JPH0320237B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトインシユリンと同一の一次構造
を有するインシユリン（以下、「ヒト型インシユ
リン」と称する）の製造法に係り、詳しくはブ
タ、マツコウクジラ等のインシユリンからヒト型
インシユリンを半合成する方法に関する。
を有するインシユリン（以下、「ヒト型インシユ
リン」と称する）の製造法に係り、詳しくはブ
タ、マツコウクジラ等のインシユリンからヒト型
インシユリンを半合成する方法に関する。
インシユリンは、糖尿病治療剤として、ウシ、
ブタ、クジラ、カツオなどから工業的に生産され
利用されているタンパク性ホルモンである。ヒト
および大部分の高等動物のインシユリンは、Ａ鎖
と呼ばれる21個のアミノ酸から成るペプチド鎖と
Ｂ鎖と呼ばれる30個のアミノ酸から成るペプチド
鎖とを有し、Ａ鎖とＢ鎖との間は２本のジスルフ
イド結合（−Ｓ−Ｓ−）により結合されている。
また、Ａ鎖中には１本のジスルフイド結合が存在
する。各ペプチド鎖を構成するアミノ酸およびそ
の配列は動物の種属によつて異なるが、ヒトイン
シユリンとブタ、マツコウクジラ、ナガスクジ
ラ、ウサギのインシユリンとは極めて類似した構
造を有している。図面は、ヒトインシユリンの１
次構造を示すものであるが、Ｂ鎖Ｃ端（B30）の
アミノ酸残基がヒトではスレオニン（Thr）であ
るのに対し、ブタ、マツコウクジラ、ナガスクジ
ラではアラニン（Ala）であり、ウサギではセリ
ン（Ser）である点のみが異なる。
ブタ、クジラ、カツオなどから工業的に生産され
利用されているタンパク性ホルモンである。ヒト
および大部分の高等動物のインシユリンは、Ａ鎖
と呼ばれる21個のアミノ酸から成るペプチド鎖と
Ｂ鎖と呼ばれる30個のアミノ酸から成るペプチド
鎖とを有し、Ａ鎖とＢ鎖との間は２本のジスルフ
イド結合（−Ｓ−Ｓ−）により結合されている。
また、Ａ鎖中には１本のジスルフイド結合が存在
する。各ペプチド鎖を構成するアミノ酸およびそ
の配列は動物の種属によつて異なるが、ヒトイン
シユリンとブタ、マツコウクジラ、ナガスクジ
ラ、ウサギのインシユリンとは極めて類似した構
造を有している。図面は、ヒトインシユリンの１
次構造を示すものであるが、Ｂ鎖Ｃ端（B30）の
アミノ酸残基がヒトではスレオニン（Thr）であ
るのに対し、ブタ、マツコウクジラ、ナガスクジ
ラではアラニン（Ala）であり、ウサギではセリ
ン（Ser）である点のみが異なる。
したがつて、ブタ、マツコウクジラ、ナガスク
ジラ、ウサギ等のインシユリン（以下、「ブタ型
インシユリン」と総称する）のＢ鎖Ｃ端にあるア
ミノ酸残基をThrに置換すればヒトインシユリン
と同じ一次構造のヒト型インシユリンを合成する
ことができる。かかるヒト型インシユリンは、従
来異種動物から得られていたインシユリン製剤よ
りも抗原性が少なく、安全性の高いインシユリン
製剤の製造を実現するものである。
ジラ、ウサギ等のインシユリン（以下、「ブタ型
インシユリン」と総称する）のＢ鎖Ｃ端にあるア
ミノ酸残基をThrに置換すればヒトインシユリン
と同じ一次構造のヒト型インシユリンを合成する
ことができる。かかるヒト型インシユリンは、従
来異種動物から得られていたインシユリン製剤よ
りも抗原性が少なく、安全性の高いインシユリン
製剤の製造を実現するものである。
従来においても、上記事実に着目してブタ型イ
ンシユリンからヒト型インシユリンを製造する試
みは行われたが、それらのほとんどはインシユリ
ンのＢ鎖中にトリプシンによつて開裂させられる
アルギニン−グリシン（Arg−Gly）結合（B22−
B23）が存在することを利用してデスオクタペプ
チド−B23〜B30−インシユリン（「DOI」という）
を製造し、これを原料としてヒト型インシユリン
のオクタペプチド（B23〜B30）と縮合させてヒ
ト型インシユリンを製造するものであつた。これ
ら、従来において提案された製造方法は、それぞ
れの時代の技術水準に制約されてアミノ基やカル
ボキシル基の保護技術が問題になるなど必ずしも
満足すべきものではなかつた。特に、中間生成物
としてDOIを経由するため、これと縮合させるオ
クタペプチドの合成が必要となる。しかし、この
オクタペプチドを効率よく合成することは技術的
な困難を伴つた。また、DOIの製造段階で用いた
トリプシンの残渣がオクタペプチドトと縮合段階
