
Ｉで消化して得られたａＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａ断片
を５ｅａｌで切断してａＦＧＦｃＤＮＡのＡｖａｌ−５
ｃａｌ断片及び５ｃａｌ　−ＢａｍＨ１断片を調製した
。参考例２に記載の方法で製造されたｐＴＢ］ｏ１５を
Ａ　ｖａ　＋で分断してｂＦＧＦｃＤＮＡの上流領域を
含むＴ７プロモーター断片を調製し、また更にＢａｍＨ
Ｉで分解してｂＦＧＦ　ｃＤＮＡの下流領域を含むベク
ター断片を得た。

参考例１（ａ）に記載の方法で製造されたｐＴＢ　９７
５をＡ　ｖａ　Ｉで分解してａＦＧＦｃＤＮＡの上流領
域を含むＴ７プロモーター断片を取得し、またさらにＢ
ａｍＨＩで分断してベクター断片を調製した。

ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａ上流領域を含むＴ７プロモ
ーター断片、ａＦＧＦｃＤＮＡのＡｖａＩ−３ｃａｌ断
片、及びｂＦＧＦｃＤＮＡのＲｓａｌ　−ＢａｍＨＩ断
片を、ｂＦＧＦｃＤＮＡの下流領域を含むベクター断片
にＴ４　　ＤＮＡリガーゼにより結合させａ−ｂＦ　Ｇ
　Ｆ　ａｂ６３／７３発現プラスミドｐＴＢＩ０７３を
構築した。（第８図） またｂＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａ上流領域を含むＴ７プ
ロモーター断片、ｂＦＧＦｃＤＮＡのＡｖａＩ−Ｒｓａ
ｌ断片、及びａＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａの５ｃａｒ　
−ＢａｍＨＩ断片を、ベクター断片にＴ４　　ＤＮＡリ
ガーゼにより結合させｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／　
６４発現プラスミド５− ｐＴ８．１０７４を構築した。（第８図）ａ−ｂＦ　Ｇ
　Ｆ　ａｂ６３／　７３はヒトａＦＧＦのアミノ末端１
〜６３残基とヒトｂＦＧＦのカルボキシル末端７４残基
（すなわち第７３〜１４６番目のアミノ酸）からなる。

またｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／　６４はヒトｂＦＧ
Ｆのアミノ末端７２残基（１〜７２）とヒトａＦＧＦの
カルボキシル末端７７残基（すなわち第６４〜１４０番
目のアミノ酸）からなる。

（ｂ）ａ−ｂＦＧＦａｂ６３／７３ｃＤＮＡおよびｂ−
ａ　ＦＧＦｂａ７２／６４ｃＤＮＡの大腸菌テノ発現プ
ラスミドｐＴＢ１０７３及びプラスミドｐＴＢ１０７４
をそれぞれＴ７発現用大腸菌株ＭＭ２’９４　（Ｄ　Ｅ
　３　）／　ｐＬｙｓＳに導入し、ａ−ｂＦ　Ｇ　Ｆ　
ａｂ６３／７３を発現する形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉＭＭ２９４（ＤＥ３）ノｐＬｙｓＳ　
、ｐＴ　Ｂ　］　０７３（ＩＦＯ１４９６６、ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−２６６２）およびｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７
２　／　６４を発現する形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ　２９４　（Ｄ　Ｅ　３　）／ｐ
ＬｙｓＳ、ｐＴＢ　１０７４（Ｉ　ＦＯｌ　４９６７゜
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２６６３）をそれぞれ得た。

６ Ｅ、　　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４　（Ｄ　Ｅ　３）／ｐ１
．ｙｓｓ、ｐＴ　Ｂ１０７３およびＥ、　ｃｏｌｉ　Ｍ
Ｍ　２９４　（Ｄ　Ｅ　３　）／ｐＬｙｓＳ　、　ｐＴ
　Ｂ　］、　０７４をそれぞれＬ　Ｂ培地で培養し、イ
ソプロピルβ−Ｄチオガラクトシドで発現を誘導した後
、菌体全蛋白質を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより調へると前者
の場合１５．５ＫＤａの位置に、後者の場合１６．７Ｋ
Ｄａの位置にそれぞれ特異的な染色バンドが確認された
（第９図）。第９図［１］において、１は分子量マーカ
ー、２はｈａＦ　Ｇ　Ｆを、３はｈｂＦＧＦを、４はＥ
、　ｃｏｌｉ　ＭＭ　２９４　（Ｄ　ＩＥ３）／ｐＬｙ
ｓＳ、ｐＴＢ　］　０７３の菌体全蛋白質をそれぞれ示
す。第９図［２］において、１は分子量マーカーを、２
はｈａＦＧＦを、３はｈｂＦＧＦを、４はＥ、　ｃｏｌ
ｉ　ＭＭ２９４　（Ｄ　Ｅ　３）／ｐＬｙｓＳ　、ｐＴ
　Ｂ１０７４の菌体全蛋白質をそれぞれ示す。

