JPH0462302B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0462302B2 JPH0462302B2 JP60079429A JP7942985A JPH0462302B2 JP H0462302 B2 JPH0462302 B2 JP H0462302B2 JP 60079429 A JP60079429 A JP 60079429A JP 7942985 A JP7942985 A JP 7942985A JP H0462302 B2 JPH0462302 B2 JP H0462302B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- urokinase
- precursor
- urokinase precursor
- albumin
- present
- Prior art date
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はウロキナーゼ前駆体乾燥製剤に関す
る。 〔従来の技術〕 ヒト腎細胞から分泌されるウロキナーゼ前駆体
は、それ自身ではウロキナーゼ活性を発現しない
が、プラスミン等のプロテイナーゼの作用を受け
ると著しいウロキナーゼ活性を発現する。 ウロキナーゼ前駆体は、フイブリンに対する親
和性が高く、血漿中のフイブリノーゲンに作用
（分解）することなく血栓を構成するフイブリン
に到達し、血栓中の微量のプラスミンの作用によ
りウロキナーゼ活性を発現する。 即ち、ウロキナーゼ前駆体は血栓部位に限定し
た線溶を惹起させ、選択的かつ効率的に血栓を溶
解する特性を有するため新規な血管栓塞疾患の治
療剤として有望視されている。 ところで、ウロキナーゼ前駆体は粗製段階及び
精製過程の高濃度中性溶媒中に保たれておれば比
較的安定であるが、高度精製された状態あるいは
（凍結）乾燥した状態では不安定である。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、ウロキナーゼ前駆体の安定化
をはかることにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、本目的を解決すべく、鋭意研究
を重ねた結果、極性アミノ酸及びその塩の中から
選ばれる少なくとも一種及びヒトアルブミンとを
併用してウロキナーゼ前駆体に添加することによ
つて、乾燥ウロキナーゼ前駆体が相乗的に安定化
されるという新知見を得て本発明を完成した。 即ち、本発明は、ウロキナーゼ前駆体を主成分
とし、安定化剤として極性アミノ酸及びその塩の
中から選ばれる少なくとも一種及びヒトアルブミ
ンを配合してなるウロキナーゼ前駆体乾燥製剤で
ある。 （ウロキナーゼ前駆体） 本発明で用いられるウロキナーゼ前駆体とは、
尿及び人腎細胞及び遺伝子工学によつて得られる
ものが例示される（特願昭58−170354参照）。 本発明はウロキナーゼ前駆体の高度精製された
ものにおいて特に効果が著しい。たとえば、比活
性100000IU／mg蛋白の濃度が例示される〔なお、
IUはUKの国際単位の略である。前駆体１mlをプ
ラスミン処理した時のUK活性に相当する1IU／
mlは前駆体溶液１mlをプラスミン処理した時に、
UK1IUと同等の活性を有することを意味する。
以下同様〕。 （安定化剤） 本発明で使用される極性アミノ酸としては例え
ば、グルタミン酸、アスパラギン酸アルギニン、
リジン、ヒスチジン等が例示される。 これら極性アミノ酸の塩としてはグルタミン酸
ソーダ、アルギニンソーダが好適である。 本発明に使用されるアルブミンは抗原性の問題
からヒト由来のアルブミンであることが好まし
く、それらは医療用に精製されたものであれば特
に制限はない。その純度は、電気泳動で分析して
80％以上がアルブミンであるものが好ましい。ヒ
ト由来アルブミンを得る方法としては、エタノー
ル分画法（特公昭47−2869、特公昭35−5297）、
有機酸の存在下で加熱する方法（特公昭43−
1604、特公昭51−40132）等が例示される。特に
好ましくはアルブミンを加熱処理（好ましくは、
60℃、10時間程度）して肝炎ウイルス等不活化処
理を行なつたものが使用される。 （安定化剤の添加量） これら安定化剤は、ウロキナーゼ前駆体
10000IU〜250000IUに対してヒトアルブミンは10
〜50mgに相当する割合で、また極性アミノ酸また
はその塩は５〜30mgに相当する割合で添加され
る。 〔発明の効果〕 本発明において、前記安定化剤は、ウロキナー
ゼ前駆体の精製時、製剤化時の保存時などウロキ
ナーゼ前駆体が不活性化されうる条件下に置かれ
る任意の時期に添加され、効果を発揮する。 〔実施例〕 以下の実験例及び実施例において、本発明をよ
り明確に説明する。 なおウロキナーゼ前駆体の活性は、プラスミン
により活性化後合成基質（Glt−Gly−Arg−
MCA）を用い測定した。 実験例 １ 0.10Mリン酸緩衝液を溶媒とした精製ウロキナ
ーゼ前駆体（比活性135000IU／mg蛋白）溶液に
同緩衝液を溶媒としたヒトアルブミンを加え、ヒ
トアルブミン20mg／mlを含むウロキナーゼ前駆体
溶液25000IU／mlを調製した。この溶液に各種添
加物（極性アミノ酸またはその塩）を総量８mg／
ml加え、凍結乾燥した。対照としては精製ウロキ
ナーゼ前駆体溶液に何も添加しないもの及びヒト
アルブミンのみを添加したものを同様に凍結乾燥
したものを用いた。 これらを凍結乾燥直後と50℃で３箇月間保存し
