JPH03197866A - 多項目同時判定能を有する免疫測定用試薬及び多項目同時判定免疫測定方法 - Google Patents
多項目同時判定能を有する免疫測定用試薬及び多項目同時判定免疫測定方法Info
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- JPH03197866A JPH03197866A JP33621989A JP33621989A JPH03197866A JP H03197866 A JPH03197866 A JP H03197866A JP 33621989 A JP33621989 A JP 33621989A JP 33621989 A JP33621989 A JP 33621989A JP H03197866 A JPH03197866 A JP H03197866A
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- antigen
- antibody
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
この発明は、多項目同時判定能を有する免疫測定用試薬
及び多項目同時判定免疫測定方法に関する。更に詳しく
は血液、尿等の生体成分に含まれる二種以上の微量成分
を一度に対象として測定した後判定操作を行い、そのう
ち−微量成分（−項目）でも異常がある場合には検出可
能な多項目同時判定能を有する免疫測定用試薬及び多項
目同時判定免疫測定方法に関するものである。
及び多項目同時判定免疫測定方法に関する。更に詳しく
は血液、尿等の生体成分に含まれる二種以上の微量成分
を一度に対象として測定した後判定操作を行い、そのう
ち−微量成分（−項目）でも異常がある場合には検出可
能な多項目同時判定能を有する免疫測定用試薬及び多項
目同時判定免疫測定方法に関するものである。
〈従来の技術〉
血液、尿等に含まれる微量成分の中には特定の疾患の際
に検出されたり、その量が増加するものがあり、その量
を測定することは病気の診断にとって大変有意義である
ことが認められている。
に検出されたり、その量が増加するものがあり、その量
を測定することは病気の診断にとって大変有意義である
ことが認められている。
しかしこのような疾患マーカーとなる微量成分と、その
疾患とが完全に１対１で対応しているわけではなく、一
つの疾患、特に感染症、腫瘍といった疾患群においては
、数種のマーカーが変動したり、逆にいずれのマーカー
の変動からその疾患群を疑うことができるという現実が
ある。このような理由から、い（つかのマーカーを測定
することが疾患を見逃さないという意味で、臨床検査の
分野では重要視されている。ただ、多くのマーカーを別
々に測定することは、日常の検査、特に集団検診等で多
数の検体から稀な腫瘍を検出するような場合には、労力
、費用等の点で非常な負担をかけることになる。そこで
その解決策となる簡便な微量検査法に従った多項目同時
判定能を有する免疫測定用試薬及び多項目同時判定免疫
測定方法の開発が望まれている。
疾患とが完全に１対１で対応しているわけではなく、一
つの疾患、特に感染症、腫瘍といった疾患群においては
、数種のマーカーが変動したり、逆にいずれのマーカー
の変動からその疾患群を疑うことができるという現実が
ある。このような理由から、い（つかのマーカーを測定
することが疾患を見逃さないという意味で、臨床検査の
分野では重要視されている。ただ、多くのマーカーを別
々に測定することは、日常の検査、特に集団検診等で多
数の検体から稀な腫瘍を検出するような場合には、労力
、費用等の点で非常な負担をかけることになる。そこで
その解決策となる簡便な微量検査法に従った多項目同時
判定能を有する免疫測定用試薬及び多項目同時判定免疫
測定方法の開発が望まれている。
さて、免疫学的測定法を用いた生体成分の定量法はラジ
オイムノアッセイの開発によりその感度が飛躍的に上昇
し、それまで測定できなかった微量成分を定量すること
が可能となった。その方法は、例えばプラスチックチュ
ーブのような固相表面に抗体を固定化し、測定対象物の
含まれる検体とラジオアイソトープ標識化抗原を入れる
が、または検体を入れてから反応しなかった検体部分を
捨てた後、ラジオアイソトープ標識化抗原を加えるかし
て一定時間反応後、チューブをよ（洗浄しチューブに固
定化されたラジオアイソトープ量をカウントする。固定
化されたアイソトープ量と測定対象物である抗原量に相
関があるので抗原量が測定できるわけである。しかしこ
の方法はラジオアイソトープを使用するため、その廃棄
に多大の制限を受けること、また標識物の分離、洗浄な
どの操作が煩雑であるという欠点がある。
オイムノアッセイの開発によりその感度が飛躍的に上昇
し、それまで測定できなかった微量成分を定量すること
が可能となった。その方法は、例えばプラスチックチュ
ーブのような固相表面に抗体を固定化し、測定対象物の
含まれる検体とラジオアイソトープ標識化抗原を入れる
が、または検体を入れてから反応しなかった検体部分を
捨てた後、ラジオアイソトープ標識化抗原を加えるかし
て一定時間反応後、チューブをよ（洗浄しチューブに固
定化されたラジオアイソトープ量をカウントする。固定
化されたアイソトープ量と測定対象物である抗原量に相
関があるので抗原量が測定できるわけである。しかしこ
の方法はラジオアイソトープを使用するため、その廃棄
に多大の制限を受けること、また標識物の分離、洗浄な
どの操作が煩雑であるという欠点がある。
そこでラジオアイソトープに変わる標識物が種々考案さ
