JPH03204818A

JPH03204818A - ヒトａｄｆを含有する医薬組成物

Info

Publication number: JPH03204818A
Application number: JP2260260A
Authority: JP
Inventors: Jiyunji Yodoi; 淳司淀井; Atsushi Uchida; 内田　温士; Atsushi Tagaya; 温多賀谷; Akira Mitsui; 彰三井; Tadashi Hirakawa; 平川　忠
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-28
Publication date: 1991-09-06
Anticipated expiration: 2018-05-26
Also published as: JP3409118B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ヒト成人Ｔ細胞白血病由来因子（以下ヒトＡ
ＤＦと称する）を有効成分とする放射線防護剤、抗炎症
剤、リウマチ治療剤、自己免疫疾患治療剤、虚血性臓器
障害治療剤、薬物中毒治療剤及び動脈硬化治療剤に関す
る。癌などの放射線療法時に、本発明に係るヒトＡＤＦ
を併用することにより、放射線の副作用を大幅に軽減出
来る。

また、ヒトＡＩ）Ｆはフリーラジカルの中和活性を有し
ており、フリーラジカルの生体過酸化による組織障害を
伴う炎症、リウマチ、自己免疫疾患。

虚血性臓器障害、薬物中毒、動脈硬化などの治療薬ある
いは予防薬としても広く利用できる。

一方、Ｗｏｌ　１ｍａｎ等はヒトの生体内の酸化還元蛋
白質であるチオレドキシンのアミノ酸配列を公表してい
る（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ　２６３．　（Ｎｏ　
３０）、　ＰＰ　１５５０６−１５５１２．１９８８）
。

Ｗｏｌｌｍａｎ等が示したチオレドキシンのアミノ酸配
列はヒトＡＤＦのアミノ酸配列と２ケ所が異なる以外は
全てヒトＡＤＦと同一の配列を有していた。

またヒトＡＤＦもチオレドキシン様の酸化還元作用を有
している。従って、ヒトＡＤＦをチオレドキシンと呼ぶ
研究者もいるが、本発明においてはヒトＡＤＦという用
語で統一する。

〔従来の技術〕

放射線は、癌の治療に有効な手段の一つである。

しかし、放射線は、非特異的に癌細胞だけでなく正常細
胞をも破壊するので、治療効果を上げる為に放射線量を
増せば増すほど、造血障害１発熱。

嘔吐などの副作用は免れず、また、癌が治癒出来たとし
ても、内分泌異常による発育障害、中枢神経障害などの
後遺症が問題になってくる。治療の現場では、今まで、
腫瘍の縮小効果ばかりに目が向けられていたが、治療成
績が向上し生存率が高くなるにつれ、治療前後の患者の
、あるいは長期生存者の”生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ　
ｏｆ　１ｉｆｅ）″を確保することが不可欠になってき
た。従って、放射線治療時に、放射線防護剤を併用して
正常細胞の障害を出来るだけ抑え、治療成績を向上させ
ると共に、副作用を軽減させるという考え方は重要であ
る。放射線による細胞障害は、放射線により生体内に発
生したフリーラジカルが原因と考えられているが、この
フリーラジカルを不活性化して副作用を軽減しようとい
う考えから、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、あるいは
その他のＳＨ化合物が放射線防護剤として研究開発され
てきた。ところが、ＧＳＨは試験管内では確かに放射線
防護効果が認められたものの、細胞膜を通過出来ないた
め、動物に投与しても殆ど効果は認められなかった。

また、米国で開発されたＳＨ化合物の一つであるＷＲ−
２７２１（Ｓ　−２−（３−アミノプロピル−アミノ）
−エチルホスフォロチオ酸）は、放射線による骨髄幹細
胞の障害を防ぐことは出来たが、それ自身に強い副作用
があり日本では製造が中止されている。一方、生体由来
の蛋白質であるインターロイキン１　　（ＩＬＩ）にも
放射線防護作用があることが見いだされたが、ＩＬＬは
発熱活性があり、人体に投与する場合、投与量が制限さ
れる。

また、作用機構もよくわかっていないので、活性を自由
に制御することが難しい。従って、現在、放射線治療時
の副作用を有効に抑え、しかもそれ自身の毒性が低いよ
うな防護剤は見いだされていない。

放射線による生体障害の原因と考えられるフリーラジカ
ルは、炎症、あるいは、リウマチ、自己免疫疾患、虚血
性臓器傷害、薬物中毒などにおいても多量に生体内に発
生し、強力な酸化反応（過酸化反応）により生体膜、蛋
白質、酵素、あるいはＤＮＡを攻撃し生体を傷害する原
因となる、と考えられている。また、動脈硬化はフリー
ラジカルの一種である過酸化脂質の蓄積が原因と考えら
れている。従って、放射線防護作用を有するＳＨ化合物
が強力なフリーラジカル消去作用を持つとき、この物質
は炎症あるいはその他の生体過酸化を伴う上記の各種疾
患の治療薬あるいは予防薬としても有効に利用できる。

