JPH0124800B2 - - Google Patents

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JPH0124800B2
JPH0124800B2 JP50125830A JP12583075A JPH0124800B2 JP H0124800 B2 JPH0124800 B2 JP H0124800B2 JP 50125830 A JP50125830 A JP 50125830A JP 12583075 A JP12583075 A JP 12583075A JP H0124800 B2 JPH0124800 B2 JP H0124800B2
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astrocytin
malignin
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recognin
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Bogochi Samyueru
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Description

【発明の詳现な説明】
本発明は新芏な化合物以䞋、本明现曞ではレ
コグニンRecogninsず称す。に関する。レ
コグニンは、通垞のたたは異垞な现胞たたは組
織、䟋えば腫瘍现胞たたは人為的な癌现胞を凊理
し、所望の物質を分離しお補せられる。レコグニ
ンは、これらの化孊関連物質を補するために䜓液
を有する支持物にレコグニンを接觊するこずに䜿
甚するこずができる。これらの化孊関連物質は、
蚺断および治療目的すなわち癌を蚺断したり治療
するのに有甚なものである。この化孊関連物質
は、生䜓䞭もしくは詊隓管䞭、䟋えば定量的沈
降、オヌチテロニむOuchterlony耇拡散もし
くは免疫螢光性においお免疫化孊的特性でレコグ
ニンず反応する物質である。 本発明にかかるレコグニンの぀はアストロシ
チンAstrocytinである。アストロシチンは脳
腫瘍組織、奜たしくは脳神経膠腫組織から埗られ
る。アストロシチン前兆物を含む蛋癜質成分は最
初は现胞組織から抜出される。奜たしい抜出方法
は、アストロシチン前駆物を含む蛋癜質成分を溶
解するように、均質条件䞋に䞭性緩衝物ず組織ず
を凊理するかもしくは现胞および組織を分解する
こずである。 この点でアストロシチン前駆物はただ、蛋癜
質、糖蛋癜質、脂蛋癜質、栞酞、栞蛋癜質等を含
む分子量の倧きな物質である。その埌溶解した蛋
癜質は生成した組織抜出物から分離される。組織
からの抜出溶液は粟補され䞍溶性粒子が陀去され
る。分子量の小さい汚染物は、埗られた溶液から
蒞発濃瞮技術によ぀お陀去される。埗られた溶液
はその埌凊理され、〜の範囲のpKを有する
蛋癜質を埗るように他の汚染物からアストロシチ
ン前兆物が分解される。その埌、その溶液は䟋え
ばクロマトグラフむカラムに茉眮され、酞性溶媒
で溶離される。䞭性たたはpK4以䞋の酞で溶離さ
れる蛋癜質成分はすべお捚おられ、〜範囲の
pKを有するこれらの蛋癜質成分は収集される。
溶出液はその埌凊理され、玄8000の分子量を有す
る物質が埗られる。これは䟋えば、材料をたずフ
むルタヌにかけお、分子量の小さい物質すなわち
分子量1000以䞋の物質を去し、再床フむルタヌ
にかけお玄25000以䞊の物質を去しお達成され
る。1000〜25000の範囲の分子量を有する蛋癜質
成分はその埌さらに薄局ゲルTLGクロマト
グラフむによ぀お凊理され、アストロシチンが埗
られる。 このようにアストロシチンは、均䞀および高速
の遠心分離をくり返すこずによ぀お脳神経膠腫を
䞭性緩衝物で抜出し、埗られた抜出物から玄〜
の範囲のpKを有する蛋癜質成分を分離し、そ
の蛋癜質成分から高分子量すなわち玄230000以䞊
の分子量を有する物質を分離し、それから玄8000
の分子量を有するアストロシチンを単離するこず
によ぀お、補するこずができる。 䞊蚘の方法によ぀お補せられたアストロシチン
は、定量的沈降玠テストおよびオヌチテロニむゲ
ル拡散テストにおいお特有の抗䜓を有する単䞀線
の沈降物を圢成し、酞性たたは䞭性PHを有する氎
溶液および氎成溶液に可溶であり、アルカリ性PH
では難溶であり、分光光床蚈による吞収ピヌク波
長が280Όであり、玄8000の分子量を有しおい
るこずを特城ずしおいる。 アストロシチンの特城はたた、グルタミン酞お
よびアスパラギン酞の残枣の割合がきわめお高
く、ヒスチゞンに察するこれらの酞の割合がきわ
めお高いこずである。さらにアストロシチンの分
析を以䞋に瀺す。 䞊蚘ず同様にしお、マリグニンMalignin
ず称せられる他のレコグニンは、人為的な癌现胞
すなわち詊隓管䞭で刺激を受けお成長した癌现胞
から補せられる。マリグニンは、玄10000の分子
量を有し、アストロシチンずほが類䌌しおいるが
アミノ酞残枣成分が異なる、すなわちマリグニン
は、グルタミン酞およびアスパラギン酞の割合が
高くか぀ヒスチゞンに察するこれらの酞の割合が
高い。さらにマリグニンの分析を以䞋に瀺す。 すなわち、マリグニンは、発酵培逊菌䞭で成長
した人為的な癌现胞を均䞀および高速の遠心分離
をくり返すこずによ぀お䞭性緩衝物で抜出し、埗
られた抜出物から玄〜の範囲のpKを有する
蛋癜質成分を分離し、その蛋癜質成分から高分子
量すなわち玄230000以䞊の分子量を有する物質を
分離し、それから玄10000の分子量を有する物質
を単離するこずによ぀お、補するこずができる。 人為的な现胞培逊で補せられたマリグニンの量
およびマリグニンである人為的现胞発酵で補せら
れた党蛋癜質の割合は、倧きな培逊容噚䞭での人
為的な癌现胞培逊菌の成長によ぀お増倧する。 この方法で補せられたマリグニンは、定量的沈
降玠テストおよびオヌチテロニむゲル拡散テスト
においお特有の抗䜓を有する単䞀線の沈降物を圢
成し、酞性たたは䞭性PHを有する氎溶液および氎
成溶液に可溶であり、アルカリ性PHでは難溶であ
り、分光光床蚈による吞収ピヌク波長が280Ό
であり、玄10000の分子量を有しおいるこずを特
城ずしおいる。 レコグニンの特城はさらに、ブロムアセチルセ
ルロヌズず耇合しおブロムアセチルセルロヌズ−
レコグニンを圢成するこずが可胜であり、哺乳動
物に泚射した際に特有の抗䜓である抗レコグニン
が生じ、その抗レコグニンが本来の䜍眮でレコグ
ニン前兆物に特に付着するこずである。䟋えば、
ある皮の抗レコグニン、抗マリグニンは詊隓管䞭
においお脳腫瘍现胞に毒性を瀺した。 アストロシチン、マリグニンおよびそれらに類
䌌した物質の劂きレコグニンは、生物孊系に導入
されおもよい物質ずしお有甚であ぀お、材料をレ
コグニンで被芆するが劂き異質な反応を枛少する
こずができる。生物孊系に化孊関連物質が生じる
ようにレコグニンの他の実䟋を導入するこずもで
きる。レコグニンはたた、特別な生物孊系の成長
を栄逊的に促進するのに䜿甚されおもよい。レコ
グニンの有甚性はたた、生物孊系における適応性
を促進するために担䜓を有するレコグニンの耇合
物から成るタヌゲツトTarget剀が補造でき
るこずにある。そしお䟋えばそのレコグニン耇合
物はレコグニン自䜓の物理的化孊的特性を有しお
いる。担䜓は、レコグニンず耇合物を圢成するず
ずもに生物孊的に実質的に䞍掻性である物質から
遞定されるべきである。 ポリペプチドたたは蛋癜質ず安定耇合物を圢成
するいかなる公知物質もレコグニンず耇合するの
に有甚である。その䞀䟋ずしおブロムアセチル−
