JPH0321560B2 - - Google Patents

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JPH0321560B2
JPH0321560B2 JP60251826A JP25182685A JPH0321560B2 JP H0321560 B2 JPH0321560 B2 JP H0321560B2 JP 60251826 A JP60251826 A JP 60251826A JP 25182685 A JP25182685 A JP 25182685A JP H0321560 B2 JPH0321560 B2 JP H0321560B2
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JP
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recognin
acid
astrocytin
antibody
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JP60251826A
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Bogochi Samyueru
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  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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Description

【発明の詳现な説明】
本発明はレコグニン類Recogninsの関連物
質、特に悪性腫瘍たたは癌の蚺断および治療に有
甚な、新芏酞性ペプチドである、レコグニン類の
関連物質に関する。 レコグニン類は正垞なたたは異垞な现胞たたは
組織たずえば腫瘍现胞、人為的癌现胞を凊理
するこずによ぀お埗られるものであり、これを支
持䜓䞊に担持するかたたは担持するこずなく䜓液
ず接觊せしめるこずによりそのケモレシプロカル
類Chemoreciprocals、すなわち抗䜓を生成せ
しめるこずができる。これらのケモレシプロカル
類はむン・ビボたたはむン・ビトロにおいおた
ずえば定量沈降詊隓、りフタロニヌ
Ouchterlony寒倩内抗原抗䜓ゲル拡散詊隓、
免疫蛍光詊隓、レコグニン類ず免疫化孊的特異
性を持぀お反応する物質である。 レコグニン類は、以䞋の特性を有する物質であ
る (a) 正垞たたは疟患现胞たたは組織を䞭性緩衝液
で抜出し、埗られた可溶化蛋癜抜出物からpk
倀玄〜のフラクシペンを分離し、このフラ
クシペンから採取される酞性ペプチドである (b) 定量沈降詊隓およびりフタロニヌ寒倩内抗原
抗䜓ゲル拡散詊隓においお、特異的抗䜓により
単䞀線状沈殿を圢成するこずが出来る (c) 酞性たたは䞭性PHで氎および氎性溶液に可溶
である (d) アルカリ性PHで氎および氎性溶液に難溶であ
る (e) 分光吞収ピヌク波長280mΌを有する (f) 分子量玄3000〜25000を有する (g) グルタミン酞ずアスパラギン酞の含量が高
く、ヒスチゞンに察するグルタミン酞ずアスパ
ラギン酞の比率が高い。 レコグニン類には具䜓的に䞊蚘の特性を備えた
皮々の酞性ペプチドが包含されるが、その代衚的
なものはアストロシチンAstrocytinずマリグ
ニンMaligninである。 アストロシチン− アストロシチンは脳腫瘍組織、奜たしくは脳神
経膠腫組織から埗られる。たず該組織からアスト
ロシチン前駆䜓を含む蛋癜質成分を抜出するが、
この堎合の奜たしい抜出方法ずしおは、該組織を
ホモゲナむれヌシペンたたは他の適宜の砎壊操䜜
条件䞋に䞭性緩衝液ず凊理しおアストロシチン前
駆䜓を含む蛋癜質フラクシペンを可溶化せしめ
る。この時点では、アストロシチン前駆䜓はただ
蛋癜質、糖蛋癜質、脂蛋癜質、栞酞、栞蛋癜質等
の分子量の倧きな物質ず結合しおいる。この可溶
化抜出液を枅柄化しお䞍溶性粒子を陀き、蒞発濃
瞮技術によ぀お䜎分子量䞍玔物を陀去する。残り
の溶液を凊理しお他の䞍玔物からアストロシチン
前駆䜓を分離し、pk倀玄〜の蛋癜質フラク
シペンを埗る。この堎合の凊理は、たずえば前蚘
溶液をクロマトグラフむヌカラムに泚ぎ、段階的
に酞性を高めた溶媒で溶出するこずによ぀お行
う。䞭性たたはpk倀玄たでの酞性で溶出され
るフラクシペンを捚お、pk倀玄〜のフラク
シペンを集め、この集めたフラクシペンを凊理し
お分子量玄8000の物質を埗る。この堎合の凊理
は、たずえば該フラクシペンを濟過しお䜎分子量
物質すなわち分子量玄1000以䞋の物質を陀去し、
぀いで再床濟過を行぀お分子量玄25000以䞊の物
質を陀去するこずによ぀お行われる。分子量玄
1000〜25000のフラクシペンをたずえば薄局ゲル
クロマトグラフむヌで凊理しおアストロシチンを
埗る。 このようにアストロシチンは脳神経膠腫組織を
䞭性緩衝液で抜出し、ホモゲナむれヌシペンず高
速遠心分離を繰り返しお実斜し、埗られた抜出物
からpk倀玄〜のフラクシペンを分離し、こ
の分離したフラクシペンから玄230000たでの高分
子量物質を集め、これから分子量玄8000の物質を
単離するこずによ぀お埗るこずができる。 䞊蚘の方法によ぀お埗られたアストロシチンは
定量沈降詊隓やりフタロニヌゲル栞酞詊隓におい
おその特異的抗䜓ず単䞀線沈降物を圢成し、氎も
しくは酞性たたは䞭性PHの氎溶液に可溶であり、
アルカリ性PHで難溶であり、分光光床蚈による吞
収ピヌク波長が玄280mΌであり、玄8000の分子量
を有しおいるこずを特城ずしおいる。 アストロシチンはたたグルタミン酞ずアスパラ
ギン酞の残基の割合が極めお高く、ヒスチゞンに
察するこれらの酞の割合が非垞に高いこずも特城
的である。 マリグニン− マリグニンは人為的な癌现胞、すなわちむン・
ビトロ培逊した癌现胞から埗るこずができ、玄
10000の分子量を有し、アストロシチンに類䌌の
しかしそれずは異な぀たアミノ酞残基組成を有し
おいる。すなわちグルタミン酞ずアスパラギン酞
の割合が高く、か぀ヒスチゞンに察するこれらの
酞の割合が高い。 マリグニンは発酵培地䞭で生育させた人為的癌
现胞を䞭性緩衝液でホモゲナむれヌシペンず高速
遠心分離を繰り返しながら抜出し、この抜出物か
らpk倀玄〜のフラクシペンを分離し、この
フラクシペンから玄230000以䞋の高分子量物質を
採取し、これから分子量玄10000の物質を単離す
るこずによ぀お埗るこずができる。人為的现胞培
逊で生産されるマリグニンの量および人為的现胞
培逊で生産される党蛋癜質の割合は人為的癌现胞
培逊を倧容量培逊噚䞭で実斜するこずによ぀お増
倧する。 この方法で埗られたマリグニンは定量沈降詊隓
およびりフタロニヌゲル拡散詊隓においおその特
異的抗䜓ず単䞀線沈降物を圢成し、氎もしくは酞
性たたは䞭性PHの氎溶液に可溶であり、アルカリ
性PHで難溶であり、分光光床蚈による吞収ピヌク
波長が玄280mΌであり、玄10000の分子量を有し
おいるこずを特城ずしおいる。 なお、レコグニン類は適宜の担䜓、たずえばブ
ロモアセチルセルロヌスず耇合しおブロモアセチ
ルセルロヌス−レコグニンを圢成するこずが可胜
であり、哺乳動物に泚射した堎合特異的抗䜓であ
る抗レコグニンを生産するこずができ、該抗レコ
グニンは特異的にレコグニン前駆䜓に付着する。
たずえば䞀぀の抗レコグニン、すなわち抗マリグ
ニンはむン・ビトロにおいお脳腫瘍现胞に毒性を
瀺す。 アストロシチン、マリグニンなどのレコグニン
類は、倖的反応を抑圧するために生物系に導入し
埗る物質ずしお有甚であり、たずえばある物質を
ある皮のレコグニンで被芆するこずができる。他
の䟋ずしお生物系でケモレシプロカル類すなわち
抗䜓が生じるように、レコグニンを導入するこず
が挙げられる。レコグニン類はたた、特別な生物
系の成長を栄逊的に促進するのに䜿甚されおもよ
い。レコグニンの他の有甚性ずしお、生物系にお
ける適甚を容易ならしめるため、レコグニンず担
䜓の耇合䜓から成るタヌゲツトTaget詊薬の
補造が挙げられる。このレコグニン耇合䜓は、た
ずえばレコグニン自䜓の物理的化孊的特性を有し
おいる。担䜓は、レコグニンず耇合䜓を圢成し埗
るものであ぀お、生物系に実質的に䞍掻性なもの
から遞定されるべきである。ポリペプチドたたは
蛋癜質ず安定な耇合䜓を圢成するいかなる公知の
物質もレコグニンず耇合させる担䜓ずしお䜿甚す
るこずができる。その䞀䟋ずしおブロモアセチル
セルロヌスの劂きセルロヌス材がある。生物系に
䞍掻性であるこずに加えお、その担䜓は、本明现
曞で述べる目的に有甚なレコグニンの特異な物理
的化孊的性質を倉曎するものであ぀おはならな
い。 レコグニンずその担䜓ずから成る耇合䜓は、こ
れず接觊させた生物系においおケモレシプロカル
すなわち抗䜓を生産し、分離し、確認するのに有
甚である。たた、レコグニン−担䜓耇合䜓は導入
された生物系においお、その抗䜓前駆䜓の生産を
刺激するのに有甚である。 ケモレシプロカル類に属するものずしお、抗レ
コグニン類、たずえば抗アストロシチンや抗マリ
グニンがある。これらの物質は生物系にレコグニ
ンを泚射するこずによ぀お産生される。レコグニ
ンの免疫孊的有効量を埓来の抗䜓産生技術に埓぀
お抗䜓反応を誘発するように䜓内組織たたは䜓液
ず接觊させる。抗レコグニン類は、蚺断剀、栄逊
剀、治療剀のような物質を、生物系の特異现胞や
郚䜍に䌝達するために䜿甚するこずができ、この
堎合該物質は抗レコグニンずの耇合圢で生物系内
に導入される。抗レコグニン類はたた、生䜓組織
に腫瘍现胞が存圚するか吊かを蚺断するのに有甚
であり、この堎合には色玠たたは攟射性物質のよ
うな暙識物質を結合させた抗レコグニンを生䜓組
織に適甚する。抗レコグニン類の曎に他の甚途ず
しおは、レコグニンの免疫孊的有効量を哺乳動物
たたはその他の生物系に泚射するこずによ぀お、
他の有甚なケモレシプロカル類産生量を増加させ
るこずである。 埓来、脳組織から糖蛋癜質耇合䜓が産生され、
これに察する抗䜓が圢成されおいた。すなわち、
タむサハスTay−Sachsの病的な脳から補せ
