JPH0123059B2 - - Google Patents

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JPH0123059B2
JPH0123059B2 JP5769181A JP5769181A JPH0123059B2 JP H0123059 B2 JPH0123059 B2 JP H0123059B2 JP 5769181 A JP5769181 A JP 5769181A JP 5769181 A JP5769181 A JP 5769181A JP H0123059 B2 JPH0123059 B2 JP H0123059B2
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JP
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ala
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JP5769181A
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Nobuaki Nakagawa
Shigeo Kuzuki
Ko Morita
Kunio Ooyama
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Toyo Jozo KK
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Toyo Jozo KK
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Publication date
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Priority to CH8335/81A priority patent/CH661735A5/de
Priority to FR8124412A priority patent/FR2497198B1/fr
Priority to GB8139060A priority patent/GB2092160B/en
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、被検液中のヒト副甲状線ホルモン
（ヒト−PTHまたはそのＣ末端フラクメントのエ
ンザイム・イミユノ・アツセイ（EIA）に関す
る。 詳しくは、下記一般式〔〕 R2−Ala46−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro51−Arg
−Lys53−Lys−Glu55−Asp−Asn−Val−
Leu−Val60−Glu−Ser−His−Glu−Lys65
−Ser−Leu−Gly−Glu−Ala70−Asp−Lys
−Ala−Asp−Val75−Asp−Val−Leu−
Thr−Lys80−Ala−Lys−Ser−Gln84−OH
〔〕 （ただし式中、R2はＨまたはＨ−R3−基、R3
はCys基を示す）で表わされるペプチドを用いて
得られる抗体を用いてなるヒト−PTHまたはそ
のＣ末端フラグメントのEIAに関する。 ヒト−PTHは、84個のアミノ酸よりなるペプ
チドホルモンであり、近年このPTHのＣ末端側
の血中濃度を測定することがPTH関連疾患を診
断するに重要であると報告されている。〔F.P.
Dibella etal；J.Cln.Endocrinol.Metab.，46(4)，
604（1978）〕。 そこで、本発明者らは、ヒト−PTHのＣ末端
側のフラグメントである32残基〔ｈ−PTH（53−
84）〕、34残基〔ｈ−PTH（51−84）〕、39残基〔ｈ
−PTH（46−84）〕、さらに〔Cys45〕−ｈ−PTH
（45−84）および〔Tyr45〕−ｈ−PTH（45−84）
を合成し（特願昭55−187686号；特開昭57−
126456号公報）、そのｈ−PTH（46−84）、
〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−84）により良好にヒト
−PTHのＣ末端フラグメントに対する抗体を用
いたEIAに基いて定量をなし得ることを見い出し
た。特に好ましくは〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−
84）またはその蛋白質結合体、例えば牛血清アル
ブミン（BSA）との結合体を抗原として得られ
る特異的抗体を用い、かつEIAに用いられる酵素
標識体として、下記一般式〔〕 Ｒ−Lys53−Lys−Glu55−Asp−Asn−Val−Leu
−Val60−Glu−Ser−His−Glu−Lys65−Ser
−Leu−Gly−Glu−Ala70−Asp−Lys−Ala
−Asp−Val75−Asp−Val−Leu−Thr−
Lys80−Ala−Lys−Ser−Gln84−OH 〔〕 （式中、ＲはＨまたはR1−Rro51−Arg52−基、
R1はＨまたはR2−Ala46−Gly47−Ser48−Gln49−
Arg50−基、R2はＨまたはＨ−R45 3−基、R3は
Cys基を示す）で表わされるペプチドを酵素にて
標識せしめた標識化合物を用いることにより、ヒ
ト−PTHまたはヒト−PTHC末端フラグメント
を良好に定量し得ることを見い出した。本発明
は、上記の知見に基づいてなされたもので、ヒト
ーPTHまたはそのＣ末端フラグメントを含有す
る被検液に、免疫反応媒体中、標識抗原として酵
素標識したヒト−PTHのＣ末端フラグメントお
よび抗体として下記一般式〔〕 R2−Ala−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−
Lys−Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−
Val−Glu−Ser−His−Glu−Lys−Ser−
Leu−Gly−Glu−AlaAsp−Lys−Ala−Asp
−Val−Asp−Val−Leu−Thr−Lys−Ala
−Lys−Ser−Gln−OH 〔〕 （ただし式中、R2はＨまたはＨ−R3−基、R3
はCys基を示す）で表わされるペプチドを用いて
ヒト以外の哺乳動物に感作せしめて得られる特異
的抗体を反応せしめ、次いで反応によつて結合し
た部分と結合していない遊離部とを分離し、その
後結合した部分または結合していない遊離部の酵
素活性を測定することを特徴とする被検液のヒト
−PTHまたはそのＣ末端フラグメントの測定法
である。 まず本発明に用いられる一般式〔〕で表わさ
れるペプチド、一般式〔〕で表わされるペプチ
ドは、その式〔〕、〔〕で示されるアミノ酸順
序に個々のアミノ酸または低級ペプチドを縮合せ
しめ、縮合反応の最終段階で側鎖の官能基の保護
基を脱離することにより得られる。縮合順序とし
ては式〔〕、〔〕で示されるアミノ酸配列であ
れば、如何なる順序からでも合成し得るが、Ｃ−
末端側から合成するのが有利である。また合成す
るに当つては、カルボジイミド法、アジド法、活
性エステル法や無水物法などの縮合方法を用いる
ことが好ましく、さらに縮合の各段階ではラセミ
化が起らない方法またはラセミ化が最小になる方
法を用いるのが望ましく、好ましくはアジド法、
活性エステル法、Wu¨nseh法またはGeiger法、と
りわけ縮合剤としてＮ−エチル−N′−３−ジメ
チルアミノプロピル−カルボジイミド（WSCI）
を用いる変法などが用いられる。また合成に当つ
ては、ペプチド分野の合成技術に基いて、適宜使
用し得る保護基を用い、縮合を順次行なうもの
で、ペプチド分野の合成技術がひろく用いられ
る。なお合成の詳細に関しては、何んら限定する
ものではないが、特願昭55−187680号明細書（特
開昭57−126456号公報）を参照されたい。 このようにして本発明における抗体を得るため
のｈ−PTH（46−84）、〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−
84）の一般式〔〕で表わされるペプチド、およ
び酵素標識体として用いる一般式〔〕のペプチ
ドや抗体を得る対照としてのｈ−PTH（53−84）、
ｈ−PTH（51−84）を得ればよい。 このようにして一般式〔〕で表わされるペプ
チド（以下、ペプチド〔〕と略す）および一般
式〔〕で表わされるペプチド（以下、ペプチド
〔〕と略す）を用いてEIAに基いてヒト−PTH
またはそのＣ末端・フラグメントを測定するもの
であるが、まずそのPTH測定のための用いる
EIAの実施に必要な各試薬、例えば抗血清、また
は抗体や酵素標識体までを調整するのである。ま
ずペプチド〔〕を用いてその特異的抗体を得る
に当つては、ペプチド〔〕をそのまま、または
BSAまたはそのアルカリ処理もしくはソジウム
ラウリルサルフエートとメルカプトエタノール処
理による分子内ジスルフイド基を開裂せしめた処
理物などの蛋白質との結合体として用いて、種々
の哺乳動物例えばウサギ、ラツト、モルモツトや
マウスなどに投与せしめて感作せしめればよく、
例えば上記のペプチド〔〕またはその蛋白質結
合体をフロイント・コンプリート・アジユバント
に乳化せしめ、これをモルモツトに皮下注射せし
め、２週間隔で４〜７回投与することにより感作
せしめ得るもので、次いでこの目的とする抗体を
産生した動物より採血し、それを常法により遠心
処理などを行なつてその抗血清を得ればよい。ま
たこの抗血清は十分高濃度の特異的抗体を含有し
てなるもので、適宜そのまま保存してもよく、ま