れた。一つはペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼのような酵素であり、他にはフル
オレッセインイソチオシアネート、ローダミンのような
蛍光物質、更にはルミノール、アクリジニウムのような
発光物質等である。このような物質を標識してラジオイ
ムノアッセイと同様な測定系が組み立てられ、実際に使
用されている。
れた。一つはペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼのような酵素であり、他にはフル
オレッセインイソチオシアネート、ローダミンのような
蛍光物質、更にはルミノール、アクリジニウムのような
発光物質等である。このような物質を標識してラジオイ
ムノアッセイと同様な測定系が組み立てられ、実際に使
用されている。
更に抗原抗体反応によって標識されている物質のシグナ
ルが変化することを利用したホモジニアスイムノアッセ
イ法（均一系免疫測定法）も開発されている。例えば特
公昭５３−２７７６３号公報に示されているように、酵
素に低分子抗原を結合した酵素標識化抗原の持つ酵素活
性と、その酵素標識化抗原に抗体が結合したときの酵素
活性に差があることを利用した方法や、特開昭５８−１
２２４５９号公報に示されているように酵素標識化抗体
が抗原と凝集反応を起こした際、適当な基質濃度を選択
すると酵素活性の変化を検出することができることを利
用した方法である。このホモジニアスイムノアッセイは
検体に試薬を加えて反応するだけで測定が可能であり、
標識物の分離、洗浄等の煩雑な操作が必要ないという利
点を有する。
ルが変化することを利用したホモジニアスイムノアッセ
イ法（均一系免疫測定法）も開発されている。例えば特
公昭５３−２７７６３号公報に示されているように、酵
素に低分子抗原を結合した酵素標識化抗原の持つ酵素活
性と、その酵素標識化抗原に抗体が結合したときの酵素
活性に差があることを利用した方法や、特開昭５８−１
２２４５９号公報に示されているように酵素標識化抗体
が抗原と凝集反応を起こした際、適当な基質濃度を選択
すると酵素活性の変化を検出することができることを利
用した方法である。このホモジニアスイムノアッセイは
検体に試薬を加えて反応するだけで測定が可能であり、
標識物の分離、洗浄等の煩雑な操作が必要ないという利
点を有する。
一方、免疫測定法のもう一つの流れに免疫比濁法がある
。この方法は測定したい抗原を含む検体にその抗原に対
する抗体を加え、生じた凝集塊による反応液の光透過性
の変化を吸光度計によって測定することにより、抗原量
を知る方法である。
。この方法は測定したい抗原を含む検体にその抗原に対
する抗体を加え、生じた凝集塊による反応液の光透過性
の変化を吸光度計によって測定することにより、抗原量
を知る方法である。
この方法も測定操作は簡便であるが、感度が得られず微
量抗原の測定には用いることができなかった。しかし最
近は、抗体をラテックス粒子に結合した試薬を用いるこ
とにより飛躍的に感度を上げ、微量抗原の測定にも用い
られるようになってきた。これら種々の測定法を用いて
疾患の診断に有用と思われる多くの微量マーカーが測定
されている。
量抗原の測定には用いることができなかった。しかし最
近は、抗体をラテックス粒子に結合した試薬を用いるこ
とにより飛躍的に感度を上げ、微量抗原の測定にも用い
られるようになってきた。これら種々の測定法を用いて
疾患の診断に有用と思われる多くの微量マーカーが測定
されている。
上記に方法は、いずれも−回の測定で一種類の物質を測
定するのが原則であるが、少量検体の有効利用、測定操
作の省力化を目的として、一部には多項目同時測定法の
開発も試みられている。例えば、特開昭５４−１１９０
２６号に示されているように、酵素免疫測定法を用い二
種類以上の測定対象となる物質の抗体にそれぞれ異なる
酵素を標識し、抗原抗体反応部分は試薬を混合して同時
に行い、酵素活性測定時に固相を分けてそれぞれの酵素
基質を加えることによって、測定対象物の濃度を別々に
知る方法や、特開昭５６−２５５８号に示されているよ
うに、一方の抗体にはラジオアイソトープを標識し他方
には酵素を標識して、抗原抗体反応終了後、先ず酵素活
性を測定し、後にラジオアイソトープ量を測定して２項
目の量を各々知ろうとする方法、他には特開昭５６−７
８５９８号に示されているように、固相として用いる反
応チューブとビーズに異なる項目の抗体を固定化してお
き、ビーズの入ったチューブに検体を入れて抗原抗体反
応をした後、ビーズとチューブを分けてそれぞれに固定
化された酵素標識化抗体量から各項目の量を知ろうとす
る方法等である。
定するのが原則であるが、少量検体の有効利用、測定操
作の省力化を目的として、一部には多項目同時測定法の
開発も試みられている。例えば、特開昭５４−１１９０
２６号に示されているように、酵素免疫測定法を用い二
種類以上の測定対象となる物質の抗体にそれぞれ異なる
酵素を標識し、抗原抗体反応部分は試薬を混合して同時
に行い、酵素活性測定時に固相を分けてそれぞれの酵素
基質を加えることによって、測定対象物の濃度を別々に
知る方法や、特開昭５６−２５５８号に示されているよ
うに、一方の抗体にはラジオアイソトープを標識し他方
には酵素を標識して、抗原抗体反応終了後、先ず酵素活
性を測定し、後にラジオアイソトープ量を測定して２項
目の量を各々知ろうとする方法、他には特開昭５６−７
８５９８号に示されているように、固相として用いる反
応チューブとビーズに異なる項目の抗体を固定化してお
き、ビーズの入ったチューブに検体を入れて抗原抗体反
応をした後、ビーズとチューブを分けてそれぞれに固定
化された酵素標識化抗体量から各項目の量を知ろうとす
