JPH03185001A - ヘパリンのｎ―アセチル化物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヘパリン様構造を有する物質及びその製造方
法に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］ヘパラ
ン硫酸（Ｈ３）のような抽出により得られる天然グリコ
サミノグリカン（ＧＡＧ）は、単離され特性づけられて
いる（Ｊｏｒｐｅｓ、Ｊ、　−Ｇａｒｄｅｌｌ。

Ｓ、　ＪＢＣ当、　２６７−２７６）。それらの構造は
ヘパリンの構造に似ており、Ｈ３ではグリコサミンの。

−Ｎ）１基はＮ−アセチル化が優勢であるのに対しヘパ
リンでは硫酸塩化が優勢であり基本的にはＮ−アセチル
化度が異なる。

前記構造の違いにより、Ｈ３はヘパリンとは異なる次の
ような特有の生物学的性質を示す。

ｌ）試験管中の抗血液凝固活性（ＡＰＴＴ、　ａｎｔｉ
−Ｘ）が低い。

２）人間や実験室動物に用いて、プロフィプリノリティ
ック（ｐｒｏｆｉｂｒｉｎｏｌｉｔｉｃ）活性（プラス
ミノーゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）有機組織賦活剤
を放つ））を示す。

３）ヘパリンに比べて優れた生物学的有用性をもつ。

従って、前記物質は、主に血栓の溶解に寄与するのみな
らず血栓の生成を防ぐ永続的な治療を意図する、心臓血
管の薬剤に特に適している。これは、副次作用を減少し
て、出血の起きる危険性を少なくすることを達成するこ
とができる。

明らかに、これらの天然ムコ多糖類は、その有機組繊細
胞中の濃度が低いために大スケールでは抽出できない。

これは治療分野でのその意義のある用途拡大を制限して
いる。

そこで、本特許出願に従って、ヘノ＜−４リンを原料と
してヘパリン様構造を有し高収率で純粋なＮ−アセチル
化物を得ることを可能にする方法が開発された。

本発明の方法は、Ｎ−脱硫酸塩化（Ｎ−ｄｅｓｕｌｆａ
ｔａｔｉｏｎ）を伴い解重合を伴わないヘパリンの制御
された加水分解を行ない、次いで無水酢酸を用いた反応
により特定の位置に、アミンＮにアセチル基を導入する
ことに基づく。

ヘパリンのＮ−脱硫酸塩化は、〇−硫酸基の加水分解を
伴わず、グリコサイデイック（ｇｌｙｃ。

５ｉｄｉｃ）結合の加水分解又は他の付随反応を伴わず
、特定的にアミノ基に対して達成される。これは既に弁
上及び長沢が述べている（１９７５）”Ｉｎｏｕｅ。

Ｙ、　−Ｎａｇａｓａｗａ、　Ｋ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄ
、　Ｒｅｓ、　４６．８７−９５（１９７６）”。しか
し、この方法は水又はメタノール−ジメチルスルホキシ
ド溶液中のヘパリン−ピリジン錯体に対して行なわれる
ため、例えば反応溶液からの錯体の分離、大量のピリジ
ンの除去、高価な溶剤の回収などの問題を伴い、大スケ
ールでは容易に導くことができなかった。

これに対し、ヘパリン−カルシウムを出発原料とすると
、コントライオン（ｃｏｎｔｒａ−ｔｏｎ）サイズによ
り、構造変化を起こさずに、また中位のＭＷに影響を与
えずに、酸水媒中で選択Ｎ−脱硫酸塩化を達成すること
ができる。

特に、生成物の褐色着色及び〇−硫酸基の加水分解が避
けられる。

そして、部分Ｎ−脱硫酸塩化ヘパリン（中間生成物Ａ）
はアセチル化反応に従う。

ヘパリンのアセチル化はダニシェフスキー（Ｄａｎｉｓ
ｈｅｆｓｋｙ、　Ｎ、　Ｍｅｔｈ、　Ｃａｒｂ、　Ｃｈ
ｅｗ、　５．（８５）。

ＩＵ）、更に長沢”Ｉｎｏｕｅ、　Ｙ、　−Ｎａｇａｓ
ａｗａ、　Ｋ。

（：ａｒｂｏｈｙｄ、　Ｒｅｓ、　４６．８７−９５　
（１９７６）”が述べている。それらのいずれも、莫大
な量の無水酢酸を使用し、ｐＨ６，５−７，０で、広い
範囲の温度において行なわれる。　これらの条件で、ま
た低温（０〜５℃）で行なうと、付随するＯ−アセチル
化は、二糖類単位の遊離の−ＯＨに関してなされる。

