JPH03191782A - 改良されたウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、改良されたウロキナーゼ又はウロキナーゼ前
駆体の製造方法に関するものである。

（従来の技術） ウロキナーゼは、人体の血液凝固線溶系の蛋白質（酵素
）であり、凝固した血液の溶解に関与している。従って
、血栓溶解剤として血管塞栓性疾患、即ち血管の閉塞に
よって生じる心筋梗塞や脳血栓等の治療薬として広く使
用されている。

ところで、ウロキナーゼについては、血栓に対する特異
性が低いため全身性出血という問題があることから、近
年ではその問題を解決したウロキナーゼ前駆体が知られ
るようになっている。

ウロキナーゼ前駆体は、４１１のアミノ酸残基よりなる
分子量約５万の蛋白質であり、セリン・プロテアーゼの
一種であるウロキナーゼの前駆体である。ウロキナーゼ
前駆体は血中に投与されると、血中に存在するプロテア
ーゼであるプラスミンにより一本鎖状態から二本鎖状態
に切断されて活性化され、ウロキナーゼとなる。

ウロキナーゼ前駆体は、ウロキナーゼに比較して血栓特
異性が高いため、ウロキナーゼの使用で問題となる全身
性出血の問題を解消し得る、新しい血栓溶解剤として期
待されるものである。

（発明の背景） ウロキナーゼ前駆体を血中に投与した場合には、血中に
存在するトロンビンによりＮ末端から数えて第１５６番
目のアルギニン残基と１５７番目のフェニルアラニン残
基の間が切断され、不活性化されてしまうという課題が
ある。

更には、血中にはウロキナーゼの活性阻害剤であるプラ
スミノーゲン・アクチベータ・インヒビター（以下、Ｆ
ＡＩという）が存在することが知られている。従って、
ウロキナーゼは勿論、ウロキナーゼ前駆体においても、
ウロキナーゼに変換された後にはＦＡＩと結合するため
に血中での安定性が低下してしまうという課題がある。

この様に、従来のウロキナーゼの欠点を解消可能なウロ
キナーゼ前駆体であっても、トロンビン耐性やＰＡＩ結
合性を考慮すると大量投与を余儀無くされ、その優位性
が損なわれる恐れがある。

従来では、ＦＡＩ結合性の低下したウロキナーゼ又はウ
ロキナーゼ前駆体については知られていない。

（発明の概要） かかる状況に鑑みて、本発明者らは、ウロキナーゼ前駆
体を材料としてトロンビン耐性を付与されたウロキナー
ゼ前駆体を製造する方法について鋭意研究を行った。そ
の結果、ウロキナーゼ前駆体をジカルボニル化合物によ
り処理することでこれを達成でき、しかもウロキナーゼ
にあってはＦＡＩとの直接の結合性が、ウロキナーゼ前
駆体にあってはウロキナーゼに変換された後のＦＡＩと
の結合性が低下したウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆
体が製造されることが見出された。

即ち本発明は、ウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆体を
ジカルボニル化合物と反応させることからなる改良され
たウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆体の製造方法であ
る。以下本発明の詳細な説明する。

本発明でウロキナーゼを材料として使用した場合には、
ＦＡＩとの結合性の低下した、改良されたウロキナーゼ
が製造できる。また、ウロキナーゼ前駆体を材料として
使用した場合には、トロンビン耐性が付与され、かつ、
ウロキナーゼに変換された場合にＦＡＩとの結合性が低
下した、改良されたウロキナーゼ前駆体が製造できる。

材料として使用するウロキナーゼは、従来知られている
高分子型あるいは低分子型のいずれの形態のものでも良
い。以上のようなウロキナーゼは、例えば尿等の生体試
料から抽出することが可能であり、又は例えば腎臓細胞
等を培養することで取得することが出来る。ウロキナー
ゼ前駆体は、例えば特開昭５９−５１３００号に記載さ
れた方法等により遺伝子工学的に製造されたものがあ゛
る。