る方法等である。
これらは全て、項目毎の操作のうち共通で行える部分は
同時に行っているが、その後反応試薬を分けるか、シグ
ナル検出方法を分けて、項目毎の測定値を別々に知ろう
とする試みである。
同時に行っているが、その後反応試薬を分けるか、シグ
ナル検出方法を分けて、項目毎の測定値を別々に知ろう
とする試みである。
〈発明が解決しようとする問題点〉
多（の微量マーカーを測定することが診断の助けとなる
という事実の反面、これを−項目ずつ別々に測定するの
に要する手間は大変なものがある。特に集団検診の用に
多数の一般健常人の中から異常を検出するような時には
その労力、費用等は尋常なものではない。従来技術に見
られるような操作の一部を共通にする方法も、シグナル
検出等は別々に行わなければならなく、簡略化という面
ではさほど有効とは言えなかった。そこでこの労力を減
らす手段として全操作を一回行っただけで、多項目の中
で一項目でも異常値があれば検出できるスクリーニング
試薬及び測定方法の開発を試みた。すなわち目標とする
複数の検査項目に対する測定試薬の調節された混合物を
用い、−項目でも異常があればシグナルが変化して異常
項目が含まれることを検出できる試薬及び方法を開発し
ようというわけである。全ての人を対象に全ての項目を
測定するのではな（、先ずこのスクリーニング試薬また
は測定方法で測定を行い、異常のなかった人については
これらの項目は全て正常であるからそれ以上の測定は行
わず、異常値の出た人のみ各項目毎の測定を行ってどの
項目が異常であるかを特定すればよいことになる。これ
によって異常を発見しようとする目的を損なわないまま
、検体の処理数を大幅に減らすことができる。
という事実の反面、これを−項目ずつ別々に測定するの
に要する手間は大変なものがある。特に集団検診の用に
多数の一般健常人の中から異常を検出するような時には
その労力、費用等は尋常なものではない。従来技術に見
られるような操作の一部を共通にする方法も、シグナル
検出等は別々に行わなければならなく、簡略化という面
ではさほど有効とは言えなかった。そこでこの労力を減
らす手段として全操作を一回行っただけで、多項目の中
で一項目でも異常値があれば検出できるスクリーニング
試薬及び測定方法の開発を試みた。すなわち目標とする
複数の検査項目に対する測定試薬の調節された混合物を
用い、−項目でも異常があればシグナルが変化して異常
項目が含まれることを検出できる試薬及び方法を開発し
ようというわけである。全ての人を対象に全ての項目を
測定するのではな（、先ずこのスクリーニング試薬また
は測定方法で測定を行い、異常のなかった人については
これらの項目は全て正常であるからそれ以上の測定は行
わず、異常値の出た人のみ各項目毎の測定を行ってどの
項目が異常であるかを特定すればよいことになる。これ
によって異常を発見しようとする目的を損なわないまま
、検体の処理数を大幅に減らすことができる。
〈問題を解決するための手段〉
本願発明は次の（１）〜（１１）の請求項から構成され
ている。
ている。
（１）測定対象物のそれぞれに特異的に結合する下記の
（Ａ）、（Ｂ）のいずれか一方または両者の２以上と、
必要に応じて下記の（Ｃ）（Ｄ）のいずれか一方または
両者の１以上を含むことを特徴とする多項目同時判定能
を有する免疫測定用試薬。
（Ａ）、（Ｂ）のいずれか一方または両者の２以上と、
必要に応じて下記の（Ｃ）（Ｄ）のいずれか一方または
両者の１以上を含むことを特徴とする多項目同時判定能
を有する免疫測定用試薬。
（Ａ）非放射性物質標識化抗体
（Ｂ）非放射性物質標識化抗原
（Ｃ）（Ａ）と同種の未標識抗体
（Ｄ）（Ｂ）と同種の未標識抗原
（２）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体が、酵素標識化抗原または酵素標識化抗体である
特許請求の範囲第（１）項記載の多項目同時判定能を有
する免疫測定用試薬。
化抗体が、酵素標識化抗原または酵素標識化抗体である
特許請求の範囲第（１）項記載の多項目同時判定能を有
する免疫測定用試薬。
（３）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体が、蛍光物質標識化抗原または蛍光物質標識化抗
体である特許請求の範囲第（１）項記載の多項目同時判
定能を有する免疫測定用試薬。
化抗体が、蛍光物質標識化抗原または蛍光物質標識化抗
体である特許請求の範囲第（１）項記載の多項目同時判
定能を有する免疫測定用試薬。
（４）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体として非放射性物質標識化抗原微粒子または非放
射性物質標識化抗体微粒子を使用する特許請求の範囲第
（１）〜（３）項記載の多項目同時判定能を有する免疫
測定用試薬。
化抗体として非放射性物質標識化抗原微粒子または非放
射性物質標識化抗体微粒子を使用する特許請求の範囲第
（１）〜（３）項記載の多項目同時判定能を有する免疫
測定用試薬。
（５）微粒子として、赤血球、ゼラチン粒子、またはラ
テックスに代表される合成高分子を用いる特許請求の範
囲第（４）項記載の多項目同時判定能を有する免疫測定
用試薬。
テックスに代表される合成高分子を用いる特許請求の範
囲第（４）項記載の多項目同時判定能を有する免疫測定
用試薬。
（６）測定対象物のそれぞれに特異的に結合する下記の
（Ａ）、（Ｂ）のいずれか一方または両者の２以上と、
必要に応じて下記の（Ｃ）（Ｄ）のいずれか一方または
両者の１以上とを被測定対象物に接触させたものに、均
一系免疫測定法を適用し、得られるシグナルの値から測