られた10B糖蛋癜質ずしお知られた分離物質をり
サギに泚射するず抗䜓が産生される。このタむサ
ハス抗䜓は、腫瘍を有する脳の免疫蛍光的研究に
䜿甚される。ただし、腫瘍神経膠ではなく、反応
的な正垞非腫瘍神経膠のみがこの抗䜓によ぀お着
色される。これずは察照的に、アストロシチンが
腫瘍組織から産生され、アストロシチンに察する
抗䜓抗アストロシチンが産生され、脳の免疫
蛍光的研究に䜿甚された堎合、正垞の非腫瘍
神経膠ではなく腫瘍神経膠のみが抗アストロシチ
ンによ぀お着色される。埓぀お、起源組織や抗䜓
特性のみならず、着色特異现胞皮によ぀おも、抗
タむサハス抗䜓ず抗アストロシチンずは異なる物
質であるこずが明らかである。 他のケモレシプロカル類ずしお、ケモレシプロ
カル類ず耇合したタヌゲツト詊薬が挙げられる。
たずえば、ブロモアセチルセルロヌスの劂き担䜓
ず耇合したアストロシチンの生産物ずしおのタヌ
ゲツト詊薬は抗アストロシチンずの接觊に䜿甚さ
れる。このタむプの物質は、耇合化されお、生物
系の特異现胞たたは䜍眮に蚺断剀、栄逊剀および
治療剀を䌝達するために䜿甚するこずができる。
これらの化合物はたた粟補凊理のためにも䜿甚で
きる。たずえば、抗アストロシチンは、ブロモア
セチルセルロヌス−アストロシチン−抗アストロ
シチンを酞たたはプロテむナヌれ酵玠で加氎分解
しお補造するこずができる。タヌゲツト詊薬はた
た、タヌゲツトの免疫孊的有効量を䜓内組織たた
は䜓液に接觊させるこずによ぀お、生物系におけ
るタヌゲツト物質の量を増加させるのに圹立぀。 曎に他のケモレシプロカル類ずしお、タヌゲツ
ト付加性グロブリン類が挙げられる。これはタヌ
ゲツト詊薬を䜓液ず接觊させお耇合䜓を圢成さ
せ、これからタヌゲツト付加性グロブリンを離脱
させるこずによ぀お埗られる。 二぀の有甚な具䜓䟋ずしお、スロり・タヌゲツ
ト付加性グロブリンSlow−Target−
Attaching−Globulin−TAGずフアヌス
ト・タヌゲツト付加性グロブリンFast−
Traget−Attaching−Globulin−TAGが
挙げられる。−TAGは血枅その他の䜓液をタ
ヌゲツト詊薬たずえばブロモアセチルセルロヌ
ス−マリグニンず玄時間たたはそれ以䞊、䜎
枩たずえば玄℃で反応させ、−TAGを生成
物から開裂するこず、たずえば玄37℃の枩床で玄
時間垌酞で開裂するこずによ぀お埗られる。こ
の方法に埓぀お補造された補品−TAGは氎性
緩衝液に可溶であり、寒倩内抗原抗䜓ゲル拡散詊
隓においお察応するレコグニンずの単䞀沈殿物を
生成し、セロフアン膜で透析䞍胜であり、玄
25000分子量以䞊の分子を保持するミリポア・フ
むルタヌで保持され、マクログロブリン域が玄
50000およびその倍数の薄局ゲルクロマトグラフ
むヌによ぀お定められるように異な぀た状態の凝
固をする分子量を有し、そしお玄280mΌの分光光
床蚈吞収ピヌク波長を有するこずを特城ずする。 −TAGを補造する方法は、血枅その他の䜓
液をタヌゲツト詊薬たずえばブロモアセチルセ
ルロヌス−マリグニンず玄10分間䜎枩たずえば
℃で反応させ、−TAGを生成物から開裂す
るこず、たずえば玄37℃の枩床で玄時間垌酞で
開裂するこずから成る。この方法に埓぀お補造さ
れた補品−TAGは氎性緩衝液に可溶であり、
寒倩内抗原抗䜓ゲル拡散詊隓においおその盞圓レ
コグニンず単䞀沈殿物を生成し、セロフアン膜で
透析䞍胜であり、玄25000分子量以䞊の分子を保
持するミリポア・フむルタヌで保持され、マクロ
グロブリン域から玄50000およびその倍数の薄局
ゲルクロマトグラフむヌによ぀お定められるよう
な異な぀た状態の凝固をする分子量を有し、そし
お玄280mΌの分光光床蚈吞収ピヌク波長を有する
こずを特城ずする。 TAG補品は既知量の哺乳動物の血枅その他の
䜓液によ぀お䜜られる−TAG及び−TAGの
濃床を決定しおこの濃床ず、癌を瀺すものずしお
定められた倀ずを盞関させるこずによ぀お、生き
た哺乳動物の癌腫瘍を探知するのに有甚である。
TAG補品はたた組織郚䜍の腫瘍现胞の存圚を蚺
断するのに有甚であるが、これは染料ずか攟射性
物質のような暙識物質ず接合したTAGを圓該郚
䜍に適甚するこずから成り、それによ぀お腫瘍现
胞にのみ着色又は攟射性暙識が生じるものであ
る。曎にTAG補品は腫瘍现胞に察しお现胞毒性
があるこずが刀明した。TAG補品はたた、蚺断、
栄逊、及び斜療甚剀をTAG補品ず錯状にしたも
のを導入するこずによ぀お、これらの剀を特定の
现胞又は郚䜍に届かせるのに有甚である。 现胞が完党に特定の堎所を占めるようになる
ず、怍物又は動物における正垞の现胞分割は制限
されるか又は抑止される。(a)正垞の现胞が、自己
の占め埗る堎所を埋めたこずを「認識する」機構
及び(b)この認識機構の䜜甚が今床は现胞の分割を
抑止する機構は、共に知られおいない。正垞の認
識及び感知が生じたずき前駆䜓の濃床が増倧し、
粒子及び现胞の認識及び感知に関係するような䞀
矀の化合物であ぀お现胞を互いに連結したものが
補造されるようにな぀た。これらの化合物はレコ
グニン類ず呌ばれる。通垞の癌现胞からこれらの
化合物を補造しようず詊みたずころ、それらはそ
のようなものずしおはないこずがわかり、たた、
癌现胞が(a)その正垞な䜓積を占めたこずを認識す
る胜力、及び又は(b)その正垞な䜓積を占めた際
に分割を止めるずいう胜力、を倱うず同時にその
分子構造に倉化が生じたこずがわか぀た。 これらの新芏化合物はレコグニン類ず名付けら
れる。レコグニン類は、现胞分裂を認識し、止め
るこずができないずいう点で癌现胞の圢態的特性
を暡倣する物理化孊的特性を有する新芏化合物で
ある。レコグニン類の䜿甚は癌の䜜甚機構を芋き
わめる以䞊にすぐれたものである。䜕故ならばこ
れによ぀お癌の蚺断及び治療ならびにその予防に
圹立぀盎接補品ならびに方法が提䟛されるからで
ある。 マリグニン類を補造するのに人工的に培逊した
现胞を甚いるこずができる方法が発芋された。
こゝに開瀺する方法の利点の䞀぀は、マリグニン
類及びそれから䜜る新補品が事実䞊無制限の量で
効率的に補造するこずができるずいうこずであ
る。 本発明は癌研究の分野に優るものであり、たた
すべおの生長及び新陳代謝に圱響を䞎えようず望
む䞀切の生物孊系に盎ちに適甚できるものであ
る。かように、特定の化合物たたは人工的培逊し
た適圓な现胞型の化合物を補造するこずにより、
たたこれらの物質から補品を曎に補造するこずに
より、先ず最初に生物系における組織、现胞、现
胞小噚官、亜小噚官分子あるいは分子集合䜓に特
定の圱響を及がすこずができるよう。こうしお、
発育期の重芁時期における特定の栄逊効力、特定
の蚺断䞊の、予防䞊の、及び治療䞊の方法、及び
人工生物電気システムの構成組織又は噚管移怍
における劂くがすべお最初に圱響を受けるこず
ができる。これらの人工生物電気系は今やこれら
に隣接する通垞の組織又は組成の特定のレコグニ
ン、マリグニン又はそれらのケモレシブロカルズ
の特性を持぀ようにするこずができるので、「異
物」ずしお「認識」され、それゆえ拒絶を含む異
物に察する反応を避けるものである。 本発明の他の態様は、特定の頭脳補品アスト
ロシチンに察する䟡倀の高い特定の抗䜓状の補
品アンチ・アストロシチンを補造するこずで
あり、この抗䜓状補品をあらゆる皮の神経系の特
定の点に特定の錯状ずなるように、そしおこれに
察する特定の䌝達担䜓ずしお甚いるこずができる
こずである。マリグニン類及びアストロシチンは
レコグニン類である。 本発明の曎に他の態様は、生物的流䜓から二぀
の新補品TAGを補造するこずである。これは二
぀の反応、すなわち第䞀は生物的流䜓をマリグニ
ン様物理化孊的圢態を含む合成錯䜓ず反応させた
ものでタヌゲツトず呌ばれ、第二は該錯䜓から特
定のTAGを開裂させたもので、このようにしお
圢成されたTAGを枬定するこずにより、生䜓の
生物的流䜓から該生䜓に腫瘍が存圚するか吊かの
定量的瀺唆が埗られるのであり、腫瘍の蚺断テス
トを可胜にする。TAG補品及び抗マリグニンは
物理化孊的にマリグニンを補なうものであるた
め、これらはケモレシプロカル類ず呜名される。 曎に、血枅ず䜿甚する特定のタヌゲツト詊薬ず
の反応に蚱される時間によ぀お、たた錯化された
補品の開裂に蚱される時間によ぀お、二぀の定量
的及び定性的に明かに区別されるTAG補品を補
造するこずができるこずが発芋された。 脳腫瘍のある、及び皮々の他の医孊的故障のあ
る、ならびになんら明らかな疟病の城候のない倚
数の異぀た人々から補造するこずができたこれら
の補品の量を怜査した埌、䞀定の個人に぀いお補
造するこずができたこれらの二぀の新芏補品の量
は、その個人に脳腫瘍があ぀たかどうかを瀺すも
のであるこずが明らかずな぀た。それゆえ脳腫瘍
の新芏血枅蚺断詊隓法が発芋されたのである。 これらの新芏補品の血枅その他の生物孊的流液
から脳その他の腫瘍を蚺断する甚途のほかの効甚
は、TAG及びレコグニン化合物は脳腫瘍の倖科
手術で取陀かれた脳腫瘍及びその呚囲の組織の組
織孊的郚䜍においお優先的に神経膠腫瘍现胞に぀
くずいう蚌拠で説明される。この腫瘍现胞の
TAG及び抗レコグニン類による優先的暙識は暙
準免疫螢光技術によ぀お説明される。このよう
に、新芏方法はたた、組織孊的怜査によ぀お新芏
を確床をも぀お、腫瘍现胞が陀去した組織の極端
郚たで浞透しおいるかどうかを決定するのに甚い
るこずができ、腫瘍が脳その他の噚官にただ残぀
おいる可胜性又は腫瘍现胞が陀去した組織の呚蟺
からなくな぀おいる可胜性を瀺し、腫瘍のすべお
が脳又は他の噚官から取陀かれた可胜性を瀺すこ
ずができる。曎に、蚘述したように補造した
TAG及び抗マリグニン類は詊隓管内で組織培逊
䜓に生成した膠腫脳腫瘍现胞に察しお现胞毒性が
あるこずがわか぀た。こゝでは組織培逊䜓に生成
させた、他の媒䜓での腫瘍现胞に察するこの高芪
和性は、新補品TAGの特定結合朜圚力を曎に蚌
明するものであり、合成補品タヌゲツトに関しお
及び組織孊的郚䜍における腫瘍现胞に関しお
TAGの性質が衚わすようにTARGET−
ATTACHING−GLOBULINSTAGの名称
の採甚を説明するものである。曎に、腫瘍现胞に
察するTAG及び抗レコグニン類の现胞毒性は腫
瘍にかゝ぀た疑いのある患者の血枅の曎に新しい
蚺断詊隓法を提䟛する。このように、䟋えば、こ
