JPS6039558A - 分離材料およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は架橋アガロースよりなる分離材料および該分離
材料の製造方法に関する。

多糖類分子から構成される寒天およびアガロースゲルは
なかんず（かかるゲルが多量の水を結合できるためにク
ロ２）グラフィー分離、例えば溶存物質の拡散に基づく
ような方法に広く応用されている。これらの分離におい
ては各種分子サイズの物質の混合物を水性Ｍ液に浸漬し
たゲル粒子床を通過させる。その際異なるサイズの分子
はそのゲル床を異なる速度で通過する（このタイプの分
離は一般に１ゲル濾過」と相称されている）。ゲルの分
離特性は細孔径および場合により存在する分子をゲルに
吸着させる基ＶＣ左右される。それ故ゲル濾過ではゲル
の示すこのような基、例えば荷電した基が極めてわずか
であることがＭ９である。迅速な分離を可能とするには
分離すべき物質を含有する溶液をゲル床をポンプで通過
させる。この関連で、その分離を分割能を保持しつつ行
なうには粒子サイズを小さくすることが必要である。溶
液をゲル床をポンプで通過させる場合にはゲル粒子のサ
イズに依存する逆圧が生じる。より小さい粒子を用いる
場合には、より高い圧力が必要となるがその場合にそれ
らがつふれて流動特性が損われ７ｃシ最悪の場合には流
れの停止がおきないようにするには、よシ高度の１ｌｉ
ＩＩＩ性が必要とされる。

ゲル濾過により生物学的物質を分離するだめの理想的な
ゲルは、親水性、巨孔性であり、化学的に抵抗性があり
、機械的に安定であるべきであり、また荷電した基ある
いは他の吸着中心を含んでいるべぎではない。

このようなゲルはイオン交換体およびアフィニティー材
料などの生産物のための基本マトリックス材料の製造に
とっても理想的であろう。

クロマトグラフィーおよび電気泳動分離のための寒天お
よびアガロース生産物は商業的に入手することかでき、
またその出発材料は前掲の諸要求を満たすために様々な
方法で改変が加えられている。化学的観点および機緘的
観点のいずれの観点からもそれらゲルをよシ安定にする
ために、それらゲルは架橋されるが、その場合に分子Ｍ
Ｎ　Ｚは出発重合体の２個のヒドロキシ官能部分（その
酸素原子は前記分子鎖Ｚの結合点となる）の間に導入さ
れ、そして次の結合すなわち −ｏ−ｚ−ｏ− が生じる。このタイプの架橋が多数ゲルに導入されると
その構造は安定化する。すなわち例えばエピクロロヒド
リンによる架橋は米国特許第３．５０７：８５１号明＃
ｉｌｌ　−ｉ！ｉ’　Ｋ記載され、また官能基−ＣＯＣ
Ｌ、　−８Ｏ２ＣＡおよび−Ｎ＝Ｃ＝Ｓを含む二官能性
反応剤による架橋は米国特許第５，８６０，５７３号明
細書に記載されている。英国特許第１，３５２，６１３
号明細書は荷電した基の含有骨を低下させるための非酸
化条件下にエビハロヒドリン、ビス−エポキシド、ジビ
ニルスルホンおよびその他の架橋性ビニル化合物による
架橋を記載している。

しかしながら、入手し得る製品はゲル床において高圧が
生じると理想的ゲルの基準のうち小ゲル粒子による分離
に有用なものとするのに充分な機械的安定性という要求
に適合し得ないことが明らかとなっている。迅速な分離
に対する需要が高まっていることから、このいわゆるＨ
ＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）はますます重要
となってきている。それ故、文献上既知の方法によるア
ガロースゲルの変性は望ましい剛性を達成するのに充分
々手段ではなかった。

Ｊ、　Ｐｏｒａｔｈ氏ら（「Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｂｙＪ第１０３巻第４９〜６２
頁（１９７５）参照〕は特に様々な鎖長の架橋剤のアガ
ロースゲルの特性に対する影響を研究し、挿入分子鎖Ｚ
が５原子の鎖長を有する架橋剤を用いると剛性が相当に
向上したゲルが得られることが確立した。これらの結果
は当該鎖長が細孔のサイズに全く影響を及ぼすことな（
アガロースゲルの構造中にはまシ込むものと解釈されて
いた。