定対象物の全てが正常値であるか、測定対象物の少な（
とも１以上が異常値であるかを検出することを特徴とす
る多項目同時判定免疫測定方法。
（Ａ）、（Ｂ）のいずれか一方または両者の２以上と、
必要に応じて下記の（Ｃ）（Ｄ）のいずれか一方または
両者の１以上とを被測定対象物に接触させたものに、均
一系免疫測定法を適用し、得られるシグナルの値から測
定対象物の全てが正常値であるか、測定対象物の少な（
とも１以上が異常値であるかを検出することを特徴とす
る多項目同時判定免疫測定方法。
（Ａ）非放射性物質標識化抗体
（Ｂ）非放射性物質標識化抗原
（Ｃ）（Ａ）と同種の未標識抗体
（Ｄ）（Ｂ）と同種の未標識抗原
（７）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体が、酵素標識化抗原または酵素標識化抗体である
特許請求の範囲第（６）項記載の多項目同時判定免疫測
定方法。
化抗体が、酵素標識化抗原または酵素標識化抗体である
特許請求の範囲第（６）項記載の多項目同時判定免疫測
定方法。
（８）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体が、蛍光物質標識化抗原または蛍光物質標識化抗
体である特許請求の範囲第（６）項記載の多項目同時判
定免疫測定方法。
化抗体が、蛍光物質標識化抗原または蛍光物質標識化抗
体である特許請求の範囲第（６）項記載の多項目同時判
定免疫測定方法。
（９）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体として非放射性物質標識化抗原微粒子または非放
射性物質標識化抗体微粒子を使用する特許請求の範囲第
（６）〜（８）項記載の多項目同時判定免疫測定方法。
化抗体として非放射性物質標識化抗原微粒子または非放
射性物質標識化抗体微粒子を使用する特許請求の範囲第
（６）〜（８）項記載の多項目同時判定免疫測定方法。
（ｌＯ）微粒子として、赤血球、ゼラチン粒子、または
ラテックスに代表される合成高分子を用いる特許請求の
範囲第（９）項記載の多項目同時判定免疫測定方法。
ラテックスに代表される合成高分子を用いる特許請求の
範囲第（９）項記載の多項目同時判定免疫測定方法。
（１１）均一系免疫測定法として免疫比濁法を使用する
特許請求の範囲第（６）項記載の多項目同時判定免疫測
定方法。
特許請求の範囲第（６）項記載の多項目同時判定免疫測
定方法。
生体成分中で診断マーカーとなり得る物質には、疾患時
にその量が増加するものが多い。そしてそれぞれのマー
カーには正常値と異常値を分けるカットオフ値が設けら
れている。前述のホモジニアスイムノアッセイを利用し
、二種類以上の項目に対する測定試薬を混合して用い、
−項目でもカットオフ値を越えた場合に異常値を示す試
薬はスクリーニング試薬となり得る。本発明はこのよう
な概念を具現化する試薬及び方法である。
にその量が増加するものが多い。そしてそれぞれのマー
カーには正常値と異常値を分けるカットオフ値が設けら
れている。前述のホモジニアスイムノアッセイを利用し
、二種類以上の項目に対する測定試薬を混合して用い、
−項目でもカットオフ値を越えた場合に異常値を示す試
薬はスクリーニング試薬となり得る。本発明はこのよう
な概念を具現化する試薬及び方法である。
更に具体的な例を挙げて説明すると、原発性肝癌で値が
上昇することが知られているアルファフニドプロティン
（ＡＦＰ）と、種々の悪性腫瘍で上昇することから主要
マーカーの一つとされているフェリチンを測定項目とし
て選択し、その混合測定試薬を用いて何れかが上昇すれ
ば検出できるようにすれば広く悪性腫瘍を検出できるス
クリーニング法となる訳である。また癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）とＡＦＰの組み合わせと同様に広（悪性腫瘍を検
出できるスクリーニング法となる。他にも成人Ｔ細胞白
血病ウィルス（ＡＴＬＶ）、大免疫不全ウィルス（ＨＩ
Ｖ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の抗原や抗体をマー
カーとして選択し、組み合わせて測定すれば輸血後感染
症に対するスクリーニング法となる等、幅広（使用する
ことができる。
上昇することが知られているアルファフニドプロティン
（ＡＦＰ）と、種々の悪性腫瘍で上昇することから主要
マーカーの一つとされているフェリチンを測定項目とし
て選択し、その混合測定試薬を用いて何れかが上昇すれ
ば検出できるようにすれば広く悪性腫瘍を検出できるス
クリーニング法となる訳である。また癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）とＡＦＰの組み合わせと同様に広（悪性腫瘍を検
出できるスクリーニング法となる。他にも成人Ｔ細胞白
血病ウィルス（ＡＴＬＶ）、大免疫不全ウィルス（ＨＩ
Ｖ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の抗原や抗体をマー
カーとして選択し、組み合わせて測定すれば輸血後感染
症に対するスクリーニング法となる等、幅広（使用する
ことができる。
しかし個々のマーカーのカットオ）値はバラバラであり
、逆に一つの測定法が持つ感度はほぼ一定しているので
、本発明では一つの測定法で種々のカットオフ値に対す
るシグナルの感度をそろえるために、必要に応じて標識
化抗体と未標識抗体を混合して使用する。すなわち正常
値の範囲が広（カットオフ値が高い項目については、そ
の正常領域分の測定物質を吸収できるだけの未標識抗体
を測定試薬に加えておき、抗原が異常領域に入ったなと