セルロヌズの劂きセルロヌズ材がある。生物孊系
に䞍掻性であるこずに加えお、その担䜓は、本明
现曞で述べる目的に有甚なレコグニンの特有の物
理的化孊的性質を倉曎しないものでなければなら
ない。 レコグニンずその担䜓ずから成る耇合物は、接
觊される生物孊系の化孊関連物質を補造し、分離
し、確認するのに有甚である。レコグニン−担䜓
耇合物はたた、導入される生物孊系の化孊関連物
質前兆物の補造を促進するのに有甚である。 化孊関連物質の類は、抗レコグニンすなわち
抗アストロシチンおよび抗マリグニンである。こ
れらの物質は生物孊系にレコグニンを泚射しお補
するこずができる。レコグニンの免疫孊的に有効
な服甚量は、埓来の抗䜓補造技術に埓぀お抗䜓反
応を誘発するように䜓内組織たたは䜓液ず接觊さ
せお算出される。抗レコグニンは、抗レコグニン
を有する耇合圢剀を生物孊系に導入しお成る生物
孊系の特異现胞たたは䜍眮に蚺断剀、栄逊剀およ
び治療剀の劂き物質を投䞎するのに䜿甚するこず
ができる。その抗レコグニンはたた、着色たたは
攟射性分類衚瀺が腫瘍现胞にのみ生じるように、
染料および攟射性物質の劂き分類衚瀺物質を配合
した抗レコグニンを生䜓組織に適甚するこずによ
぀お、生䜓組織に腫瘍现胞が存圚するか吊かを蚺
断するのに有甚である。さらに抗レコグニンを䜿
甚するのは、レコグニンの免疫的に有効な服甚量
を哺乳動物その他の生物孊系に泚射するこずによ
぀お、他の有甚な化孊関連物質䟋えばTAG、
埌述の哺乳動物から産出高を増加するためであ
る。 埓来、糖蛋癜質耇合物は、脳組織から補造さ
れ、抗䜓が脳組織に圢成されおいた。タむサハス
Tay−Sachsの病的な脳から補せられた10B糖
蛋癜質ずしお知られた分離物質は、ラビツトおよ
び補せられた抗䜓に泚射されおいた。これらのタ
むサハス抗䜓は、腫瘍を有する脳の免疫螢光性研
究に䜿甚されおいた。腫瘍グリアではなく反応的
な普通の非腫瘍グリアのみがこれらの抗䜓によ぀
お着色されおいた。 これず察照的に、アストロシチンが腫瘍組織か
ら補せられた時、アストロシチンに察する抗䜓
抗アストロシチンが補せられ、脳の免疫螢光
性研究に䜿甚され、普通の非腫瘍グリアでは
なく腫瘍グリアのみが抗アストロシチンによ぀お
着色されおいた。したが぀お、原因組織、抗䜓の
性質および着色された现胞特有のタむプによ぀
お、抗タむサハス抗䜓および抗アストロシチンは
異なる物質であるのは明らかである。 化孊関連物質の他の類は、それらの化孊関連物
質ず耇合したタヌゲツト剀である。䟋えば、タヌ
ゲツトブロムアセチル−セルロヌズの劂き担䜓
ず耇合したアストロシチン物質は抗アストロシ
チンずの接觊に䜿甚される。このタむプの化合物
は、耇合されお、生物孊系の特異现胞たたは䜍眮
に蚺断剀、栄逊剀および治療剀を投䞎するために
䜿甚するこずができる。これらの化合物はたた掗
浄凊理のためにも䜿甚できる。䟋えば、抗アスト
ロシチンは、ブロムアセチルセルロヌズ−アスト
ロシチン−抗アストロシチンを酞たたはプロテむ
ナヌれ酵玠で加氎分解しお補するこずができる。
タヌゲツト剀はたた、タヌゲツトの免疫孊的に有
効な服甚量を䜓内組織たたは䜓液に接觊させるな
どによ぀お、生物孊系のTAG物質埌述の量
を増加するのに圹立぀。 付加的な化孊関連物質はTAG剀タヌゲツト
に付着するグロブリンである。TAG物質は、
TAGを耇合分解するための期間を倉化するため
にタヌゲツト剀を䜓液ず接觊させお埗られる。 二぀の有甚な実斜態様は−TAG及び−
TAGである。 −TAGSLOW−Target−Attaching−
Glodulinの補造方法は、血枅その他の䜓液を暙
的即ち、ブロモアセチルセルロヌズ−マリグニ
ンず玄時間又はそれ以䞊、䜎枩䟋えば玄℃
で反応させ、−TAGを生成物から開裂するこ
ず、䟋えば玄37℃の枩床で玄時間皀釈酞で開裂
するこずから成る。この方法に埓぀お補造された
補品−TAGは氎性緩衝液に可溶であり、アり
チタヌロニヌOuchterlonyゲル拡散詊隓にお
いおその盞圓レコグニンずの単系沈柱物を生成
し、セロフアン膜で透析䞍胜であり、25000分子
量以䞊の分子を保持するミリポア−フむルタヌで
留保され、マクロ・グロブリン域が玄50000及び
その倍数の薄局ゲル・クロマトグラフむヌによ぀
お定められるような異぀た状態の凝固をする分子
量を有し、そしお280Όの分光光床蚈吞収ピヌ
ク波を有するこずを特城ずする。 −TAGFast−Target−Attaching−
Globulinを補造する方法は、血枅その他の䜓液
を暙的即ち、ブロムアセチルセルロヌズ−マリ
グニンず玄10分間䜎枩䟋えば℃で反応させ、
−TAGを生成物から開裂するこず、䟋えば玄
37℃の枩床で玄時間皀釈酞で開裂するこずから
成る。この方法に埓぀お補造された補品−
TAGは氎性緩衝液に可溶であり、アりチタヌロ
ニヌOuchterlonyゲル拡散詊隓においおその
盞圓レコグニンずの単系沈柱物を生成し、セロフ
アン膜で透析䞍胜であり、25000分子量以䞊の分
子を保持するミリポア・フむルタヌで留保され、
マクロ・グロブリン域から玄50000及びその倍数
の薄局ゲル・クロマトグラフむヌによ぀お定めら
れるような異぀た状態の凝固をする分子量を有
し、そしお280Όの分光光床蚈吞収ピヌク波長
を有するこずを特城ずする。 TAG補品は既知量の哺乳動物の血枅その他の
䜓液によ぀お䜜られる−TAG及び−TAGの
濃床を決定しおこの濃床ず、癌を瀺すものずしお
定められた倀ずを盞関させるこずによ぀お、生き
た哺乳動物の癌腫瘍を探知するのに有甚である。
TAG補品はたた組織郚䜍の腫瘍现胞の存圚を蚺
断するのに有甚であるが、これは染料ずか攟射性
物質のような暙識物質ず接合したTAGを圓該郚
䜍に適甚するこずから成り、それによ぀お腫瘍现
胞にのみ着色又は攟射性暙識が生じるものであ
る。曎にTAG補品は腫瘍现胞に察しお现胞毒性
があるこずが刀明した。TAG補品はたた、蚺断、
栄逊、及び斜療甚の剀をTAG補品ず錯状にした
ものを導入するこずによ぀お、これらの剀を特定
の现胞又は郚䜍に届かせるのに有甚である。 现胞が完党に特定の堎所を占めるようになる
ず、怍物又は動物における正垞の现胞分割は制限
されるか又は抑止される。(a)正垞の现胞が、自己
の占め埗る堎所を埋めたこずを「認識する」機構
及び(b)この認識機構の䜜甚が今床は现胞の分割を
抑止する機構は、共に知られおいる。正垞の認識
及び感知が生じたずき先駆物質の濃床が増倧し、
粒子及び现胞の認識及び感知に関係するような䞀
矀の化合物であ぀お现胞を互いに連結したものが
補造されるようにな぀た。これらの化合物はレコ
グニンズず呌ばれる。通垞の癌现胞からこれらの
化合物を補造しようず詊みたずころ、それらはそ
のようなものずしおはないこずがわかり、たた、
癌现胞が(a)その正垞な䜓積を占めたこずを認識す
る胜力、及び又は(b)その正垞な䜓積を占めた際
に分割を止めるずいう胜力、を倱うず同時にその
分子構造に倉化が生じたこずがわか぀た。 新芏な化合物ならびにそのような化合物を補造
する方法が発芋された。これらの新芏化合物はレ
コグニンズず名付けられる。レコグニンズは、现
胞分割を認識し止めるこずができないずいう点で
癌现胞の圢態的特性を暡倣する物理化孊的特性を
有する新芏化合物である。レコグニンの䜿甚は癌
の䜜甚機構を芋きわめる以䞊にすぐれたものであ
る、䜕故ならばこれによ぀お癌の蚺断及び治療な
らびにその予防に圹立぀盎接補品ならびに方法が
提䟛されるからである。 マリグニンズMALIGNINSを補造するの
に人工的に培逊した现胞を甚いるこずができる方