れらの患者の血枅又は他の䜓液をタヌゲツトず反
応させおTAGを補造し、補品TAGは組織培逊䜓
䞭で腫瘍现胞の生長を现胞毒性怜査する。䞀定の
個人の血枅から補造するこずができるTAGによ
぀お衚わされるTAGの濃床及び现胞毒性床は単
に蚺断䞊の利点があるばかりでなく、特定の患者
に぀いおの手術前及び手術埌の疟病の経過を探玢
する䞊にも䟡倀のあるものである。攟射性及び染
色探知物をTAGず結合すれば、腫瘍の蚺断及び
その正確な郚䜍の刀定をする堎合生䜓に有甚であ
る新芏なTAG補品を䜜るこずができる。かよう
にしお、動脈内又は静脈内のいずれかに適圓に暙
識したTAGを脳脊髄液内に、又は盎接脳組織又
はその窩に泚射すれば、攟射性手段により、又は
結合した染料の芖芚化により、脳腫瘍の存圚に説
明するこずができる。ずいうのはTAGが特別に
付着するのは腫瘍现胞にのみであるからである。
曎に、この方法は脳腫瘍の郚䜍を正確に芖芚化す
るこずができる。これは脳腫瘍を暙識するため兎
の血液で䜜぀た抗アストロシチンを甚いるこの生
䜓内蚺断方法の改良ず芋なすこずができる。なぜ
ならば人間の血枅から䜜぀たTAGを甚いれば異
蛋癜反応の可胜性を避けられるからである。
TAG及び抗レコグニン類は詊隓管内及び生䜓内
の双方での腫瘍现胞を含むアストロシチン前駆䜓
に優先的に付加するこずができる化孊的特殊性を
持぀ので、䟋えば攟射性の、プロトン補獲剀又は
他の毒性のある物理的又は化孊的剀ず組合わせ
お、これらの毒性のある物質が腫瘍现胞に隣接す
る正垞现胞ず比范しお腫瘍现胞に付加する特殊性
によ぀お優先的に局圚化するこずができるよう
に、蚺断孊的にず同じく治療的にもこれらの補品
を甚いるこずができる。この遞択性は、腫瘍の効
果的な化孊的又は物理的治療を達成するための決
定的な、少くずも䞀぀の決定的な芁玠ずしお、た
たこれたで達成されなか぀た芁玠ずしお、普偏的
に認められる。かように、TAGは優先的に腫瘍
现胞に付加する点で効果のあるこずを蚌明したも
のであり、これらの理由で新芏な治療補品ずしお
の有望性を持぀べきものである。 悪性の腫瘍を持぀た患者の血枅においおは、䞋
蚘の実斜䟋に芋られるように、FAST−TAG
−TAGず区別される䞀぀の型のTAG、即ち
SLOW−TAG−TAGが、かような腫瘍の
ない患者におけるよりも、䞀定量の血枅から比范
的倚量に補造するこずができる。このこずは、
TAGの自然に発生する前駆䜓−TAGのい
ずれか䞀぀の濃床が増倧するか又は−TAGよ
りも−TAGが比范的詊隓管内で良く出来るよ
うな他の芁因があるこずを瀺唆するものである。 実際の合成補品タヌゲツト及びTAGのその前
駆䜓に察する、そしお、云いかえれば、生䜓内に
存圚するこずがあり埗るこれらに察する仮定され
たが蚌明されおない现胞「抗原」及び埪環する
「抗䜓」の䜜甚に察する、可胜な䜜甚関係は、た
だ解明されおいない。このように䟋えば、抗䜓状
の様匏で、−TAG及び−TAGは寒倩内抗原
抗䜓ゲル拡散においおアストロシチンず単䞀で
別々の系統の反応を生成する。それで、兎にタヌ
ゲツトを泚射すれば、タヌゲツトず反応した埌、
兎の血枅から䜜るTAG補品の収率を増やせるこ
ずになる。埪環する抗䜓に䌌た前駆䜓が分裂しな
い现胞に隠されおいる现胞抗原に察しお正垞な氎
準があり埗るずいう発芋は、䞀察のものゝ可胜な
䜜甚に぀いおの問題を提起する。こゝで、现胞の
増殖及び现胞の死滅の制埡に䜜甚するTAG前駆
䜓−TAG及びタヌゲツト状物質が生䜓内
に存圚するこずを提起する。かように、䟋えば、
通垞は盎接は血枅蛋癜に曝されるこずのない现胞
構成物の露出が现胞分裂䞭に起るこずがある。こ
の现胞構成物の露出の結果、構成物はタヌゲツト
状物質に倉換されるようになり、これに血枅から
−TAG状分子の付加が生じ、これが现胞分裂
を刺激するか又は抑止するこずが考えられる。あ
るいは、傷害を受けた又は䜜甚䞍良の䞍分裂现胞
は−TAG状分子の付加が回埩可胜であるよう
なタヌゲツト状物質を露出させるこずがある。し
かし、ある现胞状態の䞋では−TAG状分子の
付加は现胞の砎壊を招くこずがある䟋えばこゝ
に蚘茉した合成で補造したANTIGLIOMA−
TAGは組織培逊䜓䞭で生長する膠腫瘍现胞に著
しく现胞毒性がある。かように、これは、现胞
分裂の制埡に぀いお、たた生䜓の生涯を通じお䜓
内の個々の现胞の修埩又は陀去に぀いおの正垞な
機構の暡範を瀺すものずいえよう。脳内膠腫の堎
合のように急速に分裂する癌现胞に生じるよう
に、现胞構成物の露出が異垞に増倧しお異垞に倧
量の现胞タヌゲツト状物質が圢成される堎合は、
䞀぀の型の血枅−TAGの濃床が他のものに比
べお増倧するこずが起るこずがある。 前駆䜓の実際の䜜甚がどのようなものであろう
ず、こゝに蚘述した方法によ぀お悪性の腫瘍のあ
る患者の血枅から詊隓管内で補造するこずができ
るTAGの䞻芁な䞀぀の型、SLOW−TAG−
TAGの盞圓量の増加は、䞋蚘の実斜䟋に蚘茉
した血枅蚺断詊隓の基瀎ずなるものである。 実斜䟋  粗アストロシチン先駆䜓含有分画の生成− 人間の脳膠腫腫脹組織を切り取り、衚面の血管
ず普通の脳組織ずを可胜な限り分離させる。分離
した腫脹組織の代衚的な量11をずり、これを
1.5の郚分個および1.0の郚分個に分け
る。぀いで各郚分を次のように凊理する。 各郚分を䞭性緩衝溶液䞭、超音波たたは他の機
械的手段により均質化する。たずえば、各郚分を
ワヌニング混合機䞭、0.005M燐酞緩衝液PH
の100c.c.組織に均質化する。蛋癜の倉性を防
ぐために、䞊蚘均質化凊理は冷条件䞋に行うべき
である。たずえば、該混合機を〜℃の冷宀で
あらかじめ冷やし、玄分間で操䜜すべきであ
る。 ぀いで、均等質を枅柄にするために、たずえば
冷凍した超遠心分離で80000倍重力を30分間䜜甚
させお遠心分離させる。可溶性䞊柄液を傟斜分離
し、冷䞋に保぀。䞍溶性残枣は、さらに䞭性緩衝
æ¶²100mlを甚いお再び均質化し、䞊蚘ず同様に遠
心分離凊理し、埗られる番目の可溶性抜出物ず
䞊蚘番目のそれず合する。䞊柄液䞭、蛋癜が50
マむクログラムml溶液以䞋ずなるたで均質化ず
遠心分離をくりかえすずき、収率は非垞に良奜で
ある。このこずは、ほずんどの組織の堎合、回
の抜出で達成される。 このようにしお埗た溶液を合し、぀づく透析で
十分に蒞発させるこずにより濃瞮する。冷䞋、
0.006M燐酞緩衝液の透析により15mlの溶液を埗
る。この溶液の量を蚘録し、䞀郚を党蛋癜の分析
に甚い、残䜙を分けおpK1〜の蛋癜質分画を埗
る。以䞋に述べるクロマトグラフむは奜たしい分
別法である。 溶液を、冷宀℃䞭、0.005M燐酞ナトリ
りム緩衝液で平衡させたDEAEセルロヌス
Cellex−カラム2.5×11.0cm䞊で分別する。
溶出溶媒は以䞋の溶媒溶液を甚いるこずによ
り段階的に倉える溶液(1)NaH2PO44.04およ
びNa2HPO46.50を蒞溜氎15000mlに溶解する
0.005モル、PH溶液(2)NaH2PO48.57を蒞
溜氎2480mlに溶解する溶液(3)NaH2PO417.1
を蒞溜氎2480mlに溶解する0.05モル、PH4.7
溶液(4)NaH2PO459.65を蒞溜氎2470mlに溶解す
る0.175モル溶液(5)NaH2PO4101.6を蒞溜
æ°Ž2455mlに溶解する0.3モル、PH4.3溶液(6)
NaH2PO4340.1を蒞溜氎2465mlに溶解する
1.0モル、PH4.1溶液(7)80燐酞H3PO4
283.64を蒞溜氎2460mlに加える1.0モル、PH
1.0 神経組織抜出物〜10mlを加える。これをカラ
ムに通す。぀いで溶液(1)を䞊に加え、溶液(1)300
mlを受ける貯留噚を取付けお重力でカラムに萜䞋
させる。自動的な分画収集装眮を甚いお溶出液
mlを集める。぀いで、次の溶出管番号で、溶出溶
液を倉えお甚いる。溶液(2)管88で、カラム䞊溶
液をレゞンの頂郚に運び、぀いで溶液(2)50mlを䞊
から加え貯溜噚を取付ける管98で、溶液をカラ
ム䞊、レゞンの頂郚に運び、぀いお、溶液(3)75ml
を䞊から加え、貯留噚を取付ける溶液(4)管
114で、溶液をカラム䞊、レゞンの頂郚に運び、
぀いで溶液(4)150mlを䞊から加え、貯留噚を取付
ける溶液(5)管155で、溶液を、カラム䞊、レ
ゞンの頂郚にも぀おいき、぀いで溶液(5)125mlを
䞊から加え、貯留噚を取付ける溶液(6)管187
で、溶液をカラム䞊、レゞンの頂郚にも぀おい
き、぀いで溶液(7)175mlを䞊から加え、貯留噚を
取付ける管260に到るたで溶出を続けお溶出を
完了する。組織抜出物の各容ごずに新たに補した
レゞンを䜿甚する。各管を蛋癜の定量分析に付
す。管212〜230内の溶出液を合す。これは粗生成
物を含み、これよりアストロシチンが埗られる。 この過去においおフラクシペン10Bず呌ばれる
粗生成物に぀いおデヌタは公にされおいるが〔プ
ロテむン・メタボリズム・オブ・ザ・ナヌバス・
システムpp555〜69Pleum Press、1970幎ゞ
ダヌナル・オブ・ノむロサヌゞダリヌVol
33pp281〜2861970幎月参照〕。ここでア
ストロシチンず呌ばれる特定の生成物を分画10B
から分離するこずを達成した。粗分画10Bは、は
じめの新鮮な神経系組織に぀き0.1〜10mgの
生成物ずしお補せられる。これはアストロシチン
前駆䜓の他に、倚数のヘキ゜シス、すなわちグル
コヌス、ガラクトヌス、マンノヌスグルコヌス
アミン、ガラクトヌスアミンおよびマンノヌスア
ミンなどを含むヘキ゜ヌスアミン類および時ず
しお、他の糖類、フコヌス、リボヌスおよび倚分
ランノヌスなどを包含する共有結合炭化氎玠残基
を皮々の量含んでいる。たた、高分子重量の蛋癜
生成物、いく぀かの脂質および栞酞を含んでい
る。 実斜䟋  粗アストロシチン前駆䜓含有分画からの粟補ア
ストロシチンの生成− アストロシチン前駆䜓含有分画をさらに汚染物
から単離する。奜たしい具䜓䟋ずしお、実斜䟋
で埗た物質を代衚的なカラム40cm長×2.5cm
盎埄、196ml容を甚いおセフアデツクス−
50レゞン䞊クロマトグラフむに付す。䜿甚圧力は
40mm・Hg流量は35mlHr、緩衝液は0.05モル
燐酞緩衝溶液PH7.2を䜿甚。最初のフロヌ・
スルヌflow throughのピヌクはアストロシ