きにだけ、得られるシグナルが上昇するように調整する
。また逆に正常値の範囲が狭（、カットオフ値の低い項
目については未標識抗体を加えず、少しの抗原量増加に
対してもシグナルが上昇するように調整する。このよう
にそれぞれのカットオフ値に対応した抗体を加えた標識
抗体試薬を混合して使用すると、どれか−項目でもカッ
トオフ値以上の抗原が存在した場合にはシグナルが高値
を示す。
、逆に一つの測定法が持つ感度はほぼ一定しているので
、本発明では一つの測定法で種々のカットオフ値に対す
るシグナルの感度をそろえるために、必要に応じて標識
化抗体と未標識抗体を混合して使用する。すなわち正常
値の範囲が広（カットオフ値が高い項目については、そ
の正常領域分の測定物質を吸収できるだけの未標識抗体
を測定試薬に加えておき、抗原が異常領域に入ったなと
きにだけ、得られるシグナルが上昇するように調整する
。また逆に正常値の範囲が狭（、カットオフ値の低い項
目については未標識抗体を加えず、少しの抗原量増加に
対してもシグナルが上昇するように調整する。このよう
にそれぞれのカットオフ値に対応した抗体を加えた標識
抗体試薬を混合して使用すると、どれか−項目でもカッ
トオフ値以上の抗原が存在した場合にはシグナルが高値
を示す。
このスクリーニング法を用いるホモニジアスイムノアッ
セイは前述の種々の方法が有効であるが、特開昭５８−
１２２４５９号公報に示されているホモニジアスエンザ
イムイムノアッセイ（均。
セイは前述の種々の方法が有効であるが、特開昭５８−
１２２４５９号公報に示されているホモニジアスエンザ
イムイムノアッセイ（均。
−系酵素免疫測定法）を用いる場合には、例えばペルオ
キシダーゼ標識抗フェリチンと未標識抗フェリチン、そ
れにペルオキシダーゼ標識抗アルファフェトプロティン
を混合した試薬を使用すれば、フェリチンかアルファフ
ェトプロティンがカットオフ値以上になれば酵素基質の
発色の増加から異常を検出できる。またラテックス凝集
法を用いる場合も、ラテックス感作抗フェリチン、抗フ
ェリチン、ラテックス感作抗アルファフェトプロティン
の組み合わせで同様に透過光の減少から異常を検出する
ことができる。更に存在量の多い項目の場合には免疫比
濁法も利用でき、それぞれに対する抗体をカットオフ値
の高い項目は多（、カットオフ値の低い項目は少な（混
合してスクリーニング試薬を作ることができる。
キシダーゼ標識抗フェリチンと未標識抗フェリチン、そ
れにペルオキシダーゼ標識抗アルファフェトプロティン
を混合した試薬を使用すれば、フェリチンかアルファフ
ェトプロティンがカットオフ値以上になれば酵素基質の
発色の増加から異常を検出できる。またラテックス凝集
法を用いる場合も、ラテックス感作抗フェリチン、抗フ
ェリチン、ラテックス感作抗アルファフェトプロティン
の組み合わせで同様に透過光の減少から異常を検出する
ことができる。更に存在量の多い項目の場合には免疫比
濁法も利用でき、それぞれに対する抗体をカットオフ値
の高い項目は多（、カットオフ値の低い項目は少な（混
合してスクリーニング試薬を作ることができる。
〈実施例１〉
（Ａ）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗大アルファー
フェトプロティンの調製 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）５ｍｇを１ｍｊ
２の蒸留水に溶解し、用事調製した０、 １Ｍ メタ
過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を０、２ｒｒ＋ｊ
２加える。室温で２０分間振盪した後、セファデックス
Ｇ−２５カラム（１，５ｘ１２ｃｍカラム、１ｍＭ
酢酸緩衝液、ｐＨ４，２平衡化）を通して脱塩する。得
られたＮ ａ Ｉ Ｏ４処理ＨＲＰ ２ｍＪ２ （４
ｍｇ）を、０．３ＭＮ ａ ＨＣＯｓで調製した６０ｍ
Ｍ テトラメチレンジアミン２ｍρに加える。室温で
２時間振盪反応した後、蒸留水で用事調製した４ ｍ
ｇ ／ ｍβの水素化ホウツナトリウム ０．５ｒｒ＋
１２を加え、４℃で１時間静置した後、０．１５Ｍの食
塩を含む２０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７，０（ＰＢ
Ｓ）に対して透析する。得られたアミノ基導入ＨＲＰを
セフｙクリルＳ−２００カラム（２，５Ｘ９０ｃｍ、Ｐ
ＢＳ平衡化）に通し自己重合していない分画をプールし
濃縮する。
フェトプロティンの調製 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）５ｍｇを１ｍｊ
２の蒸留水に溶解し、用事調製した０、 １Ｍ メタ
過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を０、２ｒｒ＋ｊ
２加える。室温で２０分間振盪した後、セファデックス
Ｇ−２５カラム（１，５ｘ１２ｃｍカラム、１ｍＭ
酢酸緩衝液、ｐＨ４，２平衡化）を通して脱塩する。得
られたＮ ａ Ｉ Ｏ４処理ＨＲＰ ２ｍＪ２ （４
ｍｇ）を、０．３ＭＮ ａ ＨＣＯｓで調製した６０ｍ
Ｍ テトラメチレンジアミン２ｍρに加える。室温で
２時間振盪反応した後、蒸留水で用事調製した４ ｍ
ｇ ／ ｍβの水素化ホウツナトリウム ０．５ｒｒ＋
１２を加え、４℃で１時間静置した後、０．１５Ｍの食
塩を含む２０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７，０（ＰＢ
Ｓ）に対して透析する。得られたアミノ基導入ＨＲＰを
セフｙクリルＳ−２００カラム（２，５Ｘ９０ｃｍ、Ｐ
