JPH0320706B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は架橋アガロースよりなる分離材料およ
び該分離材料の製造方法に関する。

多糖類分子から構成される寒天およびアガロー
スゲルはなかんずくかかるゲルが多量の水を結合
できるためにクロマトグラフイー分離、例えば溶
存物質の拡散に基づくような方法に広く応用され
ている。これらの分離においては各種分子サイズ
の物質の混合物を水性溶液に浸漬したゲル粒子床
を通過させる。その際異なるサイズの分子はその
ゲル床を異なる速度で通過する（このタイプの分
離は一般に「ゲル過」と指称されている）。ゲ
ルの分離特性は細孔径および場合により存在する
分子をゲルに吸着させる基に左右される。それ故
ゲル過ではゲルの示すこのような基、例えば荷
電した基が極めてわずかであることが重要であ
る。迅速な分離を可能とするには分離すべき物質
を含有する溶液をゲル床をポンプで通過させる。
この関連で、その分離を分割能を保持しつつ行な
うには粒子サイズを小さくすることが必要であ
る。溶液をゲル床をポンプで通過させる場合には
ゲル粒子のサイズに依存する逆圧が生じる。より
小さい粒子を用いる場合には、より高い圧力が必
要となるがその場合にそれらがつぶれて流動特性
が損われたり最悪の場合には流れの停止がおきな
いようにするには、より高度の剛性が必要とされ
る。

ゲル過により生物学的物質を分離するための
理想的なゲルは、親水性、巨孔性であり、化学的
に抵抗性があり、機械的に安定であるべきであ
り、また荷電した基あるいは他の吸着中心を含ん
でいるべきではない。

このようなゲルはイオン交換体およびアフイニ
テイー材料などの生産物のための基本マトリツク
ス材料の製造にとつても理想的であろう。

クロマトグラフイーおよび電気泳動分離のため
の寒天およびアガロース生産物は商業的に入手す
ることができ、またその出発材料は前掲の諸要求
を満たすために様々な方法で改変が加えられてい
る。化学的観点および機械的観点のいずれの観点
からもそれらゲルをより安定にするために、それ
らゲルは架橋されるが、その場合に分子鎖Ｚは出
発重合体の２個のヒドロキシ官能部分（その酸素
原子は前記分子鎖Ｚの結合点となる）の間に導入
され、そして次の結合すなわち −Ｏ−Ｚ−Ｏ− が生じる。このタイプの架橋が多数ゲルに導入さ
れるとその構造は安定化する。すなわち例えばエ
ピクロロヒドリンによる架橋は米国特許第
3507851号明細書に記載され、また官能基−
COCl、−SO₂Clおよび−Ｎ＝Ｃ＝Ｓを含む二官能
性反応剤による架橋は米国特許第3860573号明細
書に記載されている。英国特許第1352613号明細
書は荷電した基の含有量を低下させるための非酸
化条件下にエピハロヒドリン、ビス−エポキシ
ド、ジビニルスルホンおよびその他の架橋性ビニ
ル化合物による架橋を記載している。

しかしながら、入手し得る製品はゲル床におい
て高圧が生じると理想的ゲルの基準のうち小ゲル
粒子による分離に有用なものとするのに充分な機
械的安定性という要求に適合し得ないことが明ら
かとなつている。迅速な分離に対する需要が高ま
つていることから、このいわゆるHPLC（高速液
体クロマトグラフイー）はますます重要となつて
きている。それ故、文献上既知の方法によるアガ
ロースゲルの変性は望ましい剛性を達成するのに
充分な手段ではなかつた。J.Porath氏ら
〔「Journal of Chromatography」第103巻第49〜
62頁（1975）参照〕は特に様々な鎖長の架橋剤の
アガロースゲルの特性に対する影響を研究し、挿
入分子鎖Ｚが５原子の鎖長を有する架橋剤を用い
ると剛性が相当に向上したゲルが得られることが
確立した。これらの結果は当該鎖長が細孔のサイ
ズに全く影響を及ぼすことなくアガロースゲルの
構造中にはまり込むものと解釈されていた。