法が発芋された。こゝに開瀺する方法の利点の䞀
぀は、マリグニンズMALIGNINS及びそれ
から䜜る新補品が事実䞊無制限の量で効率的に補
造するこずができるずいうこずである。 本発明は癌研究の分野に優るものであり、たた
すべおの生長及び新陳代謝に圱響を䞎えようず望
む䞀切の生物孊系に盎ちに適甚できるものであ
る。かように、人工的培逊した適圓な现胞型の特
定の化合物を補造するこずにより、たたこれらの
物質から補品を曎に補造するこずにより、先ず最
初に生物系における組織、现胞、现胞機胜質、次
機胜質分子あるいは分子集合䜓に特定の圱響を及
がすこずができよう。こうしお、発育期の重芁時
期における特定の栄逊効力、特定の蚺断䞊の、予
防䞊の、及び治療䞊の方法、及び人工生電気シス
テムの構成組織又は噚管移怍における劂くが
すべお最初に圱響を受けるこずができる。これら
の人工生電気系は今やこれらに隣するこずゝなる
通垞の組織又は組成の特定のレコグニン
RECOGNIN、マリグニンMALIGNIN又
はそれらのケモレシプロカルズ
CHEMORECIPROCALSの特性を持぀ように
するこずができるので、「異物」ずしお「認識」
され、それゆえ拒絶を含む異物に察する反応を避
けるものである。 本発明の他の態様は、特定の頭脳補品アスト
ロシチンに察する䟡倀の高い特定の抗䜓状の補
品アンチ・アストロシチンを補造するこずで
あり、この抗䜓状補品をあらゆる皮の神経系の特
定の点に特定に錯状ずなるように、そしおこれに
察する特定の䌝達担䜓ずしお甚いるこずができる
こずである。マリグニンズMALIGNINS及
びアストロシチンASTROCYTINはレコグ
ニンズRECOGNINSである。 本発明の曎に他の態様は、二぀の新補品の生物
孊的流䜓からTARGET−ATTACHING−
GLOBULINSTAGを補造するこずである。
これは二぀の反応即ち第䞀は生物孊的流䜓をマリ
グニンズMALIGNINSを暡倣する物理化孊
的圢態を含む合成錯䜓ず反応させたもので
TARGETず呌ばれ、第二は特定のTAGを錯䜓
から開裂させたもので、その有機䜓に腫瘍がある
かどうか生きた有機䜓の生物孊的流䜓からの定量
的衚瀺を埗お、即ち腫瘍の蚺断詊隓から、そのよ
うに䜜られたTAGの寞法によ぀おそのように呜
名されたものである。TAG補品及びANTI−
MALIGNINは物理化孊的にMALIGMINを補な
うものであるため、これらは
CHEMORECIPROCALSず呜名される。 曎に、血枅ず䜿甚する特定のTARGET詊薬ず
の反応に蚱される時間によ぀お、たた錯化された
補品の開裂に蚱される時間によ぀お、二぀の定量
的及び定性的に明かに区別されるTAG補品を補
造するこずができるこずが発芋された。 脳腫瘍のある、及び皮々の他の医孊的故障のあ
る、ならびになんら明らかな疟病の城候のない倚
数の異぀た人々から補造するこずができたこれら
の補品の量を怜査した埌、䞀定の固人に぀いお補
造するこずができたこれらの二぀の新芏補品の量
は、その個人に脳腫瘍があ぀たかどうかを瀺すも
のであるこずが明らかずな぀た、それゆえ脳腫瘍
の新芏血枅蚺断詊隓法が発芋されたのである。 これらの新芏補品の血枅その他の生物孊的流液
から脳その他の腫瘍を蚺断する甚途のほかの効甚
は、TAG及び抗RECOGNIN化合物は脳腫瘍の
倖科手術で取陀かれた脳腫瘍及びその呚囲の組織
の組織孊的郚䜍においお優先的に神経膠腫瘍现胞
に぀くずいう蚌拠で説明される。この腫瘍现胞の
TAG及び抗RECOGNINSによる優先的暙識は暙
準免疫螢光技術によ぀お蚌明される。このよう
に、新芏方法はたた、組織孊的怜査によ぀お新芏
な確床をも぀お、腫瘍现胞が陀去した組織の極端
郚たで浞透しおいるかどうかを決定するのに甚い
るこずができ、腫瘍が脳その他の噚官にただ残぀
おいる可胜性又は腫瘍现胞が陀去した組織の呚蟺
からなくな぀おいる可胜性を瀺し、腫瘍のすべお
が脳又は他の噚官から取陀かれた可胜性も瀺すこ
ずができる。曎に、蚘述したように補造した
TAG及び抗MALIGNINは詊隓管内で組織培逊
䜓に生成した膠腫脳腫瘍现胞に察しお现胞毒性が
あるこずがわか぀た。こゝでは組織培逊䜓に生成
させた、他の媒䜓での腫瘍现胞に察するこの高芪
和性は、新補品TAGの特定結合朜圚力を曎に蚌
明するものであり、合成補品TARGETに関しお
及び組織孊的郚䜍における腫瘍现胞に関しお
TAGの性質が衚わすようにTARGET−
ATTACHING−GOBULINSTAGの名称の
採甚を説明するものである。曎に、腫瘍现胞に察
するTAG及び抗RECOGNINSの现胞毒性は腫瘍
にかゝ぀た疑いのある患者の血枅の曎に新しい蚺
断詊隓法を提䟛する。このように、䟋えば、これ
らの患者の血枅又は他の䜓液をTARGETず反応
させおTAGを補造し、補品TAGは組織培逊䜓䞭
で腫瘍现胞の生長を现胞毒性怜査する。䞀定の個
人の血枅から補造するこずができるTAGによ぀
お珟わされるTAGの濃床及び现胞毒性床は単に
蚺断䞊の利点があるばかりでなく、特定の患者に
぀いおの手術前及び手術埌の䞍調の経過を探玢す
る䞊にも䟡倀のあるものである。攟射性及び染色
探知物をTAGず結合すれば、腫瘍の蚺断及びそ
の正確な郚䜍の刀定をする堎合生䜓に有甚である
新芏なTAG補品を䜜るこずができる。かように
しお、動脈内又は静脈内のいずれかに適圓に暙識
したTAGを脳脊髄液内に、又は盎接脳組織又は
その窩に泚射すれば、攟射性手段により、又は結
合した染料の芖芚化により、脳腫瘍の存圚を説明
するこずができる、ずいうのはTAGが特別に付
着するのは腫瘍现胞にのみであるからである。曎
に、この方法は脳腫瘍の郚䜍を正確に芖芚化する
こずができる。これは脳腫瘍を暙識するため兎の
血液で䜜぀た抗ASTROCYTINを甚いるこの生
䜓内蚺断方法の改良ず芋なすこずができる。なぜ
ならば人間の血枅から䜜぀たTAGを甚いれば異
蛋癜反応の可胜性を避けられるからである。
TAG及び抗RECOGNINSは詊隓管内及び生䜓内
の双方での腫瘍现胞を含むASTROCYTIN前駆
物質に優先的に付着するこずができる化孊的特殊
性を持぀ので、䟋えば攟射性の、プロトン補獲剀
又は他の毒性のある物理的又は化孊的剀ず組合わ
せお、これらの毒性のある物質が腫瘍现胞に隣接
する正垞现胞ず比范しお腫瘍现胞に付着する特殊
性によ぀お優先的に局圚化するこずができるよう
に、蚺断孊的にず同じく斜療的にもこれらの補品
を甚いるこずができる。この遞択性は、腫瘍の効
果的な化孊的又は物理的斜療を達成するための決
定的な、少くずも䞀぀の決定的な芁玠ずしお、た
たこれたで達成されなか぀た芁玠ずしお、普遍的
に認められる。かように、TAGは優先的に腫瘍
现胞に付着する点で効果のあるこずを蚌明したも
のであり、これらの理由で新芏な治療補品ずしお
の有望性を持぀べきものである。 悪性の腫瘍を持぀た患者の血枅においおは、䞋
蚘の実斜䟋に芋られるように、FAST−TAG
−TAGず区別される䞀぀の型のTAG、即ち
SLOW−TAG−TAGが、かような腫瘍の
ない患者におけるよりも、䞀定量の血枅から比范
的倚量に補造するこずができる。このこずは、
TAGの自然に発生する前駆物質−TAGの
いずれか䞀぀の濃床が増倧するか又は−TAG
よりも−TAGが比范的詊隓管内で良く出来る
ような他の芁因があるこずを瀺唆するものであ
る。 実際の合成補品TARGET及びTAGのその前
駆物質に察する、そしお、云いかえれば、生䜓内
に存圚するこずがあり埗るこれらに察する仮定さ
れたが蚌明されおない现胞「抗原」及び埪環する
「抗䜓」の䜜甚に察する、䜜甚のあり埗る関係は、
ただ解明されおいない。このように䟋えば、抗䜓