ＢＳ平衡化）に通し自己重合していない分画をプールし
濃縮する。
次に、ジオキサンで調製した２２ｍＭ Ｎ（４−カル
ボキシシクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ハイド
ロキシスクシンイミドエステル０．１ｍＪ２を、上記ア
ミノ基導入ＨＲＰ １ｍＪ２（３ｍｇ）に加え３０℃
において１時間反応する。反応液を５０ｍＭ リン酸
緩衝液 ｐＨ７゜０で平衡化したセファデックスＧ−２
５カラム（１，５Ｘ１２ｃｍ）に通しマレイミド化ＨＲ
Ｐを得る。
ボキシシクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ハイド
ロキシスクシンイミドエステル０．１ｍＪ２を、上記ア
ミノ基導入ＨＲＰ １ｍＪ２（３ｍｇ）に加え３０℃
において１時間反応する。反応液を５０ｍＭ リン酸
緩衝液 ｐＨ７゜０で平衡化したセファデックスＧ−２
５カラム（１，５Ｘ１２ｃｍ）に通しマレイミド化ＨＲ
Ｐを得る。
一方、２ｍ℃の抗人アルファーフェトプロティン（ＡＦ
Ｐ）の特異抗体Ｆ （ａｂ’ ）２分画（５ｍ ｇ ／
ｍ １２ 、５０ ｍ Ｍ 酢酸緩衝液、ｐＨ５，
０）に、０．１ｍＭの０．２５Ｍ２−メルカプトエチル
アミン液を加え、３７℃において９０分分間光反応を行
う。反応液を５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１，５Ｘ
１２ｃｍ）に通し、抗人ＡＦＰＦａｂ’分画を得る。
Ｐ）の特異抗体Ｆ （ａｂ’ ）２分画（５ｍ ｇ ／
ｍ １２ 、５０ ｍ Ｍ 酢酸緩衝液、ｐＨ５，
０）に、０．１ｍＭの０．２５Ｍ２−メルカプトエチル
アミン液を加え、３７℃において９０分分間光反応を行
う。反応液を５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１，５Ｘ
１２ｃｍ）に通し、抗人ＡＦＰＦａｂ’分画を得る。
マレイミド化ＨＲＰ２ｍｇ （２ｍ℃）と前記抗人ＡＦ
ＰＦａｂ’分画８ｍｇ （３ｍ［）を混合し３０℃にお
いて１時間反応後、更に一夜静置反応させる。反応液を
ＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（２
，５ｘ９０ｃｍ）でゲル口過し、分子量１２万以上のＨ
ＲＰ標識人抗ＡＦＰ分画をプールする。
ＰＦａｂ’分画８ｍｇ （３ｍ［）を混合し３０℃にお
いて１時間反応後、更に一夜静置反応させる。反応液を
ＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（２
，５ｘ９０ｃｍ）でゲル口過し、分子量１２万以上のＨ
ＲＰ標識人抗ＡＦＰ分画をプールする。
（Ｂ）ＨＲＰ標識抗人フェリチンの調製（Ａ）と同様な
方法で、ＨＲＰにテトラメチレンジアミンを結合してア
ミノ基導入ＨＲＰを調製し、更にＮ−（４−カルボキシ
シクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ハイドロキシ
スクシンイミド エステルを結合して、マレイミド基導
入ＨＲＰを調製する。
方法で、ＨＲＰにテトラメチレンジアミンを結合してア
ミノ基導入ＨＲＰを調製し、更にＮ−（４−カルボキシ
シクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ハイドロキシ
スクシンイミド エステルを結合して、マレイミド基導
入ＨＲＰを調製する。
また、抗人フェリチン特異抗体Ｆ （ａｂ’ ） ２分
画も（Ａ）と同様の方法で還元しＦａｂ’分画にする。
画も（Ａ）と同様の方法で還元しＦａｂ’分画にする。
２ｍｇのマレイミド基導入ＨＲＰと８ｍｇの抗人フェリ
チン特異抗体Ｆａｂ’分画を反応させた後、ゲル口過よ
って分子量１２万以上のＨＲＰ標識抗大フェリチン分画
をプールする。
チン特異抗体Ｆａｂ’分画を反応させた後、ゲル口過よ
って分子量１２万以上のＨＲＰ標識抗大フェリチン分画
をプールする。
（Ｃ）フェリチン測定の感度調整
前記（Ｂ）で調整したＨＲＰ標識抗人フェリチンを、３
％ポリエチレングリコール６０００ （ＰＥＧ）を含む
ＰＢＳで希釈し、２μｇ／ｍ℃の濃度に調整する。次に
、大フェリチン標準物の希釈列をＰＢＳで調製する。更
に、抗人フェリチンウサギＩｇＧ（硫安精製物）のＰＥ
Ｇを含むＰＢＳによる希釈列を調整する。ＨＲＰ標識抗
人フェリチンと抗大フェリチンウサギＩｇＧの希釈列を
当量混合し、各濃度未標識抗体を含む標識抗体を調製す
る。人フェリチン標準物の希釈列５０μ℃に上記の標識
抗体試薬１００μβを加え、３７℃において２０分間反
応させる。反応液に酵素基質液（２５ｍＭ フェノー
ル、０．７５ｍＭ４−アミノアンチピリン、３５ｍＭ
過酸化水素水を含むＰＢＳ）０．５ｍＪ２を加え、更
に１０分間反応させ、最後に１．８％ホルムアルデヒド
を含むＰＢＳ ２ｍｇを加えて反応を停止させ、５０
００ｍでの吸光度を測定する。
％ポリエチレングリコール６０００ （ＰＥＧ）を含む
ＰＢＳで希釈し、２μｇ／ｍ℃の濃度に調整する。次に
、大フェリチン標準物の希釈列をＰＢＳで調製する。更
に、抗人フェリチンウサギＩｇＧ（硫安精製物）のＰＥ
Ｇを含むＰＢＳによる希釈列を調整する。ＨＲＰ標識抗
人フェリチンと抗大フェリチンウサギＩｇＧの希釈列を
当量混合し、各濃度未標識抗体を含む標識抗体を調製す
る。人フェリチン標準物の希釈列５０μ℃に上記の標識
抗体試薬１００μβを加え、３７℃において２０分間反
応させる。反応液に酵素基質液（２５ｍＭ フェノー
ル、０．７５ｍＭ４−アミノアンチピリン、３５ｍＭ
過酸化水素水を含むＰＢＳ）０．５ｍＪ２を加え、更
に１０分間反応させ、最後に１．８％ホルムアルデヒド