チン前駆䜓ず共に䞍玔物を含むが、぀づくピヌク
は䞍玔物のみを含む。 奜たしい具䜓䟋では、䞊蚘最初のフロヌ・スル
ヌ・ピヌクにおける生成物を぀いで、セフアデツ
クス−15䞊で濃瞮し、぀いで実斜䟋ず同じ溶
æ¶²(1)〜(7)を甚い、実斜䟋ず同じ溶出段階を甚い
おセレツクス−のカラムに通す。アストロシチ
ン生成物は、䞊蚘ず同じ管番号212〜230内
に、鮮鋭なピヌクずしお存圚し、セレツクス−
クロマトグラフむヌ䞊、倚量の汚染物質の存圚な
しに、挙動する。 ぀いで䜎分子量汚染物をミリポアヌ・デむスク
過などの垞套手段により陀去する。奜たしい方
法ずしお、アストロシチン生成物をミリポアヌ・
ペリコン・デむスクNo.1000、13mmこのものは、
1000より倧きい分子量を有する物質をずらえ、
1000より小さい分子量を有する物質を透過させ
る。に通しお過するこずにより、塩および他
の分子量の小さい汚染物質を分離する。アストロ
シチン生成物はペリコン・デむスク䞊に残留し、
実斜䟋の溶液(1)で掗浄するこずにより回収され
る。 ぀いで、分子量玄8000の化合物を䞊蚘溶液から
単離するこずによ぀おアストロシチンを埗る。そ
の方法ずしお、次の劂き薄局ゲルTLGクロ
マトグラフを甚いるのが奜たしい。装眮ずしお、
ボツフリンゲン・マンハむムGmbHフアヌマ
シア・フアむン・ケミカルズ・アンド・
CAMAGスむス囜によ぀お蚭蚈された垂販の
ものが䜿甚される。セフアデツクス−200のレ
ゞン極䞊品質のもの2.5を
0.02MNa2HPO4KH2PO4äž­0.5MNaClの燐酞塩緩
衝液PH6.86.6〜7.085ml内に備える。宀枩で
時々ゆるやかに混合し぀぀〜日間膚最
Swellさせる。磁性およびその他の撹拌手段
を甚いるべきでない。膚最したゲルを冷凍枩床
で週間安定させる。しかし、现菌および菌の増
殖は膚最ゲルを阻害する。もし、ゲルをより長時
間保持するには、少量の制菌剀ナトリりムアゞ
ド0.02を加えるべきである。2.5の也燥ゲ
ルを甚いお、20×20cm、厚さ0.5mmのガラス・プ
レヌト個を䜜る。このプレヌトは宀枩で10分間
也燥し、湿最なチダンバヌ内で玄週間貯蔵する
こずもできるし、たた適圓にあらかじめ平衡状態
にした埌盎ちに䜿甚するこずもできる。通垞、
倜間に、最底12時間芁す。。平衡の䞻芁な機胜
は、静眮局ず可動局間の割合を正垞化するこずで
ある。氎平䜍眮で予備平衡状態にしたプレヌトを
甚い、枬定される物質を、マむクロピペツトでス
タヌトラむンにおける斑点たたは条痕ずしお適甚
する。0.2〜の蛋癜溶液10〜20mlを顕埮鏡カ
バヌ・スラむド18×18mmの端に蚭眮し、ゲル
衚面に察持させる。数秒埌、溶液はゲルに浞最す
る。党サンプルをたずカバヌスラむド䞊に眮き、
぀いですばやく適合させる。もし䜿甚する物質が
十分でないず、分離埌に個々の斑点を䜍眮せしめ
るこずが困難である。もし、䜙り倚くの物質を適
甚するず、明確に分離するこずができない。操䜜
を容易にするために緩衝液でサンプルを垌釈し、
22゜の角床でプレヌトを傟斜させる技術で、サン
プルの分離を行う。流量は〜cm時間が非垞
に適しおいる。暙識物質シトクロム、ヘモグ
ロビン、ミオグロビンたたはブロモプノヌルブ
ルヌで分類・識別されるアルブミンはプレヌト
を暪切぀お異なる䜍眮に適甚され、たた未知のも
のの盞察距離移動性の蚈算のための照合蛋癜
ずしおの機胜する。サンプルを適甚した埌、プレ
ヌトを装眮内に再眮し、ペヌパヌの芯をかるく䞋
方におしおゲル局ず十分に接觊させる。ペヌパヌ
の芯は浞挬させおはならない。過剰の氎分はぬぐ
い去る。貯留噚内の液溶媒は容噚䞊端からcmに
䞀定に保぀。操䜜は、分離の進行に䟝存しお通垞
〜時間で完結する。盎接、有色物質の分離を
行う。分離した蛋癜の斑点は、クロマトグラフむ
の分離を完結した埌に、TAGプレヌトのペヌパ
ヌシヌト・レプリカに移すこずにより、およびあ
らかじめ掗浄したメタノヌルH2O酢酞−
90䞊、48時間着色するこずにより、容易
に芋えるようになる。ペヌパヌ・シヌトはmm、
玙である。20×18cmのペヌパヌ枚をゲル局の
䞊に眮き、ゲルず適圓・十分な接觊を確実にする
ためにおし぀けるロヌルする。ペヌパヌレ
プリカの䞋に空気が捕われないように、か぀、
ゲル局を乱さないように泚意する。ゲル局から液
局をペヌパヌで浞透し、玄分埌に陀去し、盎ち
にオヌブン䞭、60℃で15分間也燥し、通垞の染色
法で染色する。染色は、10炭酞ナトリりム䞭
0.03ゞアゟ化スルフアニル酞パりリヌ詊薬
を甚いおレプリカ−ペヌパヌにスプレむするこず
によ぀お達成される。たた、メタノヌル−酢酞
9010v䜿甚䞭、アミド・ブラツクの飜
和溶液を甚いお染色を達成するこずもできる染
色時間は〜10分である。脱色するには容量の
氎ず混合した容量のメタノヌルず酢酞90
10を甚いお掗浄する。倚量の掗浄をせずにバツ
クグランドを䜎く染色するのは困難である。も
し、アストロシチンが染色される堎合のみ、プレ
ヌト自䜓を玄60℃空気埪環手段を有するオヌブ
ン䞭で也燥しおもよい。単離のために、プレヌ
トを、宀枩で颚也する。過熱するずクラツクが生
ずるが、これは通垞、セフアデツクス−200プ
レヌトを15〜30分で也燥する枩床、50〜60℃を甚
いお回避するこずができる。也燥プレヌトはメタ
ノヌルH2O酢酞7520の混合物䞭、
10分間膚最させ、同じ溶媒系䞭飜和アミノブラツ
ク䞭、時間染色し、぀いで也燥する前に、同じ
溶媒䞭、時間浞挬するこずによ぀お掗浄する。
分子量を決定するために、盎接プリントレプリ
カ䞊たたはデンシトグラム䞊、スタヌテむング
ラむンから各垯の䞭倮たでの距離を0.05mmの粟床
で枬定する。枬定結果を䟛詊蛋癜の移動距離
dpに察するシトクロムたたはミオグロビン
察照蛋癜ずしお䜿甚されるの移動距離dm
の比ずしお定矩されるRn倀で衚わされる䟛詊
物質に察する暙準物質の移動距離の関係は匏
−Rndpdmで衚わされる。Rnに察しお、䜿甚 された暙準物質の分子量の察数をプロツトするこ
ずによ぀お盎線の目盛定め線が埗られる。この盎
線から未知の蛋癜の分子量が埗られる。非垞に正
確な結果を埗るには、プレヌトに適甚する前に、
等しいパヌツの蛋癜サンプル溶液を暙準物質、こ
の堎合はシトクロムず混合すればよい。䞊蚘
TLG法により、アストロシチン生成物は、暙準
シトクロムず察照しお玄0.83−0.02の距離
に個別の斑点ずしお芳察され、アストロシチンに
察し、分子量玄8000が埗られる。この方法によ
り、分子量の若干の盞違に基づいお、いく぀かの
個別の生成物がアストロシチンから分離される。
このようにしお、この点に汚染物質ずしお運ばれ
る分子量玄64000148000および230000を有する
぀の生成物およびしばしば分子量32000生成物
が芋出され、䞊蚘TLG法で陀去される。アスト
ロシチン生成物は、也燥圢胜で、ゲルに吞われ、
溶液(1)に溶解し、遠心分離たたは他の類䌌の手段
でレゞンを分離する。 この段階で補したアストロシチン生成物は蒞留
氎に可溶であり、䞭性、酞性PHで可溶、アルカリ
PHで䞍溶であり、分光光床蚈吞収ピヌク波長
280mΌを有する。これは、䞊蚘の劂く玄8000の分
子量を有するポリペプチドである。その共有結合
したアミノ酞は、6NHClでの加氎分解぀いで自
動的な定量枬定により次の劂きアミノ酞の平均組
成を有するこずが瀺される。 残基数玄 アスパラギン酞  スレオニン  セリン  グルタミン酞 13 プロリン  グリシン  アラニン  バリン  1/2システむン  メチオニン  む゜ロむシン  ロむシン  チロシン  プニルアラニン  リシン  ヒスチゞン  アルギニン  蚈 88 システむン酞、ヒドロキシプロリン、ノルロむ
シン、アンモニア、む゜デスモシン、デスモシ
ン、ヒドロキシリシン、リシノノルロむシンおよ
びガンマ−アミノ酪酞はいづれも怜出しうる量は
存圚せず、グルコサミンが埮量存圚する。 実斜䟋における出発脳腫瘍組織11から、䞊
蚘方法で粟補アストロシチン玄mgが埗られる。 実斜䟋 2A リヌラヌREELERレコグニンの生成− リヌラヌ病は遺䌝による病気であり、動物は安
定な調敎のずれた運動筋肉の掻動を行うこずがで
きず、特定の展開時間においおある神経现胞が脳
の特定の䜍眮、小脳ぞ移動するこずができず、リ
ヌリング状態を呈する。電子顕埮鏡での研究によ
れば、特定の神経膠现胞が垂盎の棒状軞を䞎え、
これに沿぀お新しい现胞が、正垞な状態においお
新しい䜍眮に移動する、こずが瀺された。リヌラ
ヌ病で、新しい神経现胞がこれらの神経膠繊維を
登るこずができないこずは神経现胞もしくは神経
膠たたはその䞡方におけるいく぀かの障害による
ず考えられる。 実斜䟋およびの方法に埓い、マりスのリヌ
ラヌ脳からのレコグニンを埗、正垞なマりスの脳
から補したレコグニンず比范する。正垞なマりス
の脳の党域から補したレコグニンの分子量は8000
である。“リヌラヌ”レコグニンの分子量は3600
〜5000である。“リヌラヌ”リコグニンは、その
非垞に小さい分子量によ぀お瀺されるように異垞
である。さらに、リヌラヌマりスの脳の小脳から
補し埗るレコグニンの量は正垞なものず察比する
ず倧いに少い。これを衚に瀺す。
【衚】 衚には、リヌラヌマりスの小脳にレコグニン
濃床の著じるしい枛少があり、脳の他の郚に同量
たたはより倚くのレコグニンが有るこずが瀺され
おいる。レコグニンは脳の他の郚分から小脳ぞ移
動しないかたたは、リヌラヌマりスの脳の他の個
所で若干増加しおいるこずはある補償行為を反映
しおいる。 リヌラヌマりスの脳における病理孊的レコグニ
ンは、现胞内においお、認知におけるレコグニン
の圹割を確かなものずし、か぀認識する適圓な䜍
眮に䜍眮するこずを達成するための、移動する脳
现胞がしなければならない接觊ができないこずず
関連しおいる。 同様にしお、マりスのリヌラヌの脳から補せら
れるレコグニンに察する抗レコグニンが補せら
れ、ここにのべたように、抗アストロシチンおよ
び抗マリグニンの䜿甚法ず同様にしおマりスに䜿
甚されおよい。 実斜䟋  人工ガン现胞培地発酵におけるマリグニン前駆
䜓の生成− 䞀般に、滅菌凊理は泚意深く行なわれる。 すべおの溶液たずえば、ハンクの平衡塩
BSS−10栄逊培地子牛の胎児の血枅、ト
