JPH031960B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、臨床診断の分野において使用する
トランスアミナーゼの測定方法に関する。GOT，
AST又はAATと呼ばれるグルタミン酸オキザロ
酢酸トランスアミナーゼ（Ｌ−aspartate
ketoglutarete Amino Transferase、EC2.6.1.1.）
は、細胞内の存在位置を異にし、電気泳動的に区
別される二種類の形で存在する。すなわち (1) ミトコンドリアに結合している陽イオン性ア
イソエンザイム（ｍ−GOT）と、 (2) 細胞質に存在する陰イオン性アイソエンザイ
ム（ｓ−GOT）とである。 血漿中のGOTの全活性の測定は、心筋梗塞の
診断に広く利用されており、又、生理液中の
GOT活性レベルは、他の病理形態、特に肝臓と
骨格筋レベルの診断にも利用されている。 臨床診断に実用されている測定方法において
は、生物試料中の２種のアイソエンザイムを合わ
せた全酵素活性が測定されてしまう。 組識の壊死状態に関するより精巧な検査手段を
得るためには、グルタミン酸オキザロ酢酸トラン
スアミナーゼの２種のアイソエンザイムの相対的
な活性を識別することが重要である。 他の酵素、例えば乳酸脱水素酵素（LDH）及
びクレアチンキナーゼについては、臨床的適用に
おいて、種々のアイソエンザイム型に関する適切
な活性測定により、より高い識別力が得られるこ
とが注目される。 グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
の、細胞質性及びミトコンドリア性の２種の酵素
の、実際に存在する測定法は、電気泳動法、クロ
マトグラフ法又は免疫学的方法に基礎を置いてお
り、これらの場合には、前もつて１つのアイソエ
ンザイムを他のアイソエンザイムから分離してお
く必要がある。 この発明は、２種のアイソエンザイムを分離す
ることを必要としないで、血清又は血漿試料中の
２種のアイソエンザイムの活性を分離測定するこ
とができる、新規な測定法に関するものである。 この方法は、本質上、Ｌ−セリンＯ−サルフエ
ート（Ｌ−serine Ｏ−sulfate）とブタ細胞質性
グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼと
の既知反応に基礎を置いており、この酵素は、
種々の時間のインキユベーシヨンの後、前記の基
質の誘導体と酵素の活性部位の反応基との間の共
有結合の形成により失格する（R.A.John，P.
Fasella：“The reaction of Ｌ−serine−Ｏ−
sulphate with AsPartate Aminotransterase”
Biochemistry，Vol.8，No.11，Nov.1969）。 我々は、実験の過程で、予期に反して、ヒト．
ミトコンドリア性アイソエンザイムの存在下にヒ
ト．細胞質性アイソエンザイムを失活せしめるイ
ンキユベーシヨン条件により、ヒト．ミトコンド
リア性アイソエンザイムの活性喪失は生じないこ
とを見出した。 従つて、Ｌ−セリンＯ−サルフエート（Ｌ−
serine Ｏ−sulfate）とのインキユベーシヨンの
前及び後に、血漿又は血清中に存在するGOT活
性を測定することにより、第一の場合には２種の
アイソエンザイムの両者の総活性を評価すること
ができ、第二の場合（Ｌ−セリンＯ−サルフエー
ト（Ｌ−serine Ｏ−sulfate）とインキユベート
した後）にはミトコンドリア性アイソエンザイム
のみの活性を評価することができる。そして、こ
れらの単純差を求めることにより、細胞質性アイ
ソエンザイムの活性値が得られる。 次に、ミトコンドリア性及び細胞質性の二種の
アイソエンザイムのGOT活性測定の分析条件に
ついて説明する。 血清又は血漿中の活性測定には、同一試料から
採取した２個の同量の小分け試料を使用するのが
好ましく、この内の一つの小分け試料は総活性
（２種のアイソエンザイムの両者）の測定に使用
し、一方、前もつてＬ−セリンＯ−サルフエート
（Ｌ−serine Ｏ−sulfate）とインキユベーシヨン
した後の他方の小分け試料から、ミトコンドリア
性アイソエンザイムのみの活性値を求める。 血清又は血漿の同一試料から0.5mlを取り出し、
２本の別々の試験管に入れる。第一の試験管(A)に
Ｌ−セリンＯ−サルフエート（Ｌ−serine Ｏ−
sulfate）の2M水溶液25マイクロリツターを加え
て、Ｌ−セリンＯ−サルフエート（Ｌ−serine
Ｏ−sulfate）の最終濃度が約50mMとなるよう
にし、過度の希釈をしない。第二の試験管(B)に
は、25マイクロリツターの水を加えて、試験管(A)
にＬ−セリンＯ−サルフエート（Ｌ−serine Ｏ
−sulfate）を加えた場合と同じ希釈にする。室