今や駕くべきことに、架橋反応を新しい方法で行なうこ
とにより大幅に改善された流動特性を有するゲルを得る
ことができることを見出した。

本発明によれば架橋は２工程プロセスで行なわれる。一
つの反応工程においては２個の結合点の間に６〜１２原
子の鎖長（前記２参照）を与える少なくとも１種の二官
能性または多官能性架橋剤が用いられる。明らかなこと
ではあるが、これはＰｏ　ｒ　ａ　ｔｈ氏らによシ至適
結果を与えることが見出されているものよシも相当長い
鎖である。

もう一つの反応工程では重合体を２〜５原子の船長を与
える少なくとも１秤の架橋剤と反応させる。異なる鎖長
を有する架橋剤を用いるこれら２工程の組合せにより一
段と優れた％性を有する生産物が得られる。長い方の架
橋剤（６〜１２原子の鎖長）との第１反応を好ましくは
非プロトン溶媒中で行ないか（得られた生成物を第２工
程で短い方の架橋剤（２〜５原子の鎖長）によシ安定化
することが特に有利である。

従って、本発明は架橋アガロースゲルよシなる分離材料
であって該分離材料はそのアガロースが一方において２
個の結合点の間に６〜１２原子の連鎖を与える少な（と
も１種の二官能性または多官能性架橋剤、そして他方に
おいて２個の結合点の間に２〜５原子の連鎖を与える少
なくとも１種の二官能性架橋剤を用いて架橋されている
ことを特徴としている。

本発明方法はアガロースを２工程でａ）２個の結合点の
間に６〜１２原子の連鎖を与える少なくとも１種の二官
能性または多官能性架橋剤、およびｂ）　２個の結合点
の間に２〜５原子の連鎖を与える少なくとも１種の二官
能性架橋剤を用いて好ましくは記載の順序で架橋するこ
とを特徴としている。

脂肪族エポキシドまたはそれらの相当するハロヒドリン
類またはエビハロヒドリン類またはハライド類が架橋剤
として使用されるのが好ましい。何故ならこれら化合物
はヒドロキシ基含有マトリックスに対しエーテル結合を
形成するからである。このタイプの結合はクロマトグラ
フィー分離において通常採用される条件下において化学
的に安定であシ、また反応の際に望ましくない吸着作用
を生じ得る荀電した基が導入されることはない。

第１反応工程ではヒドロキシドによる中和化を避けるた
めにノ・ロゲニドを含有しない架橋剤を用いるのが好ま
しい。このために第１反応工程で有利に適用される長い
方の架橋剤は通常エポキシドからなる。

長い方の架橋剤を用いるこの第１工程のための二官能性
架橋剤としては例えば式 （式中人は、場合により芳香族基によシおよび／または
１個またはそれ以上の酸素原子によシ中〃ｉされそして
場合により１個またはそれ以上のヒドロキシル基によシ
置換され、高々１個の酸素原子がこの二官能性架橋剤の
一つの同じ炭素原子に結合する直鎖状または単一分枝鎖
状アルキレン基でありそしてＡは２〜８原子の鎖長な有
する）で表わされる化合物が誉げられる。

芳香族基は好ましくはフェニル基である。

本発明方法に用いられる二官能性架橋剤としては式 を有する化合物が挙げられる。

四官能性架橋剤としては例えば式 を有する化合物を用いることができる。

前述のエポキシドに代えて、相当するノ・ロヒドリン類
、エピハロヒドリン類またはノ・ライド類を用いること
ができる。

短い方の架橋剤としては例えば式 ％式％ （式中Ｈａｔは塩素または臭素である）で表わされる化
合物あるいは前記ジノ＼ロヒドリンをノ・ロゲン化水素
を脱離することにより得ることができる式 ％式％ で表わされる相当するエポキシ化合物、または式 ％式％ を有する化合物ジェポキシブタンが挙げられる。