［課題を解決するための手段］ 本発明の目的でもあるが、ｐＨ９，３〜９．５（上限は
無水酢酸の加水分解と両立し得るｐＨ）で、滴定曲線よ
り予め決めた実質的に化学量論量の無水酢酸（１〜１．
１モル（ＣＨ３ＣＯ）　＝０／遊離アミノＮのモル）に
より、２５〜３０℃で行なっても、Ｎ−アセチル化が独
占的に起きることを見い出した。

この温度では、反応は速く１５分以内に完了する。反応
が長時間に延びた場合であっても、二次反応は起きない
。

得られた化合物（最終生成物Ｂ）は、驚くほど一定の組
成であり、以下の表及び図から明らかになるような正確
な分析記述を伴う分子化学により良く特性づけられる。

本発明が目的とする化合物をより良く特定するために、
ここで”Ｃ−ＮＭＲによる特性づけを記述する。

最終生成物ＢのＮＭＲスペクトル（第１図）は、プルツ
カ−型（Ｂｒｖｃｋｅｒ　Ｍａｄ、）　ＣｘＰ−３００
スペクトロメーターによりＤ２０溶液中、７５ＭＨｚで
測定された。比較の目的で標準ヘパリン（第２図）及び
ヘパラン硫酸（Ｈ３，第３図）のスペクトルも載せてい
る。これらのスペクトルは文献（Ｂ。

Ｃａ５ｕ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃ
ｈ、　（Ｄｒｕｇ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）３３、１３５−
１４２．１９８３）により知られテイル。

第１図において、９０〜９５ｐｐａ＋の領域（Ｃ−１ア
ノメリツク（Ｂｎｏｍｅｒｉｃ）炭素に起因する）中及
び５３〜６１　ｐｐｍの領域（Ｃ−２７ミノ糖単位に起
因する）中のピークは、異なるウロン単位を見分けるた
めの、ウロン及びヘキソサミン単位における該単位の定
量及び硫酸基分布の決定に極めて適する。

本明細書中では以下の略記を採用する。

Ｌ−イズロニルー２−サルフエー）”　＝　ＩｄｏＡ２
ＳＯｓＤ−グルクロン酸　　　　　　　　＝　Ｇ１ｃＡ
グルコサミンＮ−サルフェート　　＝　ＧｌｃＮＳＯｓ
Ｎ−アセチルグルコサミン　　　　＝　ＧｌｃＡｃ無置
換のアミノ基をもつグルコサミン＝　Ｇ１ｃＮＨａｒ＝
　還元末端基、主にヘキソサミンに関する以下の相対パ
ーセントは、異なる基の固有ピーク下の面積を考慮して
計算したものである。全ヘキソサミンに関して（Ｃ−１
ピークを評価して）　、　ＩｄｏＡ２ＳＯ−＝６８．２
％：全ウロン酸に属してＧ１ｃＮＳＯｓ＝３７．８％、
ＩｄｏＡ２ＳＯｓに結合したＧｌｃＮＡｃ：３７．８％
；　ＧｌｃＡに結合したＧｌｃＮＡｃＪｌ、０％；還元
Ｇ１ｃＮ＝１３．４％。

Ｃ−２及びＣ）ＩＳ　（Ｎ−アセチル）ピーク下の面積
から、ＧｌｃＮＳＯ，のパーセント量は３６．２％、　
全ＧｌｃＮＡｃ単位の量は５３％。

生成物は、ＩｄｏＡ２ＳＯ，単位をヘパリンの全ウロン
酸の７１〜９１％と多く含有するのでヘパリンに類似し
、アセチル基を全グルコサミンヘパラン硫酸の５８％と
多く含有するのでヘパラン硫酸に類似する。しかし、考
慮すべき測定では、前述の両方のＧＡＧでは少量である
ＧｌｃＮＡｃ−４ＩｄｏＡ２ＳＯ，なる結果がこの生成
物では優勢であるため、異なる。

以下の実施例は、ヘパリン様Ｎ−アセチル化物（最終生
成物Ｂ）をヘパリン−カルシウムから製造するという独
自の方法について述べる。実験モデルに基づけば、この
化合物は線維素溶解及び抗トロンピン活性を示し、抗血
液凝固活性には欠ける。その結果、出血の危険性が低い
、抗血液凝固活性は、（Ｂｅｋｅｍｅｙｅｒ　Ｈ，−Ｈ
ｉｒｓｃｈｅｌｍａｎｎ、　”Ａｇｅｎｔａｎｄ　Ａｃ
ｔｉｏｎｓ　、　Ｖｏｌ、１６　ｐａｇ、４４６　（１
９８５）に従って、ラットの尾に関するモデルを用いて
試験した。