（ｃ）　ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２　／　６４の精製
Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４　（Ｄ　Ｅ　３）／ｐＬｙ
ｓＳ、ｐＴ　Ｂ１０７４の２５〇−培養の大腸菌体をリ
ゾチーム／超音波処理により破さいした後に遠心して得
た粗抽出液をヘパリンアフィニティーＨＰＬＣにアプラ
イした。カラムをＱ、５ＭＮａＣｌ２を含むＴｒｉｓｂ
ｕｆｆｅｒで洗った後、０．６Ｍから２ＭのＮａＣＱ直
線的濃度勾配を１７０分に渡って流速６１１ｆｌ／ｍｉ
ｎでかけ蛋白の溶出をＯＤ　、８．でモニターした（第
１０図）。分画８５番から１００番を集め５ＤＳＰＡＧ
Ｅで調べたところ単一バンドが１６．７ＫＤａの位置に
認められた（第１１図）。第１１図において、ｌは分子
量マーカーを、２はｈａＦＧＦを、３はｈｂＦ　Ｇ　Ｆ
を、４はｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／　６４をそれぞ
れ示す。

また、参考例３で得られたウシａＦＧＦの部分ペプチド
［＋３３−１４０］に対する抗体ＡＦＣＩＤまたはヨー
ロッパ特許公開第２８８，６８７号公報記載の方法で得
られたヒ１−ｂＦＧＦに対するモノクローナル抗体Ｍｏ
Ａｂ７８によるウェスタンブロッティングにおいて１６
．７ＫＤａの位置にバンドが検出されこの蛋白質がｈｂ
Ｆ　Ｇ　Ｆのアミノ末端側配列及びｈａＦ　Ｇ　Ｆのカ
ルボキシル末端側配列を有していることが確認された（
第１２図〉。第１２図［１］は抗つンａＦＧＦ部分ペプ
チド抗体ＡＦＣ＋Ｄを用いた場合の結果を、第１２図［
２］は抗ヒトｂＦＧＦモノクローナル抗体ＭｏＡｂ７８
を用いた場合の結果をそれぞれ示す。また第１２図にお
いて、１は分子量マーカーを、２はｈａＦＧＦを、３は
ｈｂＦ　Ｇ　Ｆを、４はｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／
　６４をそれぞれ示す。ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／
　６４の収量は１４．４ｍｇてあった。

実施例２　ハイブリッド蛋白質ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ
７２／６４の生物活性 （ａ）　ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２　／　６４のＤＮ
Ａ合成誘起促進活性 休止状態にあるＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３細胞に対するｂ−ａ
Ｆ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／　６４のＤＮＡ合成誘起活性を
［３Ｈ］チミジンの細胞への取り込みを指標として調へ
た。結果を第１３図に示す。第１３図において（１）は
ｈａＦ　Ｇ　Ｆの、（２）はｈｂＦ　Ｇ　Ｆの、（３）
はｂ−ａＦＧＦ７２／６４の結果をそれぞれ示す。

また、第１２図において、〇−〇はヘパリン非存在下の
、・−・はヘパリン存在下（５０％ｇ／ｄ’）の結果を
それぞれ示す。ヘパリン存在下（５０％ｇ９ ／ｄ）においてｈａＦＧＦ、ｈｂＦＧＦ、ｂ−ａＦＧＦ
ｂａ７２／６４は同様の活性曲線を示した。ヘパリン存
在下ｈａＦ　Ｇ　Ｆ　（３２ｐｇ／　ｄ）により誘起さ
れた［３Ｈ］チミジン取り込みを１００％とした場合、
ヘパリン非存在下で５０％の取り込みを誘起するにはｈ
ａＦ　Ｇ　Ｆは６８１　ｐｇ／ｄ、ｈｂＦ　Ｇ　Ｆは６
．４ｐｇ／ｄ、ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／　６４は
１９．７ｐｇ／ｍの濃度を要し、ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂ
ａ７２／　６４の比活性はｈｂＦ　Ｇ　Ｆの３２％であ
った。しかしながらｈｂＦＧＦが１６０ｐｇ／ａａ２以
上の濃度において阻害的に働くのに対して、ｂ−ａＦ　
Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／　６４は４　ｎｇ／ｄの濃度まて濃
度依存的にＤＮＡ合或を誘起した。

ｂ−ａＦＧＦｂａ７２／６４はヘパリン非存在下におい
てｈｂＦ　Ｇ　Ｆより比活性は低いがその効果的濃度範
囲は広いことがわかった。

（ｂ）　ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２　／　６−４の細
胞増殖促進活性ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／　６４の
ヒトさい帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥ）に対する増殖促進
効果を調べた。