で及ぼす悪影響も懸念された。
ンシユリンからヒト型インシユリンを製造する試
みは行われたが、それらのほとんどはインシユリ
ンのＢ鎖中にトリプシンによつて開裂させられる
アルギニン−グリシン（Arg−Gly）結合（B22−
B23）が存在することを利用してデスオクタペプ
チド−B23〜B30−インシユリン（「DOI」という）
を製造し、これを原料としてヒト型インシユリン
のオクタペプチド（B23〜B30）と縮合させてヒ
ト型インシユリンを製造するものであつた。これ
ら、従来において提案された製造方法は、それぞ
れの時代の技術水準に制約されてアミノ基やカル
ボキシル基の保護技術が問題になるなど必ずしも
満足すべきものではなかつた。特に、中間生成物
としてDOIを経由するため、これと縮合させるオ
クタペプチドの合成が必要となる。しかし、この
オクタペプチドを効率よく合成することは技術的
な困難を伴つた。また、DOIの製造段階で用いた
トリプシンの残渣がオクタペプチドトと縮合段階
で及ぼす悪影響も懸念された。
そこで本発明の目的は、トリプシンに代わる酵
素としてＢ鎖のPro（プロリン）−Lys（リジン）
（B28−B29）結合に特異的に作用する酵素を用い
てペプチド結合を切断し、更に同一酵素を用いて
ペプチド結合を生成せしめることにより、効率の
よいヒト型インシユリン製造法を提供することに
ある。本発明ではペプチド結合の開裂と生成に同
一酵素を使用するため、異種酵素又は触媒の悪影
響の恐れは全くなくなつた。また、生成工程で用
いるペプチドは短いジペプチド（Lys−Thr）で
あるため合成が容易であり、そのため本発明の製
造法は極めて実用性の高いものとなつた。
素としてＢ鎖のPro（プロリン）−Lys（リジン）
（B28−B29）結合に特異的に作用する酵素を用い
てペプチド結合を切断し、更に同一酵素を用いて
ペプチド結合を生成せしめることにより、効率の
よいヒト型インシユリン製造法を提供することに
ある。本発明ではペプチド結合の開裂と生成に同
一酵素を使用するため、異種酵素又は触媒の悪影
響の恐れは全くなくなつた。また、生成工程で用
いるペプチドは短いジペプチド（Lys−Thr）で
あるため合成が容易であり、そのため本発明の製
造法は極めて実用性の高いものとなつた。
本発明のヒト型インシユリンの製造法は、ブタ
型インシユリンを該インシユリンのＢ鎖のPro−
Lys結合に特異性に作用する酵素の存在下で加水
分解しデスジペプチド−B29、B30−インシユリ
ン（以下、「DDI」と略記）を製造する工程と、
X2−デスジペプチド−B29、B30−インシユリン
（以下、「X2−DDI」と略記）とN〓−Ｘ−Lys−
Thr（Ｘは、プロトンソルボリシス的又はβ−脱
離により分解し得るアミノ保護基を表す）とを前
記工程と同一の酵素の存在下で縮合させる工程と
を含むことを特徴としている。
型インシユリンを該インシユリンのＢ鎖のPro−
Lys結合に特異性に作用する酵素の存在下で加水
分解しデスジペプチド−B29、B30−インシユリ
ン（以下、「DDI」と略記）を製造する工程と、
X2−デスジペプチド−B29、B30−インシユリン
（以下、「X2−DDI」と略記）とN〓−Ｘ−Lys−
Thr（Ｘは、プロトンソルボリシス的又はβ−脱
離により分解し得るアミノ保護基を表す）とを前
記工程と同一の酵素の存在下で縮合させる工程と
を含むことを特徴としている。
本発明で使用する「ブタ型インシユリンＢ鎖の
Pro−Lys結合に特異的に作用する酵素」（以下、
「本発明酵素」と略称する）としては、次のもの
を挙げることができる。
Pro−Lys結合に特異的に作用する酵素」（以下、
「本発明酵素」と略称する）としては、次のもの
を挙げることができる。
(1) Ｒ、ワルター（Ｒ、Walter）が小羊の腎臓
から分離し、Biochimica et Biophysica
Acta、422（1976）138−158に報告したペプチ
ダーゼ（Post−proline cleaving enzyme）。
から分離し、Biochimica et Biophysica
Acta、422（1976）138−158に報告したペプチ
ダーゼ（Post−proline cleaving enzyme）。
(2) フラボバクテリウム属中のある種の菌により
生産されるペプチダーゼ（Post−proline
cleaving enzyme）で次のような酵素学的性質