状の様匏で、−TAG及び−TAGはアりチタ
ヌロニヌ・ゲル拡散においおASTROCYTINず
単䞀で別々の系統の反応を生成する。それで、兎
にTARGETを泚射すれば、TARGETず反応し
た埌、兎の血枅から䜜るTAG補品の収率を増や
せるこずになる。埪環する抗䜓に䌌た前駆物質が
分割しない现胞に隠されおいる现胞抗原に察しお
正垞な氎準があり埗るずいう発芋は、䞀察のも
のゝあり埗る䜜甚に぀いおの問題を提起する。
こゝで、现胞の増殖及び现胞の死滅の制埡に䜜甚
するTAG前駆物質−TAG及びTARGET
状物質が生䜓内に存圚するこずを提起する。かよ
うに、䟋えば、通垞は盎接は血枅蛋癜に曝される
こずのない现胞構成物の露出が现胞分割䞭に起る
こずがある。この现胞構成物の露出の結果、構成
物はTARGET状物質に倉換されるようになり、
これに血枅から−TAG状分子の付着が生じ、
これが现胞分割を刺戟するか又は抑止するこずが
考えられる。あるいは、傷害を受けた又は䜜甚䞍
良の䞍分割现胞は−TAG状分子の付加が回埩
可胜であるようなTARGET状物質を露出させる
こずがある。しかし、ある现胞状態の䞋では−
TAG状分子の付加は现胞の砎壊を招くこずがあ
る䟋えばこゝに蚘茉した合成で補造したANTI
−GLIOMA−TAGは組織培逊䜓䞭で生長する膠
腫瘍现胞に著しく现胞毒性がある。かように、
これは、现胞分割の制埡に぀いお、たた有機䜓の
生涯を通じお䜓内の個々の现胞の修埩又は陀去に
぀いおの正垞な機構の暡範を瀺すものずいえよ
う。脳内膠腫の堎合のように急速に分割する癌现
胞に生じるように、现胞構成物の露出が異垞に増
倧しお異垞に倧量の现胞TARGET状物質が圢成
される堎合は、䞀぀の型の血枅−TAGの濃床
が他のものに比べお増倧するこずが起るこずがあ
る。 前蚘物質の実際の䜜甚がどのようなものであろ
うず、こゝに蚘述した方法によ぀お悪性の腫瘍の
ある患者の血枅から詊隓管内で補造するこずがで
きるTAGの䞻芁な䞀぀の型、SLOW−TAG
−TAGの盞圓量の増加は、䞋蚘の実斜䟋に蚘
茉した血枅蚺断詊隓の基瀎ずなるものである。 実斜䟋  粗アストロシチン先駆䜓含有分画の生成− 人間の脳膠腫腫脹組織を切り取り、衚面の血管
ず普通の脳組織ずを可胜な限り分離させる。分離
した腫脹組織の代衚的な量11をずり、これを
1.5の郚分個および1.0の郚分個に分け
る。぀いで各郚分を次のように凊理する。 各郚分を䞭性緩衝溶液䞭、超音波たたは他の機
械的手段により均質化する。たずえば、各郚分を
ワヌニング混合機䞭、0.005M燐酞緩衝液PH
の100c.c.組織に均質化する。蛋癜の倉性を防
ぐために、䞊蚘均質化凊理は冷条件䞋に行うでき
である。たずえば、該混合機を〜℃の冷宀で
あらかじめ冷やし、玄分間で操䜜すべきであ
る。 ぀いで、均等質を枅柄にするために、たずえば
冷凍した超遠心分離で80000倍重力を30分間䜜甚
させお遠心分離させる。可溶性䞊柄液を傟斜分離
し、冷䞋に保぀。䞍溶性残枣は、さらに䞭性緩衝
æ¶²100mlを甚いお再び均質化し、䞊蚘ず同様に遠
心分離凊理し、埗られる番目の可溶性抜出物ず
䞊蚘番目のそれず合する。䞊柄液䞭、蛋癜が50
マむクログラムml溶液以䞋ずなるたで均質化ず
遠心分離をくりかえすずき、収率は非垞に良奜で
ある。このこずは、ほずんどの組織の堎合、回
の抜出で達成される。 このようにしお埗た溶液を合し、぀づく透析で
十分に蒞発させるこずにより濃瞮する。冷䞋、
0.006M燐酞緩衝液の透析により15mlの溶液を埗
る。この溶液の量を蚘録し、䞀郚を党蛋癜の分析
に甚い、残䜙を分けおpK1〜の蛋癜質分画を埗
る。以䞋に述べるクロマトグラフむは奜たしい分
別法である。 溶液を、冷宀℃䞭、0.005M燐酞ナトリ
りム緩衝液で平衡させたDEAEセルロヌス
Cellex−カラム2.5×11.0cm䞊で分別する。
溶出溶媒は以䞋の溶媒溶液を甚いるこずによ
り段階的に倉える溶液(1)NaH2PO44.04およ
びNa2HPO46.50を蒞溜氎15000mlに溶解する
0.005モル、PH溶液(2)NaH2PO48.57を蒞
溜氎2480mlに溶解する溶液(3)NaH2PO417.1
を蒞溜氎2480mlに溶解する0.05モル、PH4.7
溶液(4)NaH2PO459.65を蒞溜氎2470mlに溶解す
る0.175モル溶液(5)NaH2PO4101.6を蒞溜
æ°Ž2455mlに溶解する0.3モル、PH4.3溶液(6)
NaH2PO4340.1を蒞溜氎2465mlに溶解する
1.0モル、PH4.1溶液(7)80燐酞H3PO4
283.64を蒞溜氎2460mlに加える1.0モル、PH
1.0 神経組織抜出物〜10mlを加える。これをカラ
ムに通す。぀いで溶液(1)を䞊に加え、溶液(1)300
mlを受ける貯留噚を取付けお重力でカラムに萜䞋
させる。自動的な分画収集装眮を甚いお溶出液
mlを集める。぀いで、次の溶出管番号で、溶出溶
液を倉えお甚いる。溶液(2)管で、カラム䞊
溶液をレゞンの頂郚に運び、぀いで溶液(2)50mlを
䞊から加え貯溜噚を取付ける管で、溶液を
カラム䞊、レゞンの頂郚に運び、぀いお、溶液(3)
75mlを䞊から加え、貯留噚を取付ける溶液(4)
管で、溶液をカラム䞊、レゞンの頂郚に運
び、぀いで溶液(4)150mlを䞊から加え、貯留噚を
取付ける溶液(5)管で、溶液を、カラム
䞊、レゞンの頂郚にも぀おいき、぀いで溶液(5)を
䞊から加え、貯留噚を取付ける溶液(6)管
で、溶液をカラム䞊、レゞンの頂郚にも぀おい
き、぀いで溶液(7)175mlを䞊から加え、貯留噚を
取付ける管に到るたで溶出を続けお溶出
を完了する。組織抜出物の各容ごずに新たに補し
たレゞンを䜿甚する。各管を蛋癜の定量分析に付
す。管〜内の溶出液を合す。これは
粗生成物を含み、これよりアストロシチンが埗ら
れる。 この過去においおフラクシペン10Bず呌ばれる
粗生成物に぀いおのデヌタは公にされおいるが
〔プロテむン・メタボリズム・オブ・ザ・ナヌバ
ス・システムpp555〜69Pleum Press、1970
幎ゞダヌナル・オブ・ノむロサヌゞダリヌ、
Vol.33、pp281〜2861970幎月参照〕、ここ
でアストロシチンず呌ばれる特定の生成物を分画
から分離するこずを達成した。粗分画
は、はじめの新鮮な神経系組織に぀き0.1
〜10mgの生成物ずしお補せられる。これはアスト
ロシチン先駆䜓の他に、倚数のヘキ゜シス、すな
わちグルコヌス、ガラクトヌス、マンノヌスグ
ルコヌスアミン、ガラクトヌスアミンおよびマン
ノヌスアミンなどを含むヘキ゜ヌスアミン類お
よび時ずしお、他の糖類、フコヌス、リボヌスお
よび倚分ランノヌスなどを包含する共有絊合炭化
氎玠残基を皮々の量含んでいる。たた、高分子重
量の蛋癜生成物、いく぀かの脂質および栞酞を含
んでいる。 実斜䟋  粗アストロシチン先駆䜓含有分画からの粟補ア
ストロシチンの生成− アストロシチン先駆䜓含有分画をさらに汚染物
から単離する。奜たしい具䜓䟋ずしお、実斜䟋
で埗た物質を代衚的なカラム40cm長×2.5cm
盎埄、196ml容を甚いおセフアデツクス−
50レゞン䞊クロマトグラフむに付す。䜿甚圧力は
40mm・Hg流量は35mlHr、緩衝液は0.05モル
燐酞緩衝溶液PH7.2を䜿甚。最初のフロヌ・
スルヌflow throughのピヌクはアストロシ
チン先駆䜓ず共に䞍玔物を含むが、぀づくピヌク
は䞍玔物のみを含む。 奜たしい具䜓䟋では、䞊蚘最初のフロヌ・スル
ヌ・ピヌクにおける生成物を぀いで、セフアデツ
クス−15䞊で濃瞮し、぀いで実斜䟋ず同じ溶
æ¶²(1)〜(7)を甚い、実斜䟋ず同び溶出段階を甚い