たそのまま使用時に必要に応じて希釈して用いれ
ばよい。さらにこの抗血清は、塩析、等電点沈
澱、透析、クロマトグラフイー、ゲル過手段な
どの常法によりその特異的抗体を得てもよい。 また上記の蛋白質との結合体を得るに当つて
は、多官能性試薬、例えばスクシンアルデヒド、
グルタルアルデヒド、アジポアルデヒドなどのア
ルデヒド化合物、ヘキサメチレンジイソシアナー
ト、２，４−トルエンジイソシアナートなどのジ
イソシアナート化合物や３−（2′−ベンゾチアゾ
リル−ジチオ）プロピオン酸スクシンイミドエス
テル（特願昭53−85900号（特開昭55−17302号公
報）参照）６−Ｎ〔３−（2′−ベンゾチアゾリルー
ジチオ）プロピオニル〕カプロン酸スクシンイミ
ドエステル、Ｎ−〔２−（2′−ピリジルジチオ）エ
チル〕３−（2′−ベンゾチアゾリルージチオ）プ
ロピオンアミド特願昭54−3507号（特開昭55−
94367号公報）、特願昭54−41737号（特開昭55−
133382号公報）、特願昭54−44589（特開昭55−
136261号公報）、マレイミド安息香酸スクシンイ
ミドエステル、Ｎ，N′−エチレンビスマレイミ
ド、ビスジアゾベンジジン、ジエチルマロンイミ
デートなどが用いられ、これらの多官能性試薬
は、用いるペプチド〔〕および蛋白質の結合に
関与するアミノ基、カルボキシル基やチオール基
などの官能基を考慮して選択使用すればよい。特
に好ましくは、ペプチド〔〕として〔Cys45〕−
ｈ−PTH（45−84）を用い、かつ多官能性試薬と
して３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロ
ピオン酸スクシンイミドエステルなどのチオール
基と良好に反応する試薬を用いて蛋白質を結合せ
しめることにより、そのCys45の基のチオール基
に基いて良好なペプチド〔〕の蛋白質結合体が
得られる。 また結合せしめるに当つては、本発明のペプチ
ド〔〕と蛋白質、例えばBSAとの使用量とし
てはBSA1モル当りペプチド〔〕１〜20モル程
度である。さらに反応に当つては、例えばPH７〜
８の水性媒体にペプチド〔〕を必要量加え、次
いでこれに多官能性試薬を添加して通常冷却下／
室温下にて１〜５時間反応せしめ、適宜これをゲ
ル過などの精製手段を用いて精製した後、これ
にBSAを加えて室温下１〜５時間反応せしめ、
反応後ゲル過、透析などの手段にて精製してペ
プチド〔〕とBSAなどの蛋白質との結合体を
得ればよい。さらに前記の特異的抗体は、必要に
応じて不溶性担体、例えばアルブミンやゼラチン
などの不溶性蛋白質担体、アガロース、セルロー
スやデキストリンなどのエピクロルヒドリン処理
や臭化シアン処理、さらにこれらのアミノ基導入
試薬処理してなる不溶性半合成高分子系担体、ア
クリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸エステ
ル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エステル、
ビニルアルコール、酢酸ビニル、アミノスチレ
ン、アクリルアミド、エチレンなどのポリマーま
たはコポリマーなどの不溶性高分子系担体を用い
て、前述の如くの多官能性化合物にて結合せしめ
た不溶化抗体として用いてもよい。 さらにまたEIAたる測定に用いられるペプチド
〔〕の酵素標識体を得るに当つて、まず用いら
れる酵素としては、酸化還元酵素、加水分解酵
素、転位酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガー
ゼが適宜使用されるもので、例示すればラクテー
トデヒドロゲナーゼ、マレイトデヒドロゲナー
ゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マルトースデヒ
ドロゲナーゼ、ラクテートオキシダーゼ、マレイ
トオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コリ
ンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミ
ノ酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、カ
タラーゼ、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、リゾチーム、リパーゼ、アルカリホスフアタ
ーゼ、アミノペプチターゼ、トリプシン、パパイ
ン、α−キモトリプシン、アミダーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、グリセロキナーゼなどが挙られる。さら
にこれらの酵素は、あらかじめ任意のスペーサー
導入を行なつてもよく、例えばグルタルアルデヒ
ドなどのジアルデヒド、ω−アミノ酸酸クロライ
ドなどの反応性誘導体、ジアルデヒドやジカルボ
ン酸クロライドとヘキサメチレンジアミン、デカ
メチレンアミンなどのジアミン、Ｓ−アセチルメ
ルカプトサクシニツク・アンハイドライド、ジア
ルデヒドと２−アミノエタンチオールなどのスペ
ーサー導入試薬を用いて新たにアルデヒド基、ア
ミノ基、チオール基を導入してもよい。このよう
な酵素を用いて酵素標識体を得るに当つては、本
発明のペプチド〔〕、酵素の有するアミノ基、
水酸基、カルボキシル基、チオール基などや、さ
らに導入されたアルデヒド基、アミノ基、チオー
ル基、カルボキシル基などに基いて、両者を結合
し得る多官能性試薬を用いて、ペプチド〔〕一
酵素結合体を得るものである。またこのようなペ
プチド〔〕一酵素結合体である酵素標識体を製
造するに当つては、例えばPH６〜８の緩衝液中メ
タノール、エタノール、アセトン、ジオキサン、
ジメチルスルホキサイド、ジメチルアセトアミ
ド、テトラヒドロフランなどの有機溶媒の存在
下、またはこれらの有機溶媒中、０℃〜40℃にて
本発明のペプチド〔〕と多官能性試薬とを反応
せしめる。この際使用する割合としてはペプチド
〔〕に対して多官能試薬等モル比以上使用すれ
ばよく、通常等モル比程度使用される。次いでこ
の反応終了後、必要に応じて精製し、これに酵素
を加え、好ましくは酵素の安定PHを有する緩衝液
中にて反応せしめればよく、また使用する酵素量
としてはペプチド〔〕と等モル程度用いればよ
い。のようにして得られた生成物たるペプチド
〔〕一酵素結合体は、吸着クロマトグラフイー
やゲル過などの精製手段により精製採取すれば
よい。 次いで本発明を実施するに当たつてEIAの競争
法が用いられる。競争法に関して詳しく例示すれ
ば、まずヒト−PTHの含量を測定しようとする
試料、ペプチド〔〕の酵素標識体およびペプチ
ド〔〕を用いて得られた抗血清または抗体を免
疫反応媒体、例えばリン酸緩衝液やベロナール緩
衝液中にて４〜５℃程度にて約１〜３日間インキ
ユベイトし、次いで免疫結合した部分たる結合部
Ｂと結合してない遊離部Ｆとを分離するためのＢ
−Ｆ分離を行なうもので、好ましくは抗血清作成
に用いた哺乳動物と同一動物の正常血清およびそ
の動物に対する抗血清を加えて一夜インキユベイ
トし、その後3000rpm、20〜30分程度にて遠心分
離してＢ−Ｆ分離し、次いでそのＢたる沈澱物の
有する酵素標識体の酵素活性の測定またはそのＦ
たる液層部の酵素活性の測定を行なえばよい。ま
た固相法としては、上記競争法におけるペプチド
〔〕を用いて得られる抗血清または抗体の代わ
りに不溶化抗体を用いて競争反応を行なわせ、反
応後そのＢ−Ｆ分離を行ない、同様に酵素活性測
定を行なえばよい。 このようにして、ペプチド〔〕を用いて得ら
れる抗体、およびペプチド〔〕の酵素標識体を
用いることにより、極めて正確かつ簡便に試料中
のヒト−PTHまたはそのＣ末端−フラグメント
の定量をなし得る優れた方法であり、特に
〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−84）のβ−ガラクトシ
ダーゼ標識体は、特に好ましいものであつた。 次に本発明の実施例および参考例を挙げて詳し
く述べるが、本発明はこれらによつて何んら限定
されるものではない。 実施例 (1) 抗原について。 各参考例の如くして得られた、ｈ−PTH（53−
84）、ｈ−PTH（51−84）、ｈ−PTH（46−84）、
および下記の如くして得られたBSA−〔Cys45〕−
ｈ−PTH（45−84）を抗原として用いた。 なお、BSA−〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−84）の
作成は次の通りである。 BSA50mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）10mlに
溶かし、これにEDTA・４ナトリウム塩６mgを
加えた。次いでこれに、５mgの３−（2′−ベンゾ
チアゾリル−ジチオ）プロピオン酸スクシンイミ
ドエステル含有ジメチルホルムアミド溶液1.5ml
を加えて氷冷下60分間撹拌反応せしめ、反応後こ
れに〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−84）50mgを加え
た。氷冷下で30分間反応した後、PHを7.0に調整
し、セフアデツクスＧ−75〔0.15M NaClを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）にて充填〕のカラ
ム（径５cm×50cm）でゲル過して、350mlから
450mlの流出分画を回収し、BSA−〔Cys45〕−ｈ
−PTH（45−84）含有区分を得た〔BSA1分子当