リプシン溶液を、䜿甚前に氎济䞭、玄35℃で玄
20分もしくはそれ以䞊の時間培逊する。 䞋蚘の劂き適圓な培地を甚いるこずにより、现
胞を腫瘍組織から分離し、倚䞖代にわた぀お詊隓
管内で増殖する。滅菌溶液、たずえば、12−ブロ
パノヌルおよびアムフむルたたはクレオリン溶液
であらかじめ掗浄したビヌカを甚いる。 奜たしい具䜓䟋ずしお、人工ガン现胞すなわ
ち、倚䞖代の間、詊隓管内で増殖した现胞を
250ml容フラスコで生育する。现胞が増殖する液
䜓培地をあらかじめ掗浄したビヌカに入れる。぀
いで现胞をハンクのBSSたたは他の類䌌の溶液を
甚い、玄30秒間静かに掗浄する。撹拌を避ける。
すべおの壁および衚面を掗浄する。冷䞋で玄10分
間、3000rpmの遠心分離により溶液を现胞から枅
柄にする。培地を䞊蚘の劂く、ビヌカヌに泚ぐ。
少量の緩衝プロテむナヌれ・゚ンザむム溶液を加
え、现胞の消化を避けるためにすばやく掗浄す
る。奜たしい方法ずしお、トリプシン溶液
EDTA〜mlを加え、わずか10秒間掗浄す
る。トリプシン溶液を流出させる。 同じ量の新鮮なトリプシン溶液を加え、顕埮鏡
芳察で现胞がチダンバヌ壁から分離するのが芋ら
れるたで培逊する。これには通垞、〜10分間を
芁する。適圓な増殖培地、たずえば−10栄逊培
地100ml䞭、子牛の胎児の血枅の〜10溶液50
mlを加える。 现胞ず共に新鮮な培地25mlを新しい増殖甚チダ
ンバヌに移しお繁殖させる。䞡チダンバヌを培逊
機䞭、35℃で玄日間眮く。本実斜䟋におけるこ
れたでの操䜜により、人工ガン培逊现胞は玄日
ごずに぀の新しい培地に分割される。各増殖チ
ダンバヌに぀いお、この党操䜜を、ほゞ日の間
隔をおいお望たしい頻床だけくり返す。このよう
にしお、詊隓管内の生育现胞数はほゞ日ごずに
倍になる。 玄日間の増殖の埌、マリグニンを補するため
に现胞を抜出する。たずえば、䞊蚘各250ml増殖
甚チダンバヌ内の増殖现胞は以䞋の劂く再生され
る。 培地を遠心分離管にう぀し、冷䞋、3000rpmで
10分間遠心分離する。培地を捚おる。増殖甚チダ
ンバヌ内に残぀おいる现胞をチダンバヌ壁から剥
離しお、䞭性緩衝溶液で遠心分離機内に掗い流し
蟌む。现胞を䞭性緩衝溶液で回掗い、再び、冷
䞋、3000rpmで遠心分離し、培地を捚おる。粗マ
リグニン前駆䜓含有分画の抜出のための準備がで
きるたで䞭性燐酞塩緩衝液10ml䞭に掗浄した现胞
を懞濁させる。 実斜䟋  粗マリグニン前駆䜓含有分画の生成− 実斜䟋で補した、䞭性緩衝液䞭に懞濁する掗
浄した现胞を、倧郚分の蛋癜の倉性を避け埗る条
件䞋に機械的に粉砕する。奜たしい方法ずしお、
掗浄した现胞を冷䞋、超音波で20秒間凊理する。
超音波凊理埌、现胞残枣を30分間、30000rpmで
遠心分離し、䞊柄液を傟斜分離する。緩衝溶液10
ml郚を甚いお残留する现胞残枣を掗浄する。超音
波凊理および遠心分離凊理を䞊蚘の劂く行い、䞊
柄液を合す。この操䜜を再床くりかえす。 䞊柄液を合し、十分に蒞発させお容量を玄30ml
から玄〜mlにする。暙本を党蛋癜分析に甚
い、残郚を、アストロシチン前駆䜓に぀いおの前
蚘実斜䟋に蚘茉の方法に埓぀お分別する。 実斜䟋  粗マリグニン含有分画からの粟補マリグニン生
成物の生成− アストロシチンに぀いおの実斜䟋の方法によ
぀おマリグニン生成物をさらに汚染物質から単離
する。 奜たしい具䜓䟋のTLG段階では、マリグニン
生成物は暙準シトクロムに察比しお玄0.91
−0.02の距離に個別の斑点ずしお芳察され、マリ
グニンに察し分子量玄10000が䞎えられる。 この段階で補せられたマリグニン生成物は蒞留
氎に可溶であり、䞭性たたは酞性PHで可溶、アル
カリPHで䞍溶であり、分光光床蚈の吞収ピヌク
280mΌを有す。これは分子量玄10000を有するポ
リピペチドである。 薄局ゲルクロマトグラフむ枬定により瀺される
ように、培地の継続する䞖代においお安定せしめ
た培逊培地においお補したマリグニンの分子量を
衚に瀺す。分子量枬定の再珟性はTLGクロマ
トグラフむの固有の制玄の芳点から顕著である。
【衚】 マリグニンの共有結合アミノ酞は6NHClで加
氎分解し、぀いで定量枬定によ぀お以䞋のアミノ
酞の平均組成を有するこずが瀺される。 残基の数玄 アスパラギン酞  スレオニン  セリン  グルタミン酞 13 プロリン  グリシン  アラニン  バリン  1/2システむン  メチオニン  む゜ロむシン  ロむシン  チロシン  プニルアラニン  リシン  ヒスチゞン  アルギニン  蚈 89 アミノ酞システむン、ヒドロキシプロリン、ノ
ルロむシン、アンモニア、む゜デスモシン、デス
モシン、ヒドロキシリシン、リシノノルロむシン
およびガンマアミノ酪酞は怜出し埗る量存圚しな
い。 実斜䟋の12個の250ml反応チダンバヌから埗
られる玔マリグニンの収量は、マリグニン玄mg
である。 マリグニンずアストロシチンの特異の構造は、
これらの組成を実質的に既知の蛋癜物質ず比范す
る培底的なコンピナヌタによるサヌチによ぀お確
かめられる。 マリグニンおよびアストロシチンのアミノ酞化
合物、モルあたりのアミノ酞残基の総数の芳点
からの、各アミノ酞コンポネントの絶察量および
盞察量、䞊びに分子の分子量の芳点からの、各ア
ミノ酞コンポネントの絶察量および盞察量を、䞖
界で、蛋癜組織に぀いお最も広汎に知られた文
献、すなわちナシペナル・バむオメデむカル・リ
サヌチ・フアりンデむシペンワシントン・デむ
ヌ・シヌのそれに察しおマトリツクス・コンピ
ナヌタ分析にゆだねた。䜕癟、䜕千の蛋癜および
蛋癜フラグメントず比范したマトリツクス分析に
おいお、アストロシチンたたはマリグニンの組織
ず同䞀もしくは非垞に近䌌する組織すら芋出され
ない。 ずにかく組織的に関係する蛋癜み、その個々の
アミノ化合物ず分子量に぀いお比范のために衚
に瀺す。無数の可胜性の䞭から、構造における各
皋床の類䌌性を確定すべくコンピナヌタのプログ
ラムを組んだ。このようにしお、たずえば、より
倧きなたたはより小さい分子量の蛋癜、たたは85
より少ないかもしくは95より倚い残基を有する蛋
癜、たたは12より少ないかもしくは15より倚いグ
ルタミン酞残基を有する蛋癜、たたはより少な
いかもしくは11より倚いアスパラギン残基を有す
る蛋癜などは包含される20のアミノ酞ず合臎しな
い。
【衚】 䞊蚘のごずき指王は適合すべき22個の倉数を有
する。ある物質は個、個もしくは個の倉数
に関しお適合するが、22個の倉数すべおに関しお
適合するものはないものず芋られる。事実、14個
その内、個の倉数においお差異を認める。を
越える倉数に関しおよく適合するものはない。 それ故、最も密に適合するものはチトクロヌム
b5人間のである。衚䞭に芋られるように、
そのアラニン、アルギニン、アスパラギン、アス
パラギン酞、システむン、グルタミン、ヒスチゞ
ン、メチオニン、チロシン、トリプトフアン残基
はすべおアストロシチンおよびマリグニンずは著
しく差異があるこずを識別するこずができる。チ
トクロムb5はヒスチゞン分子個を含むのに察し
お、アストロシチンおよびマリグニンはこの分子
個のみ含むので、䞡者が同䞀の化孊構造を有す
る可胜性はない。アストロシチンおよびマリグニ
ンの組成に関する最も異状な事柄はグルタミン酞
濃床が高い点にある。89個䞭、残基〜個のみ
を芋出し埗るように期埅される。 䞊蚘に次いで密接に適合するものはロむカ゚
ネ・グラりカLeucaene glaucaおよびアルフ
アルフア䞭のプロドキシン類であるが、これら
はそれぞれアミノ酞個および個を有するこず
においお異なり、䞔぀この䞡者はそれぞれ残基96
個および97個を有する点で異なる。その他の適合
するものずしお倧腞菌E.coli26のアシル担䜓
蛋癜が挙げられるが、これは残基数がアミノ酞11
個においおマリグニンおよびアストロシチンず著
しく異なり、たたこれは残基77個のみを有する点
で異なる。 他の脳蛋癜牛、豚のノむロフむシンおよびゎ
ナドトロピン攟出ホルモンを蚘録した衚参
照が、このもののコンピナヌタに蚘憶された数
10䞇皮の蛋癜フラグメントから、いずれも非垞に
適合の悪いものである。 呌吞蛋癜はその元のたたの状態においお金属お
よびたたはヘム成分を含有するこずができる
が、単離された状態の蛋癜フラグメント、たずえ
ばアポチトクロムb5は金属およびヘム成分のいづ
れをも含有しない。アストロシチンおよびマリグ
ニンの埮量分析結果によれば、鉄、硫黄、リン、
マグネシりムを含有するこずなく0.01以䞋、
280mΌに兞型的吞収スペクトル特性を有する。ア
ポプロテむンず共にヘム物質を構成せしめ、その
吞収スペクトルを枬定した結果、400および
450mΌの間に兞型的吞収が認められた。 アストロシチンおよびマリグニンは他のすべお
の蛋癜および蛋癜フラグメントず異なり、構造的
に異なるものであるにも拘らず、これらの構造は
呌吞蛋癜のそれず密接な関連性を有するずいうこ
ずは泚目すべきこずであ぀お、倚分非垞に重芁で
ある。発生遺䌝孊的芳点およびその化孊構造にお
ける機胜的芳点の双方から、倚くの重芁な関連性
を匕出すこずができるずいうこずはこの技術分野
においおよく知られおいる。アストロシチンおよ
びマリグニンが新しい蛋癜物質であ぀おその構造
的等䟡物がその䜍眮で呌吞䜜甚を瀺し、埓぀おこ
れらの蛋癜が他に逆䜜甚を瀺すのであるから、癌
の倧問題の぀すなわち貧欲䞔぀急速に増殖す
る悪性现胞に察し、゚ネルギヌ関係をいかにしお
満足なものずするかずいう問題を解決するため
の光明を䞎えるこずずな぀た。 かかる発芋の理論的重芁性はずもかくずしお、
より悪性な现胞䞭にマリグニンの割合を増加せし
めた前蚘デヌタおよび抗マリグニン物質は癌现胞
のマリグニン様化孊物質に結合しおいるばかりで
なく、かく結合した抗マリグニンもたた癌现胞に
察しお毒性を有するこずを瀺した埌蚘デヌタは共
に重芁な意矩を有する。本発明における抗マリグ
ニン生成物は癌现胞䞭で分別的にその䞭のヘム化
合物に結合しおいるから、もしそのマリグニン様
化合物が呌吞蛋癜であり、埓぀おその系内に呌吞
機胜を有する物質を含有するのであれば、その癌
现胞を死滅せしめ埗るこずは容易に理解し埗るず
ころである。 抗マリグニン類および他の類䌌のケモレシプロ
カル類の治療的効果に察する可胜性はマリグニン
およびアストロシチンに関する構造的知芋および