おセレツクス−のカラムに通す。アストロシチ
ン生成物は、䞊蚘ず同じ管番号〜
内に、鮮鋭なピヌクずしお存圚し、セレツク
ス−クロマトグラフむヌ䞊、倚量の汚染物質の
存圚なしに、挙動する。 ぀いで䜎分子量汚染物をミリポアヌ・デむスク
過などの垞套手段により陀去する。奜たしい方
法ずしお、アストロシチン生成物をミリポアヌ・
ペリコン・デむスクNo.1000、13mmこのものは、
1000より倧きい分子量を有する物質をずらえ、
1000より小さい分子量を有する物質を透過させ
る。に通しお過するこずにより、塩および他
の分子量の小さい汚染物質を分離する。アストロ
シチン生成物はペリコン・デむスク䞊に残留し、
実斜䟋の溶液(1)で掗浄するこずにより回収され
る。 ぀いで、分子量玄8000の化合物を䞊蚘溶液から
単離するこずによ぀おアストロシチンを埗る。そ
の方法ずしお、次の劂き薄局ゲルTLGクロ
マトグラフを甚いるのが奜たしい。装眮ずしお、
ボツフリンゲン・マンハむムGmbHフアヌマ
シア・フアむン・ケミカルズ・アンド・
CAMAGスむス囜によ぀お蚭蚈された垂販の
ものが䜿甚される。セフアデツクス−200のレ
ゞン極䞊品質のもの2.5を0.02M
Na2HPO4KH2PO4äž­0.5M NaClの燐酞塩緩衝液
PH6.86.6〜7.085ml内に備える。宀枩で時々ゆ
るやかに混合し぀぀〜日間膚最Swellさ
せる。磁性およびその他の撹拌手段を甚いるべ
きでない。。膚最したゲルを冷凍枩床で週間安
定させる。しかし、现菌および菌の増殖は膚最ゲ
ルを阻害する。もし、ゲルをより長時間保持する
には、少量の制菌剀ナトリりムアゞド0.02
を加えるべきである。2.5の也燥ゲルを甚いお、
20×20cm、厚さ0.5mmのガラス・プレヌト個を
䜜る。このプレヌトは宀枩で10分間也燥し、湿最
なチダンバヌ内で玄週間貯蔵するこずもできる
し、たた適圓にあらかじめ平衡状態にした盎盎ち
に䜿甚するこずもできる。通垞、倜間に、最底
12時間芁す。。平衡の䞻芁な機胜は、静眮局ず可
動局間の割合を正垞化するこずである。氎平䜍眮
で予備平衡状態にしたプレヌトを甚い、枬定され
る物質を、マむクロピペツトでスタヌトラむンに
おける斑点たたは条痕ずしお適甚する。0.2〜
の蛋癜溶液10〜20mlを顕埮鏡カバヌ・スラむド
18×18mmの端に蚭眮し、ゲル衚面に察持させ
る。数秒埌、溶液はゲルに浞最する。党サンプル
をたずカバヌスラむド䞊に眮き、぀いですばやく
適合させる。もし䜿甚する物質が十分でないず、
分離埌に個々の斑点を䜍眮せしめるこずが困難で
ある。もし、䜙り倚くの物質を適甚するず、明確
に分離するこずができない。操䜜を容易にするた
めに緩衝液でサンプルを垌釈し、22゜の角床でプ
レヌトを傟斜させる技術で、サンプルの分離を行
う。流量は〜cm時間が非垞に適しおいる。
暙識物質シトクロム、ヘモグロビン、ミオグ
ロビンたたはブロモプノヌルブルヌで分類・識
別されるアルブミンはプレヌトを暪切぀お異な
る䜍眮に適甚され、たた未知のものの盞察的距離
移動性の蚈算のための照合蛋癜ずしおの機胜
する。サンプルを適甚した埌、プレヌトを装眮内
に再眮し、ペヌパヌの芯をかるく䞋方におしおゲ
ル局ず十分に接觊させる。ペヌパヌの芯は浞挬さ
せおはならない。過剰の氎分はぬぐい去る。貯留
噚内の液溶媒は容噚䞊端からcmに䞀定に保぀。
操䜜は、分離の進行に䟝存しお通垞〜時間で
完結する。盎埌、有色物質の分離を行う。分離し
た蛋癜の斑点は、クロマトグラフむの分離を完結
した埌に、TLGプレヌトのペヌパヌシヌト・レ
プリカに移すこずにより、およびあらかじめ掗浄
したメタノヌルH2O酢酞−90䞊、
48時間着色するこずにより、容易に芋えるように
なる。ペヌパヌ・シヌトはmm、玙である。20
×18cmのペヌパヌ枚をゲル局の䞊に眮き、ゲル
ず適圓・十分な接觊を確実にするためにおし぀け
るロヌルする。ペヌパヌレプリカの䞋に
空気が捕われないように、か぀、ゲル局を乱さな
いように泚意する。ゲル局から液局をペヌパヌで
浞透し、玄分埌に陀去し、盎ちにオヌブン䞭、
60℃で15分間也燥し、通垞の染色法で染色する。
染色は、10炭酞ナトリりム䞭0.03ゞアゟ化ス
ルフアニル酞パりリヌ詊薬を甚いおレプリカ
−ペヌパヌにスプレむするこずによ぀お達成され
る。たた、メタノヌル−酢酞9010v䜿
甚䞭、アミド・ブラツクの飜和溶液を甚いお染
色を達成するこずもできる染色時間は〜10分
である。脱色するには容量の氎ず混合した容
量のメタノヌルず酢酞9010を甚いお掗浄す
る。倚量の掗浄をせずにバツクグランドを䜎く染
色するのは困難である。もし、アストロシチンが
染色される堎合のみ、プレヌト自䜓を玄90℃空
気埪環手段を有するオヌブン䞭で也燥しおもよ
い。単離のために、プレヌトを、宀枩で颚也す
る。過熱するずクラツクが生ずるが、これは通
垞、セフアデツクス−200プレヌトを15〜30分
で也燥する枩床、50〜60℃を甚いお回避するこず
ができる。也燥プレヌトはメタノヌルH2O
酢酞7520の混合物䞭、10分間膚最さ
せ、同じ溶媒系䞭飜和アミノブラツク䞭、時間
染色し、぀いで也燥する前に、同じ溶媒䞭、時
間浞挬するこずによ぀お掗浄する。分子量を決定
するために、盎接プリントレプリカ䞊たたは
デンシトグラム䞊、スタヌテむングラむンから各
垯の䞭倮たでの距離を0.05mmの粟床で枬定する。
枬定結果を䟛詊蛋癜の移動距離dpに察する
シトクロムたたはミオグロビン察照蛋癜ずし
お䜿甚されるの移動距離dmの比ずしお定
矩されるRn倀で衚わされる䟛詊物質に察する
暙準物質の移動距離の関係は匏−Rndpdm で衚わされる。Rnに察しお、䜿甚された暙準物
質の分子量の察数をプロツトするこずによ぀お盎
線の目盛定め線が埗られる。この盎線から未知の
蛋癜の分子量が埗られる。非垞に正確な結果を埗
るには、プレヌトに適甚する前に、等しいパヌツ
の蛋癜サンプル溶液を暙準物質、この堎合はシト
クロムず混合すればよい。䞊蚘TLG法により、
アストロシチン生成物は、暙準シトクロムず察
照しお玄0.83−0.02の距離に個別の斑点ずし
お芳察され、アストロシチンに察し、分子量玄
8000が埗られる。この方法により、分子量の若干
の盞違に基づいお、いく぀かの個別の生成物がア
ストロシチンから分離される。このようにしお、
この点に汚染物質ずしお運ばれる分子量玄64000、
148000および230000を有する぀の生成物および
しばしば分子量32000生成物が芋出され、䞊蚘
TLG法で陀去される。アストロシチン生成物は、
也燥圢態で、ゲルに吞われ、溶液(1)に溶解し、遠
心分離たたは他の類䌌の手段でレゞンを分離す
る。 この段階で補したアストロシチン生成物は蒞留
氎に可溶であり、䞭性、酞性PHで可溶、アルカリ
PHで䞍溶であり、分光光床蚈吞収ピヌク波長280
Όを有する。これは、䞊蚘の劂く玄8000の分子
量を有するポリペプチドである。その共有結合し
たアミノ酞は、6NHClでの加氎分解぀いで自動
的な定量枬定により次の劂きアミノ酞の平均組成
を有するこずが瀺される。 残基数玄 アスパルチン酞  トレオニン  セリン  グルタミン酞 13 プロリン  グリシン  アラニン  バリン  1/2システむン  メチオニン  む゜ロむシン  ロむシン  チロシン  プニルアラニン  リシン  ヒスチゞン  アルギニン  蚈 88 シスチン酞、ヒドロキシプロリン、ノルロむシ
ン、アンモニア、む゜デスモシン、デスモシン、
ヒドロキシリシン、リシノノルロむシンおよびガ
ンマ−アミノブチル酞はいづれも怜出しうる量は
存圚せず、グルコヌスアミンが埮量存圚する。 実斜䟋における出発脳腫瘍組織11から、䞊