り、〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−84）は平均11分子
結合〕。 (2) 抗体について 上記各抗原を用いて、500μｇ／mlの濃度の
0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）を
調整した。この溶液各々2.5mlづつ分取し、フロ
イント・コンプリート・アジユバンド25mlづつ加
えて乳化し、各々５匹づつの雄モルモツト背部に
皮下注射して免疫した（２週間毎に５回皮下注
射）。次いでその最終免疫から２週間目に、心臓
より採血し、常法に従つて各抗原に対する抗血清
を得た。 なお以下、ｈ−PTH（53−84）に対する抗血清
はＡと略し、ｈ−PTH（51−84）に対する抗血清
はＢと略し、ｈ−PTH（46−84）に対する抗血清
はＣと略し、BSA−〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−
84）に対する抗血清はＤと略す。 (3) 酵素標識体について 〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−84）４mgを１mlの
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し、これ
に、Ｎ〔２−（2′−ピリジルジチオ）エチル〕３
−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオ
ンアミド0.6mg含有ジメチルホルムアミド0.9ml
を加え、０℃にて60分間撹拌反応した。反応後
塩酸にてPHを6.0に調節し、0.1Mリン酸緩衝液
（PH6.0）を媒体として、セフアデツクスＧ−25
のカラム（１cm×50cm）でゲル過し、15〜19
mlの分画を得た｛１ml当り〔Cys45〕−ｈ−
PTH（45−84）として660γを含む｝。次いでβ
−ガラクトシダーゼ1.2mgを含む0.1Mリン酸緩
衝液（PH8.0）1.5mlに、上記分画20μを加え、
０℃、60分間撹拌反応せしめた後、セフアデツ
クスＧ−100のカラム（１cm×50cm）にて
0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）
で溶出してゲル過し、その13〜17mlの溶出分
画を得た。この分画におけるβ−ガラクトシダ
ーゼ標識体は、〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−84）：
β−ガラクトシダーゼは約１：１であつた（以
下、「LotA」と略す）。 ｈ−PTH（53−84）２mgを１mlの0.1Mリン
酸緩衝液（PH8.0）に溶解し、これに３−（2′−
ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸スク
シンイミドエステル315μｇを含むジメチルホ
ルムアミド0.2mgを加えて、０℃、60分間撹拌
反応した。反応後この8.5μを、１mgのβ−ガ
ラクトシダーゼ含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）１mlに加えて、０℃、60分間反応せしめ
た。次いで反応液をセフアデツクスＧ−100の
カラム（１cm×50cm）にてゲル過して、その
14〜17mlの溶出分画を得た。本品のβ−ガラク
トシダーゼ標識体は、ｈ−PTH（53−84）：β
−ガラクトシダーゼは約１：１であつた（以
下、「LotB」と略す）。 (4) 測定法について、 試料液100μ、酵素標識体含有液100μ、適
宜希釈した抗血清100μおよびモルモツトの正
常血清（100倍希釈）100μを５℃にて24時間イ
ンキユベイトレ、次いで抗モルモツトγ−グロブ
リンウサギ血清（10倍希釈）10μを加えて５
℃、24時間インキユベイトレ、これに0.5M
NaCl3mlを加えた後3000rpm、15分間遠心分離し
てその沈澱物を回収した。次いでこの沈澱物を、
０−ニトロフエニル−β−ガラクトシド５mg／ml
含有0.1Mリン酸緩衝液（0.1％アジ化ナトリウ
ム、0.1％BSA、20mMメルカプトエタノール、
10％エタノール含有、PH6.7）200μに加えて37
℃、90分間反応せしめ、次いで0.2Mグリシン緩
衝液（PH10.4）2.5mlを加えて反応を停止せしめ
た後420nmの波長にて吸光度測定した。 なお、免疫反応における希釈媒体としては、
0.1％アジ化ナトリウム、0.25％BSA、
0.15MNacl.5mMEDTAを含む0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.2）を用いた。 酵素標識体としてLotAを用いて、前記の各
抗血清の抗体力価（Bo／Ｔ）を測定した。そ
の結果第１表に示す通りであつた。
【表】 なお各抗血清は1000倍希釈にて用いたものであ
る。 酵素標識体としてLotBを用いて、前記のＣ
およびＤ抗血清の抗体力価（Bo／Ｔ）を測定
した。 その結果、第２表に示す通りであつた。
【表】 なお各抗血清は2000倍希釈にて用いたものであ
る。 前記抗血清を用いて、その検量線を作成し
た。用いた抗血清としてはＡ−２（600倍希釈）、
Ｂ−２（500倍希釈）Ｃ−２（1500倍希釈）、Ｄ−
２（2000倍希釈）を用い、また酵素標識体とし
てLotBを用いて、ｈ−PTH（53−84）に対す
る検量線を作成した。その結果、Ａ−２の場合
は第１図に示す通りで、Ｂ−２の場合は第２図
に示す通りで、Ｃ−２の場合は第３図に示す通
りで、Ｄ−２の場合は第４図に示す通りであつ
た。 上記の結果、本発明のペプチド〔〕を用い
て得られた抗血清は良好な検量線を与えるもの
で、このことからヒト−PTHまたはそのＣ末
端フラグメントを良好にEIAにて測定し得るも
のであつた。 参考例 １ ｈ−PTH（53−84）；Ｈ−Lys−Lys−Glu−
Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu−Ser−His−
Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−Glu−Ala−Asp−
Lys−Ala−Asp−Val−Asp−Val−Leu−Thr−
Lys−Ala−Lys−Ser−Gln−OHの製造例。 (1) BOC−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu
（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val
−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu−
（OBzl）−Ala −Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Asp
（OBzl）−Val−Asp（OBzl）−Val−Leu−Thr
（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ−Cl）−
Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔１〕〔アミノ酸分析；
Thr0.92(1)Ser1.60(3)、Glu4.06(5)、Gly0.85(1)、
Ala3.00(3)、Val3.33(4)、Leu2.48(3)、Lys5.41
(6)、His0.70(1)〕3.49ｇ（0.6mM）およびアニ
ソール３mlを無水弗化水素（HF）25mlに０℃
に冷却下加え、75分間撹拌した。反応後、HF
を減圧下留去し、残渣にエーテルを加えた。生
じた沈澱物を回収し、0.1N酢酸50mlに溶かし、
ダウエツクス×１のカラム（2.7×35cm）に通
した。流出液を凍結乾燥して粗生成物2.18ｇを
得た。これを8M尿素水溶液50mlに溶かし、ア
ンモニア水でPH9.5に調節した後、50分間放置
した。次いでこの溶液を8M尿素水溶液で充填
したCM−セルロースのカラム（4.4×12cm）に
チヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）約100mlで流出した後、0.01M酢酸ア
ンモニウム水溶液（PH4.5）700ml〜0.1M酢酸
アンモニウム水溶液（PH4.5）700mlの直線型濃
度勾配による溶出を行い、次いで0.2M酢酸ア
ンモニウム水溶液（PH4.5）300mlで溶出した。
溶出液は、13.5mlづつ分画し、各分画はFolin
−Lowry法（500nm）により測定して30〜50本
目の区分C1、56〜119本目の区分C2および120
〜150本目の区分C3の溶出液を得た。 各区分をセフアデツクスLH−20のカラムに
通して脱塩した。流出液は85mlづつ分画し、各
分画は上記と同じ方法で測定した。区分C1は
3.4×113cmのカラムに通し、31〜40本目の区分
L1、41〜44本目の区分L2および45〜54本目の
区分L3を得た。区分C2は3.4×120cmのカラムに
通し、35〜45本目の区分L1、46〜52本目の区
分L2および53〜60本目の区分L3を得た。区分
C3は3.4×120cmのカラムに通し、31〜44本目の
区分L1および45〜52本目の区分L2を得た。各
区分を凍結乾燥して、次の各成分を得た。
【表】 (2) C2L2の精製 前記のC2L2565mgを0.1N酢酸５mlに溶かし、
CM−セルロースのカラム（4.4×70cm）にチヤ
ージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）500ml〜0.1M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は6.0mlづつ分画し、各分画は
Folin−Lowry法により測定して113〜136本目
の区分C2L2−C1、137〜151本目の区分C2L2−
C2および152〜190本目の区分C2L2−C3を得た。 各区分をセフアデツクスLH−20のカラムに
通して脱塩した。流出液は5.2mlづつ分画し、
各分画は上記と同じ方法で測定した。区分
C2L2−C1は3.4×120cmのカラムに通し、55〜72
本目の区分C2L2−C1L1および73〜80本目の区
分C2L2−C1L1を得た。区分C2L2−C2は3.4×
110cmのカラムに通し、50〜59本目の区分C2L2
−C2L1および60〜67本目の区分C2L2−C2L2を
得た。区分C2L2−C3は3.4×110cmのカラムに通
し、45〜60本目の区分のC2L2−C3L1および61
〜72本目の区分C2L2−C3L2を得た。各区分を
凍結乾燥して、次の各成分を得た。 C2L2−C1L1 108.7mg C2L2−C1L2 95.9mg C2L2−C2L1 53.6mg C2L2−C2L2 44.1mg C2L2−C3L1 97.0mg C2L2−C3L2 95.1mg (3) C2L2−C1L1の精製 前記のC2L2−C1L1を0.1N酢酸１mlに溶かし、
CM−セルロースのカラム（2.0×15cm）にチヤ
ージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）300ml〜0.1M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は7.4mlづつ分画し、各分画は
Folin−Lowry法（500nm）により測定した46
〜56本目の区分C2L2−C1L1−Ｃを得た。これ
を凍結乾燥し、セフアデツクスLH−20のカラ
ム（3.0×90cm）にチヤージし、0.1N酢酸で溶
出した。溶出後は6.0mlづつ分画し、上記と同
じ方法で測定して25〜35本目の区分C2L2−
C1L1−CLを得た。これを凍結乾燥してｈ−
PTH（53−84）90.0mgを得た。 TLC；R9＝0.76 １スポツト アミノ酸分析；Asp4.45(5)、Thr0.92(1)、
Ser2.16(3)、Glu4.94(5)、Gly0.96(1)、Ala3、
Val3.96(4)、Leu2.92(3)、Lys6.22(6)、His1.01(1) 参考例 ２ ｈ−PTH（51−84）；Ｈ−Pro−Arg−Lys−
Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu−
Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−Glu−
Ala−Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp−Val−
Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−Gln−OHの
製造例。 (1) Ｐ（52−54）；AOC−Arg（Tos）−Lys（Ｚ−
Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC〔２〕について BOC−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC
（融点72〜75℃、元素分析値〔C41H50O10N4Cl2
として、Ｃ＝59.22％、Ｈ＝5.98％、Ｎ＝6.81
％）14.65ｇ（18mM）にTFA50mlを加え、室
温で30分間撹拌した。反応後、TFAを減圧下
留去し、残渣にエーテルを加えた。生じた沈澱
物を集め、DMF10mlに溶かし、これにAOC−
Arg（Tos）−OH9.19ｇ（1.2倍Ｍ）−HOBT2.92
ｇ（1.2倍Ｍ）およびWSCI3.95ml（1.2倍Ｍ）を
加え、室温で一夜撹拌した。反応後、DMFを
減圧下留去し、残渣を酢酸エチル300mlに溶か
した後、５％重曹水、1N塩酸、水の順に各々
３回づつ洗浄した。酢酸エチル層を無水芒硝で
乾燥後、減圧乾固し、酢酸エチル−エーテルよ
り再結晶して〔２〕14.46ｇ（収率69.6％）を
得た。 融点；79〜82℃ TLC；Rf7＝0.76 元素分析〔C55H70O13N8SClとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 57.06 6.26 9.82 計算値 57.23 6.11 9.71 (2) Ｐ（51−54）；BOC−Pro−Arg（Tos）−Lys
（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC〔３〕について。 〔２〕14.43ｇ（12.5mM）にTFA40mlを加
え、室温で20分間撹拌した。反応後、TFAを
減圧下留去し、残渣にエーテルを加え、生じた
沈澱物を集め、DMF80mlに溶した。これに
HOBT2.03ｇ（1.2倍Ｍ）、BOC−Pro−
OH3.23ｇ（1.2倍Ｍ）およびWSCI2.75ml（1.2
倍Ｍ）を加え、室温で一夜撹拌した。反応後、
DMFを減圧下留去し、残渣を酢酸エチル300ml
に溶かした後、５％重曹水、1N塩酸水の順に
洗浄した。酢酸エチル層を無水芒硝で乾燥後、
減圧乾固し、残渣を酢酸エチル−エーテルより
２回再結晶して〔37〕14.71ｇ（収率95.1％）
を得た。 融点；90〜93℃ TLC；Rf7＝0.64 元素分析〔C59H75O14N9SCl2として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 57.33 6.20 9.79 計算値 57.27 6.11 10.19 (3) Ｐ（51−54）；BOC−Pro−Arg（Tos）−Lys
（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−OH〔４〕について。 亜鉛末20ｇ／酢酸30mlに〔37〕6.19ｇ
（5mM）を酢酸40mlに溶かした溶液を加え、室
温で２時間撹拌した。反応後、亜鉛末を別
し、液を減圧濃縮し、残渣に５％重曹水とエ
ーテルを加えて抽出し、分離した水層を1N塩
酸でPH２に調節した後、酢酸エチルで抽出し
た。酢酸エチル層を水で３回洗浄し、無水芒硝
で乾燥後、減圧乾固し、残渣を酢酸エチル−エ
ーテルより再結晶して〔４〕5.40ｇ（収率96.5
％）を得た。 融点；110〜113℃ TLC；Rf4＝0.43 元素分析〔C51H69O13N9SCl2として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 54.56 6.46 11.22 計算値 54.73 6.21 11.27 (4) Ｐ（51−84）；BOC−Pro−Arg（Tos）−Lys
（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu（OBzl）−Asp
（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val−Glu（OBzl）
−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）
−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu（OBzl）−Ala−
Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Asp（OBzl）
Val−Asp（OBzl）−Val−Leu−Thr（Bzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）
−Gln−OBzl〔５〕について。 BOC−Glu（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val
−Leu−Val−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−
Glu（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−
Gly−Glu（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ
−Cl）−Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）
−Val−Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala
−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔６〕
〔アミノ酸分析；Asp4.11(5)、Thr0.92(1)、
Ser1.59(3)、Glu3.99(5)、Gly0.83(1)、Ala3、
Val3.28(4)、Leu2.49(3)、Lys4.08(4)、His0.71
(1)〕7.83ｇ（1.5mM）にTFA50mlを加え、室
温で60分間撹拌し、反応後、TFAを減圧下留
去し、残渣にエーテルを加えた。生じた沈澱物
を集め、DMF120mlとNMP120mlを加えて溶し
た。これにHOBT0.30ｇ（1.5倍Ｍ）、〔４〕2.52
ｇ（1.5倍Ｍ）およびWSCI0.41ml（1.5倍Ｍ）を
加え、室温で２日間撹拌し、反応液を氷水に加