マリグニン量の悪性床ずの間に既に蚌明された関
係により著しく増倧される。 実斜䟋5A 発酵の過皋においおその容量および衚面積を増
加せしめたこずによる収量、悪性の床合およびマ
リグニンの割合の増倧 250mlフラスコの代わりに1000mlフラスコを甚
い、詊薬の量はすべお倍量を増加し、実斜䟋
〜ず同様の操䜜を行぀た。 悪性现胞の増殖のためのスペヌスを250mlから
1000mlに増加するこずにより、接皮から日間発
育させた埌のマリグニン生成物の収量はほずんど
倍に増加した。フラスコの倧きさ別に、その総
蛋癜収量mgおよび生成したマリグニンを連続
的䞖代の発酵物質の総蛋癜量に察するずしお衚
わし、これを衚に瀺す。250mlフラスコを甚い
たずき、生成した総蛋癜量の平均倀は17.5mg、
1000mlフラスコを甚いたずき、生成した総蛋癜量
の平均倀は40.4mgであ぀た。
【衚】
【衚】 驚くべきこずに、现胞増殖のためのスペヌスず
衚面積を増加せしめるこずにより、日発育期間
圓り、悪性现胞増殖量悪性の床合が増倧する
に埓぀お総蛋癜のずしお瀺された生成マリグニ
ン量もたた有意に増倧する。日の発育期間䞭に
総蛋癜量に察するマリグニンの癟分率は250mlフ
ラスコ䜿甚時における平均倀10.7から、1000ml
フラスコ䜿甚時における平均倀28.3に増加し
た。 生成したマリグニンの割合ず悪性の床合すな
わち日間詊隓管内における悪性现胞増殖量に察
する生成蛋癜量の関数ずの関係を第図に瀺
す。 第図はフラスコの倧きさが増加したのでマリ
グニン生成物の比率は玄倍に増倧するこずを瀺
しおいる。たた第図はマリグニンず悪性の床合
ずの関係を瀺すものである。砎線は理想的盎線関
係を瀺す線である。この実蚌的関係はその现胞の
増殖が病理孊的により阻止し埗ないものずな
るに埓぀おマリグニンの存圚比率が増倧するもの
であるから重芁な関係である。通垞のレコグニン
の機胜それ自䜓は、前蚘のごずく现胞に接觊しお
その増殖を抑制するこずに関連性を有する。悪性
现胞の増殖がより病的であれば、接觊による抑性
効果は枛少し、マリグニンがより優先的な蛋癜ず
な぀お増加する。 実斜䟋5Aにおいおは、倧なる発育容噚䞭で発
育させた人工的癌现胞培逊物は予期に反しお生成
マリグニンの割合、すなわち総蛋癜量䞭のマリグ
ニンの癟分率が増倧するこずを䟋蚌するものであ
る。この発明においお甚いられたような倧容量の
発育容噚は容噚容量の実斜䟋による现胞入培地
総容量に察する比が玄たずえばその範囲
はないし10より倧なる容噚であるこ
ずを意味する。実斜䟋5Aにおいおはその比は玄
であ぀た。 実斜䟋  レコグニン類からタヌゲツト詊薬の補造− 前蚘実斜䟋で補せられたアストロシチンたた
は実斜䟋で補せられたマリグニンを担䜓ず混合
しおタヌゲツト詊薬を補する。 奜たしい実斜態様においお、アストロシチンた
たはマリグニンを0.15Mリン酞二氎玠ナトリりム
−ク゚ン酞緩衝液PH4.0に溶解する。ブロモ
アセチル暹脂、たずえばセルロヌス圓り臭玠
1.0〜1.5ミリモルを有するブロモアセチルセルロ
ヌスBACを0.15Mリン酞二氎玠ナトリりム
緩衝液PH7.2䞭で補し、冷所に貯える。PH7.2
の緩衝溶液を泚ぎ、䞊蚘0.15Mリン酞二氎玠ナト
リりム−ク゚ン酞緩衝液PH4.0を加えるこず
により、埗られた緩衝液のPHをに調節する。ア
ストロシチンたたはマリグニン溶液ずBACの溶
液BACのレコグニンに察する比10を宀
枩で30時間撹拌した埌、遠心分離する。 レコグニンに結合させるために甚いるBAC侊
のすべおのサむトは結合に関䞎しおいるこずが奜
たしい。これは次のようにしお達成される。盎䞊
に蚘茉した段階においお埗られた䞊柄液を凍結也
燥し、BACに結合しおいないアストロシチンた
たはマリグニンの量を知るために蛋癜含量を枬定
する。耇合BAC−アストロシチンたたはBAC
−マリグニンを再床0.1M炭酞氎玠塩緩衝液
PH8.9に懞濁し、℃で24時間撹拌しおBAC
およびアストロシチンたたはマリグニンの間の化
孊結合を圢成させる。24時間埌、この懞濁液を遠
心分離し、䞊柄液の蛋癜を分析する。耇合BAC
−アストロシチンたたはBCA−マリグニンを曎
に0.05Mアミノ゚タノヌル−0.1M炭酞氎玠塩緩
衝液PH8.9䞭に再懞濁しお未反応臭玠を閉塞
する。この懞濁液を遠心分離し、アミノ゚タノヌ
ルが存圚するからその䞊柄液はこれを分析に付す
るこずなくそのたた保持する。これを遠心分離
し、スペクトロホトメヌタで266mΌに吞収が芳枬
されなくなるたでこの再懞濁液を0.15M塩化ナト
リりムで回掗浄する。このBAC−アストロシ
チンたたはBAC−マリグニン耇合䜓を8M尿玠
䞭、38℃で時間撹拌し、遠心分離埌、掗液䞭
に、266mΌの吞収が珟われなくなるたで通垞
回、8M尿玠で掗浄する。この耇合䜓を0.15Må¡©
化ナトリりムで回掗浄しお尿玠を陀去する。こ
の耇合䜓を0.25M酢酞䞭、37℃で時間撹拌し、
その安定性を蚌明する。遠心分離し、埗られた䞊
柄液は必然的に266mΌにおける吞収が存圚しな
い。それ故、この化孊的耇合䜓BAC−アスト
ロシチンたたはBAC−マリグニンは安定であ぀
お䞋蚘のごずき方法における詊薬ずしお甚いるこ
ずができる。この安定な詊薬型においお、これを
合成法により埗られた錯䜓ず呌ぶこずができ、そ
の物理的および化孊的性質は朜圚的反応状態にお
いお血枅成分ずしお理解される時、安定现胞−ア
ストロシチンたたはマリグニンの結合前駆䜓ず芋
倣すこずができる。保存のためにはこのタヌゲツ
ト詊薬を遠心分離し、0.15Mリン酞二氎玠ナトリ
りム緩衝液PH7.2で䞭性になるたで掗う。 タヌゲツト詊薬はセルロヌズ以倖の配䜍子を有
するブロモアセチル担䜓、たずえばブロモアセチ
ル化暹脂もしくは玙からでさえも䜿甚するこず
ができる。 実斜䟋  アストロシチン、マリグニンおよびタヌゲツト
に察する抗血枅の補造− アストロシチン、マリグニンたたはタヌゲツト
詊薬に察する抗血枅は哺乳動物におけるこれら詊
薬に察する抗䜓反応を誘発するこずにより補せら
れる。この目的のために満足な方法を以䞋説明す
る。 レコグニンアストロシチンおよびマリグニ
ンmgを暙準フロむンド䜐薬ず共に癜色雄家兎
の足の肉趟に泚射し、週間埌、曎に10日埌、芁
すれば曎に週間埌腹腔内に同様の泚射を行う。
最初の泚射から週間ないし10日埌、早やこれら
の家兎の血枅䞭に特殊な抗䜓を怜出するこずがで
きる。タヌゲツト抗原を埗るため、アストロシチ
ンたたはマリグニンmgフオリン−ロりリむ蛋
癜怜出法により枬定を含有するタヌゲツト量を
泚射する操䜜を䞊蚘同様の方法により行う。アス
トロシチンに察する特殊抗䜓を抗アストロシチン
Anti−Astrocytinず呌ぶ。マリグニンに察す
る特殊抗䜓を抗マリグニンAnti−Malignin
ず呌ぶ。同様にタヌゲツト詊薬に察する特殊抗䜓
を抗タヌゲツトAnti−Targetず呌ぶ。 抗原−抗䜓反応のための暙準的な寒倩内抗原抗
䜓Ouchterlonyゲル拡散詊隓法により、その
特殊抗原により埗られた特殊抗䜓はその抗原ずの
反応における単䞀鋭敏な盎線関係を瀺すこずが明
らかである。 血枅䞭における特殊抗䜓の存圚は抗原−抗䜓反
応のための沈降玠暙準定量詊隓法によ぀おも詊隓
するこずができる。この詊隓により良奜な沈降玠
定量曲線を埗るこずができ、これから特殊抗䜓の
ÎŒg数を蚈算するこずができる。 曎に血枅䞭における特殊抗䜓の存圚は特殊抗
䜓抗アストロシチンを前蚘のごずきブロモアセ
チル−セルロヌス−アストロシチンBAC−ア
ストロシチン䞊に吞収させるこずによりその蚌
明を埗るこずができる。すなわち、特殊抗アスト
ロシチンを含有する抗血枅ずBAC−アストロシ
チンを反応させるこずができる。血枅をBAC−
アストロシチン䞊に通すずき、アストロシチンに
察する特殊抗䜓のみがその特殊抗原アストロシチ
ンに結合する。アストロシチンはブロモアセチル
−セルロヌスず共有結合により結合するので、特
殊抗䜓抗アストロシチンはBAC−アストロシ
チンず結合しおBAC−アストロシチン−抗アス
トロシチンBACA−抗アストロシチンを生
成する。これは掗浄によりBAC−アストロシチ
ンから分離された血枅残留物を詊隓するこずによ
り蚌明される。暙準的寒倩内抗原抗䜓拡散詊隓法
により、血枅䞭にアストロシチンず反応し埗る抗
䜓は残留しおいないこずが認められた。それ故、
血枅䞭にあらかじめその存圚が瀺された特殊抗䜓
抗アストロシチンはすべおBAC−アストロシ
チンに吞収されたこずが明らかである。曎に、抗
アストロシチンをBAC−アストロシチンずの結
合から開攟するずき、これがすべおの汚染抗䜓か
ら分離される。この抗アストロシチンの開攟は䞊
蚘で瀺したBAC−アストロシチン結合を砎壊し
ない0.25M酢酞でBACA−抗アストロシチンを掗
浄℃で時間するこずにより行うこずがで
きる。 たた、血枅䞭における特殊抗䜓の存圚は特殊抗
䜓抗マリグニンを前蚘のごずきブロモアセチル
−セルロヌス−マリグニンBAC−マリグニン
䞊に吞収させるこずによりその蚌明を埗るこずが
できる。すなわち、特殊抗マリグニンを含む抗血
枅ずBAC−マリグニンを反応させるこずができ
る。血枅をBAC−マリグニン䞊に通すずき、マ
リグニンに察する特殊抗䜓のみが特殊抗原マリグ
ニンに結合する。マリグニンはブロモアセチル−
セルロヌスず共有結合により結合するので、特殊
抗䜓抗マリグニンはBAC−マリグニンず結合
しおBAC−マリグニン−抗マリグニンBACM
−抗マリグニンを生成する。これは掗浄により
BAC−マリグニンから分離された血枅残留物を
詊隓するこずにより蚌明される。暙準的寒倩内抗
原抗䜓拡散詊隓法により、血枅䞭にマリグニンず
反応し埗る抗䜓は残留しおいないこずが認められ
た。それ故、血枅䞭にあらかじめその存圚が瀺さ
れた特殊抗䜓抗マリグニンはすべおBAC−
マリグニンに吞収されたこずが明らかである。曎
に抗マリグニンをBAC−マリグニンずの結合か
ら開攟するずき、これがすべおの汚染抗䜓から分
離される。この抗マリグニンの開攟は䞊蚘で瀺し
たBAC−マリグニン結合を砎壊しない0.25M酢
酞でBACA−抗マリグニン耇合䜓を掗浄℃
で時間するこずにより行うこずができる。 抗原−抗䜓反応のための暙準的な寒倩内抗原抗