蚘方法で粟補アストロシチン玄mgが埗られる。 実斜䟋 2A “リヌラヌREELER”レコグニンの生成
− リヌラ病は遺䌝による病気であり、動物は安定
な調敎のずれた運動筋肉の掻動を行うこずができ
ず、特定の展開時間においおある神経现胞が脳の
特定の䜍眮、小脳ぞ移動するこずができず、リヌ
リング状態を呈する。電子顕埮鏡での研究によれ
ば、特定の神経膠现胞が垂盎の棒状軞を䞎え、こ
れに沿぀お新しい现胞が、正垞な状態においお新
しい䜍眮に移動する、こずが瀺された。リヌラヌ
病で、新しい神経现胞がこれらの神経膠繊維を登
るこずができないこずは神経现胞もしくは神経膠
たたはその䞡方におけるいく぀かの障害によるず
考えられる。 実斜䟋およびの方法に埓い、マりスのリヌ
ラヌ脳からのレコグニンを埗、正垞なマりスの脳
から補したレコグニンず比范する。正垞なマりス
の脳の党域から補したレコグニンの分子量は8000
である。“リヌラヌ”レコグニンの分子量は3600
〜5000である。“リヌラヌ”リコグニンは、その
非垞に小さい分子量によ぀お瀺されるように異垞
である。さらに、リヌラヌマりスの脳の小脳から
補し埗るレコグニンの量は正垞なものず察比する
ずき倧いに少い。これを衚に瀺す。
【衚】 衚には、リヌラヌマりスの小脳にレコグニン
濃床の著じるしい枛少があり、脳の他の郚に同量
たたはより倚くのレコグニンが有るこずが瀺され
おいる。レコグニンは脳の他の郚分から小脳ぞ移
動しないかたたは、リヌラヌマりスの脳の他の個
所で若干増加しおいるこずはある補償行為を反映
しおいる。 リヌラヌマりスの脳における病理孊的レコグニ
ンは、现胞内においお、認知におけるレコグニン
の圹割を確かなものずし、か぀認識する適圓な䜍
眮に䜍眮するこずを達成するための、移動する胜
现胞がしなければならない接觊ができないこずず
関連しおいる。 同様にしお、マりスのリヌラヌの脳から補せら
れるレコグニンに察する抗レコグニンが補せら
れ、ここにのべたように、抗アストロシチンおよ
び抗アマリグニンの䜿甚法ず同様にしおマりスに
䜿甚されおよい。 実斜䟋  人工ガン现胞培地発酵におけるマリグニン先駆
䜓の生成− 䞀般に、滅菌凊理は泚意深く行なわれる。 すべおの溶液たずえば、ハンクの平衡塩
BSS、−10栄逊媒䜓、子牛の脱児の血枅、ト
リプシン溶液を、䜿甚前に氎济䞭、玄35℃で玄
20分もしくはそれ以䞊の時間培逊する。 䞋蚘の劂き適圓な媒䜓を甚いるこずにより、现
胞の腫瘍組織から分離し、倚䞖代にわた぀お詊隓
管内で増殖する。滅菌溶液、たずえば、12−プロ
パノヌルおよびアムフむルたたはクレオリン溶液
であらかじめ掗浄したビヌカを甚いる。 奜たしい具䜓䟋ずしお、人工ガン现胞すなわ
ち、倚䞖代の間、詊隓管内で増殖した现胞を
250ml容フラスコで生育する。现胞が増殖する液
䜓媒䜓をあらかじめ掗浄したビヌカに入れる。぀
いで现胞をハンクのBSSたたは他の類䌌の溶液を
甚い、玄30秒間静かに掗浄する。撹拌を避ける。
すべおの壁および衚面を掗浄する。冷䞋で玄10分
間、3000rpmの遠心分離により溶液を现胞から枅
柄にする。媒䜓を䞊蚘の劂く、ビヌカヌに泚ぐ。
少量の緩衝プロテむナヌれ・゚ンザむム溶液を加
え、现胞の消化を避けるためにすばやく掗浄す
る。奜たしい方法ずしお、トリプシン溶液
EDTA〜mlを加え、わずか10秒間掗浄す
る。トリプシン溶液を流出させる。 同じ量の新鮮なトリプシン溶液を加え、顕埮鏡
芳察で现胞がチダンバヌ壁から分離するのが芋ら
れるたで培逊する。これには通垞、〜10分間を
芁する。適圓な増殖媒䜓、たずえば−10栄逊媒
䜓100ml䞭、子牛の胎児の血枅の〜10溶液50
mlを加える。 现胞ず共に新鮮な媒䜓25mlを新しい増殖甚チダ
ンバヌに移しお繁殖させる。䞡チダンバヌを培逊
機䞭、35℃で玄日間眮く。本実斜䟋におけるこ
れたでの操䜜により、人工ガン现胞培地は玄日
ごずに぀の新しい培地に分割される。各増殖チ
ダンバヌに぀いお、この党操䜜を、ほゞ日の間
隔をおいお望たしい頻床だけくり返す。このよう
にしお、詊隓管内の生育现胞数はほゞ日ごずに
倍になる。 玄日間の増殖の埌、マリグニンを補するため
に现胞を抜出する。たずえば、䞊蚘各250ml増殖
甚チダンバヌ内の増殖现胞は以䞋の劂く再生され
る。 媒䜓を遠心分離管にう぀し、冷䞋、3000rpmで
10分間遠心分離する。媒䜓を捚おる。増殖甚チダ
ンバヌ内に残぀おいる现胞をチダンバヌ壁から剥
離しお、䞭性緩衝溶液で遠心分離機内に掗い流し
蟌む。现胞を䞭性緩衝溶液で回掗い、再び、冷
䞋、3000rpmで遠心分離し、媒䜓を捚おる。粗マ
リグニン先駆䜓含有分画の抜出のための準備がで
きるたで䞭性燐酞塩緩衝液10ml䞭に掗浄した现胞
を懞濁させる。 実斜䟋  粗マリグニン先駆䜓含有分画の生成− 実斜䟋で補した、䞭性緩衝液䞭に懞濁する掗
浄した现胞を、倧郚分の蛋癜の倉性を避け埗る条
件䞋に機械的に粉砕する。奜たしい方法ずしお、
掗浄した现胞を冷䞋、超音波で20秒間凊理する。
超音波凊理埌、现胞残枣を30分間、30000rpmで
遠心分離し、䞊柄液を傟斜分離する。緩衝溶液10
ml郚を甚いお残留する现胞残枣を掗浄する。超音
波凊理および遠心分離凊理を䞊蚘の劂く行い、䞊
柄液を合す。この操䜜を再床くりかえす。 䞊柄液を合し、十分に蒞発させお容量を玄30ml
から玄〜mlにする。暙本を党蛋癜分析に甚
い、残郚を、アストロシチン先駆䜓に぀いおの前
蚘実斜䟋に蚘茉の方法に埓぀お分別する。 実斜䟋  粗マリグニン含有分画からの粟補マリグニン生
成物の生成− アストロシチンに぀いおの実斜䟋の方法によ
぀おマリグニン生成物をさらに汚染物質から単離
する。 奜たしい具䜓䟋のTLG段階では、マリグニン
生成物は暙準シトクロムに察比しお玄0.91
−0.02の距離に個別の斑点ずしお芳察され、マリ
グニンに察し分子量玄10000が䞎えられる。 この段階で補せられたマリグニン生成物は蒞留
氎に可溶であり、䞭性たたは酞性PHで可溶、アル
カリPHで䞍溶であり、分光光床蚈的吞収ピヌク
280Όを有す。これは分子量玄10000を有するポ
リピペチドである。 薄局ゲルクロマトグラフむ枬定により瀺される
ように、培地の継続する䞖代においお安定せしめ
た培逊培地においお補したマリグニンの分子量を
衚に瀺す。分子量枬定の再珟性はTLGクロマ
トグラフむの遺䌝的な制玄の芳点から顕著であ
る。
【衚】 マリグニンの共有結合アミノ酞は6NHClで加
氎分解し、぀いで定量枬定によ぀お以䞋のアミノ
酞の平均組成を有するこずが瀺される。 残基の数玄 アスパラギン酞  トレオニン  セリン  グルタミン酞 13 プロリン  グリシン  アラニン  バリン  1/2システむン  メチオニン  む゜ロむシン  ロむシン  テむロシン  プニルアラニン  リシン  ヒスチゞン  アルギニン  蚈 89 アミノ酞シスチン酞、ヒドロキシプロリン、ノ
ルロむシン、アンモニア、む゜デスモシン、デス
モシン、ヒドロキシリシン、リシノノルロむシン
およびガンマアミノブチル酞は怜出し埗る量存圚
しない。 実斜䟋の12個の250ml反応チダンバヌから埗
られる玔マリグニンの収量は、マリグニン玄mg
である。 マリグニンずアストロシチンの特異の構造は、
これらの組成を実質的に既知の蛋癜物質ず比范す
る培底的なコンピナヌタによるサヌチによ぀お確
かめられる。 マリグニンおよびアストロシチンのアミノ酞化
合物、モルあたりのアミノ酞残基の総数の芳点
からの、各アミノ酞コンポネントの絶察量および
盞察量、䞊びに分子の分子量の芳点からの、各ア
ミノ酞コンポネントの絶察量および盞察量を、䞖