た後、残存ウロキナーゼ前駆体力価（％）と測定
し、その結果を第１表に示した。
る。 〔従来の技術〕 ヒト腎細胞から分泌されるウロキナーゼ前駆体
は、それ自身ではウロキナーゼ活性を発現しない
が、プラスミン等のプロテイナーゼの作用を受け
ると著しいウロキナーゼ活性を発現する。 ウロキナーゼ前駆体は、フイブリンに対する親
和性が高く、血漿中のフイブリノーゲンに作用
（分解）することなく血栓を構成するフイブリン
に到達し、血栓中の微量のプラスミンの作用によ
りウロキナーゼ活性を発現する。 即ち、ウロキナーゼ前駆体は血栓部位に限定し
た線溶を惹起させ、選択的かつ効率的に血栓を溶
解する特性を有するため新規な血管栓塞疾患の治
療剤として有望視されている。 ところで、ウロキナーゼ前駆体は粗製段階及び
精製過程の高濃度中性溶媒中に保たれておれば比
較的安定であるが、高度精製された状態あるいは
（凍結）乾燥した状態では不安定である。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、ウロキナーゼ前駆体の安定化
をはかることにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、本目的を解決すべく、鋭意研究
を重ねた結果、極性アミノ酸及びその塩の中から
選ばれる少なくとも一種及びヒトアルブミンとを
併用してウロキナーゼ前駆体に添加することによ
つて、乾燥ウロキナーゼ前駆体が相乗的に安定化
されるという新知見を得て本発明を完成した。 即ち、本発明は、ウロキナーゼ前駆体を主成分
とし、安定化剤として極性アミノ酸及びその塩の
中から選ばれる少なくとも一種及びヒトアルブミ
ンを配合してなるウロキナーゼ前駆体乾燥製剤で
ある。 （ウロキナーゼ前駆体） 本発明で用いられるウロキナーゼ前駆体とは、
尿及び人腎細胞及び遺伝子工学によつて得られる
ものが例示される（特願昭58−170354参照）。 本発明はウロキナーゼ前駆体の高度精製された
ものにおいて特に効果が著しい。たとえば、比活
性100000IU／mg蛋白の濃度が例示される〔なお、
IUはUKの国際単位の略である。前駆体１mlをプ
ラスミン処理した時のUK活性に相当する1IU／
mlは前駆体溶液１mlをプラスミン処理した時に、
UK1IUと同等の活性を有することを意味する。
以下同様〕。 （安定化剤） 本発明で使用される極性アミノ酸としては例え
ば、グルタミン酸、アスパラギン酸アルギニン、
リジン、ヒスチジン等が例示される。 これら極性アミノ酸の塩としてはグルタミン酸
ソーダ、アルギニンソーダが好適である。 本発明に使用されるアルブミンは抗原性の問題
からヒト由来のアルブミンであることが好まし
く、それらは医療用に精製されたものであれば特
に制限はない。その純度は、電気泳動で分析して
80％以上がアルブミンであるものが好ましい。ヒ
ト由来アルブミンを得る方法としては、エタノー
ル分画法（特公昭47−2869、特公昭35−5297）、
有機酸の存在下で加熱する方法（特公昭43−
1604、特公昭51−40132）等が例示される。特に
好ましくはアルブミンを加熱処理（好ましくは、
60℃、10時間程度）して肝炎ウイルス等不活化処
理を行なつたものが使用される。 （安定化剤の添加量） これら安定化剤は、ウロキナーゼ前駆体
10000IU〜250000IUに対してヒトアルブミンは10
〜50mgに相当する割合で、また極性アミノ酸また
はその塩は５〜30mgに相当する割合で添加され
る。 〔発明の効果〕 本発明において、前記安定化剤は、ウロキナー
ゼ前駆体の精製時、製剤化時の保存時などウロキ
ナーゼ前駆体が不活性化されうる条件下に置かれ
る任意の時期に添加され、効果を発揮する。 〔実施例〕 以下の実験例及び実施例において、本発明をよ
り明確に説明する。 なおウロキナーゼ前駆体の活性は、プラスミン
により活性化後合成基質（Glt−Gly−Arg−
MCA）を用い測定した。 実験例 １ 0.10Mリン酸緩衝液を溶媒とした精製ウロキナ
ーゼ前駆体（比活性135000IU／mg蛋白）溶液に
同緩衝液を溶媒としたヒトアルブミンを加え、ヒ
トアルブミン20mg／mlを含むウロキナーゼ前駆体
溶液25000IU／mlを調製した。この溶液に各種添
加物（極性アミノ酸またはその塩）を総量８mg／
ml加え、凍結乾燥した。対照としては精製ウロキ
ナーゼ前駆体溶液に何も添加しないもの及びヒト
アルブミンのみを添加したものを同様に凍結乾燥
したものを用いた。 これらを凍結乾燥直後と50℃で３箇月間保存し
た後、残存ウロキナーゼ前駆体力価（％）と測定
し、その結果を第１表に示した。
【表】
実験例 ２
実験例１と同様にして、ヒトアルブミンとアル
ギニン及びグルタミン酸ソーダを種々の割合で混
合し、凍結乾燥品を作成した。 これを凍結乾燥直後と50℃１箇月間保存した後
残存ウロキナーゼ前駆体力価（％）を測定した。
結果は第２表に示すとおりである。
ギニン及びグルタミン酸ソーダを種々の割合で混
合し、凍結乾燥品を作成した。 これを凍結乾燥直後と50℃１箇月間保存した後
残存ウロキナーゼ前駆体力価（％）を測定した。
結果は第２表に示すとおりである。
【表】
第１表及び第２表中に示した力価は、前記処理
を行なう前の力価を100とした場合に対する残存
活性である。 実施例 １ 精製ウロキナーゼ前駆体（比活性135000IU／
mg蛋白）25000IU、ヒトアルブミン20mg、アルギ
ニン6.4mgをPH7.0、0.1Mリン酸緩衝液１mlに溶解
し、無菌ろ過後、バイアル瓶に充填し、凍結乾燥
し、製剤中ヒトアルブミン20mg、アルギニン6.4