を有するもの。
生産されるペプチダーゼ（Post−proline
cleaving enzyme）で次のような酵素学的性質
を有するもの。
作用および基質特異性
特定のプロリン関与ペプチド結合に特異的
に作用し、分解する働きがある。
に作用し、分解する働きがある。
ａ 分解されるもの（↓は、分解する結合を
示す） Ｚ−Gly−Pro−↓２−NNap Ｚ−Ala−↓Pro−２−NNap Ｚ−Gly−Pro−↓ONp Ｚ−Gly−Pro−↓MCA Ｚ−Gly−Pro−↓Ala Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly Ｚ−Gly−Pro−↓Leu Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Ala Ｚ−Gly−Pro−↓Phe Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Ｄ−Ala Pht−Gly−Pro−↓Leu−Gly Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly−Gly For−Gly−Pro−↓Leu−Gly Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly−Ala Thr−Lys−Pro−↓Arg Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly−Pro Cys−Tyr−Phe−Gln−Asn−Cys−Pro
−↓Arg−Gly−NH2 Cys−Tyr−Ile−Gln−Asn−Cys−Pro−↓
Leu−Gly−NH2 ｂ 分解されないもの Gly−Pro−２−NNap Ｚ−Pro−２−
NNap Pro−２−NNap Gly−Pro−Leu
−Gly Ｚ−Gly−Pro−Ｄ−Ala Ｚ−Ala
−Gly−Pro Ｚ−Pro−Leu Gly−Pro
Gly−Pro−Ala Leu−Gly Gly−Gly−
Gly Ｚ−Gly−Phe 上式中、Ｚはカル
ボベゾンキシ基、２−NNapはβ−ナフチ
ルアミド（naphthylamide）、ONpはｐ−
ニトロフエニールエステル、Phtはフタリ
ール基（phthalyl）、Forはホルミル基
（formyl）をそれぞれ表す。
示す） Ｚ−Gly−Pro−↓２−NNap Ｚ−Ala−↓Pro−２−NNap Ｚ−Gly−Pro−↓ONp Ｚ−Gly−Pro−↓MCA Ｚ−Gly−Pro−↓Ala Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly Ｚ−Gly−Pro−↓Leu Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Ala Ｚ−Gly−Pro−↓Phe Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Ｄ−Ala Pht−Gly−Pro−↓Leu−Gly Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly−Gly For−Gly−Pro−↓Leu−Gly Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly−Ala Thr−Lys−Pro−↓Arg Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly−Pro Cys−Tyr−Phe−Gln−Asn−Cys−Pro
−↓Arg−Gly−NH2 Cys−Tyr−Ile−Gln−Asn−Cys−Pro−↓
Leu−Gly−NH2 ｂ 分解されないもの Gly−Pro−２−NNap Ｚ−Pro−２−
NNap Pro−２−NNap Gly−Pro−Leu
−Gly Ｚ−Gly−Pro−Ｄ−Ala Ｚ−Ala
−Gly−Pro Ｚ−Pro−Leu Gly−Pro
Gly−Pro−Ala Leu−Gly Gly−Gly−
Gly Ｚ−Gly−Phe 上式中、Ｚはカル
ボベゾンキシ基、２−NNapはβ−ナフチ
ルアミド（naphthylamide）、ONpはｐ−
ニトロフエニールエステル、Phtはフタリ
ール基（phthalyl）、Forはホルミル基
（formyl）をそれぞれ表す。