を含むＰＢＳ ２ｍｇを加えて反応を停止させ、５０
００ｍでの吸光度を測定する。
各濃度フェリチンで得られた吸光度と、Ｏｎ ｇ ／
ｍβのときに得られた吸光度の差を、未標識抗体の含量
別に第１表（巻末）に示す。
ｍβのときに得られた吸光度の差を、未標識抗体の含量
別に第１表（巻末）に示す。
第１表に結果は、未標識抗体の添加量を増やすことによ
り、フェリチン（抗原）を添加しても吸光度差を低く押
さえることができることを示している。
り、フェリチン（抗原）を添加しても吸光度差を低く押
さえることができることを示している。
（Ｄ）ＡＦＰ、フェリチン同時測定スクリーニング試薬
の調製と測定方法 （Ａ）で調製したＨＲＰ標識抗人ＡＦＰと（Ｂ）で調製
したＨＲＰ標識抗人フェリチンをそれぞれ１μｇ／ｍρ
と、抗人フェリチンウサギＩｇＧを力価で７５μｇ ／
ｍ ４２含む測定試薬を、３％ＰＥＧを含むＰＢＳで
調製する。ＡＦＰＩ準物とフェリチン標準物を各濃度含
む検体５０μβに、上記測定試薬１００μβを加え、３
７℃において２０分間反応させる。（Ｃ）で用いた酵素
基質液０．５ｍ℃を加え、更に１０分間反応させる。最
後に１．８％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ２ｍ℃を加
えて反応を停止させ、５００ｎｍの吸光度を測定する。
の調製と測定方法 （Ａ）で調製したＨＲＰ標識抗人ＡＦＰと（Ｂ）で調製
したＨＲＰ標識抗人フェリチンをそれぞれ１μｇ／ｍρ
と、抗人フェリチンウサギＩｇＧを力価で７５μｇ ／
ｍ ４２含む測定試薬を、３％ＰＥＧを含むＰＢＳで
調製する。ＡＦＰＩ準物とフェリチン標準物を各濃度含
む検体５０μβに、上記測定試薬１００μβを加え、３
７℃において２０分間反応させる。（Ｃ）で用いた酵素
基質液０．５ｍ℃を加え、更に１０分間反応させる。最
後に１．８％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ２ｍ℃を加
えて反応を停止させ、５００ｎｍの吸光度を測定する。
各濃度のＡＦＰとフェリチンを含む標準物質を測定して
得られた吸光度と、両者を含まない緩衝液を測定して得
られた吸光度の差を第２表（巻末）に示す。
得られた吸光度と、両者を含まない緩衝液を測定して得
られた吸光度の差を第２表（巻末）に示す。
第２表において、いま２０ ｎ ｇ ／ ｍ １２未満
をＡＦＰの正常値、２００ ｎ ｇ／ｍβ未満をフェリ
チンの正常値とし、このスクリーニング法によるカット
オフ値を吸光度差０．０１５とする。吸光度差がこの値
未満であれば、第２表からＡＦＰは２０ ｎ ｇ ／
ｍβ未満、かつフェリチンは２００ｎｇ／ｍρ未満と判
定できる。逆にＡＦＰが２０ｎｇ ／ ｍ １２以上、
またフェリチンが２００ｎｇ／ｍρ以上であれば吸光度
差は必ず０．０１５を越える。従ってカットオフ値未満
なら、ＡＦＰ、フェリチンともに正常であり、カットオ
フ値以上ならＡＦＰ、フェリチンのいずれかが異常であ
る可能性がある。よってカットオフ値以上の検体のみに
ついてＡＦＰ、フェリチンの単一検査を行えばよいこと
になる。以上をまとめて第３表（巻末）に示す。
をＡＦＰの正常値、２００ ｎ ｇ／ｍβ未満をフェリ
チンの正常値とし、このスクリーニング法によるカット
オフ値を吸光度差０．０１５とする。吸光度差がこの値
未満であれば、第２表からＡＦＰは２０ ｎ ｇ ／
ｍβ未満、かつフェリチンは２００ｎｇ／ｍρ未満と判
定できる。逆にＡＦＰが２０ｎｇ ／ ｍ １２以上、
またフェリチンが２００ｎｇ／ｍρ以上であれば吸光度
差は必ず０．０１５を越える。従ってカットオフ値未満
なら、ＡＦＰ、フェリチンともに正常であり、カットオ
フ値以上ならＡＦＰ、フェリチンのいずれかが異常であ
る可能性がある。よってカットオフ値以上の検体のみに
ついてＡＦＰ、フェリチンの単一検査を行えばよいこと
になる。以上をまとめて第３表（巻末）に示す。
第３表において、検体の大多数はＡＦＰ、フェリチンと
もに正常なので、このスクリーニング法により多くの正
常検体を除くことができる。
もに正常なので、このスクリーニング法により多くの正
常検体を除くことができる。
（Ｅ）大血清検体の測定
（Ｄ）と同様の方法で、ＡＦＰ濃度、フェリチン濃度が
ラジオイムノアッセイ法で測定されている検体を測定し
た。本法による吸光度差とラジオイムノアッセイで得ら
れたＡＦＰ値の関係を第１図に示す。また本法による吸
光度差とフェリチン値の関係を第２図に示す。第１図及
び第２図から、ＡＦＰが２０ ｎ ｇ ／ ｍ １２以
上の場合とフェリチンが２００ ｎ ｇ ／ ｍ １２
以上の場合には必ず０．０１５を越えており、このスク
リーニング法が有効であるといえる。
ラジオイムノアッセイ法で測定されている検体を測定し
た。本法による吸光度差とラジオイムノアッセイで得ら
れたＡＦＰ値の関係を第１図に示す。また本法による吸
光度差とフェリチン値の関係を第２図に示す。第１図及
び第２図から、ＡＦＰが２０ ｎ ｇ ／ ｍ １２以
上の場合とフェリチンが２００ ｎ ｇ ／ ｍ １２
以上の場合には必ず０．０１５を越えており、このスク
リーニング法が有効であるといえる。
なお第２図において、吸光度差が異常に高い３点は、Ａ
ＦＰが夫々９９００．１０５００．１８６００ｎｇ／ｍ
βと非常に高い検体であった。
ＦＰが夫々９９００．１０５００．１８６００ｎｇ／ｍ
βと非常に高い検体であった。
〈発明の効果〉
この発明は以上のように構成したから、健常者（血液、
尿等の生体成分中の疾患の指標となる二種以上の微量成
分のうちいずれにも以上がないもの）と異常者（少なく
ともいずれかの項目に異常を有するもの）を速やかに識