一方、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、フ
リーラジカルの一種である０！−を消去する活性を持ち
、現在抗炎症薬として開発が進められているが、生体内
半減期が１０分以内と非常に短（、化学修飾あるいはリ
ポソームへの封入などを施して半減期を延ばす工夫が必
要であり、臨床応用をする上での難関となっている。

尚、酸化還元能を有するヒトＡＤＦ　（ヒトチオレオト
キシン）のフリーラジカル消去活性については、今日、
我々が報告するまで明らかになっていなかった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の課題は、癌放射線療法などに於いて、有効に放
射線の副作用を軽減する事が出来、更にフリーラジカル
による炎症や生体過酸化を伴う各種炎症の治療あるいは
予防に有効で、しかも生体に対する毒性が低いヒトＡＤ
Ｆを含有する薬剤の提供である。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明者は、上記課題を解決する為に鋭意検討を行った
結果、ヒトＡＤＦに優れた放射線防護効果、抗炎症効果
、リウマチ治療効果、自己免疫疾患の治療効果、虚血性
臓器障害治療効口譜が薬物中毒治療効果及び動脈硬化治
療効果を見い出し本発明を完成するに至った。

以下、本発明の詳細な説明する。

ヒトＡＤＦは、ヒト成人型Ｔ細胞白血病患者より樹立さ
れたＴ細胞白血病細胞株（ＡＴＬ−２）の培養上清中に
最初に見出された蛋白質であり、本発明者は既に、蛋白
質の精製及びｃＤＮＡのクローニングに成功し、さらに
遺伝子組み換え法によりリコンビナントヒトＡＤＦの大
量生産にも成功している。（特開平１−８５０９７）。

ヒトＡＤＦは、大腸菌、高等植物、兎などのチオレドキ
シンに共通の活性部位の構造を有しており、しかも、リ
コンビナントヒトＡＤＦはチオレドキシン様の還元活性
を有している事も確認された。さらに、ヒトＡＤＦはフ
リーラジカル消去能を有することも、今回の我々の発明
により初めて明らかにされた。

本発明で使用するヒトＡＤＦ蛋白質は、次の方法あるい
はそれ以外の方法で製造したものなど、その製法に制限
はない。■ヒト由来細胞株（ＡＴＬ−２など）の細胞培
養上清、または細胞抽出液から、塩析、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、クロマトフオーカシング
、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー
などの一般に用いられる手法により精製する。（特枯草
菌、酵母、高等動物細胞、植物細胞などの宿主細胞に導
入し、宿主細胞内で発現した組換えヒトＡＤＦ蛋白質を
、■に記したような手法を用いて精製する。（特開平１
−８５０９７）■ペプチド化学合成法により、（Ｉ）の
配列を有するポリペプチドを合成する。

くり返し述べるが、いずれの生産法を用いてもよい。

本発明のヒトＡＤＦを、放射線療法時に投与することに
より、放射線による副作用を大幅に軽減させることが出
来る。例えば、放射線全身あるいは局所照射による治療
を必要とする各種の癌、また、骨髄移植に先だって放射
線全身照射が必要な急性、慢性白血病、再生不良性貧血
など放射線療法を必要とする各種疾患に適用が可能であ
る。また、ヒトＡＤＦは、ヒト由来の蛋白質であるので
、人体に投与しても異物として認識されず、毒性は非常
に低い。ヒトＡＤＦの投与は、特に制限はないが放射線
照射の前、後、あるいは照射前後に渡って体重１　ｋｇ
当り１−３０ｍｇの用量を数回行う。

投与時期は、照射直前、直後各１日以内を含めるのが望
ましく、投与量は、１０■／体重眩程度が望ましいが、
照射線量、患者の症状に応じて変化させる。また、投与
方法は、静脈内投与、筋肉内投与またはその他の投与方
法によればよい。

本発明のヒトＡＤＦは、種々のフリーラジカルを還元し
消去する能力も有している。また、フリーラジカルがＳ
−３架橋を持った蛋白質あるいは酵素と反応すると分子
内あるいは分子間に誤ったＳ−Ｓ架橋が形成され、活性
を失うが、本発明のヒトＡＤＦはこのような失活した蛋
白質あるいは酵素のＳ−Ｓ架橋を矯正し、活性を回復さ
せる能力も有している。従って、フリーラジカルによる
生体傷害を伴う炎症、あるいは、リウマチ、自己免疫疾
患、虚血性臓器障害、薬物中毒などの疾患においてヒト
ＡＤＦを投与することにより症状を大幅に軽減できる。