作用至適PH 7.0
安定PHの範囲 5.0〜9.0
作用至適温度 40℃
熱安定性 42℃以下
阻害作用 すい臓性およびリマビーン性ト
リプシンインヒビター、けい卵白性オボムコ
イド、ペプスタチン等によつて阻害されな
い。
リプシンインヒビター、けい卵白性オボムコ
イド、ペプスタチン等によつて阻害されな
い。
分子量 約78000
等電点 PH9.1
上記酵素の生産菌としては、例えばフラボバ
クテリウム メニンゴセプテイカム
（Flavobacterium meningosepticum）
IFO12535、フラボバクテリウムTY−78−74
（Flavobacterium TY−78−74）微工研菌寄
第4849号がある。
クテリウム メニンゴセプテイカム
（Flavobacterium meningosepticum）
IFO12535、フラボバクテリウムTY−78−74
（Flavobacterium TY−78−74）微工研菌寄
第4849号がある。
フラボバクテリウムTY−78−74は、下記
〜に示す菌学的性質を有する。
〜に示す菌学的性質を有する。
形態
１ 細胞の形：桿菌
２ 運動性：なし
３ グラム染色：−
生育
１ 肉汁寒天平板培養：＋
２ 肉汁寒天斜面培養：＋
３ 肉汁液体培養：＋
生理学的性質
１ 硝酸塩の還元：＋
２ インドールの生成：＋
３ 硫化水素の生成：−
４ デンプンの分解：−
５ 無機窒素源の利用：−
６ 色素の生成：黄色
７ ウレアーゼ：＋
８ オキシダーゼ：＋
９ カタラーゼ：＋
10 生育の温度範囲：20〜40℃
11 酸素：好気性
12 OFテスト：０または＋
13 ガスの発生
ａ Ｌ−アラビノース：−
ｂ Ｄ−キシロース：−
ｃ Ｄ−グルコース：＋
ｄ しよ糖：−
ｅ 乳糖：＋
ｆ Ｄ−マンニツト：＋
ｇ デンプン：−
(3) ウイリアムＧ、ルイス（William G.Lewis）
らがバジデイオミセテ アルミラリア メレア
（basidiomycete Armillaria mellea）から分
離して、アルミラリア メレアプロテアーゼと
称し、Biochimica et Biophysica Acta、522
（1978）551−560に報告しているペプチダーゼ。
らがバジデイオミセテ アルミラリア メレア
（basidiomycete Armillaria mellea）から分
離して、アルミラリア メレアプロテアーゼと
称し、Biochimica et Biophysica Acta、522
（1978）551−560に報告しているペプチダーゼ。
(4) M.ウインガード（M.Wingard）ほかがJ.
Bacteriol.112（1972）940に報告しているミク
ソバクターAL−１プロテアーゼ
（Myxobacter AL−1protease）。
Bacteriol.112（1972）940に報告しているミク
ソバクターAL−１プロテアーゼ
（Myxobacter AL−1protease）。
ブタ型インシユリンのＢ鎖のPro−Lysを本発
明酵素の存在下に開裂せしめる反応は、通常通り
水性媒体中にて４〜48時間行い、温度は30〜40
℃、PHは７〜９が適当である。使用する酵素ごと
のより好ましい条件は、前記(1)の小羊の腎臓から
分離したペプチダーゼの場合は30〜40℃、PH7.5
〜8.0であり、(2)の酵素の場合には、30〜40℃、
PH7.0〜8.0である。また(3)のアルミラリア メレ
ア プロテアーゼの場合は、30〜40℃、PH7.0〜
8.0が望ましい。この工程によりブタ型インシユ
リンのＢ鎖Ｃ端のジペプチドLys−Ala又はLys
−Serは主鎖から切断され、DDIが生成する。こ
うして得られた反応生成物をセフアデツクスＧ−
50（商品名、フアルマシア社製）等のカラムに負
荷し、Lys−Ala又はLys−Serを分別し、DDI画
分を集める。
明酵素の存在下に開裂せしめる反応は、通常通り
水性媒体中にて４〜48時間行い、温度は30〜40
℃、PHは７〜９が適当である。使用する酵素ごと
のより好ましい条件は、前記(1)の小羊の腎臓から
分離したペプチダーゼの場合は30〜40℃、PH7.5
〜8.0であり、(2)の酵素の場合には、30〜40℃、
PH7.0〜8.0である。また(3)のアルミラリア メレ
ア プロテアーゼの場合は、30〜40℃、PH7.0〜
8.0が望ましい。この工程によりブタ型インシユ