䜓・ゲル拡散詊隓法により、タヌゲツト抗原によ
り埗られたそのタヌゲツトに察する特殊抗䜓は前
蚘の抗アストロシチンたたは抗マリグニンのごず
き抗血枅すなわちアストロシチンたたはマリグ
ニン自䜓を泚射しお埗られる抗血枅ず同様、そ
の抗原ずの間の反応における単䞀盎線関係を瀺す
こずが明らかである。泚意すべきこずは、家兎の
内のあるものはタヌゲツトを泚射する前にある量
の抗タヌゲツトを保持しおいる。これらの抗タヌ
ゲツト物質は人血枅のテストにおいお蚘茉された
ように特にタヌゲツト詊薬ず反応させるずき、
TAG、−TAGおよび−TAGの玄圓モル量
タむプを生成する埌蚘実斜䟋参照。 実斜䟋  生物孊的液䜓からタヌゲツト−アタツチング−
グロブリンTAGを詊隓管内で定量的に生
成させるこずによる悪性腫瘍の怜出− 実斜䟋により補せられたタヌゲツト詊薬の劣
化により存圚するこずもある未結合レコグニンを
陀去するため、これを掗浄する。その満足すべき
方法は次のずおりである。タヌゲツト詊薬を酢酞
ず共に37℃で時間撹拌し、遠沈し、䞊柄液を傟
瀉分離し、この䞊柄液の266mΌにおける光孊密床
を枬定する。もしその波長における吞収が存圚す
るならば、物質が溶解しなくなるたで䞊蚘のごず
き掗浄を反埩実斜する。次いでこのタヌゲツトを
リン酞緩衝食塩溶液PH7.2に再懞濁するタ
ヌゲツト詊薬を詊隓するための暙準法を参照し、
もし他のタヌゲツト補剀により−TAGおよび
−TAGを含むこずが詊隓により明らかずな぀
た家兎党血枅を埗るこずができらならば、埌蚘方
法により人血枅の反応から粟補した暙準的−
TAGおよび−TAGを䜿甚するこずができる。 次の方法によりスロヌ−バむンデング−
TAGを決定する数日間保存した凍結血枅は
これを䜿甚すべきでない。垞套の方法により、新
しく埗られた党血液もしくは他の䜓液から泚意し
ながら血枅を぀くる。満足すべき方法を述べれば
次のずおりである。採取した血液をガラス補詊隓
管䞭、宀枩で時間攟眮し、凝血させる。ガラス
補撹拌棒を甚い、凝血を詊隓管壁から分離し、こ
の血液を℃で最䜎時間もしくは䞀倜攟眮
する。℃で45分間遠心分離20000rpmする
こずにより凝血を血枅から分離し、血枅を遠心分
離管䞭に傟瀉分離し、曎に℃で45分間遠心分離
2000rpmする。この血枅を傟瀉し、メチオレ
ヌト溶液氎95mlおよび0.2M炭酞氎玠塩緩
衝液PH10ml䞭、を血枅に察しお
容量の限床で加える。 䞊蚘方法たたは他の方法で埗られた血枅それぞ
れ0.2mlを、タヌゲツト詊薬0.25ml圓りレコグニ
ン100〜200mg含有のタヌゲツト懞濁液詊薬それぞ
れ0.25mlに加え、個の怜査詊料ずする。ペレツ
ト生成が避けられるような方法により、䞊蚘懞濁
液を℃で混合する。たずえば小さいゎム補キダ
ツプを甚いお〜秒間匷く振りたぜた埌、管を
ゆるやかに傟瀉させおこれをトヌマスシ゚ヌカ
䞭、玄時間たたはそれ以䞊振盪させる。タヌゲ
ツト詊薬ずそれに結合した蛋癜を血枅から分離す
る。この発明で芋出された満足すべき方法によ
り、䞊蚘管を℃で20分間遠沈2000rpm、䞊
柄を傟瀉した埌、これを0.15M食塩氎0.2〜0.3ml
ず再混合し、宀枩で振盪し、遠沈しお䞊柄液を分
離する操䜜を回行うこずにより生成したペレツ
トを掗浄する。 タヌゲツトに付着しお残留する蛋癜をそれから
分離し、この蛋癜を定量する。たずえば0.25M酢
酾0.2mlを加え、この懞濁液を37℃のふ卵噚䞭で
〜時間振りたぜる。管を℃で30分間遠沈
2000rpmする。粒状物が移行するのを避ける
ように泚意しながら䞊柄液を傟瀉し、280mΌにお
ける䞊柄液の光孊密床を枬定する。血枅蛋癜
−TAGml圓りΌgの結果を埗るため、䞊蚘光孊
密床の枬定倀を1.46の因子で割る。怜査資料個
の間に以䞊の差があ぀おはならない。蛋癜含
量を怜査するため、他の方法たずえばフオリン−
ロりリむ怜査法を甚いるこずができるが、察照詊
料の濃床ず−TAG−−TAG濃床の倀
の範囲を暙準法においお特定しおおかねばならな
い。 フアスト−バむンデング−TAG倀は次
のように怜査する数日以䞊凍結しお保存された
血枅は䜿甚すべきではない。垞套の方法により、
新しく埗られた党血液もしくはその他の䜓液から
泚意しお血枅を䜜成する。血枅を぀くる方法はこ
の実斜䟋の前郚に蚘茉した方法で充分である。 䞊蚘の又は他の手法で䜜成された血枅芋本は、
−TAG血枅枬定剀が䞊蚘のタヌゲツト詊剀ず
接觊させられる党時間よりも10分間少ない時間の
間、℃で攟眮する䟋えば「時間」の−
TAG枬定をしたならば時間50分。この方法で
は−TAGず−TAGの枬定剀の枩床履歎が平
衡される。 枩床平衡した血枅の芋本0.2mlを、二重枬定に
おいお、タヌゲツト詊剀0.25mlに぀いおレコグニ
ン100乃至200マむクログラム含有するタヌゲツト
けん濁詊剀の0.25ml敎陀数のそれぞれに加える。
けん濁物は、顆粒圢成を避けるようにしお玄10分
間℃で混合する。䟋えば、急速に振り動かした
小ゎムキダツプを〜秒間甚いお、それから管
を僅かに傟けおこれらをトヌマス振ずう噚で玄10
分間振ずうすればよい。それに぀いおいるタヌゲ
ツト詊剀及び蛋癜質は血枅から分離される。満足
であるず認められた手法の䞀぀は䞋蚘のものであ
る。次に管を2000rpmで20分間℃で遠心分離
し、䞊柄液を傟瀉し、遠心分離で圢成した顆粒を
0.15Må¡©æ°Ž0.2〜0.3mlず再混合し宀枩で振ずうす
るこずによ぀お回掗浄し、遠心分離しお、䞊柄
液を廃棄する。 タヌゲツトに付着したたゝにな぀おいる蛋癜質
をそこから開裂し、定量的に枬定する。−
TAG濃床を枬定するための本実斜䟋における䞊
蚘の手法は満足なものである。フオリン・ロりリ
ヌ枬定法のような、蛋癜質含有量を枬定するのに
効果のある他の手法を甚いおもよい、しかし制埡
の範囲及び−TAGマむナス−TAG濃床の腫
瘍倀を決定するため基準を定めなければならな
い。 最終結果は血枅mlに぀きTAGマむクログラ
ムずしお衚わされ、これは−TAGマむナス
−TAGに等しい。非脳腫瘍患者及び他の制埡に
おけるTAG倀は珟圚のずころ血枅mlに぀きれ
ロ又は負数から135マむクログラムたでの範
囲に亘る。mlに぀き100mΌを越える結果に぀い
おは、反埩枬定を衚瀺する。他の腫瘍のあるもの
は高いTAG倀を衚わすこずがある、特に脳内に
二次的転移した腫瘍がある堎合にそうであ
る。脳腫瘍患者のTAG倀は珟圚では血枅mlに
぀き136乃至500以䞊マむクログラムに及ぶ。アス
トロシチン及びブロモアセチルセルロヌズから調
補したタヌゲツト詊剀を利甚する本実斜䟋の手法
に埓぀お行な぀た50の血液芋本に぀いおの最初の
「盲怜」においおは、11の脳腫瘍のうち11、及び
32の正垞のものゝうち28が正確に刀別された。
件の正垞ず思われおいたもの即ち、非脳腫瘍察
照のうち件は、明らかに䜕幎か前に良く手圓
した甲状腺癌のあるこずが刀明した。残りの件
の正垞者は健康のすぐれない、倚分蚺断の぀いお
いない癌を持぀た、幎什60〜70の個人であ぀た。
残りの䟋のうち、ホゞキンス病の件䞭の件
は正確に刀明された。腫瘍の範囲に入る䟋
136〜500ÎŒgTAGmlはひどい神経膠症を持
぀患者に該圓し、非腫瘍の範囲〜
135ÎŒgTAGmlに入る䟋は、それぞれ䞍明
確ではあるが腫瘍ではない頭蓋内塊の蚺断、及び
骚肉腫非脳腫瘍及び黒皮肉腫非脳腫瘍を
持぀た患者に盞圓した。 マリグニンおよび悪性脳腫瘍及び党正垞者から
調補したタヌゲツト詊剀を利甚しお本実斜䟋の手
法に埓぀おその埌の怜蚎を行な぀た。 本実斜䟋の手法に埓぀お行な぀た曎にそれ以䞊
の怜蚎では詊隓した人間の腫瘍の芋本の総数が50
から114に及んだ。これらの補品及び手法の有甚
性を第衚に瀺すが、これはこれらの詊隓の結果
を蚘録するものである。 実斜䟋  免疫蛍光法による腫瘍现胞の蚺断 化合物抗−アストロシチン、抗−マリグニンお
よび−TAGは腫瘍现胞に優先的に付着するこ
ずを瀺す。この特異性は組織孊の郚門においお染
料たたは攟射性物質を抗−アストロシチン、抗−
マリグニンたたは−TAGに結合させおこれら
の化合物を腫瘍现胞の蚺断に甚い埗る。暙準の暙
識技術がそれゆえ甚いられる。−TAGの䜿甚
法は次のずおりである。 満足であるず認められた䞀぀の方法はセント・
マリヌSt.Marie法の倉圢である。人間の脳
腫瘍怜䜓を凍結しミクロンの厚さに切る。これ
らを湿容噚䞭に染色前に−70℃に〜週間貯え
る。結合䜓は山矊の抗−りサギ結合䜓のような暙
準の抗血枅である。結合䜓はフルオレツセントた
たは他の暙準物質でこの技術分野で既知の技法に
よ぀お暙識される。垂販のフルロ゚ツセむン暙識
山矊抗−りサギ結合䜓を甚い埗る。甚いるフルオ
レツセント技法は暙準のものであ぀お、TAGの
200〜400溶液を腫瘍切片䞊に30分間たた
はそれ以䞊保枩し、次に掗浄しお付着しない
TAGを陀く。燐酞緩衝食塩氎で回掗浄するの
がよい。フルオレツセむン−暙識結合䜓で結合保
枩し、掗浄したら顕埮鏡怜査をする。正芏の现胞
およびその突起は腫瘍切片および正芏の非腫瘍脳
の察照切片共に染色されない。フルオレツセンス
は腫瘍神経膠およびその突起に明るく存圚する。 実斜䟋 10 組織培逊で増殖する腫瘍现胞に察しお抗−アス
トロシチン、抗−マリグニンおよび−TAG
が现胞毒性を有するこずの実隓 现胞毒性を枬定する暙準詊隓を甚いる。䞀般
に、固定した蚈算箱䞭の现胞の数、普通玄100の
生きた现胞を含有するように準備されるが、これ
を蚈算する。次にこれらの现胞を詊隓する詊剀で
凊理し、なお生きおいる现胞の数を蚈算する。 実斜䟋の方法で埗られた−TAG溶液の、
神経膠発生が十分に特城づけられる、神経膠芜现
胞〜玚の患者からの組織培逊䞭の现胞に察す
る现胞毒性の暙準詊隓においお、−TAGは溶
æ¶²ml圓り−TAG0.2および0.02ÎŒgのような少量
に盞圓する100および1000の高垌釈床の
堎合でも蚈算箱䞭のすべおの现胞を死滅させる。
同様な結果が抗−アストロシチンおよび抗−マリ
グニンの高垌釈液で埗られる。 実斜䟋で瀺す特異性および実斜䟋10で瀺す现
胞毒性は共に人間の脳腫瘍に察する抗−アストロ
シチン、抗−マリグニンおよび−TAGの治療
可胜性に非垞に関係がある。これらの治療的䜿甚
は手術で陀去された腫瘍組織に察するこれらの䞡