え、生じた沈澱物を水洗後、メタノールを加え
て加熱処理した。冷却後不溶物を集め、上記の
加熱処理を２回繰り返した後、エーテルで洗浄
して〔５〕8.20ｇ（収率87.9％）を得た。 アミノ酸分析；Asp4.09(5)、Thr1.05(1)、
Ser2.30(3)、Glu4.08(5)、Pro0.52(1)、Gly0.88
(1)、Ala3、Val3.42(4)、Leu2.53(3)、Lys5.11
(6)、His0.69(1)、Arg0.51(1) （41）ｈ−PTH（51−84） 無水HF40mlに０℃に冷却下〔５〕3.73ｇ
（0.6mM）およびアニソール４mlを加え、60分
間撹拌した。反応後、HFを減圧下留去し、残
渣にエーテルを加え、生じた沈澱物を集め、
0.1N酢酸50mlに溶かし、ダウエツクス×１の
カラム（アセテート型−2.7×33cm）に通じ、
流出液を凍結乾燥して粗生成物2.41ｇを得た。 これを8M尿素水溶液50mlに溶かし、アンモ
ニア水でPH10.0に調節した後、80分間放置し
た。次いでこの溶液を8M尿素水溶液で充填し
たCM−セルロースのカラム（4.2×11.5cm）に
チヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）で尿素を流出した後、0.01M酢酸アン
モニウム水溶液（PH4.5）700ml〜0.1M酢酸ア
ンモニウム水溶液（PH4.5）700mlの直線型濃度
勾配による溶出を行い、次いで0.2M酢酸アン
モニウム水溶液（PH4.5）250mlで溶出した。溶
出後は8.5mlづつ分画し、各分画はFolin−
Lowry法（500nm）により測定して30〜63本目
の区分C1、105〜150本目の区分C2および151〜
195本目の区分C3の溶出液を得た。区分C2およ
び区分C3をセフアデツクスLH−20のカラムに
通して脱塩した。流出液は5.2mlづつ分画し、
区分C2は3.4×110cmのカラムに通し、51〜63本
目の区分C2L1および64〜80本目の区分C2L2を
得た。区分C3は3.4×120cmのカラムに通し、50
〜69本目の区分C3L1および70〜78本目の区分
C3L2を得た。各区分を凍結乾燥して次の各成
分を得た。
【表】 前記のC2L2区分375mgを0.1N酢酸４mlに溶か
し、CM−セルロースのカラム（2.0×31cm）にチ
ヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）500ml〜0.2M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）500mlの直線型濃度勾配による溶出を行つ
た。溶出液は7.5mlづつ分画し、85〜103本目の区
分C2L2−Ｃを得た。この区分をセフアデツクス
LH−20のカラム（3.0×123cm）に通して脱塩し
た。流出液は６mlづつ分画し、34〜42本目の区分
C2L2−CL1および43〜50本目の区分C2L2−CL2を
得た。各区分を凍結乾燥して次の各成分を得た。 C2L2−CL1 80.0mg アミノ酸分析；Asp4.95(5)、Thr0.98(1)、
Ser2.47(3)、Glu5.14(5)、Gly1.01(1)、Ala3(3)、
Val4.05(4)、Leu3.02(3)、Lys6.16(6)、His0.96(1)、
Arg0.97(1)、Pro1.06(1) C2L2−CL2 197.6ｇ アミノ酸分析；Asp5.00(5)、Thr0.93(1)、
Ser2.30(3)、Glu5.17(5)、Gly1.01(1)、Ala3(3)、
Val4.03(4)、Leu3.00(3)、Lys6.15(6)、His0.95(1)、
Arg1.01(1)、Pro1.04(1) 前記のC2L2−CL2区分195mgを0.1N酢酸２mlに
溶かし、CM−セルロースのカラム（2.0×15cm）
にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300ml〜0.2M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300mlの直線型濃度勾配による溶出を行
つた。溶出液は6.4mlづつ分画し、55〜64本目の
区分C2L2−CL2−C1および56〜72本目の区分
C2L2−CL2−C2を得た。各区分をセフアデツクス
LH−20のカラムに通して脱塩した。区分C2L2−
CL2−C1は3.0×123cmのカラムに通し、流出液は
7.4mlづつ分画し、31〜38本目の区分C2L2−CL2
−C1L1と39〜43本目の区分C2L2−CL2−C1L2を
得た。区分C2L2−CL2−C1L1を凍結乾燥してｈ−
PTH（51−84）77.2mgを得た。 TLC；R10＝0.89 １スポツト 参考例 ３ ｈ−PTH（46−84）；Ｈ−Ala−Gly−Ser−Gln
−Arg−Pro−Arg−Lys−Lys−Lys−Glu−Asp
−Asn−Val−Leu−Val−Glu−Ser−His−Glu
−Lys−Ser−Leu−Gly−Glu−Ala−Asp−Lys
−Ala−Asp−Val−Asp−Val−Leu−Thr−Lys
−Ala−Lys−Ser−Gln−OHの製造例。 (1) Ｐ（49−50）；BOC−Gln−Arg（Tos）−OMe
〔７〕について。 Ｈ−Arg（Tos）−OMe・HCl11.37ｇ
（30mM）とBOC−Gln−ONP13.21ｇ（1.2倍
Ｍ）をDMF200mlに溶かし、０℃に冷却下
NMMでPH７に調節した後、一夜撹拌した。反
応後、DMFを減圧下留去し、残渣をクロロホ
ルムに溶かした後、５％重曹水で３回、1N塩
酸で２回、水で３回洗浄した。クロロホルム層
を無水芒硝で乾燥し、クロロホルムで充填した
シリカゲルのカラムでクロマトグラフイーを行
い、クロロホルム−エタノール−酢酸エチルで
流し、目的物が溶出し始めるとクロロホルム−
エタノール−酢酸エチル（１：１：１）で溶出
した。相当する区分を集めて減圧濃縮した。残
渣を酢酸エチルに溶かし、０℃に冷却下ヘキサ
ンを加えて結晶化させて〔７〕を得た。収量
11.86ｇ 融点；103〜107℃ (2) Ｐ（48−50）；BOC−Ser（Bzl）−Gln−Arg
（Tos）−OMe〔８〕について。 〔７〕9.39ｇ（16.5mM）にTFA50mlを加え
室温で20分間撹拌した後、TFAを減圧下留去
した。残渣にエーテルを加え、生じた沈澱物を
取し、DMF50mlに溶かした。この溶液に
HOBT3.24ｇ（1.45倍Ｍ）、BOC−Ser（Bzl）−
OH7.07ｇ（1.45倍Ｍ）およびWSCI4.39ml
（1.45倍Ｍ）を加え、室温で一夜撹拌した。反
応後、DMFを減圧下留去し、残渣を酢酸エチ
ル300mlに溶かした後、５％重曹、1N塩酸、水
の順に洗浄した。酢酸エチル層を無水芒硝で乾
燥後、減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル−エーテ
ルから結晶化を２回行い、〔８〕10.0ｇ（収率
81.0％）を得た。 融点；97〜102℃ 元素分析〔C34H49O10N7S・1/2H2Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 54.07 6.90 13.29 計算値 53.95 6.66 13.00 (3) Ｐ（46−50）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−OMe
〔９〕について。 〔８〕9.72ｇ（13mM）にTFA50mlを加え、
室温で30分間撹拌した。反応後、TFAを減圧
下で留去し、残渣にエーテルを加えた。生じた
沈澱物を取し、DMF100mlに溶かし、この溶
液にBOC−Ala−Gly−OH3.84ｇ（1.2倍Ｍ）、
HOBT2.11ｇ（1.2倍Ｍ）およびWSCI2.85ml
（1.2倍Ｍ）を加え、室温で２日間撹拌した。反
応後、DMFを減圧下留去し、残渣を酢酸エチ
ル200mlに溶かした後、水洗した。無水芒硝で
乾燥し、減圧濃縮した後、残渣をエタノール−
エーテルで２回結晶化して
〔９〕10.46ｇ（収
率91.9％）を得た。 融点；154−157℃ 元素分析〔C39H57O12N9Sとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 53.21 6.90 14.38 計算値 53.74 6.56 14.39 (4) Ｐ（46−50）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−NHNH2〔10〕について。
〔９〕9.64ｇ（11mM）をエタノール50mlに
溶かし、これに50％NH2NH26.4mlを加え室温
で一夜撹拌した。反応液にエタノール100mlを
加え、不溶物を取した。これをエタノール
100mlに懸濁し、加熱し、冷却後、過して
〔10〕9.02ｇ（収率93.6％）を得た。 融点；178〜180℃ 元素分析〔C33H57O11N11Sとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 52.18 6.86 16.65 計算値 52.10 6.56 17.59 (5) Ｐ（46−54）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）
−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg（Tos）−Lys（Ｚ
−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC〔11〕について。 参考例２に記載の〔３〕8.04ｇ（6.6mM）に