リンのＢ鎖Ｃ端のジペプチドLys−Ala又はLys
−Serは主鎖から切断され、DDIが生成する。こ
うして得られた反応生成物をセフアデツクスＧ−
50（商品名、フアルマシア社製）等のカラムに負
荷し、Lys−Ala又はLys−Serを分別し、DDI画
分を集める。
次に、DDIのＡ、Ｂ両鎖のＮ端にあるアミノ基
を常法に従つて、第３ブチルオキシカルボニル残
基（BOC）−、第３アミルオキシカルボニル残基
（AOC）−、メチルスルホニルエチルオキシカル
ボニル残基（MSC）−等プロトンソルボリシス的
又はβ脱離により分解し得るアミノ保護基（Ｘ）
によつて保護し、X2−DDIとする。
を常法に従つて、第３ブチルオキシカルボニル残
基（BOC）−、第３アミルオキシカルボニル残基
（AOC）−、メチルスルホニルエチルオキシカル
ボニル残基（MSC）−等プロトンソルボリシス的
又はβ脱離により分解し得るアミノ保護基（Ｘ）
によつて保護し、X2−DDIとする。
次いで、X2−DDIとN〓−Ｘ−Lys−Thrとの縮
合反応を、前記開裂工程と同一の酵素存在下で起
させる。この場合、酵素がトランスペプチダーゼ
活性を現し、平衡が合成方向へ傾斜するように反
応条件を選択する必要がある。その条件として
は、N〓−Ｘ−Lys−ThrをX2−DDIに対し過剰量
即ち約10倍モル量以上存在させること、反応物濃
度を可能な限り高くすること、反応生成物は速や
かに反応系外へ排除することが重要である。具体
例としては、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジ
メチルスルホキシド（DMSO）、メタノール等の
ような有機溶媒を反応媒体である水に添加するこ
とが挙げられる。有機溶媒添加の割合は40〜60％
が好ましい。また、温度は30〜40℃、PH６〜７が
好ましい。
合反応を、前記開裂工程と同一の酵素存在下で起
させる。この場合、酵素がトランスペプチダーゼ
活性を現し、平衡が合成方向へ傾斜するように反
応条件を選択する必要がある。その条件として
は、N〓−Ｘ−Lys−ThrをX2−DDIに対し過剰量
即ち約10倍モル量以上存在させること、反応物濃
度を可能な限り高くすること、反応生成物は速や
かに反応系外へ排除することが重要である。具体
例としては、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジ
メチルスルホキシド（DMSO）、メタノール等の
ような有機溶媒を反応媒体である水に添加するこ
とが挙げられる。有機溶媒添加の割合は40〜60％
が好ましい。また、温度は30〜40℃、PH６〜７が
好ましい。
以下、実施例に基いて一層詳細に説明する。
実施例 １
(イ) ブタインシユリン570mg（100μmole）および
フラボバクテリウムメニンゴセプテイカム
IFO12535より得られた前述(2)のペプチダーゼ
0.6mg／10.5U）を0.05Mリン酸塩緩衝液（PH
8.0）30mlに溶かし、30℃、20時間反応させた。
次いで氷冷後3NHClでPH２とし、セフアデツ
クスＧ−50カラム（カラムサイズ4.0×140cm、
0.01M HClで溶出、流速87.2ml／hr）に負荷
し、使用したプロリンペプチダーゼおよび生成
したLys−Alaを分別し、第1040ml〜1530mlに
溶出されたインシユリン残留画分490mlを集め、
凍結乾燥し495mg（90μmole、収率90％）を得
た。
フラボバクテリウムメニンゴセプテイカム
IFO12535より得られた前述(2)のペプチダーゼ
0.6mg／10.5U）を0.05Mリン酸塩緩衝液（PH
8.0）30mlに溶かし、30℃、20時間反応させた。
次いで氷冷後3NHClでPH２とし、セフアデツ
クスＧ−50カラム（カラムサイズ4.0×140cm、
0.01M HClで溶出、流速87.2ml／hr）に負荷
し、使用したプロリンペプチダーゼおよび生成
したLys−Alaを分別し、第1040ml〜1530mlに
溶出されたインシユリン残留画分490mlを集め、
凍結乾燥し495mg（90μmole、収率90％）を得
た。
(ロ) このインシユリン残留画分495mgをジメチル
ホルムアミド65ml、トリエチルアミン108mg、
Boc−N3（ｔ−Butyloxycarbonyl−azide）4.3
ｇに溶かし、40℃、１時間撹拌して反応させ、