本発明では、例えばウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆
体の一部分のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したものや
、当該一部分が他の蛋白質と融合した形態のものであっ
ても材料として使用できる。例えば、そのなかに少なく
ともウロキナーゼ前駆体の第１５６番目のアルギニン残
基付近のトロンビンの作用を受ける部分を含んでいるも
のであればトロンビン耐性を付与することが可能である
し、ウロキナーゼにしろウロキナーゼ前駆体にしろ、た
とえトロンビンによる切断作用を受ける部分が欠失して
いてもウロキナーゼ活性を有する以上その活性中心部位
を有しており、ここで、当該活性中心部位はＦＡＩとの
結合性を有する部位であることに他ならないから（Ａｎ
ｄｒｅａｓｅｎら、Ｊ、Ｂ、Ｃ，第２６１巻、７６４４
頁、１９８６年）、本発明によればＦＡＩ結合性を低下
させることが可能なのである。従って、高分子又は低分
子ウロキナーゼは単にウロキナーゼと、天然のウロキナ
ーゼ前駆体、変異型ウロキナーゼ前駆体は単にウロキナ
ーゼ前駆体と、ウロキナーゼ前駆体の一部分を含む融合
蛋白質等はトロンビン耐性を付与する目的においてはウ
ロキナーゼ前駆体と同様であり、ウロキナーゼ又はウロ
キナーゼ前駆体の一部分を含む融合蛋白質等はＦＡＩ結
合性を低下する目的ではウロキナーゼ又はウロキナーゼ
活性と同様であると本発明においては解釈することが出
来る。

ウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆体は、ジカルボニル
化合物との反応性等を考慮するとある程度精製されてい
ることが好ましい。また、これらを含む溶液等が塩類を
含んでいる場合には、本発明の実施に先立って例えば透
析等を実施して脱塩を行なっておくとジカルボニル化合
物材料と効率的に反応が起こるため都合が良い。ウロキ
ナーゼ又はウロキナーゼ前駆体が例えば凍結乾燥等の操
作を実施された粉状（固体状）のものの場合には、これ
を適当な緩衝液等に溶解した後、本発明を実施する。使
用される緩衝液は、その種類等には特別の制限はないが
、ｐＨ６〜９．５程度の中性域のｐＨであるとウロキナ
ーゼ活性の失活を防ぐことができ、好ましい。ウロキナ
ーゼ又はウロキナーゼ前駆体がすでに溶液状のものであ
っても、そのｐＨが中性域に調整されていない場合には
適当な酸もしくはアルカリ性物質を添加して中性域に調
整するか又は緩衝液の交換を実施しておくと良い。

本発明では、ジカルボニル化合物とウロキナーゼ又はウ
ロキナーゼ前駆体との反応を上記緩衝液中で行うが、反
応効率を高める上で該緩衝液は０〜２Ｍ　ＮａＣ１を含
む１０ｍＭ　〜２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７〜９．５）を
使用すると良く、より好ましくはＩＭＮａＣｌを含む５
０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）を使用すると良い。

ウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆体と反応させる化合
物は、更に詳細には次式［１］又は［２］で示されるジ
カルボニル化合物である。この様なジカルボニル化合物
としては、詳しくは、２，３−ブタンジオン、１，２−
シクロヘキサンジオン又はフェニルグリオキサールが例
示できる。

式■ １−Ｃ−０ ２−Ｃ−０ （ただし、式中Ｒ１及びＲ２は同一でも良い、それぞれ
−（ＣＨ２）　ｎ　　Ｘで示される化合物であり、ここ
で、Ｘは水酸基、フェニル基、メチル基、水素、カルボ
キシル基又はアミノ基であり、ｎは１から１０の整数で
ある） 式■ ｃ″″Ｏ （ただし、式中ｎは２から５の整数である）ウロキナー
ゼ又はウロキナーゼ前駆体とジカルボニル化合物の反応
は、反応液中に存在するジカルボニル化合物とウロキナ
ーゼあるいはウロキナーゼ前駆体のモル比、反応時間、
反応温度及び他の反応液中に共存する物質の量又は反応
液組成等に依存するが、本発明ではウロキナーゼ又はウ
ロキナーゼ前駆体が失活しない条件下にて反応を実施す
れば良く、特別の制限はない。例えばウロキナーゼ又は
ウロキナーゼ前駆体とジカルボニル化合物のモル比とし
ては１；１０〜１　：　１００００を、反応時間として
は１〜２０時間程度の反応時間を、反応温度としては４
〜６０℃を設定すると良く、反応液組成については先に
説明したようにＮａＣ１等を含むホウ酸緩衝液等とすれ
ば良い。