第１架橋工程の反応は副反応を抑えまた出発材料である
アガロースゲルの安定性を高めるために非プロトン溶媒
中で行なわれる。しかしながら、非プロトン溶媒を用い
る場合にはゲルのヒドロキシル基含有量が減少し、その
ためそのゲルには相当する疎水性要素が与えられるとい
う副作用が起こり得る。これに対処するために最後の架
橋工程を二つの部分工程に分け、その第１部分工程を非
プロトン溶媒中で行ないそして第２部分工程を水性溶液
中で行なうのが好ましい。場合によっては最後の架橋工
程は全面的に水性溶液中で行なわれる。

第１架橋工程および第２架橋工程においてはそれぞれの
工程で単一の架橋剤または２種またはそれ以上の異なる
架橋剤の混合物を用いてもよい。好ましくは、この間係
において同じ鎖長群内の架橋剤が異なる工程内で用いら
れる。しかしながら両方の鎖長群からの架橋剤混合物を
用いることも充分前えられ、その場合には例えば異なる
鎖長群に属する成分を２工程間で、第１工程においては
一方の群からの成分シェアを優勢とし第２工程において
は他方の群からの成分シェアを優勢とするというように
変えることができる。

更に水性溶液中のエピクロロヒドリンを第２架橋工程で
用いる場合には、その架橋剤を反復添加することができ
る。

本発明による生成物は１〜１３のｐＨ値の水中で安定で
あシまたそれらの分離特性を失うことなしに乾燥させた
シ、オートクレーブのなかで水中で今膨潤させ且つ滅菌
することができる。

これら生成物の剛性およびそれによシ改善される流動特
性に関しては以下の実施例から明らかとなろう。ゲルを
イオン交換体およびクロマトグラフィー用の他のマトリ
ックスを製造するためのおよび生物学的活性物質が結合
されるゲルを製造するための出発材料として用いるには
ゲルクロマトグラフィーに理想的なゲルを特徴付けるも
のと同じ特性も望ましい。

本発明をゲル沖過のために工夫されたアガロース生産物
を用いて例示する。なお前述の応用例のための生成物の
製造に本発明生成物を出発材料として用いることの有利
さは明白である。

実施例　１ ａ）硼水素化す）　ＩＪウムで処理されそして６重量−
のアカロース濃度を有するビーズ状（粒子サイズは５〜
２５μｍ）アガロースゲル１００ｄをアセトン中で繰返
し沈降させることにより水からアセトンに移しそしてア
セトンを添加して全容量を２００　ｍｌとした。−！８
：ンタエリスリトールトリグリシジルエーテルとペンタ
エリスリトールテトラグリシジルエーテルとの（１：１
）混合１０？および４５チ水酸化す）　ＩＪウム１　ｍ
ｌを添加しそしてその懸濁液を室温で一夜攪拌した。そ
の混合物を攪拌しながら８時間還流した後それを濾過し
そしてゲルをまず３００−のアセトンで洗浄し次いで３
回その都度３００　ｍｌの水で洗浄した。

ｂ）前記工程ａ）のゲルを反復洗浄法によシジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）に移し、そしてその容量を１０
０−に調整した。４０？のエビクロロヒドリンおよび０
．５９の硼水素化ナトリウムを添加しそして温度を５０
℃に上げた。架橋剤に対し当量の４５チ水酸化ナトリウ
ムの混合物を６時間にわたって滴加しそしてその反応混
合物を一夜攪拌した。冷却後、生成物を反復沈降法によ
り水に移しそして全量を１００ｄに調整した。

等モルＭＩＩＣ比較して１０チ過剰の４５％水酸化ナト
リウムおよび０．５１の硼水素化ナトリウムを添加し次
いで４０２のエビクロロヒドリンを６時間にわたって簡
加した。その混合物を連続的に攪拌しながら５０℃に一
夜保持し、濾過しそしてゲルを４回その都度３００−の
水を用いて洗浄した。

実施例　２ 硼水素化ナトリウムで処理されたビーズ状アガロースゲ
ル（４０〜８０μｍｎ１６創ｉ％）１００＋ｎ／を実施
例１と同様にではあるが、ジメチルスルホキシド中の４
０１のエビクロロヒドリンに代えて水中の４０２のエビ
クロロヒドリンと反応させまた最後の水中でのエビクロ
ロヒドリン反応は行なわなかった。