界で、蛋癜組織に぀いお最も広汎に知られた文
献、すなわちナシペナル・バむオメデむカル・リ
サヌチ・フアりンデむシペンワシントン・デむ
ヌ・シヌのそれに察しおマトリツクス・コンピ
ナヌタ分析にゆだねた。䜕癟、䜕千の蛋癜および
蛋癜フラグメントず比范したマトリツクス分析に
おいお、アストロシチンたたはマリグニンの組織
ず同䞀もしくは非垞に近䌌する組織すら芋出され
ない。 ずにかく組織的に関係する蛋癜のみ、その個々
のアミノ化合物ず分子量に぀いお比范のために衚
に瀺す。無数の可胜性の䞭から、組織における
各皋床の類䌌性を確定すべくコンピナヌタのプロ
グラムを組んだ。このようにしお、たずえば、よ
り倧きなたたはより小さい分子量の蛋癜、たたは
85より少ないかもしくは95より倚い残基を有する
蛋癜、たたは12より少ないかもしくは15より倚い
グルタミン酞酞基を有する蛋癜、たたはより少
ないかもしくは11より倚いアスパラギン残基を有
する蛋癜などは包含される20のアミノ酞ず合臎し
ない。
【衚】
【衚】 䞊蚘のごずき指王は適合すべき22個の倉数を有
する。ある物質は個、個もしくは個の倉数
に関しお適合するが、22個の倉数すべおに関しお
適合するものはないものず芋られる。事実、14個
その内、個の倉数においお差異を認める。を
越える倉数に関しおよく適合するものはない。 それ故、最も密に適合するものはチトクロヌム
b5人間のである。衚䞭に芋られるように、
そのアラニン、アルギニン、アスパラギン、アス
パラギン酞、システむン、グルタミン、ヒスチゞ
ン、メチオニン、チロシン、トリプトフアン残基
はすべおアストロシチンおよびマリグニンずは著
しく差異があるこずを識別するこずができる。シ
トクロムb5はヒスチゞン分子個を含むのに察し
お、アストロシチンおよびマリグニンはこの分子
個のみ含むので、䞡者が同䞀の化孊構造を有す
る可胜性はない。アストロシチンおよびマリグニ
ンの組成に関する最も異状な事柄はグルタミン酞
濃床が高い点にある。89個䞭、残基〜個のみ
を芋出し埗るように期埅される。 䞊蚘に次いで密接に適合するものはロむカ゚
ネ・グラりカLeucaene glaucaおよびアルフ
アルフア䞭のプロドキシン類であるが、これら
はそれぞれアミノ酞個および個を有するこず
においお異なり、䞔぀この䞡者はそれぞれ残基96
個および97個を有する点で異なる。その他の適合
するものずしお倧腞菌。coli26のアシル担
䜓蛋癜が挙げられるが、これは残基数がアミノ酞
11個においおマリグニンおよびアストロシチンず
著しく異なり、たたこれは残基77個のみを有する
点で異なる。 他の脳蛋癜牛、豚のノむロフむシンおよびゎ
ナドトロピン攟出ホルモンを蚘録した衚参
照が、このもののコンピナヌタに蚘憶された数
10䞇皮の蛋癜フラグメントから、いずれも非垞に
適合の悪いものである。 呌吞蛋癜はその元のたたの状態においお金属お
よびたたはヘム成分を含有するこずができる
が、単離された状態の蛋癜フラグメント、たずえ
ばアポシトクロムb5は金属およびヘム成分のいづ
れをも含有しない。アストロシチンおよびマリグ
ニンの埮量分析結果によれば、鉄、硫黄、リン、
マグネシりムを含有するこずなく0.01以䞋、
280Όに兞型的吞収スペクトル特性を有する。
アポプロテむンず共にヘム物質を構成せしめ、そ
の吞収スペクトルを枬定した結果、400および450
Όの間に兞型的吞収が認められた。 アストロシチンおよびマリグニンは他のすべお
の蛋癜および蛋癜フラグメントず異なり、構造的
に異なるものであるにも拘らず、これらの構造は
呌吞蛋癜のそれず密接な関連性を有するずいうこ
ずは泚目すべきこずであ぀お、倚分非垞に重芁で
ある。発生遺䌝孊的芳点およびその化孊構造にお
ける機胜的芳点の双方から、倚くの重芁な関連性
を匕出すこずができるずいうこずはこの技術分野
においおよく知られおいる。アストロシチンおよ
びマリグニンが新しい蛋癜物質であ぀おその構造
的等䟡物がその䜍眮で呌吞䜜甚を瀺し、埓぀おこ
れらの蛋癜が他に逆䜜甚を瀺すのであるから、癌
の倧問題の぀すなわち貧欲䞔぀急速に増殖す
る悪性现胞に察し、゚ネルギヌ関係をいかにしお
満足なものずするかずいう問題を解決するため
の光明を䞎えるこずずな぀た。 かかる発芋の理論的重芁性はずもかくずしお、
より悪性な现胞䞭にマリグニンの割合を増加せし
めた前蚘デヌタおよび抗マリグニン物質は癌现胞
のマリグニン様化孊物質に結合しおいるばかりで
なく、かく結合した抗マリグニンもたた癌现胞に
察しお毒性を有するこずを瀺した埌蚘デヌタは共
に重芁な意矩を有する。本発明における抗マリグ
ニン生成物は癌现胞䞭で分別的にその䞭のヘム化
合物に結合しおいるから、もしそのマリグニン様
化合物が呌吞蛋癜であり、埓぀おその系内に呌吞
機胜を有する物質を含有するのであれば、その癌
现胞を死滅せしめ埗るこずは容易に理解し埗るず
ころである。 抗マリグニン類および他の類䌌の化孊的逆䜜甚
物質の治療的効果に察する可胜性はマリグニンお
よびアストロシチンに関する構造的知芋およびマ
リグニン量の悪性床ずの間に既に蚌明された関係
により著しく増倧される。 実斜䟋 5A 発酵の過皋においおその容量および衚面積を増
加せしめたこずによる収量、悪性の床合および
マリグニンの割合の増倧 250mlフラスコの代わりに1000mlフラスコを甚
い、詊薬の量はすべお倍量を増加し、実斜䟋
〜ず同様の操䜜を行぀た。 悪性现胞の増殖のためのスペヌスを250mlから
1000mlに増加するこずにより、接皮から日間発
育させた埌のマリグニン生成物の収量はほずんど
倍に増加した。フラスコの倧きさ別に、その総
蛋癜収量mgおよび生成したマリグニンを連続
的䞖代の発酵物質の総蛋癜量に察するずしお衚
わし、これを衚に瀺す。250mlフラスコを甚い
たずき、生成した総蛋癜量の平均倀は17.5mg、
1000mlフラスコを甚いたずき、生成した総蛋癜量
の平均倀は40.4mgであ぀た。
【衚】
【衚】 驚くべきこずに、现胞増殖のためのスペヌスず
衚面積を増加せしめるこずにより、日発育期間
圓り、悪性现胞増殖量悪性の床合が増倧する
に埓぀お総蛋癜のずしお瀺された生成マリグニ
ン量もたた有意に増倧する。日の発育期間䞭に
総蛋癜量に察するマリグニンの癟分率は250mlフ
ラスコ䜿甚時における平均倀10.7から、1000ml
フラスコ䜿甚時における平均倀28.3に増加し
た。 生成したマリグニンの割合ず悪性の床合すな
わち日間詊隓管内における悪性现胞増殖量に察
する生成蛋癜量の関数ずの関係を第図に瀺
す。 第図はフラスコの倧きさが増加したのでマリ
グニン生成物の比率は玄倍に増倧するこずを瀺
しおいる。たた第図はマリグニンず悪性の床合
ずの関係を瀺すものである。䞭間線は理想的盎線
関係を瀺す線である。この実蚌的関係はその现胞
の増殖が病理孊的により阻止し埗ないものず
なるに埓぀おマリグニンの存圚比率が増倧するも
のであるから重芁な関係である。通垞のレコグニ
ンの機胜それ自䜓は、前蚘のごずく现胞に接觊し
おその増殖を抑制するこずに関連性を有する。悪
性现胞の増殖がより病的であれば、接觊による抑
性効果は枛少し、マリグニンがより優先的な蛋癜
ずな぀お増加する。 実斜䟋5Aにおいおは、倧なる発育容噚䞭で発
育させた人工的癌现胞培逊物は予期に反しお生成
マリグニンの堎合、すなわち総蛋癜量䞭のマリグ
ニンの癟分率が増倧するこずを䟋蚌するものであ
る。この発明においお甚いられたような倧容量の
発育容噚は容噚容量の実斜䟋による现胞入培地
総容量に察する比が玄たずえばその範囲
はないし10より倧なる容噚であるこ
ずを意味する。実斜䟋5Aにおいおはその比は玄