エーテルで沈殿させることにより（Boc）2−イ
ンシユリン残留画分結合体510mg（90μmole、
収率100％）を得た。
ホルムアミド65ml、トリエチルアミン108mg、
Boc−N3（ｔ−Butyloxycarbonyl−azide）4.3
ｇに溶かし、40℃、１時間撹拌して反応させ、
エーテルで沈殿させることにより（Boc）2−イ
ンシユリン残留画分結合体510mg（90μmole、
収率100％）を得た。
(ハ) 合成反応
() 上記結合物510mg（90μmole）とN〓−Boc
−Lys−Thr315mg（900μmole）を0.05M
NH4HCO3に溶解後凍結乾燥した。
−Lys−Thr315mg（900μmole）を0.05M
NH4HCO3に溶解後凍結乾燥した。
() この凍結乾燥物をDMF（ジメチルホルム
アミド）1.7mlに溶解した後、0.25Mトリス
塩酸緩衝液1.7mlを加えてPH6.5とした。
アミド）1.7mlに溶解した後、0.25Mトリス
塩酸緩衝液1.7mlを加えてPH6.5とした。
() (イ)で用いたと同じペプチダーゼ７mg
（122.5U）を反応開始時および８時間目にそ
れぞれ3.5mgずつ加え、37℃で24時間反応さ
せた。
（122.5U）を反応開始時および８時間目にそ
れぞれ3.5mgずつ加え、37℃で24時間反応さ
せた。
() 0.4M HClを0.7ml加えて酸性（PH3.5）と
し、反応を停止させ、セフアデツクスLH−
20カラム（カラムサイズ2.5×96.0cm）に負
荷し、DMF−0.5M酢酸（１：１）溶液で溶
出（流速23.4ml／hr）してクロマト分画を行
なう。このクロマト分画により反応に関与し
なかつた残存N〓−Boc−Lys−Thr280mgが
回収された（回収率89％）。
し、反応を停止させ、セフアデツクスLH−
20カラム（カラムサイズ2.5×96.0cm）に負
荷し、DMF−0.5M酢酸（１：１）溶液で溶
出（流速23.4ml／hr）してクロマト分画を行
なう。このクロマト分画により反応に関与し
なかつた残存N〓−Boc−Lys−Thr280mgが
回収された（回収率89％）。
() 生成した（Boc）3−インシユリンをTFA
（トリフルオル酢酸）５mlとアニソール１ml
から成る混液と０℃、60分反応させ、Boc基
を離脱させた。
（トリフルオル酢酸）５mlとアニソール１ml
から成る混液と０℃、60分反応させ、Boc基
を離脱させた。
() 生成したインシユリンを0.02M酢酸アン
モニウム緩衝液PH7.6で緩衝化したDEAE−
セフアデツクスＡ−25カラム（カラムサイズ
2.0×42cm）に負荷し、酢酸アンモニウム緩
衝液を直線的に高めて溶出し分画精製する。
モニウム緩衝液PH7.6で緩衝化したDEAE−
セフアデツクスＡ−25カラム（カラムサイズ
2.0×42cm）に負荷し、酢酸アンモニウム緩
衝液を直線的に高めて溶出し分画精製する。
ヒト型インシユリン収量260mg（収率50％）
インシユリン残留画分収量190mg（収率
37％） (ニ) 製造したヒト型インシユリンと天然のヒトイ
ンシユリンとを比較同定を次の方法で行つた。
37％） (ニ) 製造したヒト型インシユリンと天然のヒトイ
ンシユリンとを比較同定を次の方法で行つた。
() アミノ酸組成分析
() HPLC（高速液体クロマトグラフイ）
() ポリアクリルアミド ゲル電気泳動
() 生物試験：血糖降下作用、等
いずれの結果も、両者の間に顕著な差異がない
ことを示した。
ことを示した。
実施例 ２
(イ) マツコウクジラインシユリン60mgおよび小羊
の腎臓より得た前述(1)のペプチダーゼ0.4mg
（6.0U）を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（PH7.5）
６mlに溶かし、40℃で35時間反応させた後、氷
冷し、氷酢酸でPH2.6とし、セフアデツクスＧ
−50カラム（カラムサイズ2.5×96cm、流速
23.4ml／hrで、0.5M酢酸で溶出）に負荷し、
分子篩クロマトによりインシユリン残留画分
（第280ml〜420mlに溶出された140ml）を集め凍
結乾燥して44mg（収率80％）を得た。
の腎臓より得た前述(1)のペプチダーゼ0.4mg
（6.0U）を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（PH7.5）