TFA40mlを加え、室温で20分間撹拌した後、
TFAを減圧下留去した。残渣にエーテルを加
え、生じた沈澱物を取して粗製のＨ−Pro−
Arg（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−
PAC・TFAを得た。 一方、〔10〕6.83ｇ（7.3mM）をDMF30mlに
溶かし、これに−50℃に冷却下4.32N塩化水素
のジオキサン溶液5.42ml（23.4mM）とイソア
ミルニトリル1.10ml（8.09mM）を加えた後、−
20℃で20分間撹拌した。次いで上記Ｈ−Pro−
Arg（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC・TFAを加
え、−35℃でEt3N5.46ml（39mM）を加えた後、
０〜５℃で２日間撹拌した。反応後、DMFを
減圧下留去し、残渣をクロロホルム300mlに溶
かした後、５％重曹水、1N塩酸、水の順で洗
浄した。クロロホルム層を無水芒硝で乾燥し、
減圧濃縮し、エタノール−エーテルおよびクロ
ロホルム−エーテルにより精製して〔11〕
13.42ｇを得た。 TLC；Rf＝0.64〔クロロホルム−メタノール
−酢酸（83：18：3.5）〕 元素分析〔C92H120O22N18Cl2S・3H2Oとし
て〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 54.68 6.21 12.72 計算値 54.72 6.29 12.49 アミノ酸分析；Ser0.65(1)、Glu1.10(1)、Pro1
(1)、Gly1.02(1)、Ala1.00(1)、Lys1.89(2)、Arg2.02
(2) (6) Ｐ−（46−54）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）
−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg（Tos）−Lys（Ｚ
−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−OH〔12〕について。 亜鉛末15ｇ／酢酸30mlに〔11〕5.31ｇの酢酸
40ml溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応
後、亜鉛末を別し、液を減圧濃縮した。残
渣にエーテルを加え、生じた沈澱物をエタノー
ル−エーテルで１回、エタノール−酢酸エチル
で２回精製して〔12〕4.41ｇ（収率87.7％）を
得た。 TLC；Rf4＝0.22 元素分析〔C84H114O22N18S2Cl2・2H2Oとし
て〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 52.89 6.16 13.22 計算値 53.12 6.26 13.28 アミノ酸分析；Ser0.88(1)、Glu1.11(1)、
Pro1.02(1)、Gly1.02(1)、Ala1(1)、Lys2.00(2)、
Arg2.09(2) (6) Ｐ（46−84）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg（Tos）−Lys（Ｚ−
Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu（OBzl）−Asp（OBzl）
−Asn−Val−Leu−Val−Glu（OBzl）−Ser
（Bzl）−His−Glu（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ser
（Bzl）−Leu−Gly−Glu（OBzl）−Ala−Asp
（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Asp（OBzl）−
Val−Asp（OBzl）−Val−Leu−Thr（Bzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）
−Gln−OBzl〔13〕について。 参考例２に記載の〔６〕10.44ｇ（2mM）に
TFA80mlを加え、室温で60分間撹拌した後、
TFAを減圧下留去した。残渣にエーテルを加
え、生じた沈澱物をDMF160mlとNMP160mlの
混液に溶かし、これに０℃に冷却下〔12〕4.28
ｇ（1.15倍Ｍ）、HOBT0.32ｇ（1.2倍Ｍ）およ
びWSCI0.44ml（1.2倍Ｍ）を加えた後、室温で
２日間撹拌した。反応後DMFを減圧下留去し、
残渣に氷水を加えた後、生じた沈澱物を取し
た。これにメタノール200mlを加えて加熱し、
冷却後不溶物を取する操作を２回繰り返して
〔13〕12.17ｇ（収率87.4％）を得た。 (7) ｈ−PTH（46−84） 無水HF60ml120℃に冷却下〔13〕4.18ｇ
（0.6mM）とアニソール10mlを加え、60分間撹
拌した。反応後、HFを減圧下留去し、残渣に
エーテルを加えた。生じた沈澱物を集め、10％
酢酸50mlに溶かし、ダウエツクス×１のカラム
（アセテート型、2.5×24cm）に通じ、流出液を
凍結乾燥して粗生成物2.82ｇを得た。 これを8M尿素水溶液（PH9.0）50mlに溶か
し、60分間室温で放置した。次いでこの溶液を
8M尿素水溶液で充填したCM−セルロースの
カラム（2.0×33cm）にチヤージし、0.01M酢
酸アンモニウム水溶液（PH4.5）500ml〜0.3M
酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）500mlの直線
型濃度勾配による溶出を行つた。溶出液は7.5
mlづつ分画し、各分画はFolin−Lowry
（500nm）により測定して１〜22本目の区分C1、
23〜45本目の区分C2、46〜80本目の区分C3、
および81〜120本目の区分C4の溶出液を得た。
各区分をセフアデツクスLH−20のカラムに通
して脱塩した。区分C1は3.0×120cmのカラムに
適し、流出液を7.5mlづつ分画し、28〜42本目
の区分C1Lを得た。区分C2は3.4×120mlに達
し、流出液を7.6mlづつ分画し、33〜40本目の
区分C2L1および41〜62本目の区分C2L2を得た。
区分C3は3.0×120cmのカラムに通し、流出液を
6.0mlづつ分画し、31〜40本目の区分C3L1およ
び41〜51本目の区分C3L2を得た。区分C4は、
3.4×120cmのカラムに通し、流出液を7.5mlづ
つ分画し、35〜48本目の区分C4Lを得た。各区
分を凍結乾燥してC1L区分312mg、C2L1区分
142.3mg、C2L2区分1380mg、C3L1区分104mg、
C3L2区分510mgおよびC4L区分130mgを得た。 前記のC2L2区分1380mgを0.1N酢酸13mlに溶
かし、CM−セルロースのカラム（4.3×6.0cm）
にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は7.6mlづつ分画し、40〜50本
目の区分C2L2−および53〜77本目の区分C2L2
−C2を得た。各区分をセフアデツクスLH−20
のカラムに通して脱塩した。区分C2L2−C1は
2.9×120cmのカラムに通し、流出液を8.0mlづ
つ分画し、26〜30本目の区分C2L2−C1L1およ
び31〜39本目の区分C2L2−C1L2を得た。区分
C2L2−C2は3.4×120cmのカラムに通し、流出液
を8.0mlづつ分画し、34〜44本目の区分C2L2−
C2L1および45〜53本目の区分C2L2−C2L2を得
た。各区分を凍結乾燥してC2L2−C1L1区分79.0
mg、C2L2−C1L2区分455mg、C2L2−C2L1区分
157.3mgおよびC2L2−C2L2区分551.7mgを得た。 C2L2−C2L2区分のアミノ酸分析；Asp4.65
(5)、Thr0.97(1)、Ser3.47(4)、Glu5.99(6)、
Pro0.93(1)、Gly1.96(2)、Ala4(4)、Val3.97(4)、
Leu3.01(3)、Lys6.13(6)、His0.93(1)、Arg1.96(2) 前記のC2L2−C2L2区分を0.1N酢酸５mlに溶
かし、CM−セルロースのカラム（4.2×7.0cm）
にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）の直線型濃度包配による溶出を行つ
た。溶出液は8.0mlづつ分画し、39〜45本目の
区分C2L2−C2L2−Ｃを得た。この区分をセフ
アデツクスLH−20のカラム（2.9×120cm）の
カラムに通して脱塩した。流出液を8.0mlづつ
分画し、24〜30本目の区分C2L2−C2L2−CL1、
31〜35本目の区分C2L2−C2L2−CL2および36〜
39本目の区分C2L2−C2L2−CL3を得た。各区分
を凍結乾燥してC2L2−C2L2−CL2区分200mgお
よびC2L2−C2L2−CL1区分〔ｈ−PTH（46−
84）〕94.9mgを得た。 TLC；Rf9＝0.76 アミノ酸分析；Asp4.86(5)、Thr0.99(1)、
Ser3.5(4)、Glu6.17(6)、Pro0.96(1)、Gly1.97(2)、
Ala4、Val4.02(4)、Leu2.93(3)、Lys6.05(6)、
His0.90(1)、Arg1.87(2) 参考例 ４ 〔Tyr45〕ｈ−PTH（45−84）；Ｈ−Tys−Ala