mg含有するウロキナーゼ前駆体25000IUの製剤を
得た。 実施例 ２ 実施例１と同様に操作し、製剤中ヒトアルブミ
ン20mg、グルタミン酸ソーダ6.4mgを含有するウ
ロキナーゼ前駆体25000IUの製剤を得た。 実施例 ３ 精製ウロキナーゼ前駆体（比活性135000IU／
mg蛋白）50000IU、ヒトアルブミン40mg、アルギ
ニン12.8mgを実施例１と同様に操作し、製剤中ヒ
トアルブミン40mg、アルギニン12.8mgを含有する
ウロキナーゼ前駆体50000IUの製剤を得た。 ＜参考例：製造例＞ 培養人腎細胞を0.1％ヒト血清アルブミン添加
無血清培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離
し、その上清を凍結して保存した。プールした培
養上清をPH5.5に調整した後、CM−Sephadex Ｃ
−50に接触した。0.16Mリン酸緩衝液（PH5.5）
でカラムを洗浄した後、0.16Mリン酸緩衝液（PH
8.5）で吸着していた本ウロキナーゼ前駆体を溶
出させた。 一方、本ウロキナーゼ前駆体で予め免疫してお
いたマウスBALB／ｃの脾臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞をポリエチレングリコールにより融合
させたハイブリドーマのうち、本ウロキナーゼ前
駆体に対する抗体産生の高いクローンを選択し
た。この融合細胞の培養液から、抗ウロキナーゼ
モノクローナル抗体を回収した。このモノクロー
ナル抗体をBrCN活性化Sepharose4B
（Pharmacia社）に固定した。 このモノクローナル抗体カラムを0.4MNaCl含
有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化し、これ
に前記の本ウロキナーゼ前駆体を含有する溶出液
を接触した。0.4MNaCl含有0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）でカラムを洗浄した後、吸着していた本
ウロキナーゼ前駆体を0.5MNaCl含有0.2Mグリシ
ン−HCl水溶液（PH2.5）で溶出させた。溶出液
を中和後抗マウスIgGウサギIgGを固定化した担
体を通過し漏出してくる極く微量のマウスIgGを
除去した。通過液を除菌過した後、凍結乾燥し
比活性が少なくとも80000IU／mgの高度精製本ウ
ロキナーゼ前駆体を得た。 なお、この精製品はSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分子量５万の１本の帯を示
した。
を行なう前の力価を100とした場合に対する残存
活性である。 実施例 １ 精製ウロキナーゼ前駆体（比活性135000IU／
mg蛋白）25000IU、ヒトアルブミン20mg、アルギ
ニン6.4mgをPH7.0、0.1Mリン酸緩衝液１mlに溶解
し、無菌ろ過後、バイアル瓶に充填し、凍結乾燥
し、製剤中ヒトアルブミン20mg、アルギニン6.4
mg含有するウロキナーゼ前駆体25000IUの製剤を
得た。 実施例 ２ 実施例１と同様に操作し、製剤中ヒトアルブミ
ン20mg、グルタミン酸ソーダ6.4mgを含有するウ
ロキナーゼ前駆体25000IUの製剤を得た。 実施例 ３ 精製ウロキナーゼ前駆体（比活性135000IU／
mg蛋白）50000IU、ヒトアルブミン40mg、アルギ
ニン12.8mgを実施例１と同様に操作し、製剤中ヒ
トアルブミン40mg、アルギニン12.8mgを含有する
ウロキナーゼ前駆体50000IUの製剤を得た。 ＜参考例：製造例＞ 培養人腎細胞を0.1％ヒト血清アルブミン添加
無血清培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離
し、その上清を凍結して保存した。プールした培
養上清をPH5.5に調整した後、CM−Sephadex Ｃ
−50に接触した。0.16Mリン酸緩衝液（PH5.5）
でカラムを洗浄した後、0.16Mリン酸緩衝液（PH
8.5）で吸着していた本ウロキナーゼ前駆体を溶
出させた。 一方、本ウロキナーゼ前駆体で予め免疫してお
いたマウスBALB／ｃの脾臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞をポリエチレングリコールにより融合
させたハイブリドーマのうち、本ウロキナーゼ前
駆体に対する抗体産生の高いクローンを選択し
た。この融合細胞の培養液から、抗ウロキナーゼ
モノクローナル抗体を回収した。このモノクロー
ナル抗体をBrCN活性化Sepharose4B
（Pharmacia社）に固定した。 このモノクローナル抗体カラムを0.4MNaCl含
有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化し、これ
に前記の本ウロキナーゼ前駆体を含有する溶出液
を接触した。0.4MNaCl含有0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）でカラムを洗浄した後、吸着していた本
ウロキナーゼ前駆体を0.5MNaCl含有0.2Mグリシ
ン−HCl水溶液（PH2.5）で溶出させた。溶出液
を中和後抗マウスIgGウサギIgGを固定化した担
体を通過し漏出してくる極く微量のマウスIgGを
除去した。通過液を除菌過した後、凍結乾燥し
比活性が少なくとも80000IU／mgの高度精製本ウ
ロキナーゼ前駆体を得た。 なお、この精製品はSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分子量５万の１本の帯を示