温で30分間又は30℃で20分間放置する。この時間
の終点で反応が完結する。すなわち、試験管(A)に
おいて、Ｌ−セリンＯ−サルフエート（Ｌ−
serine Ｏ−sulfate）から誘導された化合物（ア
ミノアクリル酸）が細胞質性アイソエンザイムの
活性部位中に存在する基と完全に共有結合を形成
し、該酵素を不可逆的に失格せしめ、一方このイ
ンキユベーシヨン期間中、ミトコンドリア性アイ
ソエンザイムの同様の阻害は生じない。 そして、二つの試験管中の酵素活性を、カルメ
ン法（Karmen′s method）、すなわち、グルタミ
ン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼとリンゴ酸
脱水素酵素との共役反応における還元型ニコチン
アミドアデニンジニユークレオチド（NADH）
の消費による方法、によつて測定する。 340nmにおける１分間当たりの光学濃度の変化
から、次のようにして、血清又は血漿１当たり
の酵素単位値（Ｕ／）を求める。 試験管(B)＝TotalU／（細胞質性アイソエンザイム＋
ミトコンドリア性アイソエンザイム） 試験管(A)＝Ｕ／（ミトコンドリア性アイソエンザイ
ムのみ） Ｕ／(B)−Ｕ／(A)の差から試験管(A)において
完全に失活した細胞質性アイソエンザイムの値、
Ｕ／を求める。 例 この発明の方法の有効性を実証し、これの適用
方法を例示するために、２種のアイソエンザイム
を種々の量含む５群のヒト血清を調製した。この
５群の母体は最低の固有の活性（＜5U／）を
有するヒト血清からなる。この血清に、イー．ゼ
イ．サンプソン（E.J.Sampson）等の方法により
精製した２種のアイソエンザイムを種々の量加え
た。 最終的に、５群は次の構成となつた。 第１群：120U／（細胞質性アイソエンザイム
のみ） 第２群：112.5U／（90U／の細胞質性アイソ
エンザイムと22.5U／のミトコンドリア
性アイソエンザイム） 第３群：105U／（60U／の細胞質性アイソ
エンザイムと45U／のミトコンドリア性
アイソエンザイム） 第４群：97.5U／（30U／の細胞質性アイソ
エンザイムと67.5U／のミトコンドリア
性アイソエンザイム） 第５群：90U／（ミトコンドリア性アイソエン
ザイムのみ） この方法に従つてアイソエンザイム活性の測定
を行い、６個の異なつた測定の平均として得た結
果を表に示した（表中、細胞質性アイソエンザイ
ムをＳ−GOTとしミトコンドリア性アイソエン
ザイムをｍ−GOTとして示した）。

【表】 アイソエンザイム組成に関する理論値と実験値
の比較から、この発明の方法の有効性がその正確
さと共に明白である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血清又は血漿試料中のグルタミン酸オキザロ
   酢酸トランスアミナーゼ（GOT）の細胞質性及
   びミトコンドリア性のアイソエンザイムの単独の
   酵素活性を測定する方法において、Ｌ−セリンＯ
   −サルフエート（Ｌ−serine Ｏ−sulfate）との
   インキユベーシヨンの前と後に血清又は血漿中の
   GOT活性を測定し、第一の場合に２種のアイソ
   エンザイムの総酵素活性に係る酵素活性値を求
   め、第二の場合に、ミトコンドリア性酵素のみの
   活性に係る酵素活性値を求め、上記の二種の活性
   値の差から細胞質性アイソエンザイムの活性を求
   めることを特徴とする方法。 ２ 血清又は血漿の同一試料の２個の等量の小分
   け試料で測定を行うことを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ３ GOTとリンゴ酸脱水素酵素の共役反応にお
   ける還元型ニコチンアミドアデニンジニユークレ
   オチド（NADH）の消費によつて酵素活性を測
   定することを特徴とする特許請求の範囲第１項又
   は第２項記載の方法。 ４ Ｌ−セリンＯ−サルフエートによる細胞質性
   アイソエンザイムの失活を室温における30分間の
   インキユベーシヨンによつて行うことを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ Ｌ−セリンＯ−サルフエートによる細胞質性
   アイソエンザイムの失活を30℃における20分間の
   インキユベーシヨンによつて行うことを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 常用のグルタミン酸オキザロ酢酸トランスア
   ミナーゼ（GOT）分析試薬とＬ−セリンＯ−サ
   ルフエートとを含むことを特徴とする、GOTの
   細胞質及びミトコンドリア性のアイソエンザイム
   の単独の酵素活性を測定するための診断用キツ
   ト。