６mlに溶かし、40℃で35時間反応させた後、氷
冷し、氷酢酸でPH2.6とし、セフアデツクスＧ
−50カラム（カラムサイズ2.5×96cm、流速
23.4ml／hrで、0.5M酢酸で溶出）に負荷し、
分子篩クロマトによりインシユリン残留画分
（第280ml〜420mlに溶出された140ml）を集め凍
結乾燥して44mg（収率80％）を得た。
(ロ) 常法によりBoc−N3を用い（Boc）2−インシ
ユリン残留画分結合体を合成した。
ユリン残留画分結合体を合成した。
収率45mg（収率100％）
(ハ) 上記結合体45mgとN〓−Boc−Lys−Thr22mg
を0.05M NH4HCO3に溶解後凍結乾燥し、
DMSO（ジメチルスルホキシド）0.2mlに溶解後
0.25Mトリス−塩酸緩衝液0.2mlを加え（PH6.5
とする）、この溶液に(イ)で用いたと同じペプチ
ダーゼ4.6mgを反応開始時および６時間目にそ
れぞれ2.3mgずつ加え、40℃で24時間反応させ
た。
を0.05M NH4HCO3に溶解後凍結乾燥し、
DMSO（ジメチルスルホキシド）0.2mlに溶解後
0.25Mトリス−塩酸緩衝液0.2mlを加え（PH6.5
とする）、この溶液に(イ)で用いたと同じペプチ
ダーゼ4.6mgを反応開始時および６時間目にそ
れぞれ2.3mgずつ加え、40℃で24時間反応させ
た。
反応液に0.4M HClを0.1ml加えて酸性とした
後、セフアデツクスLH−20カラム（1.6×96.0
cm）を用いDMSO−0.5M酢酸（１：１）溶液
でクロマト分画を行なう。得られた（Boc）3−
インシユリンをTFA／アニソールで処理した
後、0.02Mトリス−塩酸緩衝液PH8.0で緩衝化
したDEAE−セルロースカラム（カラムサイズ
1.6×17cm）に負荷し、NaCl濃度を直線的に高
めて（0M→0.6M）溶出分画し、ヒト型インシ
ユリンを得た。
後、セフアデツクスLH−20カラム（1.6×96.0
cm）を用いDMSO−0.5M酢酸（１：１）溶液
でクロマト分画を行なう。得られた（Boc）3−
インシユリンをTFA／アニソールで処理した
後、0.02Mトリス−塩酸緩衝液PH8.0で緩衝化
したDEAE−セルロースカラム（カラムサイズ
1.6×17cm）に負荷し、NaCl濃度を直線的に高
めて（0M→0.6M）溶出分画し、ヒト型インシ
ユリンを得た。
ヒト型インシユリン収量19mg（収率41％）
インシユリン残留画分収量20mg（収率45
％） (ニ) 製造したヒト型インシユリンと天然のヒトイ
ンシユリンとを比較同定を次の方法で行つた。
％） (ニ) 製造したヒト型インシユリンと天然のヒトイ
ンシユリンとを比較同定を次の方法で行つた。
() アミノ酸組成分析
() HPLC（高速液体クロマトグラフイ）
() ポリアクリルアミド ゲル電気泳動
() 生物試験：血糖降下作用、等
いずれの結果も、両者の間に顕著な差異がない
ことを示した。
ことを示した。
図面はヒトインシユリンの１次構造を表す図で
ある。
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ブタ型インシユリンのＢ鎖のPro−Lys結
合に特異的に作用する 小羊の腎臓から分離したペプチターゼ、 フラボバクテリウム・メニンゴセプテイカ
ムIFO 12535もしくはフラボバクテリウムTY
−78−74により産生される次の酵素学的性質を
有するペプチターゼ、 Ａ 作用および基質特異性 特定のプロリン関与ペプチド結合に特異的
に作用する。 ａ 分解されるもの（↓は、分解する結合を
示す） Ｚ−Gly−Pro−↓−2NNap Ｚ−Ala−Pro−↓２−NNap Ｚ−Gly−Pro−↓ONp Ｚ−Gly−Pro−↓MCA Ｚ−Gly−Pro−↓Ala Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly Ｚ−Gly−Pro−↓Leu Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Ala Ｚ−Gly−Pro−↓Phe Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Ｄ−Ala Pht−Gly−Pro−↓Leu−Gly Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly−Gly For−Gly−Pro−↓Leu−Gly Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly−Ala Thr−Lys−Pro−↓Arg Ｚ−Gly−Pro−↓Leu−Gly−Pro Cys−Tyr−Phe−Gln−Asn−Cys−Pro