特に、反応効率を向上させるためには、ウロキナ−ゼ又
はウロキナーゼ前駆体とジカルボニル化合物のモル比を
１　：　５００程度とし、２０”Ｃ前後の反応温度で反
応させると良い。

本発明を実施した後に製造された改良されたウロキナー
ゼ様蛋白質から使用したジカルボニル化合物を分離する
には、例えば反応抜液を適当な緩衝液等に対して透析等
すれば良い。透析液について具体的に説明すれば、０．
１５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．０１％ポリオキシエチレン
ソルビタンモノオレエートを含む５０ｍＭ）リス緩衝液
（ｐＨ７，５）等が例示できる。

以上の操作により、材料としてウロキナーゼを使用した
場合にはＦＡＩ結合性の低下した、改良されたウロキナ
ーゼを、材料としてウロキナーゼ前駆体を使用した場合
にはトロンビン耐性が付与され、かつ活性化された後に
はＦＡＩ結合性の低下した改良されたウロキナーゼ前駆
体を製造することが出来る。

（発明の効果） 本発明によれば、材料としてウロキナーゼを使用した場
合にはＦＡＩ結合性の低下した、改良されたウロキナー
ゼ様蛋白質を、材料としてウロキナーゼ前駆体蛋白質を
使用した場合にはトロンビン耐性が付与され、かつＦＡ
Ｉ結合性の低下した改良されたウロキナーゼ様蛋白質を
製造することが出来る。ここで、トロンビンによる切断
はウロキナーゼ前駆体の失活を意味するものであるから
、本発明は血中での存在時間が長い、改良されたウロキ
ナーゼ前駆体を提供するものである。

更に本発明によれば、ＦＡＩとの結合性を有するウロキ
ナーゼ又はウロキナーゼ前駆体について、該結合性の低
下したウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆体を製造する
ことが出来る。ＦＡＩとの結合も、ウロキナーゼ又はウ
ロキナーゼ前駆体の失活を意味するものであるから、本
発明の方法は血中での安定性が高く、少量で高い血栓溶
解活性を発揮する改良されたウロキナーゼ又はウロキナ
ーゼ前駆体を提供するものである。

本発明の方法は遺伝子工学的にアミノ酸−次構造を変化
させることでトロンビン耐性を付与し又はＦＡＩ結合性
を低下するものではないから、既に製造されたウロキナ
ーゼ又はウロキナーゼ前駆体について適用されるもので
あり、ジカルボニル化合物で処理するという簡便な操作
により実施可能なものである。

本発明におけるこれらの効果は同様の操作により同時に
達成可能であるから、ウロキナーゼ又はウロキナーゼ前
駆体についてトロンビン耐性の付与とＦＡＩ結合性の低
下を同時に実現し、トロンビンにより切断されに＜＜、
更にはＦＡＩと結合し難い、即ち血中で長時間活性を保
持できる改良されたウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆
体を製造することを可能とするものである。

（実施例） 以下、本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

なお、実施例中のウロキナーゼ前駆体の活性１１ｐｊ定
は、プラスミンを添加してウロキナーゼ前駆体をウロキ
ナーゼに変換し、合成基質（Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
ｐＮＡ；Ｐｙｒはピログルタミル基を示す、Ｓ−２４４
４、第一化学薬品社製）を用いてその加水分解活性をを
測定したうえで市販のウロキナーゼと比較して算出した
。また、蛋白質濃度は、２８０ｎｍの光吸度を測定する
ことで算出した。

実施例 まず、特開昭５９−５１３００号に記載された方法に従
ってウロキナーゼ前駆体を製造し、これを材料とした。

製造された材料を５ｍｇ／ｍｌの濃度となる様に、ＩＭ
ＮａＣｌを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）で
調製した（以後、この溶液を溶液Ａとする）。

次に、２，３−ブタンジオンを１０％となるようにＩＭ
ＮａＣｌを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
添加した（以後、この溶液を溶液Ｂとする）。