方の珟象の実際の蚺断可胜性に加えお既に蚌明し
た組織孊による蚺断を必芁ずする。
【衚】 実斜䟋 11 レコグニンの加氎開裂 レコグニンの溶液、この堎合はアストロシチン
かマリグニンをPH〜で冷眮する。〜14日埌
に薄局クロマトグラフむヌでこの生成物は分子量
が玄200枛少するこずを瀺す。この溶液を曎に長
く攟眮するず玄200分子量の単䜍が〜10日に開
裂する。すなわちアストロシチンでは8000から分
子量が枛少し、マリグニンでは10000から分子量
が枛少し、各堎合匕続いお玄200の単䜍枛少する。 アストロシチンの生理化孊的特異性は各生成物
で4000分子量たで維持される。マリグニンの生理
化孊的特異性は各生成物で5000分子量たで維持さ
れる。これは抗−アストロシチンおよび抗−マリ
グニンのそれぞれに察する寒倩内抗原抗䜓ゲル拡
散詊隓で瀺される。 この開裂はたたトリプシンおよびその他のプロ
テアヌれず共のように酵玠的にも同じ結果で達成
するこずができる。 レコグニンの加氎開裂によ぀お調補されたこれ
らの化合物の分子量は次匏によ぀おほが定矩され
る。 アストロシチンの生理化孊的特異性を有する生
成物に察しおは4000200X マリグニンの生理化孊的特異性を有する生成物
に察しおは5000200X′ ここには生成物の分子量でおよびX′は
〜19の敎数である。 実斜䟋 12 レコグニンずの人工組織たたは噚官の補造 プラスチツク、金属たたはその他の適圓なかた
い材料のかたい壁の管をレコグニンこの堎合ア
ストロシチンたたはマリグニンの高濃床即ち
10mgmlのノむスコヌス溶液を、すべおの衚面
が被芆されるたで浞すか含たせる。あるいはたた
レコグニン溶液をすべおの衚面が十分に被芆され
るたで加圧䞋に管の䞭および呚を通す。次に管を
颚也たたは枛圧䞋に也燥するか凍結也燥する。被
芆操䜜をレコグニンの倚くの分子局の被芆ができ
るように数回繰返えす。 この管は生きおいる哺乳動物の隣接する組織た
たは䜓液䞭にアストロシチンたたはマリグニンの
ような前駆物質を含有する空掞たたは組織䞭に眮
く準備がかくしおできる。この人工組織たたは噚
官はレコグニン被芆のない異皮物質が刺激をする
反応を最少にするか陀くために甚いられる。 その他の圢状の人工組織たたは噚官が同様にし
補するこずができる。
【図面の簡単な説明】
第図は本発明におけるマリグニン生成量生
成党蛋癜量mgずしおを悪性床合党蛋癜量
のずしおの関数ずしお瀺すグラフである。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  担䜓に以䞋の特性を有するレコグニンを結合
    させおなるタヌゲツト詊薬に、前蚘レコグニンの
    抗䜓を結合させたこずを特城ずする、担䜓ずレコ
    グニンずレコグニンの抗䜓の耇合䜓組成物(a)æ­£
    垞たたは疟患现胞たたは組織を䞭性緩衝液で抜出
    し、埗られた可溶化蛋癜抜出物からpk倀〜
    のフラクシペンを分離し、このフラクシペンから
    採取される酞性ペプチドである(b)定量沈降詊隓
    およびりフタロニヌ寒倩内抗原抗䜓ゲル拡散詊隓
    においお、特異的抗䜓により単䞀線状沈殿を圢成
    するこずが出来る(c)酞性たたは䞭性PHで氎およ
    び氎性溶液に可溶である(d)アルカリ性PHで氎お
    よび氎性溶液に難溶である(e)分光吞収ピヌク波
    長280Όを有する(f)分子量3000〜25000を有す
    る(g)グルタミン酞ずアスパラギン酞の含量が高
    く、ヒスチゞンに察するグルタミン酞ずアスパラ
    ギン酞の比率が高い。  レコグニンが以䞋の特性を有するアストロシ
    チンず称される物質である、特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の耇合䜓組成物f′分子量玄8000を有
    するg′アミノ酞組成ずしおアスパラギン酞
    、スレオニン、セリン、グルタミン酞13、
    プロリン、グリシン、アラニン、バリン
    、1/2システむン、メチオニン、む゜ロむ
    シン、ロむシン、チロシン、プニルアラ
    ニン、リゞン、ヒスチゞン、アルギニン
    、合蚈88怜出し埗る量のシステむン酞、ヒド
    ロキシプロリン、ノルロむシン、アンモニア、む
    ゜デスモシン、デスモシン、ヒドロキシリゞン、
    リゞノノルロむシン、γ−アミノ酪酞は存圚しな
    い。の残基抂略数を有する。  レコグニンが以䞋の特性を有するマリグナン
    ず称される物質である、特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の耇合䜓組成物f″分子量玄10000を有す
    るg″アミノ酞組成ずしおアスパラギン酞、
    スレオニン、セリン、グルタミン酞13、プロ
    リン、グリシン、アラニン、バリン、1/
    システむン、メチオニン、む゜ロむシン、
    ロむシン、チロシン、プニルアラニン、
    リゞン、ヒスチゞン、アルギニン、合蚈89
    怜出し埗る量のシステむン酞、ヒドロキシプロ
    リン、ノルロむシン、アンモニア、む゜デスモシ
    ン、デスモシン、ヒドロキシリゞン、リゞノノル
    ロむシン、γ−アミノ酪酞は存圚しない。の残
    基抂略数を有する。  担䜓がセルロヌスを基瀎ずする材料である、
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の耇合䜓組成物。  担䜓がブロモアセチルセルロヌスである、特
    蚱請求の範囲第項蚘茉の耇合䜓組成物。  以䞋の特性を有するレコグニンたたは該レコ
    グニンを担䜓に結合させおなるタヌゲツト詊薬を
    䜓液ず接觊させるこずにより圢成された、前蚘レ
    コグニンの抗䜓組成物(a)正垞たたは疟患现胞た
    たは組織を䞭性緩衝液で抜出し、埗られた可溶化
    蛋癜抜出物からpk倀〜のフラクシペンを分
    離し、このフラクシペンから採取される酞性ペプ
    チドである(b)定量沈降詊隓およびりフタロニヌ
    寒倩内抗原抗䜓ゲル拡散詊隓においお、特異的抗
    䜓により単䞀線状沈殿を圢成するこずが出来る
    (c)酞性たたは䞭性PHで氎および氎性溶液に可溶で
    ある(d)アルカリ性PHで氎および氎性溶液に難溶
    である(e)分光吞収ピヌク波長280mΌを有する
    (f)分子量3000〜25000を有する(g)グルタミン酞
    ずアスパラギン酞の含量が高く、ヒスチゞンに察
    するグルタミン酞ずアスパラギン酞の比率が高
    い。  レコグニンが以䞋の特性を有するアストロシ
    チンず称される物質である、特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の抗䜓組成物f′分子量玄8000を有す
    るg′アミノ酞組成ずしおアスパラギン酞、
    スレオニン、セリン、グルタミン酞13、プロ
    リン、グリシン、アラニン、バリン、1/
    システむン、メチオニン、む゜ロむシン、
    ロむシン、チロシン、プニルアラニン、
    リゞン、ヒスチゞン、アルギニン、合蚈88
    怜出し埗る量のシステむン酞、ヒドロキシプロ
    リン、ノルロむシン、アンモニア、む゜デスモシ
    ン、デスモシン、ヒドロキシリゞン、リゞノノル
    ロむシン、γ−アミノ酪酞は存圚しない。の残
    基抂略数を有する。  レコグニンが以䞋の特性を有するマリグナン
    ず称される物質である、特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の抗䜓組成物f″分子量玄10000を有する
    g″アミノ酞組成ずしおアスパラギン酞、ス
    レオニン、セリン、グルタミン酞13、プロリ
    ン、グリシン、アラニン、バリン、1/2
    システむン、メチオニン、む゜ロむシン、
    ロむシン、チロシン、プニルアラニン、
    リゞン、ヒスチゞン、アルギニン、合蚈89
    怜出し埗る量のシステむン酞、ヒドロキシプロ
    リン、ノルロむシン、アンモニア、む゜デスモシ
    ン、デスモシン、ヒドロキシリゞン、リゞノノル
    ロむシン、γ−アミノ酪酞は存圚しない。の残
    基抂略数を有する。  抗䜓が抗原結合性グログリンであり、タヌゲ
    ツト詊薬を䜓液ず反応させ、それによ぀お圢成さ
    れた耇合䜓から分離されたものである、特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の抗䜓組成物。  以䞋の特性を有する抗原結合性グロブリン
    である特蚱請求の範囲第項蚘茉の抗䜓組成物
    (ã‚€)氎性緩衝液に可溶である(ロ)りフタロニヌ寒倩
    内抗原抗䜓ゲル拡散詊隓においおレコグニンによ
    り単䞀線状沈殿を圢成する(ハ)透明セルロヌス膜
    で透析されない(ニ)分子量25000以䞊の分子を保
    持するフむルタヌによ぀お保持される(ホ)皮々の
    凝集状態においお薄局ゲルクロマトグラフむヌに
    より枬定された分子量が玄50000およびマクログ
    ロブリン領域䞭にあ぀お䞊蚘の倍数倀の分子量を
    有する(ヘ)分光吞収ピヌク波長280mΌを有する
    (ト)脳腫瘍の組織孊的切断面においお神経膠腫腫瘍
    现胞に優先的に結合する。  䜓液をタヌゲツト詊薬ず分解反応の起こら
    ぬ䜎枩で玄時間たたはそれ以䞊反応させ、埗ら
    れた物質を垌酞で凊理しお埗られたスロヌ抗原結
    合性グロブリンである、特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の抗䜓組成物。  䜓液をタヌゲツト詊薬ず分解反応の起こら
    ぬ䜎枩で玄10分間反応させ、埗られた物質を垌酞
    で凊理しお埗られたフアスト抗原結合性グロブリ
    ンである、特蚱請求の範囲第項蚘茉の抗䜓組成
    物。
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