−↓Arg−Gly−NH2 Cys−Tyr−Ile−Gln−Asn−Cys−Pro−↓
Leu−Gly−NH2 ｂ 分解されないもの Gly−Pro−２−NNap Ｚ−Pro−２−
NNap Pro−２−NNap Gly−Pro−Leu
−Gly Ｚ−Gly−Pro−Ｄ−Ala Ｚ−Ala
−Gly−Pro Ｚ−Pro−Leu Gly−Pro
Gly−Pro−Ala Leu−Gly Gly−Gly−
Gly Ｚ−Gly−Phe 上式中、Ｚはカルボベンゾキシ基、２−
NNapはβ−ナフチルアミド基、ONpは
ｐ−ニトロフエニールエステル残基、Pht
はフタリール酸残基、Forはホルミル基を
それぞれ表す。 Ｂ 作用至適PH 7.0 安定PHの範囲 5.0〜9.0 Ｃ 作用至適温度 40℃ Ｄ 熱安定性 42℃以下 Ｅ 阻害作用 すい臓性およびリマビーン性ト
リプシンインヒビター、けい卵白性オボムコ
イド、ペプスタチンによつて阻害されない。 Ｆ 分子量 約78000 Ｇ 等電点 PH9.1 バジデイオミセテ・アルミラリア・メレアに
より産生されるペプチターゼまたは ミクソバクタAL−１より産生されるプロテ
アーゼ の存在下で該インシユリンを加水分解し、デスジ
ペプチド−B29、B30−インシユリンを製造する
工程と、X2−デスジペプチド−B29、B30−、イ
ンシユリンとN〓−Ｘ−Lys−Thr（Ｘは、アミノ
保護基を表す）とを前記工程と同一の酵素の存在
下で縮合させる工程とを含むことを特徴とするヒ
ト型インシユリンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55154620A JPS5779898A (en) | 1980-11-05 | 1980-11-05 | Preparation of human-type insulin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55154620A JPS5779898A (en) | 1980-11-05 | 1980-11-05 | Preparation of human-type insulin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5779898A JPS5779898A (en) | 1982-05-19 |
| JPH0320237B2 true JPH0320237B2 (ja) | 1991-03-18 |
Family
ID=15588154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55154620A Granted JPS5779898A (en) | 1980-11-05 | 1980-11-05 | Preparation of human-type insulin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5779898A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0087238A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-31 | Biogen N.V. | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| CN110305819B (zh) * | 2019-08-16 | 2020-09-01 | 南京工业大学 | 一株羽毛高效降解菌株及其应用 |
-
1980
- 1980-11-05 JP JP55154620A patent/JPS5779898A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5779898A (en) | 1982-05-19 |
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