JPH0320299A - 悪性腫瘍細胞増殖抑制作用を有する新規蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトまたは動物の血液、血清または摘出臓器
抽出液より分別され、悪性腫瘍細胞増殖抑制作用を有す
る新規なる蛋白質を主とする物質に関するものである． 本発明者らは、悪性腫瘍細胞の増殖を抑制する物質とし
て動物生体より各種蛋白質を分離し研究した結果、血液
および臓器より分離される蛋白質がインビトロにおける
各種悪性腫瘍細胞の増殖を抑制する作用ならびにインビ
ボにおける悪性腫瘍細胞を植付けた動物に延命効果のあ
ることを見出した． 当該蛋白質は、新規蛋白質であって、ヒトおよび動物、
就中噛乳動物の血液、血清、あるいは摘出臓器たとえば
旧Ｅ腎臓等の抽出液から得られ、悪性腫瘍細胞増殖抑制
作用を有し、悪性腫瘍細胞移植動物に顕著なる延命効果
を示す．特に悪性腫瘍細胞に対し強い増殖抑制阻害作用
を有しつつも、インビト口で殺悪性腫瘍細胞作用は示さ
ず、またヒトあるいは動物に対し無毒性で、正常細胞に
何ら認むべき阻害作用を示さぬ点において特異的な生理
活性を有するものというべきであり、医薬としてきわめ
て価値のあるものである． 本発明にかかるこの新規なる蛋白質は、ヒトまたは動物
の血液、血清または摘出臓器抽出液から、その性状に基
づいて塩析、抽仕、吸着、溶出、透析、分別、沈殿、ｒ
過、等電点沈殿、ゲルフィルトレーション，イオン交換
樹脂利用、電気泳動等の公知の操作を適宜組合わせるこ
とによって分離取得することができる．より具体的には
、まず血液、血清、あるいは臓器抽出液に硫酸゜アンモ
ニウム、食塩等を添加して有効成分を塩析沈殿させ、こ
の沈殿を透析後乾燥すると新規蛋白質の粗粉末が得られ
る． さらに進んだ精製には、イオン交換樹脂セフ７デツクス
活性炭、シリカゲルもしくはジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥと略す）およびセルロース等のカラムクロマトグ
ラフイーおよびポリアクリルアミドゲル、サツ力ロース
等を用いる電気泳動法あるいは等電点沈殿等を単独また
は組合わせることにより可能であり、さらにまた、この
新規なる蛋白質はシリカゲル、ベントナイト、酸性白土
または活性炭等の吸着体に吸着せしめて精製することが
できる． ヒトまたは動物の血液、血清あるいは摘出臓器抽出液か
ら上記のごとく分離された蛋白質物質は前述のごとくき
わめて特異的な生理作用を示し、制悪性腫痛剤として有
用である．本発明者らは、この新規なる蛋白質につき、
さらに研究を進めた結果、これが単一の物質ではなく、
さらにいくつかの成分に分離可能であり、それらがいず
れも悪性腫瘍細胞増殖抑制効果を有することを知り、こ
れらを以下新規蛋白質Ａ，Ｂ，Ｃと称する．すなわち、
前記の塩析に際し塩の飽和度をたとえば４０％、９０％
、１００％のごとく変化させ、分子量に応じて分別沈殿
させ、分子篩による吸着、溶出で純度を高めた後、カラ
ムクロマトグラフイーで注意深く分別を行うと、新規蛋
白質Ａ，ＢならびにＣが得られ、新規蛋白質Ｂの物性は
以下のとおりである． 新規蛋白質Ｂ 外　観：白色粉末 融　点：２２０℃〜２２５℃分解 性　質：蛋白質 分子量：約２２０００　（１０％　ドデシル硫酸ナトリ
ウム電気泳動法による） 溶解性：水に易溶、アセトン、酢酸エチル、ベンゼン、
ヘキサン、クロロホルムに不溶アミノ酸組成：アスパラ
ギン酸８．９％、スレオニン６．６％、セリン６．４％