線維素溶解活性エクスビボ（ｅｘ−ｖｉｖｏ）はボーリ
ンガ−・ディアグノスティカ・キット（Ｂｏｈｒｉｎｇ
ｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｋｉｔ）を用いて、ＦＤ
Ｐ　（フィブリンの解重合ペプチド）の評価をする物質
と共にラットの血漿の注射に関して試験した。

得られた錯体並びに線維素溶解活性及びトロンピン因子
の防御としての用途だけではなく、製造方法も本発明の
一部である。

最終生成物Ｂ及び中間生成物Ａの精製は、スコツト（Ｓ
ｃｏｔｔ、　Ｊ、　Ｍｅｔｈ、　Ｂｉｏｃｈ、　Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ　ＶＩＩＩＵ４５−１９７　（１９６０）に
述べられている、第四アンモニウム塩とエタノールの塩
水溶液を用いた一般的な技術により行なわれた。

［実施例］ １）ヘパリン−カルシウムの １５０ＩＵ／ｍｇのヘパリン−ナトリウム１００ｇ　（
１０％溶液を１リツトル得るに十分な量）を蒸留水に溶
解した。それを５０℃に加熱し、撹拌しながら、１リツ
トルの蒸留水に溶解した１　２０ｇのセチルトリメチル
アンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）を徐々に加えた。

得られた沈殿を上記温度でそのままの状態で１時間放置
した後、遠心分離により分離した。１回当り１％ＣＴＡ
Ｂ水溶液１００ｍβで２回洗浄し、最後に得られた固形
物を１リツトルの２　Ｍ　−Ｃａ　ＣＩ２ｍ水溶液に溶
解した。多糖は１ボリユーム（１ｖｏｌｕｍｅ）の９６
°エタノールを加えて沈殿させた。それをそのままの状
態で１夜間静置し、表面に浮かんでいるものをのけて得
られた固形物を１リツトルの２　Ｍ　　Ｃａ　ＣＩ２ｍ
水溶液に溶解した。

澄んだ溶液を再び１ボリユーム（ａ　ｖｏｌｕｍｅ）の
９６°エタノールを加えて沈殿させた。固形物を静置し
、次いで１リツトルの２　Ｍ　−Ｃａ　ＣＩ２２水溶液
に２度目の再溶解を行なった。スコツト（Ｓｃｏｔｔ、
　Ｊ、Ｍｅｔｈ、　Ｂｉｏｃｈ、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　
ＶＩＩＩ　１４５−１９７（１９６０）に従って、ベン
トナイトを加えて残ったＣＴＡＢを除去した。ベントナ
イトを濾過により除去し、澄んだ液体に最終回の１ボリ
ユーム（１ｖｏｌｕｍｅ）のエタノールを加えて沈殿さ
せた。

その固形物をエタノールで脱水し真空乾燥室で乾燥した
。

このようにして、ナトリム０．１％より少ない等級のヘ
パリン−カルシウムが９０ｇ得られた。

２）も隆艷亘Δ里鳳１ ９０ｇの多糖−カルシウムを、その１０％溶液を得るの
に十分な量の０．２５Ｍ　−ＨＣ忍に、８０℃に加熱し
ながら流し込むことにより溶解した。２時間後、反応で
の抗血液凝固活性が無いことからまた強力な硫酸カルシ
ウムの沈殿が見られることから明らかなように、Ｎ−脱
硫酸塩化が実質的に完了した。

望ましい作用が完了したなら、ＩＯＭ−ＮａＯＨ溶液を
加えｐＨを７に調節して反応を停止した。

ＣＯ５Ｃａに十分な量の１０％ｗ／ｖのＣＯ。

Ｎ　ａ　ｚを加えて完全な沈殿とし、得ら−れた沈殿は
濾過により除去した。

Ｎ−脱硫酸塩化多糖は１ボリユーム（１ｖｏｌ、）のエ
タノールを加えて単離し、１夜間静置した。そのヘパラ
ン様化合物（ｈｅｐａｒａｍｉｎｉｃ　ｍａｔｅｒｉａ
ｌ）を脱水し真空乾燥室で乾燥した。

アミノ遊離基を５０％含む物質（中間物質Ａ）が６０ｇ
得られた。

３）　　、　　　Ｂの； ５０ｇの中間物質Ａ（５％（ｗ／ｖ）溶液を１リツトル
得るに十分な量）を蒸留Ｈ，Ｏに溶解し、次いでＩＯＭ
−ＮａＯＨ溶液でｐＨを９．５に調節した。温度を２５
〜２８℃に上昇させ、ＮａＯＨ溶液でｐＨを９．３〜９
．５に調整した５ｍＪ２の無水酢酸を、撹拌下１滴ずつ
加えた。