−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−Lys−Lys
−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu−Ser
−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−Glu−Ala
−Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp−Val−Leu
−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−Gln−OHの製造
例。 (1) Ｐ（45−84）；BOC−Tyr（Bzl−Cl2）−Ala−
Gly−Ser（Bzl）−Gln−Arg（Tos）−Dro−Arg
（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu
（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val
−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu
（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−
Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）−Val−
Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ
−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔14〕について。 参考例３に記載の〔13〕6.27ｇ（0.9mM）に
TFA60mlを加え、室温で60分間撹拌した。反
応後、TFAを減圧下留去し、残渣にエーテル
を加える。生じた沈澱物を取して脱BOC化
合6.30ｇを得た。 上記脱BOC化物2.10ｇ（0.3mM）をDMF35
mlとNMP35mlの混液に溶かし、これに０℃に
冷却下BOC−Tyr（Bzl−Cl2）−OH0.16ｇ（1.2
倍Ｍ）、HOBT0.05ｇ（1.2倍Ｍ）および
WSCI0.07ml（1.2倍Ｍ）を加えて後、室温で一
夜撹拌した。反応後、DMFを減圧下留去し、
残渣に氷水を加え、生じた沈澱物を取して
〔14〕2.00ｇを得た。 (2) 〔Tyr45〕−ｈ−PTH（45−84） 無水HF20mlに０℃に冷却下〔14〕2.00ｇ
（0.27mM）およびアニソール1.0mlを加え、60
分間撹拌した。反応後、HFを減圧下留去し、
残渣にエーテルを加えた。生じた沈澱物を集
め、0.1N酢酸20mlに溶かし、ダウエツクス×
１のカラム（アセテート型、2.5×15cm）に通
じ、流出液を凍結乾燥して粗生成物1.37ｇを得
た。 これを8M尿素水溶液（PH9.5）50mlに溶か
し、室温で60分間放置した。次いでこの溶液を
8M尿素水溶液で充填したCM−セルロースの
カラム（4.3×8.0cm）にチヤージし、0.01M酢
酸アンモニウム水溶液（PH4.5）400ml〜0.3M
酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）400mlの直線
型濃度勾配による溶出を行つた。溶出後は6.5
mlづつ分画し、各分画はFolin−Lowry法
（500nm）により測定して30〜43本目の区分C1、
51〜68本目の区分C2、69〜83本目の区分C3お
よび84〜100本目の区分C4を得た。各区分をセ
フアデツクスLH−20のカラムに通して脱塩し
た。区分C1は3.4×120cmのカラムに通し、流出
液を7.5mlづつ分画し、25〜41本目の区分C1Lを
得る区分C2は3.0×120cmのカラムに通し、流出
液を7.5mlづつ分画し、25〜36本目の区分C2Lを
得た。区分C3は2.9×120cmのカラムに通し、流
出液を8.0mlづつ分画し、24〜27本目の区分
C3L1および28〜38本目の区分C3L2を得た。区
分C4は2.9×95cmのカラムに通し、流出液を7.6
mlづつ分画し、20〜25本目の区分C4L1および
26〜30本目の区分C4L2を得た。各区分を凍結
乾燥してC1L区分521.6mg、C2L区分230.2mg、
C3L1区分41.8mg、C3L2区分222.4mg、C4L1区分
74.3mgおよびC4L2区分48.9mgを得た。 前記のC2L区分を0.1N酢酸３mlに溶かし、
CM−セルロースのカラム（2.1×25cm）にチヤ
ージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）300ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は8.0mlづつ分画し、30〜36本
目の区分C2L−Ｃを得た。この区分をセフアデ
ツクスLH−20のカラム（2.9×90cm）のカラム
に通して脱塩した。流出液を8.0mlづつ分画し、
20〜29本目の区分を凍結乾燥して〔Tyr45〕−
ｈ−PTH（45−84）163.3mgを得た。 TLC；Rf9＝0.75 アミノ酸分析；Asp4.86(5)、Thr1.02(1)、
Ser3.51(4)、Glu6.05(6)、Pro0.93(1)、Gly1.90
(2)、Ala4(4)、Val4.00(4)、Leu2.93(3)、Tyr0.88
(1)、Lys6.02(6)、His0.86(1)、Arg1.81(2) 参考例 ５ 〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH（45−84）；Ｈ−
Cys（Acm）−Ala−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−
Arg−Lys−Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−
Val−Glu−Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−
Gly−Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−Asp−Val−
Asp−Val−Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−
Gln−OHの製造例。 (1) Ｐ（45−84）；BOC−Cys（Acm）−Aa−Gly
−Ser（Bzl）−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg
（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu
（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val
−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu
（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−
Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）−Val−
Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ
−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔15〕について。 参考例４で得た残りの脱BOC化物4.20mg
（0.6mM）をDMF70mlとNMP70mlの混液に溶
かし、これに０℃に冷却下HOBT0.10ｇ（1.2
倍Ｍ）、BOC−Cys（Acm）−OH0.20ｇ（1.2倍
Ｍ）およびWSCI0.13ml（1.2倍Ｍ）を加えた
後、室温で一夜撹拌した。反応後、DMFを減
圧下留去し、残渣に氷水を加え、生じた沈澱物
を集めた。これをエタノールに懸濁して加熱
し、冷却した後、不溶物を取した。この操作
を２回繰り返して〔15〕4.07ｇ（収率95.0％）
を得た。 (2) 〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH（45−84）無水
HF60mlに０℃に冷却下〔15〕4.00ｇ
（0.57mM）およびアニソール10mlを加え、60
分間撹拌した。反応後、HFを減圧下留去し、
残渣にエーテルを加えた。生じた沈澱物を集
め、20％酢酸40mlに溶かし、ダウエツクス×１
のカラム（アセテート型、2.8×35cm）に通じ、
流出液を凍結乾燥した。これを8M尿素水溶液
50mlに溶かし、アンモニア水でPH9.0に調節し
た後、30分間放置した。次いでこの溶液を8M
尿素水溶液で充填したCM−セルロース（3.4×
35cm）にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム
水溶液（PH4.5）700ml〜0.3M酢酸アンモニウ
ム水溶液（PH4.5）700mlの濃度勾配による溶出
を行つた。溶出液は8.0mlづつ分画し、各分画
はFolin−Lowry法（500nm）により測定して
25〜35本目の区分C1、36〜45本目の区分C2お
よび46〜84本目の区分C3を得た。各区分をセ
フアデツクスLH−20のカラムに通して脱塩し
た。区分C2は3.0×120cmのカラムに通し、流出
液を8.0mlづつ分画し、27〜33本目の区分C2L1
および34〜40本目の区分C2L2を得た。区分C3