した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ウロキナーゼ前駆体を主成分とし、安定化剤
として極性アミノ酸及びその塩の中から選ばれる
少なくとも一種及びヒトアルブミンを配合してな
るウロキナーゼ前駆体乾燥製剤。 ２ 極性アミノ酸及びその塩がグルタミン酸、ア
スパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン
およびそれらの塩類である特許請求の範囲の範囲
第１項記載の製剤。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60079429A JPS61238732A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ウロキナーゼ前駆体乾燥製剤 |
| CA000506647A CA1336585C (en) | 1985-04-16 | 1986-04-15 | Method of stabilizing urokinase precursor and dry preparation containing said precursor |
| KR1019860002879A KR940003056B1 (ko) | 1985-04-16 | 1986-04-15 | 우로키나제 전구체를 안정화시키는 방법 |
| ES554477A ES8706821A1 (es) | 1985-04-16 | 1986-04-16 | Metodo de estabilizar un precursor de uroquinasa |
| DE86105235T DE3688713T2 (de) | 1985-04-16 | 1986-04-16 | Verfahren zur Stabilisierung eines Urokinasevorläufers und diesen Vorläufer enthaltendes trockenes Präparat. |
| EP86105235A EP0200966B1 (en) | 1985-04-16 | 1986-04-16 | Method of stabilizing urokinase precursor and dry preparation containing said precursor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60079429A JPS61238732A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ウロキナーゼ前駆体乾燥製剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61238732A JPS61238732A (ja) | 1986-10-24 |
| JPH0462302B2 true JPH0462302B2 (ja) | 1992-10-05 |
Family
ID=13689627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60079429A Granted JPS61238732A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ウロキナーゼ前駆体乾燥製剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61238732A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63174934A (ja) * | 1987-01-13 | 1988-07-19 | Green Cross Corp:The | ウロキナ−ゼ前駆体乾燥製剤 |
| US8545459B2 (en) | 2009-02-25 | 2013-10-01 | Teleflex Medical Incorporated | Stabilized enzyme compositions |
| US9333280B2 (en) | 2009-02-25 | 2016-05-10 | Teleflex Medical Incorporated | Stabilized enzyme compositions |
| CA2925858A1 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Teleflex Medical Incorporated | Stabilized enzyme compositions |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54147916A (en) * | 1978-05-12 | 1979-11-19 | Sumitomo Chem Co Ltd | Preparation of urokinase injection |
-
1985
- 1985-04-16 JP JP60079429A patent/JPS61238732A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61238732A (ja) | 1986-10-24 |
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