ＨＵ　Ｖ　Ｅをヘパリン非存在下及び−５０％ｇ／ｄの
ヘパリン存在下に培養し、ｂ−ａＦＧＦｂａ７．２１０ ６４を濃度を変えて添加して３日培養の後に細胞数を計
数した。結果を第１４図に示す。第１４図において、−
〇−はヘパリン非存在下の、−・はヘパリン存在下（５
０μｇ／ｄ）の結果をそれぞれ示す。ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ
　ｂａ７２／　６４はヘパリン非存在下においてもＨＵ
ＶＥの増殖を濃度依存的に促進したが、ヘパリンの添加
によりこの効果は増強された。

（ｃ）　ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２　／　６４の細胞
形態変化誘導活性 ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂａ７２／　６４のＢＡＬＢ／ｃ３
Ｔ３細胞に対する形態変化誘導活性を調べた。０．５％
ウシ血清存在下で５ｔａｒｖａｔ　ｉｏｎをかけた細胞
をｌｎｇ／ｄのｂＦＧＦ、あるいはｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　
ｂａ７２　／６４存在下に２日間培養し、写真を撮影し
た。コントロールを第１５図に、ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆ　ｂ
ａ７２　／６４存在下、の場合を第１６図に、ｒｈｂＦ
　Ｇ　Ｆ存在下の場合を第１７図にそれぞれ示す。ｂ−
ａＦ　Ｇ　Ｆｂａ７２／６４による細胞の形態変化（第
１６図）はｈｂＦ　Ｇ　Ｆによる場合（第１７図）はど
顕著に認められなかった。

発明の効果 本発明のハイブリッド蛋白質は、ａＦＧＦの活性中心お
よびｂＦＧＦの活性中心の少なくとも一つを有し、しか
も有効濃度範囲が拡大され、細胞形態変化誘導活性が低
下されている等の優れた性質を有するので、創傷の治癒
促進剤などの医薬として有利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】 第１図は、参考例１で用いられた、ヒ）ａＦＧＦのｃＤ
ＮＡ配列を示す。 第２図は、参考例１で得られた、プラスミドｐＴ８９７
５の構築図を示す。 第３図は、参考例１で得られた、溶出パターンを示す。 第４図は、参考例１で得られた、溶出パターンを示す。 第５図は、参考例１で得られた、溶出パターンを示す。 第６図は、ｈａＦＧＦおよびｈｂＦ　Ｇ　Ｆのアミノ酸
配列を並記したものである。 第７図は、参考例２で得られた、プラスミドｐＴＢ１０
１５の構築図を示す。 第８図は、実施例１で得られた、プラスミドｐＴＢ１０
７３およびｐＴＢＩ０７４の構築図を示す。 第９図は、実施例１で得られた、５ＤＳ−ＰＡＧＥの結
果を示す。 第１０図は、実施例１で得られた、ヘパリンアフイニテ
ーＨＰＬＣの結果を示す。 第１１図は、実施例１で得られた、５ＤＳＰＡＧＥの結
果を示す。 第１２図は、実施例１で得られた、ウェスタンブロッテ
ィングの結果を示す。 第１３図は、実施例２で得られた、［３Ｈ］チミジンの
細胞への取り込みの結果を示す。 第１４図は、実施例２で得られた、ヒトさい帯血管内皮
細胞に対する増殖促進効果の結果を示す。 第１５図は、実施例２で得られた、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３
細胞に対する形態変化誘導活性の結果に３− おいて薬物を添加しない場合の結果を示す、生物の形態
の顕微鏡写真である。 第１６図は、実施例２で得られた、ｂ−ａＦ　Ｇ　Ｆｂ
ａ７２／６４のＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に対する形態変
化誘導活性の結果を示す、生物の形態の顕微鏡写真であ
る。 第１７図は、実施例２で得られた、ｈｂＦＧＦのＢＡＬ
Ｂ／ｃ３Ｔ３細胞に対する形態変化誘導活性の結果を示
す、生物の形態の顕微鏡写真である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）蛋白質の
   部分ペプチドと塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）
   蛋白質の部分ペプチドとを分子中に含む線維芽細胞成長
   作用を有するハイブリッド蛋白質。
2. （２）、ｂＦＧＦ蛋白質の部分ペプチドのＣ末端にａＦ
   ＧＦ蛋白質の部分ペプチドのＮ末端を連結した請求項１
   記載のハイブリッド蛋白質。
3. （３）、請求項１記載のハイブリッド蛋白質をコードす
   る塩基配列を有する組換えＤＮＡ。
4. （４）、請求項３記載の組換えＤＮＡを含むベクター。
5. （５）、請求項４記載のベクターで形質転換された形質
   転換体。
6. （６）、請求項５記載の形質転換体を培地に培養するこ
   とを特徴とする該ハイブリッド蛋白質の製造