１ｍｌの溶液Ａと５０μｌの溶液Ｂを混合し、２０℃で
２０時間反応させた。なお、この時の混合溶液中のウロ
キナーゼ前駆体と２，３ブタンジオンのモル比は、約１
　：　５００である。

反応終了後、反応液を透析チューブにつめ、０．１５Ｍ
　　ＮａＣ１を含む５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，５
）に対して４℃で８時間透析した。

以上のようにして得られた改良されたウロキナーゼ前駆
体様蛋白質について、以下の８１１定を実施した。

■ウロキナーゼ前駆体活性の低下の有無前記合成基質の
加水分解活性を測定し、市販のウロキナーゼと比較して
その比活性を算出した。

結果を表１に示す。表１によれば、本発明を実施する前
と後では比活性に変化はみられない。

表　　１ ＊表１中、その数値は、比活性（Ｉ　Ｕ　／　ｍ　ｇ　
）を示す。

■トロンビン耐性の測定 トロンビン（持出製薬製）をイオン交換カラムで精製し
、トロンビンに対する合成基質（Ｓ−２２３８、第−化
学薬品源）を測定した後、その力価を算出し、２Ｕ／ｍ
ｌに調製後、使用した。

１ｍｌのトロンビン（２Ｕ／ｍｌ）と１ｍｌの材料（５
０１Ｕ／ｍｌ）を混合し、３７℃で０〜６０分間放置し
た後、それぞれの処理の場合についてウロキナーゼ活性
を測定した。結果を図１に示す。図１によれば、本発明
の改良されたウロキナーゼ前駆体では改良前のウロキナ
ーゼ前駆体に比較してトロンビン耐性が向上しているこ
とが分かる。

■ＦＡＩ結合性の測定 ＦＡＩを常法に従って、ヒト血管内皮細胞を培養した培
養液上清から調製した。

０〜５０μｌの４Ｍ塩酸グアニジンで活性化したＦＡＩ
と５０μｌのプラスミンにより活性化した、先に改良さ
れたウロキナーゼ前駆体（５０ＩＵ／ｍｌ）を混合し、
３７℃で１５分間放置した後、そのウロキナーゼ活性を
測定した。結果を第２図に示す。図２によれば、本発明
により製造されたウロキナーゼ様蛋白質においては、Ｆ
ＡＩと反応させた場合でも活性の低下は微量であるが、
対象（２，３ブタンジオンと反応させていない材料に由
来するウロキナーゼ）では活性の低下が顕著であること
が分かる。

図１は、本発明の実施例で得られた、改良されたウロキ
ナーゼ前駆体について、そのトロンビン耐性を測定した
結果を示すものである。図中、は材料をもとに改良され
たウロキナーゼ前駆体についての、　　　は改良されて
いないウロキナーゼ前駆体（材料そのもの）についての
結果をそれぞれ示すものである。

図２は、改良されたウロキナーゼ前駆体についてそのＦ
ＡＩ結合性を測定した結果を示すものである。図中、　
　　は材料をもとに改良されたウロキナーゼ前駆体につ
いての、　　　は改良されていないウロキナーゼ前駆体
（材料そのもの）についての、結果をそれぞれ示すもの
である。

図中、縦軸はそれぞれトロンビン処理を実施していない
場合又はＦＡＩを添加していない場合の活性を１００％
とした場合の活性を、横軸はそれぞれ処理時間又はＰＡ
Ｉの添加量を示すものである。

【図面の簡単な説明】

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆体をジカルボ
   ニル化合物と反応させることからなる改良されたウロキ
   ナーゼ又はウロキナーゼ前駆体の製造方法。
2. （２）ウロキナーゼ又はウロキナーゼ前駆体を、次式［
   １］又は［２］で示されるジカルボニル化合物と反応さ
   せることを特徴とする請求項第（１）項記載の製造方法
   。 式［１］ ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、式中Ｒ１及びＲ２は同一でも良い、それぞれ
   −（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｘで示される化合物であり、ここ
   で、Ｘは水酸基、フェニル基、メチル基、水素、カルボ
   キシル基又はアミノ基であり、ｎは１から１０の整数で
   ある） 式［２］ ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、式中ｎは２から５の整数である）