更に、フリーラジカルの蓄積が原因と考えられる動脈硬
化の予防、治療薬としても利用できる。

くり返し述べるが、本発明のヒトＡＤＦを含有する薬剤
は放射線防護剤や抗炎症剤としての用途以外にもリウマ
チ、自己免疫疾患、虚血性臓器障害、薬剤中毒及び動脈
硬化などの予防あるいは治療剤として広範囲に利用でき
る可能性がある。

本発明で使用されるヒトＡＤＦは第１図に示した配列を
持つポリペプチドに限定されるものではない。

即ち、ヒトＡＤＦ活性がある限り、Ｎ末端にメチオニン
残基が付加されたポリペプチド、化学修飾、塩基置換法
によりアミノ酸配列に置換が加わったポリペプチド、ア
ミノ酸配列の一部に欠損があるポリペプチド、アミノ酸
残基の挿入があるポリペプチド、あるいは側鎖に糖鎖等
が付加されたポリペプチドでもよい、好ましくは第１図
に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド及び第１図
に示したアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが付加され
た構造を持つポリペプチドが良い。また、ヒトＡＤＦの
活性部位も既に明らかになっているので、蛋白質工学的
に自由に活性をコントロールすることも可能である。

はないが、通常いずれの場合も０．０１〜１００．０重
量％、好ましくは００１〜５０重量％含有させればよい
。またヒトＡＤＦ以外にマンニトール、マルトースなど
の種々の安定化剤や賦形剤を添加すればよい。

以下、本発明を実施例に基づいて説明する。

〔実施例１〕リコンビナントヒトＡＤＦの調製公知の方
法（特開平１−８５０９７）に従い、リコンビナントヒ
トＡＤＦを調製した。まず、ヒトＡＤＦｃＤＮＡを組み
込んだプラスミドＤＮＡで大腸菌をトランスフオームし
、大腸菌体内でヒトＡＤＦを発現させた後、イオン交換
クロマトグラフィーなどにより精製を行い、リコンビナ
ントＡＤＦ標品を得た。２０１ｉｔｅｒの大腸菌培養液
から１ｇの精製標品が得られた。この標品は、５Ｏ５−
ＰＡＧＥで分子量１２，０００の単一のバンドを示し、
イムノブロッティングを行ったところ、抗ヒトＡＤＦ抗
体と反応した。また、チオレドキシンとしての還元活性
を有し、その比活性は大腸菌由来チオレドキシンと同程
度であった。

このリコンビナントヒトＡＤＦを、ＰＢＳに対して一晩
透析した後、０．２２μｍミリポアフィルタ−に通して
滅菌し、濃度を０．５■／ｍｅに調整した後以下の実験
に用いた。

〔実施例２〕リコンビナントヒトＡＤＦのｉｎ　ｖｉｖ
。

放射線防護効果マウス（ＩＣＲ）に８．５ＧｙＯＸ線を照射した直後（
０日月）から−日おきに、１０日日目で計６回、腹腔内
にリコンビナントヒトＡＤＦを注射投与した。投与量は
、１匹、１回当り４００μｇとした。第２図に示したよ
うに、コントロールの無投与群では、照射後１１日凹か
ら死亡し始め、２１日日目でに全マウスが死亡したのに
対し、ＡＤＦ投与群では、３０日ローおいても全マウス
が生存した。

〔実施例３〕リコンビナントヒトＡＤＦのフリーラジカ
ル還元能本発明のヒトＡＤＦは、フリーラジカルの還元活性を有
することが明らかになった。第３図に示すように、リコ
ンビナントヒトＡＤＦ、チオレド× キシンレダクターゼ（ＴＡＲ）　、ＮＡＤＰＨからなる
還元型チオレドキシン再生系にキサンチンオキシダーゼ
とキサンチンから成るフリーラジカル（０□−、Ｈ，Ｏ
□）生成系を加えたところ、ＮＡＤＰＨの消費に伴う３
４０ｎｍの吸光度の減少が観察された。

去酵素であるＳＯＤにより阻害されなかったのに対し、
過酸化水素（Ｈ２０□）消去酵素であるカタラーゼによ
り阻害されたことから、ヒトＡＤＦは過酸化水素を還元
する能力を有することが明らかになった。