今や驚くべきことに、架橋反応を新しい方法で
行なうことにより大幅に改善された流動特性を有
するゲルを得ることができることを見出した。

本発明によれば架橋は２工程プロセスで行なわ
れる。一つの反応工程においては２個の結合点の
間に６〜12原子の鎖長（前記Ｚ参照）を与える少
なくとも１種の二官能性または多官能性架橋剤が
用いられる。明らかなことではあるが、これは
Porath氏らにより至適結果を与えることが見出
されているものよりも相当長い鎖である。もう一
つの反応工程では重合体を２〜５原子の鎖長を与
える少なくとも１種の架橋剤と反応させる。異な
る鎖長を有する架橋剤を用いるこれら２工程の組
合せにより一段と優れた特性を有する生産物が得
られる。長い方の架橋剤（６〜12原子の鎖長）と
の第１反応を好ましくは非プロトン溶媒中で行な
いかく得られた生成物を第２工程で短い方の架橋
剤（２〜５原子の鎖長）により安定化することが
特に有利である。

従つて、本発明は架橋アガロースゲルよりなる
分離材料であつて該分離材料はそのアガロースが
一方において２個の結合点の間に６〜12原子の連
鎖を与える少なくとも１種の二官能性または多官
能性架橋剤、そして他方において２個の結合点の
間に２〜５原子の連鎖を与える少なくとも１種の
二官能性架橋剤を用いて架橋されていることを特
徴としている。

本発明方法はアガロースを２工程でａ）２個の
結合点の間に６〜12原子の連鎖を与える少なくと
も１種の二官能性または多官能性架橋剤、および
ｂ）２個の結合点の間に２〜５原子の連鎖を与え
る少なくとも１種の二官能性架橋剤を用いて好ま
しくは記載の順序で架橋することを特徴としてい
る。

脂肪族エポキシドまたはそれらの相当するハロ
ヒドリン類またはエピハロヒドリン類またはハラ
イド類が架橋剤として使用されるのが好ましい。
何故ならこれら化合物はヒドロキシ基含有マトリ
ツクスに対しエーテル結合を形成するからであ
る。このタイプの結合はクロマトグラフイー分離
において通常採用される条件下において化学的に
安定であり、また反応の際に望ましくない吸着作
用を生じ得る荷電した基が導入されることはな
い。

第１反応工程ではヒドロキシドによる中和化を
避けるためにハロゲニドを含有しない架橋剤を用
いるのが好ましい。このために第１反応工程で有
利に適用される長い方の架橋剤は通常エポキシド
からなる。

長い方の架橋剤を用いるこの第１工程のための
二官能性架橋剤としては例えば式 （式中Ａは、場合により芳香族基によりおよ
び／または１個またはそれ以上の酸素原子により
中断されそして場合により１個またはそれ以上の
ヒドロキシル基により置換され、高々１個の酸素
原子がこの二官能性架橋剤の一つの同じ炭素原子
に結合する直鎖状または単一分枝鎖状アルキレン
基でありそしてＡは２〜８原子の鎖長を有する）
で表わされる化合物が挙げられる。芳香族基は好
ましくはフエニル基である。

本発明方法に用いられる二官能性架橋剤として
は式 および を有する化合物が挙げられる。

四官能性架橋剤としては例えば式 を有する化合物を用いることができる。

前述のエポキシドに代えて、相当するハロヒド
リン類、エピハロヒドリン類またはハライド類を
用いることができる。

短い方の架橋剤としては例えば式 Hal−CH₂−CH（OH）−CH₂−Hal （式中Halは塩素または臭素である）で表わされ
る化合物あるいは前記ジハロヒドリンをハロゲン
化水素を脱離することにより得ることができる式 で表わされる相当するエポキシ化合物、または式 を有する化合物ジエポキシブタンが挙げられる。