、グルタミン酸１０．９％、プロリン４．８％、グリシ
ン４．４％、アラニン７．１％、システイン１２．３％
、バリン５．８％、メチオニン０．７％、イソロイシン
２．４％、ロイシン８．８％、チロシン２．８％、フエ
ニールアラニン５，０％、リジン７．６％、ヒスチヂン
２．５％、アルギニン３．６％ 呈色反応：ニンヒドリン反応陽性、アンスロン、モーリ
ッシュ、過沃素酸反応陰性 赤外線吸収スペクトラム：第１図参照［　ＫＢｒペレッ
トで測定］ 紫外線吸収スペクトラム：　ＰＨ３の水中で２８３ｎｍ
および２８９ｎｍに吸収極大（第２図参照）　　ＰＨ７
の水中で２８０ｎｍに吸収極大（第３図参照）、ＰＨ１
０．０の水中で２７８ｎｍに吸収極大を示す（第４図参
照〉 なお、測定条件は下記のとおりである．融　点二ｇｉ微
鏡融点測定 分子量二幅９ｃｍ、長さ２４ｃｍ、厚さ０．５ｃｍ、担
体ボリアクリルアミドゲル７％、展開溶剤　トリスーグ
リシン緩衝液（ＰＨ８．３）、展開時間　３時間、電圧
　チューブ当９５ｍＡ 呈色反応：小試験管を使用 紫外線吸収スペクトラム＝（株）日立製紫外部吸収装置
を使用 上記記載の新規蛋白質Ｂは、７％アクリルアミドゲル電
気泳動法でＰＨ６．５では原点より移動せず、ＰＨ８．
０、ＰＨ９．５、ＰＨ−１０．０ではいずれも原点より
移動し、単一バンドを示す．したがってクロマトグラフ
イーに代えてアクリルアミドゲル電気泳動法による分別
も可能である．このような精製法で得られる新規蛋白質
Ｂは勿論の，こと、各段階で得られる粗粉末も各種悪性
腫瘍細胞増殖抑制剤として使用することが可能である．
以上のように、他成分を加えず純粋の形でもあるいは混
合物の形でも有効で、注射薬その他各種の剤形に調剤が
可能である． 以下、実施例により本発明を説明する．実施例１一 牛血清１０１に硫酸アンモニウムを９５％飽和度に加え
、得られた沈殿物をＰＨ７．３で七ファデックスＧ−５
０　　４０ｍｌ容に吸着せしめ、ＰＨ７．３の０．０５
Ｍ｝リス塩酸緩衝液５０ｍｌで溶出せしめ、新規蛋白質
粗物質６，３ｇを得た．次にジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）セルロース（ワットマン社製〉に吸着せしめ、
０．０２Ｍから０．０５Ｍのトリス塩酸ｔＩ！衝液（Ｐ
Ｈ７．３）イオン強度勾配溶液５０ｍｌで溶出し、大き
く６分画に分ける．第１分画を透析し、脱塩、凍結乾燥
すると粗物質３０ｍｇを得た． これをさらに、ＰＨ７．３の０．０２Ｍ｝リスｋ！ＩＩ
Ｉ液で平衡化したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セ
ルロース（ワットマン社製）に吸着せしめ、０．０２Ｍ
から０．０５Ｍのトリス塩酸緩衝液（ＰＨ７．３）イオ
ン強度勾配溶液４０ｍｌで溶出し、６分画に分けて第１
分画を透析し、脱塩し、凍結乾燥すると白色の新規蛋白
質８５ｍｇを得た． 本物質は５００ｍｃｇ／ｍ１で、組織培養におけるロイ
ケミャＬ−１２１０細胞の増殖曲線角度が２０度の遅れ
を示す活性を示し、電気泳動法で単一バンドを示した． 実施例２． ヒト血清ＩＺを用いて実施例１に示したと全く同様に処
理し、３６　２ｍｇの新規蛋白質Ｂを得た．このものは
、実施例１と同様の組織培養におけるロイケミャＬ−１
２１０細胞増殖曲線角度抑制活性を示し、ポリアクリル
アミドゲルを用いたＰＨ８．０、ＰＨ９．５、ＰＨＩＯ
．Ｏの電気泳動法で牛血清より分離された新規蛋白質Ｂ
と全く同一物質であると同定された． 実施例３． 新鮮牛肝臓１ｋｇを粉砕し、０．０５Ｍトリス＃１街液