は3.4×120cmのカラムに通し、流出液を8.0ml
づつ分画し、35〜47本目の区分C3L1および48
〜53本目の区分C3L2を得た。各区分を凍結乾
燥してC2L1区分148mg、C2L2区分620mg、C3L1
区分212mgおよびC3L2区分605mgを得た。 前記のC2L2区分を0.1N酢酸６mlに溶かし、
これをCM−セルロースのカラム（5.0×12cm）
にチヤージし、0.0M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）400ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）400mlの直線型濃度勾配による溶出を
行い、溶出液は6.0mlづつ分画し、110〜126本
目の区分C2L2−Ｃを得た。これをセフアデツ
クスLH−20のカラム（4.0×120cm）に通して
脱塩した。流出液は8.0mlづつ分画し、38〜54
本目の区分C2L2−CLを得た。この区分を凍結
乾燥して〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH（45−84）
246.8mgを得た。 TLC；Rf9＝0.74 アミノ酸分析；Asp4.91(5)、Thr0.98(1)、
Ser3.50(1)、Glu6.11(6)、Pro0.98(1)、Gly1.98
(2)、Ala4(4)、Val4.04(4)、Cys0.42（0.5）、
Leu2.90(3)、Lys5.99(6)、His0.87(1)、Ars1.87(2) 参考例 ６ 〔Cys45〕−ｈ−PTH（45−84）；Ｈ−Cys−Ala
−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−Lys−Lys
−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu−Ser
−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−Glu−Ala
−Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp−Val−Leu
−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−Gln−OHの製造
例。 参考例５で得た〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH
（45−84）88mg（0.02mM）を50％酢酸２mlに溶
かし、これに酢酸第二水銀57.24mg（0.18mM）を
加えた後、室温で70分間撹拌した。次いで、β−
メルカプトエタノール3.4mlを加え、室温で24時
間撹拌した。反応液を遠心分離し、上澄液をセフ
アデツクスLH−20のカラム（3.5×42cm）にチヤ
ージし、0.1M酢酸で溶出した。溶出液は５mlづ
つ分画し、ニンヒドリン反応陽性の９〜14本目の
区分を集め、これを凍結乾燥して〔Cys45〕−ｈ−
PTH（45−84）76.1mgを得た。 TLC；Rf9＝0.73 尚、本明細書中に記載の略記号は次の意味を有
する。 Gln；Ｌ−グルタミン Ser；Ｌ−セリン Lys；Ｌ−リジン Ala；Ｌ−アラニン Thr；Ｌ−スレオニン Leu；Ｌ−ロイシン Val；Ｌ−バリン Asp；Ｌ−アスパラギン酸 Glu；Ｌ−グルタミン酸 Gly；グリシン His；Ｌ−ヒスチジン Asn；Ｌ−アスパラギン Arg；Ｌ−アルギニン Pro；Ｌ−プロリン Tyr；Ｌチロシン Cys；Ｌ−システイン BOC；ｔ−ブチルオキシカルボニル AOC；ｔ−アミルオキシカルボニル Ｚ−Cl；ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル Bzl；ベンジル Tos；トシル OMe；メチルエステル OEt；エチルエステル OBzl；ベンジルエステル OSU；Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステ
ル ONP；ｐ−ニトロフエニルエステル PAC；フエナシルエステル Acm；アセトアミドメチル TosOH；ｐ−トルエンスルホン酸 TFA；トリフルオロ酢酸 Et3N；トリエチルアミン TBA；トリベンジルアミン NMM；Ｎ−メチルモルホリン HOBT；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール DMF；ジメチルホルムアミド THF；テトラヒドロフラン NMP；Ｎ−メチル−２−ピロリドン MeOH；メタノール EtOH；エタノール BuOH；ブタノール エーテル；ジエチルエーテル WSCI；Ｎ−エチル，Ｎ−３−ジメチルアミノ
プロピル−カルボジイミド また使用した薄層クロマトグラフイー（TLC）
の担体および展開溶媒は次の通りである。 担体；メルク社製シリカゲルＧ 展開溶媒； １；CHCl3−MeOH−酢酸 （95：５：３） ２； 〃 （85：15：５） ３； 〃 （85：10：５） ４； 〃 （80：25：２） ５；ベンゼン−酢酸エチル （１：１） ６；ベンゼン−酢酸エチル （２：１） ７；CHCl3−EtOH−酢酸エチル （５：２：５） ８； 〃 （10：１：５） 担体；メルク社製セルロース 展開溶媒； ９；BuOH−ピリジン−酢酸−水
（２：２：２：３） 10；BuOH−ピリジン−酢酸−水
（１：１：１：２）
【図面の簡単な説明】
第１図、第２図、第３図および第４図は検量線
を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト−PTHまたはそのＣ末端フラグメント
    を含有する被検液に、免疫反応媒体中、標識抗原
    として酵素標識したヒト−PTHのＣ末端フラグ
    メントおよび抗体として下記一般式〔〕 R2−Ala−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−
    Lys−Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−
    Val−Glu−Ser−His−Glu−Lys−Ser−
    Leu−Gly−Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−
    Asp−Val−Asp−Val−Leu−Thr−Lys−
    Ala−Lys−Ser−Gln−OH 〔〕 （ただし式中、R2はＨまたはＨ−R3−基、R3
    はCys基を示す）で表わされるペプチドを用いて
    ヒト以外の哺乳動物に感作せしめて得られる特異
    的抗体を反応せしめ、次いで反応によつて結合し
    た部分と結合していない遊離部とを分離し、その
    後結合した部分または結合していない遊離部の酵
    素活性を測定することを特徴とする被検液のヒト
    −PTHまたはそのＣ末端フラグメントの測定法。 ２ 抗体が、R2がＨ−R3−基であり、R3がCys
    基である一般式〔〕で表わされるペプチドを用
    いて得られる抗体である特許請求の範囲第１項記
    載の測定法。 ３ 抗体が、R2がＨ−R3−基であり、R3がCys
    基である一般式〔〕で表わされるペプチド−蛋
    白質結合体を用いて得られる抗体である特許請求
    の範囲第１項記載の測定法。 ４ 酵素標識したヒト−PTHのＣ末端フラグメ
    ントが、下記一般式〔〕 Ｒ−Lys−Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−
    Val−Glu−Ser−His−Glu−Lys−Ser−
    Leu−Gly−Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−
    Asp−Val−Asp−Val−Leu−Thr−Lys−
    Ala−Lys−Ser−Gln−OH 〔〕 （式中、ＲはＨまたはR1−Pro−Arg−基、R1
    はＨまたはR2−Ala−Gly−Gln−Arg−基、R2
    はＨまたはＨ−R3−基、R3はCys基を示す）で表
    わされるペプチドの酵素標識体である特許請求の
    範囲第１項記載の測定法。 ５ 一般式〔〕で表わされるペプチドが、R2
    がＨ−R3−基であり、R3がCys基である一般式
    〔〕で表わされるペプチドである特許請求の範
    囲第４項記載の測定法。 ６ 酵素標識に用いる酵素が、β−ガラクトシダ
    ーゼである特許請求の範囲第１項記載の測定法。
JP5769181A 1980-12-29 1981-04-16 Measuring method for immunity of homo-pth Granted JPS57184969A (en)

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US06/335,401 US4409141A (en) 1980-12-29 1981-12-29 Peptides for assaying human parathyroid hormone
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JPH064417B2 (ja) * 1985-02-12 1994-01-19 本田技研工業株式会社 電動式パワーステアリング装置
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