実施例　６ ａ）実施例１ａ）と同様に硼水素化ナトリウムで処理さ
れたビーズ状アガロースゲル（４０〜８０μｍ、６重量
係）１００−をアセトンに移しそして１０ｙの１，６−
ビス−グリシドキシブタン１０ｔと反応させた。

ｂ）得られた水洗された生成物をＤＭＳＯに移しそして
実施例ｉ　ｂ）と同様に４Ｏｒのエビクロロヒドリンと
反応させたが最後の水中でのエビクロロヒドリン反応は
行なわなかった。

実施例　４ ａ）実施例１　ａ）と同様に硼水素化す）　Ｉ）ラムで
処理された１００−のビーズ状アブｆロースゲル（５〜
１５μｍ、６重量％）をジグライムに移しそして１０ｆ
の１，４−ビス−グリシドキシブタンと反応させた。

ｂ）得られた水洗物を実施例２ｂ）に記載の方法で反応
させた。

実施例　５ ａ）実施例１ａ）と同様に１００−のビーズ状アカ゛ロ
ースゲル（５〜２５μｍ、１２重量％）をアセトンに移
しそしてベンタエリスリトールトリグリシジルエーテル
およびペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル
の（１：１）混合物１０Ｆと反応させた。

ｂ）得られた水洗された生成物を１００−・のアセトン
に移しそして４０９のエピクロロヒドリンおよび当量の
４５チ水酸化ナトリウムと反応させた。しかしながら、
それら反応物を８分割しそして１時ごとに１対ずつ添加
した。次いで反応を更に２時間進行させた。冷却後生成
物を水に移しそして実施例１ｂ）の第２エピクロロヒド
リン反応と同様に４０９のエピクロロヒドリンと反応さ
せた。

比戟試験例 クロマトグラフィー系における本発明によるゲルの剛性
を試験するために実肺例１．２および３のゲルを直径５
ｍｍ、長さ２５０〜３００朋のクロマトグラフィーカラ
ムに充填した。速度を上げながらカラムに水をポンプ給
送し、同時に生じる圧力増を追跡することにより圧力／
流速プロフィルを記録することができた。比較対照とし
て英国特許第１３５２６１３号明細書の記載に従ってア
ガ四−スを２，３−ジブロモプロパノールで架橋するこ
とにより製造されたアガロース市販品（５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ■ＣＩ、−６Ｂ、ファルマシア・ファインケミカル
ズ社製品）も試験した。市販品は約２　ｋｇ／ａｎ２ま
で実質的に直線的な圧力−流速依存性（有用な作業範囲
を示す）を示しそして約４勢缶２において潰れるのに対
し実施例１のゲルは約２５輪２まで、実施例２および６
のゲルは約１０ｋｇ／ｃｍ２まで実質的に直線的な圧力
−流速依存性を示すことが明らかになった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）アガロースが一方において２個の結合点の間に６〜
   １２原子の連鎖を与える少なくとも１種の二官能性また
   は多官能性架橋剤、そして他方において２個の結合点の
   間に２〜５原子の連鎖を力える少なくとも１種の二官能
   性架橋剤を用いて架橋されていることを特徴とする架橋
   アガロースよシなる分離材料。 ２）アガロースを２工程でａ）２個の結合点の間に６〜
   １２原子の連鎖を与える少々（とも１種の二官能性また
   は多官能性架橋剤、およびｂ）２個の結合点の間に２〜
   ５原子の連鎖を与える少なくとも１種の二官能性架橋剤
   を用いて好ましくは記載の順序で架橋することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の分離材料の製造方法
   。 ３）第１工程でビス−またはポリエポキシドである架橋
   剤ａ）を用いる特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４）第１架橋工程を非プロトン溶媒中で行なう特許請求
   の範囲第２項または第３項に記載の方法。 ５ン　最終架橋工程を二つの部分工程に分け、そのＭ１
   部分工程は非プロトン溶媒中で行ないそして第２部分工
   程は水性溶媒中で行なう特許請求の範囲第２項ないし第
   ４項のいずれかに記載の方法。 ６）最終架橋工程を水性溶液中で反応させる特許請求の
   範囲第２項ないし第４項のいずれかに記載の方法。