（ＰＨ７．４）２１で抽出した．肝臓抽出液を遠心分離
にかけ、澄明な抽出液約３１を得た．この肝臓抽出液を
実施例ｌに示したと全く同様に処理し、１．３４ｍｇの
新規蛋白質Ｂを得た．このものは実施例１と同様に組織
培養におけるロイケミャＬ−１２１０細胞の増殖角度抑
制活性を示し、ポリアクリルアミドゲルを用いたＰＨ８
．０、ＰＨ９．５、ＰＨＩＯ．Ｏの電気泳動法で、牛血
清より分離した新規蛋白質Ｂと全く同一物質であると同
定された。

実施例４ 実施例１，２．３で得られた、それぞれのヒトおよび牛
の血清、また牛肝臓由来の新規蛋白質Ｂ５００ｍｃｇ／
ｍ１を用いた試験で、組織培養におけるロイケミャＬ５
１７８Ｙｉ胞に対しｌ４度、ザルコーマＳ−１８０細胞
に対し１３度、エーリッヒ力ルシノーマ細胞に対し４度
の細胞増殖曲線角度の遅れを示す活性を示した．しかし
、ラット肝臓由来の第１次組織培養細胞に対しては、全
く増殖抑制作用を示さながった．また被検各種悪性腫瘍
細胞は染色試験でいずれも生存が確認された．実施例５ 実施例１で得られた新規蛋白質Ｂを用いて動物試験を行
った． それぞれＢＤＦ．マウス（体重１８．５ｇ）５匹よりな
る試験動物群を用いた． 第１群では、新規蛋白質Ｂｌ．ｌｍｇ／匹を腹腔注射し
、同時にロイケミャＬ−１２１０細胞１ＸＩＯ’を腹腔
注射した．また第２群では、第１群と同様の実験を行っ
たのち、さらに第１回注射ｆ１　４日目に新規蛋白質８
０．０８ｍｇ／匹を腹腔注射した．対照は平均１０．０
日で死亡したが、第１群第２群ともに全数６０日迄生存
し、体重増加も無処理のＢＤＰＩマウスと同様の曲線を
示した．６０日目に断頭し、開腹したが、いずれのマ々
スにも腹水の存在は見られなかった．１群のマウスに新
規蛋白質゜Ｂを４ｍｇ−／匹腹腔内投与したが、６０日
間死亡例はみられなかった．

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の新規蛋白質Ｂの赤外線吸収スペクトラ
ムを、第２図、第３図および第４図はそれぞれ新規蛋白
質ＢのＰＨ３．０，ＰＨ７．０およびＰＨ１０．０での
紫外線吸収スペクトラムを示す．

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 融点２２０〜２２５℃（分解）の白色粉末であり；１０
   ％ドデシル硫酸ナトリウム電気泳動法による分子量が約
   ２２０００で；水に易溶性、アセトン、酢酸エチル、ベ
   ンゼン、ヘキサン、クロロホルムに不溶性であり；アス
   パラギン酸８．９％、スレオニン６．６％、セリン６．
   ４％、グルタミン酸１０．９％、プロリン４．８％、グ
   リシン４．４％、アラニン７．１％、システイン１２３
   ％、バリン５．８％、メチオニン０．７％、イソロイシ
   ン２．４％、ロイシン８．８％、チロシン２．８％、フ
   ェニールアラニン５．０％、リジン７．６％、ヒスチヂ
   ン２．５％、アルギニン３６％のアミノ酸組成を有し；
   ニンヒドリン反応陽性、アンスロン、モーリツシユおよ
   び過沃素酸反応陰性で；第１図の赤外線吸収スペクトラ
   ム［ＫＢｒペレット］を示し；紫外線吸収スペクトラム
   がＰＨ３水中で２８３ｎｍおよび２８９ｎｍに、ＰＨ７
   水中で２８０ｎｍに、ＰＨ１０．０水中で２７８ｎｍに
   吸収極大を示し、ヒトまたは動物の血液、血清または摘
   出臓器抽出液から分別され、悪性腫瘍細胞増殖抑制作用
   を有する蛋白質。