別することができるという効果を有し、特に集団検診等
における検査の省力化に役立つ。
尿等の生体成分中の疾患の指標となる二種以上の微量成
分のうちいずれにも以上がないもの）と異常者（少なく
ともいずれかの項目に異常を有するもの）を速やかに識
別することができるという効果を有し、特に集団検診等
における検査の省力化に役立つ。
第１図は、本法による吸光度差とラジオイムノアッセイ
で得られたＡＦＰ値の関係を示す図、また第２図は、本
法による吸光度差とフェリチン値の関係を示す図である
。 嗅（ズ１戻 オＬ （５（ｊＯＩＩ−）： Ｓ
で得られたＡＦＰ値の関係を示す図、また第２図は、本
法による吸光度差とフェリチン値の関係を示す図である
。 嗅（ズ１戻 オＬ （５（ｊＯＩＩ−）： Ｓ
Claims (11)
- （１）測定対象物のそれぞれに特異的に結合する下記の
（Ａ）、（Ｂ）のいずれか一方または両者の２以上と、
必要に応じて下記の（Ｃ）、（Ｄ）のいずれか一方また
は両者の１以上を含むことを特徴とする多項目同時判定
能を有する免疫測定用試薬。 （Ａ）非放射性物質標識化抗体 （Ｂ）非放射性物質標識化抗原 （Ｃ）（Ａ）と同種の未標識抗体 （Ｄ）（Ｂ）と同種の未標識抗原 - （２）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体が、酵素標識化抗原または酵素標識化抗体である
特許請求の範囲第（１）項記載の多項目同時判定能を有
する免疫測定用試薬。 - （３）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体が、蛍光物質標識化抗原または蛍光物質標識化抗
体である特許請求の範囲第（１）項記載の多項目同時判
定能を有する免疫測定用試薬。 - （４）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体として非放射性物質標識化抗原微粒子または非放
射性物質標識化抗体微粒子を使用する特許請求の範囲第
（１）〜（３）項記載の多項目同時判定能を有する免疫
測定用試薬。 - （５）微粒子として、赤血球、ゼラチン粒子、またはラ
テックスに代表される合成高分子を用いる特許請求の範
囲第（４）項記載の多項目同時判定能を有する免疫測定
用試薬。 - （６）測定対象物のそれぞれに特異的に結合する下記の
（Ａ）、（Ｂ）のいずれか一方または両者の２以上と、
必要に応じて下記の（Ｃ）、（Ｄ）のいずれか一方また
は両者の１以上とを被測定対象物に接触させたものに、
均一系免疫測定法を適用し、得られるシグナルの値から
測定対象物の全てが正常値であるか、測定対象物の少な
くとも１以上が異常値であるかを検出することを特徴と
する多項目同時判定免疫測定方法。 （Ａ）非放射性物質標識化抗体 （Ｂ）非放射性物質標識化抗原 （Ｃ）（Ａ）と同種の未標識抗体 （Ｄ）（Ｂ）と同種の未標識抗原 - （７）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体が、酵素標識化抗原または酵素標識化抗体である
特許請求の範囲第（６）項記載の多項目同時判定免疫測
定方法。 - （８）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体が、蛍光物質標識化抗原または蛍光物質標識化抗
体である特許請求の範囲第（６）項記載の多項目同時判
定免疫測定方法。 - （９）非放射性物質標識化抗原または非放射性物質標識
化抗体として非放射性物質標識化抗原微粒子または非放
射性物質標識化抗体微粒子を使用する特許請求の範囲第
（６）〜（８）項記載の多項目同時判定免疫測定方法。 - （１０）微粒子として、赤血球、ゼラチン粒子、または
ラテックスに代表される合成高分子を用いる特許請求の
範囲第（９）項記載の多項目同時判定免疫測定方法。 - （１１）均一系免疫測定法として免疫比濁法を使用する
特許請求の範囲第（６）項記載の多項目同時判定免疫測
定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33621989A JPH03197866A (ja) | 1989-12-27 | 1989-12-27 | 多項目同時判定能を有する免疫測定用試薬及び多項目同時判定免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33621989A JPH03197866A (ja) | 1989-12-27 | 1989-12-27 | 多項目同時判定能を有する免疫測定用試薬及び多項目同時判定免疫測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03197866A true JPH03197866A (ja) | 1991-08-29 |
Family
ID=18296868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33621989A Pending JPH03197866A (ja) | 1989-12-27 | 1989-12-27 | 多項目同時判定能を有する免疫測定用試薬及び多項目同時判定免疫測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03197866A (ja) |
-
1989
- 1989-12-27 JP JP33621989A patent/JPH03197866A/ja active Pending
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