尚、第３図のΔＡ　３４０　／ｍｉｎとは３４０ｎｍの
吸光度の減少量を示す。

〔実施例４〕リコンビナントヒトＡＤＦの失活酵素の活
性回復効果本発明のヒトＡＤＦは、フリーラジカルにより失活した
酵素の活性を回復させる活性を有することが明らかにな
った（第４図）。リボヌクレアーゼＡ　（ＲＮａｓｅＡ
）は分子内に４つのＳ−Ｓ結合を有するが、還元剤であ
るジチオスレイトール（ＤＴＴ）によるＳ−８結合の還
元に引き続き、フリーラジカルの一つである過酸化水素
（Ｈ２Ｏ２）と反応させると分子内あるいは分子間に間
違ったＳ−８架橋が形成され不活化されたスクランブル
ＲＮａｓｅを作ることができる。スクランブルＲＮａｓ
ｅは活性を失っているが、ここに酸化型及び還元型のり
コンビナンドヒトＡＤＦを作用させると、時間と共にＲ
ＮａｓｅＡの活性が回復した。この反応は、第５図に示
すように還元型ＡＤＦにより間違ったＳ−Ｓ結合が切断
された後、酸化型ＡＤＦにより正しいＳＳ結合がかけら
れたためと考えられる。ＲＮａｓｅ活性は、２’、３’
−ｃＣＭＰの加水分解反応に伴う２８６　ｎｍの吸光度
の増加速度を測定し算出した。

結果は第４図に示した。

〔実施例５〕リコンビナントヒトＡＤＦの血中動態リコンビンナントヒトＡＤＦ　（以下ｒＡＤＦと略する
）２．５■（生理食塩水１ｍｌに溶解）をマウス（Ｃ５
７ＢＬ／６．４週齢、雌）の腹腔に投与後、−定時間経
過の後マウスをエーテル麻酔し心臓から採血し血清を採
取した。血清に含まれるｒＡＤＦを５Ｏ５−ＰＡＧＥと
イムノブロッティングにより検出した後、デンシトメー
ターによりプロッティング膜上のｒＡＤＦのバンドを定
量し、血清中ｒＡＤＦの濃度を算出した。第６図に示す
ように、ｒ　ＡＤＦは投与１５分後から血中に出現し、
１時間で血中濃度は最大に達しその後徐々に減少した。

この結果から、ｒＡＤＦの血中半減期は約１．５時間と
計算された。

明らかにＳＯＤより血中半減期が長いという結果を得た
。

〔発明の効果〕

本発明のヒトＡＤＦは優れた放射線防護作用以外に優れ
たフリーラジカル消去活性及び、フリーラジカルにより
失活した酵素を再活性化させる能力をも有する有用な物
質である。従って、ヒトＡＤＦを有効成分として含有す
る医薬製剤は放射線防護剤以外にフリーラジカルによる
生体障害を伴う炎症の治療剤、あるいはリウマチ、自己
免疫疾患、虚血性臓器疾患、薬物中毒及び動脈硬化など
の治療及び予防剤として有用である。

またヒトＡＤＦはヒト由来の蛋白質であるので、人体に
投与しても異物として認識されず、毒性は極めて低い。

さらに、血中半減期が１．５時間と、ＳＯＤに比べ１０
倍以上長いので、ＳＯＤよりはるかに低濃度で効果を発
揮するという特徴を合せもつ。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＡＤＦのアミノ酸配列を示す。第２図はヒトＡＤＦの放射線防護効果を示す。第３図はヒトＡＤＦのフリーラジカル還元能を示す。第４図はヒトＡＤＦの失活酵素の活性回復効果を示す。第５図はＲＮａｓｅの構造変化を示す。第６図はヒトＡＤＦの血中動態を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトＡＤＦを有効成分として含有する放射線防護
剤。
（２）ヒトＡＤＦを有効成分として含有する抗炎症剤。
（３）ヒトＡＤＦを有効成分として含有するリウマチ治
療剤。
（４）ヒトＡＤＦを有効成分として含有する自己免疫疾
患治療剤。
（５）ヒトＡＤＦを有効成分として含有する虚血性臓器
障害治療剤。
（６）ヒトＡＤＦを有効成分として含有する薬物中毒治
療剤。
（７）ヒトＡＤＦを有効成分として含有する動脈硬化治
療剤。
（８）ヒトＡＤＦが下記のアミノ酸配列（ I ）を有す
る請求項（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（
６）又は（７）記載の放射線防護剤、抗炎症剤、リウマ
チ治療剤、自己免疫疾患治療剤、虚血性臓器障害治療剤
、薬物中毒治療剤、又は動脈硬化治療剤。〔アミノ酸配列１〕（Ｎ末端）【遺伝子配列があります】（Ｃ末端）（９）
ヒトＡＤＦが大腸菌で生産されたものである請求項（１
）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）又は（７
）記載の放射線防護剤、抗炎症剤、リウマチ治療剤、自
己免疫疾患治療剤、虚血性臓器障害治療剤、薬物中毒治
療剤又は動脈硬化治療剤。