ＬｏｇのＮａＣｌ２を加えた後、おおよそ５分間で無水
酢酸が凝集し、撹拌下の反応時間は３０分であった。

このようにして、全ての液体を１ボリユーム（ｌ　ｖｏ
ｌ、ｌのエタノール中で沈殿させ、１夜間静置した。

沈殿、静置後、そのペーストを５００ｍＩ２の無菌水に
溶解し、５ｇのＮａＣＱを加え、６Ｍ−ＨＣβ溶液でｐ
Ｈを６．０に調整した後、除熱プレート及び０．８〜０
．２２Ｕ、の滅菌膜を用いて濾過を開始した。

その濾過した液体を同量のエタノール中で沈殿させ濾過
し、それを脱水し、真空乾燥室で６０℃、１２時間乾燥
した。

このようにして、遊離アミノ基は無いが化学組成物（滴
定曲＄ＩＵ参照）を伴い、分析特性並びに生物学的及び
薬学的属性が天然ヘパランのそれ全てと類似する、５５
ｇのＮ−アセチル化生成物が得られた。

元のヘパリン、中間物質のＡ錯体及び最終生成物Ｂの分
析典型を以下に示す。

好性データ ヘパリン 硫酸 中間物質 最終生成 物Ｂ Ａ　ＰＴＴ活性 Ａｎｔｉ−Ｘ活性 Ｎ−アセチル ウロン酸 へキソサミン 有機硫酸 （Ｓとして） 比旋光 モル関係 （ウロン酸　／ ヘキソサミン　／　Ｓ　／　１セチル）１：１：　　　
　　　　　　１：１： ２．２：０．１　　　　　１．７：０．−１０．０　　
　　　　　　　０．５ ＮＨ／全Ｎ １５０　　ＩＵ／ｍｇ １５０　１Ｕ／ｍｇ ０６８％ ３０．０％ ３０．０％ ＩＵ．０％ ＋３６＠ １０　ＩＵ／ｍｇ １０　　ＩＵ／ｍｇ ００９％ ３５．０％ ３５．０％ ８．２％ ＋４０＠ １０　　ＩＵ／ｍｇ １０　　ＩＵ／ｍｇ ４．３％ ３１．０％ ３２．０％ ７．８％ ＋４０＠ ｌ：ｌ二 １．７：０．５ ０．０ 第４〜７図は以下の詳細による評価を表わす：第４．６
．７図： Ｂ−Ａ＝カルボキシ化ツウロン化 基＝硫酸基 第５図： Ｂ−Ａ＝カルボキシ化ツウロン化 基−（Ｂ−Ａ）＝硫酸基 Ｃ−Ｂ＝遊離アミン基

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は”Ｃ−Ｎ　Ｍ　Ｒスペクトル図であり、第
１図は最終生成物Ｂ、第２図はヘパリン、第３図はヘパ
ラン硫酸である。 第４〜７図は滴定曲線であり、第４図はヘパリン、第５
図は中間生成物Ａ、第６図は最終生成物Ｂ、第７図はヘ
パラン硫酸である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｐＨ９．３〜９．５、温度２５〜３０℃で遊離ア
   ミノ基１モル当り無水酢酸１〜１．１モルの化学量論量
   の無水酢酸を加えることによる、Ｎ−脱硫酸塩化ヘパリ
   ン中の遊離アミノ基の滴定に基づく、部分又は完全Ｎ−
   脱硫酸塩化ヘパリンを出発物質としたＮ−アセチル化物
   の製造方法。
2. （２）以下の分析特性を示す、請求項（１）に記載の方
   法によりヘパリンから得られた生成物、−抗血液凝固活
   性（ＡＰＴＴ−ａｎｔｉ−Ｘ）：１０ＩＵ／ｍｇ未満 −Ｎ−アセチル含有量（−ＣＨ＿３ＣＯで表わして）：
   ３〜７重量％ Ｎ−アセチル化度によれば４０〜９０％ −ウロン酸（加水分解後）：３１±１％ −ヘキソサミン（加水分解後）：３２±１％−有機硫酸
   （Ｓとして）：８±１％ −ウロン酸／ヘキソサミン／Ｓ／アセチルのモル比：１
   ：１：１．５〜１．７：０．４〜０．９−比旋光：＞＋
   ３５゜。
3. （３）抗血液凝固活性が低く、抗トロンピン及び線維素
   溶解の独特な活性要素を持ち、経口及び注射に適した、
   請求項（２）に記載の生成物を含有する薬剤組成物。