第１架橋工程の反応は副反応を抑えまた出発材
料であるアガロースの安定性を高めるために非プ
ロトン溶媒中で行なわれる。しかしながら、非プ
ロトン溶媒を用いる場合にはゲルのヒドロキシル
基含有量が減少し、そのためそのゲルには相当す
る疎水性要素が与えられるという副作用が起こり
得る。これに対処するために最後の架橋工程を二
つの部分工程に分け、その第１部分工程を非プロ
トン溶媒中で行ないそして第２部分工程を水性溶
液中で行なうのが好ましい。場合によつては最後
の架橋工程は全面的に水性溶液中で行なわれる。

第１架橋工程および第２架橋工程においてはそ
れぞれの工程で単一の架橋剤または２種またはそ
れ以上の異なる架橋剤の混合物を用いてもよい。
好ましくは、この関係において同じ鎖長群内の架
橋剤が異なる工程内で用いられる。しかしながら
両方の鎖長群からの架橋剤混合物を用いることも
充分考えられ、その場合には例えば異なる鎖長群
に属する成分を２工程間で、第１工程においては
一方の群からの成分のシエアを優勢とし第２工程
においては他方の群からの成分シエアを優勢とす
るというように変えることができる。

更に水性溶液中のエピクロロヒドリンを第２架
橋工程で用いる場合には、その架橋剤を反復添加
することができる。

本発明による生成物は１〜13のPH値の水中で安
定でありまたそれらの分離特性を失うことなしに
乾燥させたり、オートクレーブのなかで水中で再
膨潤させ且つ滅菌することができる。これら生成
物の剛性およびそれにより改善される流動特性に
関しては以下の実施例から明らかとなろう。ゲル
をイオン交換体およびクロマトグラフイー用の他
のマトリツクスを製造するためのおよび生物学的
活性物質が結合されるゲルを製造するための出発
材料として用いるにはゲルクロマトグラフイーに
理想的なゲルを特徴付けるものと同じ特性も望ま
しい。

本発明をゲル過のために工夫されたアガロー
ス生産物を用いて例示する。なお前述の応用例の
ための生成物の製造に本発明生成物を出発材料と
して用いることの有利さは明白である。

実施例 １ ａ 硼水素ナトリウムで処理されそして６重量％
のアガロース濃度を有するビーズ状（粒子サイ
ズは５〜25μｍ）アガロースゲル100mlをアセ
トン中で繰返し沈降させることにより水からア
セトンに移しそしてアセトンを添加して全容量
を200mlとした。ペンタエリスリトールトリグ
リシジルエーテルとペンタエリスリトールテト
ラグリシジルエーテルとの（１：１）混合10ｇ
および45％水酸化ナトリウム１mlを添加しそし
てその懸濁液を室温で一夜撹拌した。その混合
物を撹拌しながら８時間還流した後それを過
しそしてゲルをまず300mlのアセトンで洗浄し
次いで３回その都度300mlの水で洗浄した。

ｂ 前記工程ａ）のゲルを反復洗浄法によりジメ
チルスルホキシド（DMSO）に移し、そして
その容量を100mlに調整した。40ｇエピクロロ
ヒドリンおよび0.5ｇの硼水素化ナトリウムを
添加しそして温度を50℃に上げた。架橋剤に対
し当量の45％水酸化ナトリウムの混合物を６時
間にわたつて滴加しそしてその反応混合物を一
夜撹拌した。冷却後、生成物を反復沈降法によ
り水に移しそして全量を100mlに調整した。等
モル量に比較して10％過剰の45％水酸化ナトリ
ウムおよび0.5ｇの硼水素化ナトリウムを添加
し次いで40ｇのエピクロロヒドリンを６時間に
わたつて滴加した。その混合物を連続的に撹拌
しながら50℃に一夜保持し、過しそしてゲル
を４回その都度300mlの水を用いて洗浄した。

実施例 ２ 硼水素化ナトリウムで処理されたビーズ状アガ
ロースゲル（40〜80μm、６重量％）100mlを実施
例１と同様にではあるが、ジメチルスルホキシド
中の40ｇのエピクロロヒドリンに代えて水中の40
ｇのエピクロロヒドリンと反応させまた最後の水
中でのエピクロロヒドリン反応は行なわなかつ
た。

実施例 ３ ａ 実施例1a）と同様に硼水素化ナトリウムで
処理されたビーズ状アガロースゲル（40〜
80μm、６重量％）100mlをアセトンに移しそし
て10ｇの１，３−ビス−グリシドキシブタン10
ｇと反応させた。

ｂ 得られた水洗された生成物をDMSOに移し
そして実施例1b）と同様に40ｇのエピクロロ
ヒドリンと反応させたが最後の水中でのエピク
ロロヒドリン反応は行なわなかつた。

実施例 ４ ａ 実施例1aと同様に硼水素化ナトリウムで処
理された100mlのビーズ状アガロースゲル（５
〜15μm、６重量％）をジグライムに移しそし
て10ｇの１，４−ビス−グリシドキシブタンと
反応させた。

ｂ 得られた水洗物を実施例2b）に記載の方法
で反応させた。

実施例 ５ ａ 実施例1a）と同様に100mlのビーズ状アガロ
ースゲル（５〜25μm、12重量％）をアセトン
に移しそしてペンタエリスリトールトリグリシ
ジルエーテルおよびペンタエリスリトールテト
ラグリシジルエーテルの（１：１）混合物10ｇ
と反応させた。

ｂ 得られた水洗された生成物を100mlのアセト
ンに移しそして40ｇのエピクロロヒドリンおよ
び当量の45％水酸化ナトリウムと反応させた。
しかしながら、それら反応物を８分割しそして
１時ごとに１対ずつ添加した。次いで反応を更
に２時間進行させた。冷却後生成物を水に移し
そして実施例1b）の第２エピクロロヒドリン
反応と同様に40ｇのエピクロロヒドリンと反応
させた。

比較試験例 クロマトグラフイー系における本発明によるゲ
ルの剛性を試験するために実施例１，２および３
のゲルを直径５mm、長さ250〜300mmのクロマトグ
ラフイーカラムに充填した。速度を上げながらカ
ラムに水をポンプ給送し、同時に生じる圧力増を
追跡することにより圧力／流速プロフイルを記録
することができた。比較対照として英国特許第
1352613号明細書の記載に従つてアガロースを２，
３−ジブロモプロパノールで架橋することにより
製造されたアガロース市販品（Sepharose CL
−6B、フアルマシア・フアインケミカルズ社製
品）も試験した。市販品は約２Kg／cm²まで実質的
に直線的な圧力−流速依存性（有用な作業範囲を
示す）を示しそして約４Kg／cm²において潰れるの
に対し実施例１のゲルは約25Kg／cm²まで、実施例
２および３のゲルは約10Kg／cm²まで実質的に直線
的な圧力−流速依存性を示すことが明らかになつ
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アガロースが一方において２個の結合点の間
   に６〜12原子の連鎖を与える少なくとも１種の二
   官能性または多官能性架橋剤、そして他方におい
   て２個の結合点の間に２〜５原子の連鎖を与える
   少なくとも１種の二官能性架橋剤を用いて架橋さ
   れていることを特徴とする架橋アガロースよりな
   る分離材料。 ２ アガロースを２工程でａ）２個の結合点の間
   に６〜12原子の連鎖を与える二官能性または多官
   能性架橋剤、およびｂ）２個の結合点の間に２〜
   ５原子の連鎖を与える二官能性架橋剤を用いて好
   ましくは記載の順序で架橋することを特徴とする
   分離材料の製造方法。 ３ 第１工程でビス−またはポリエポキシドであ
   る架橋剤ａ）を用いる特許請求の範囲第２項に記
   載の方法。 ４ 第１架橋工程を非プロトン溶媒中で行なう特
   許請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。 ５ 最終架橋工程を二つの部分工程に分け、その
   第１部分工程は非プロトン溶液中で行ないそして
   第２部分工程は水性溶液中で行なう特許請求の範
   囲第２項ないし第４項のいずれかに記載の方法。 ６ 最終架橋工程を水性溶液中で反応させる特許
   請求の範囲第２項ないし第４項のいずれかに記載
   の方法。