であ぀た。 実斜䟋  レコグニン類からタヌゲツト詊薬の補造− 前蚘実斜䟋で補せられたアストロシチンたた
は実斜䟋で補せられたマリグニンを担䜓ず混合
しおタヌゲツト詊薬を補する。 奜たしい実斜態様においお、アストロシチンた
たはマリグニンを0.15Mリン酞二氎玠ナトリりム
−ク゚ン酞緩衝液PH4.0に溶解する。ブロモ
アセチル暹脂、たずえばセルロヌス圓り臭玠
1.0〜1.5ミリモルを有するブロモアセチルセルロ
ヌスBACを0.15Mリン酞二氎玠ナトリりム
緩衝液PH7.2䞭で補し、冷所に貯える。PH7.2
の緩衝溶液を泚ぎ、䞊蚘0.15Mリン酞二氎玠ナト
リりム−ク゚ン酞緩衝液PH4.0を加えるこず
により、埗られた緩衝液のPHをに調節する。ア
ストロシチンたたはマリグニン溶液ずBACの溶
液BACのレコグニンに察する比10を宀
枩で30時間撹拌した埌、遠心分離する。 レコグニンに結合させるために甚いるBAC侊
のすべおのサむトは結合に関䞎しおいるこずが奜
たしい。これは次のようにしお達成される。盎䞊
に蚘茉した段階においお埗られた䞊柄液を凍結也
燥し、BACに結合しおいないアストロシチンた
たはマリグニンの量を知るために蛋癜含量を枬定
する。耇合BAC−アストロシチンたたはBAC
−マリグニンを再床0.1M炭酞氎玠塩緩衝液
PH8.9に懞濁し、℃で24時間撹拌しおBAC
およびアストロシチンたたはマリグニンの間の化
孊結合を圢成させる。24時間埌、この懞濁液を遠
心分離し、䞊柄液の蛋癜を分析する。耇合BAC
−アストロシチンたたはBAC−マリグニンを曎
に0.05Mアミノ゚タノヌル−0.1M炭酞氎玠塩緩
衝液PH8.9䞭に再懞濁しお未反応臭玠を閉塞
する。この懞濁液を遠心分離し、アミノ゚タノヌ
ルが存圚するからその䞊柄液はこれを分析に付す
るこずなくそのたた保持する。これを遠心分離
し、スペクトロホトメヌタで266Όに吞収が芳
枬されなくなるたでこの再懞濁液を0.15M塩化ナ
トリりムで回掗浄する。このBAC−アストロ
シチンたたはBAC−マリグニン耇合䜓を8M尿玠
䞭、38℃で時間撹拌し、遠心分離埌、掗液䞭
に、266Όの吞収が珟われなくなるたで通垞
回、8M尿玠で掗浄する。この耇合䜓を0.15M
塩化ナトリりムで回掗浄しお尿玠を陀去する。
この耇合䜓を0.25M酢酞䞭、37℃で時間撹拌
し、その安定性を蚌明する。遠心分離し、埗られ
た䞊柄液は必然的に266Όにおける吞収が存圚
しない。それ故、この化孊的耇合䜓BAC−ア
ストロシチンたたはBAC−マリグニンは安定で
あ぀お䞋蚘のごずき方法における詊薬ずしお甚い
るこずができる。この安定な詊薬型においお、こ
れを合成法により埗られた錯䜓ず呌ぶこずがで
き、その物理的および化孊的性質は朜圚的反応状
態においお血枅成分ずしお理解される時、安定现
胞−アストロシチンたたはマリグニンの結合前駆
䜓ず芋倣すこずができる。保存のためにはこのタ
ヌゲツト詊薬を遠心分離し、0.15Mリン酞二氎玠
ナトリりム緩衝液PH7.2で䞭性になるたで掗
う。 タヌゲツト詊薬はセルロヌズ以倖の配䜍子を有
するブロモアセチル担䜓、たずえばブロモアセチ
ル化暹脂もしくは玙からでさえも䜿甚するこず
ができる。 実斜䟋  アストロシチン、マリグニンおよびタヌゲツト
に察する抗血枅の補造− アストロシチン、マリグニンたたはタヌゲツト
詊薬に察する抗血枅は哺乳動物におけるこれら詊
薬に察する抗䜓反応を誘発するこずにより補せら
れる。この目的のために満足な方法を以䞋説明す
る。 レコグニンアストロシチンおよびマリグニ
ンmgを暙準フロむンド䜐薬ず共に癜色雄家兎
の足の肉趟に泚射し、週間埌、曎に10日埌、芁
すれば曎に週間埌腹腔内に同様の泚射を行う。
最初の泚射から週間ないし10日埌、早やこれら
の家兎の血枅䞭に特殊な抗䜓を怜出するこずがで
きる。タヌゲツト抗原を埗るため、アストロシチ
ンたたはマリグニンmgフオリン−ロりリむ蛋
癜怜出法により枬定を含有するタヌゲツト量を
泚射する操䜜を䞊蚘同様の方法により行う。アス
トロシチンに察する特殊抗䜓を抗アストロシチン
Anti−Astrocytinず呌ぶ。マリグニンに察す
る特殊抗䜓を抗マリグニンAnti−Malignin
ず呌ぶ。同様にタヌゲツト詊薬に察する特殊抗䜓
を抗タヌゲツトAnti−Targetず呌ぶ。 抗原−抗䜓反応のための暙準的オヌクタヌロニ
むOuchterlonyゲル拡散詊隓法により、その
特殊抗原により埗られた特殊抗䜓はその抗原ずの
反応における単䞀鋭敏な盎線関係を瀺すこずが明
らかである。 血枅䞭における特殊抗䜓の存圚は抗原−抗䜓反
応のための沈降玠暙準定量詊隓法によ぀おも詊隓
するこずができる。この詊隓により良奜な沈降玠
定量曲線を埗るこずができ、これから特殊抗䜓の
mg数を蚈算するこずができる。 曎に血枅䞭における特殊抗䜓の存圚は特殊抗
䜓抗アストロシチンを前蚘のごずきブロモアセ
チル−セルロヌス−アストロシチンBAC−ア
ストロシチン䞊に吞収させるこずによりその蚌
明を埗るこずができる。すなわち、特殊抗アスト
ロシチンを含有する抗血枅ずBAC−アストロシ
チンを反応させるこずができる。血枅をBAC−
アストロシチン䞊に通すずき、アストロシチンに
察する特殊抗䜓のみがその特殊抗原アストロシチ
ンに結合する。アストロシチンはブロモアセチル
−セルロヌスず共有結合により結合するので、特
殊抗䜓抗アストロシチンはBAC−アストロシ
チンず結合しおBAC−アストロシチン−抗アス
トロシチンBACA−抗アストロシチンを生
成する。これは掗浄によりBAC−アストロシチ
ンから分離された血枅残留物を詊隓するこずによ
り蚌明される。暙準オヌクタヌロニむ拡散詊隓法
により、血枅䞭にアストロシチンず反応し埗る抗
䜓は残留しおいないこずが認められた。それ故、
血枅䞭にあらかじめその存圚が瀺された特殊抗䜓
抗アストロシチンはすべおBAC−アストロシ
チンに吞収されたこずが明らかである。曎に、抗
アストロシチンをBAC−アストロシチンずの結
合から開攟するずき、これがすべおの汚染抗䜓か
ら分離される。この抗アストロシチンの開攟は
0.25M酢酞ずBACA−抗アストロシチンで掗浄
℃で時間するこずにより行うこずができ
る。 たた、血枅䞭における特殊抗䜓の存圚は特殊抗
䜓抗マリグニンを前蚘のごずきブロモアセチル
−セルロヌス−マリグニンBAC−マリグニン
䞊に吞収させるこずによりその蚌明を埗るこずが
できる。すなわち、特殊抗マリグニンを含む抗血
枅ずBAC−マリグニンを反応させるこずができ
る。血枅をBAC−マリグニン䞊に通すずき、マ
リグニンに察する特殊抗䜓のみが特殊抗原マリグ
ニンに結合する。マリグニンはブロモアセチル−
セルロヌスず共有結合により結合するので、特殊
抗䜓抗マリグニンはBAC−マリグニンず結合
しおBAC−マリグニン−抗マリグニンBACM
−抗マリグニンを生成する。これは掗浄により
BAC−マリグニンから分離された血枅残留物を
詊隓するこずにより蚌明される。暙準オヌクタヌ
ロニむ拡散詊隓法により、血枅䞭にマリグニンず
反応し埗る抗䜓は残留しおいないこずが認められ
た。それ故、血枅䞭にあらかじめその存圚が瀺さ
れた特殊抗䜓抗マリグニンはすべおBAC−
マリグニンに吞収されたこずが明らかである。曎
に抗アストロシチンをBAC−マリグニンずの結
合から開攟するずき、これがすべおの汚染抗䜓か
ら分離される。この抗マリグニンの開攟は0.25M
酢酞ずBACA−抗マリグニンで掗浄℃で
時間するこずにより行うこずができる。 抗原−抗䜓反応のための暙準的オヌクタヌロニ
む・ゲル拡散詊隓法により、タヌゲツト抗原によ
り埗られたそのタヌゲツトに察する特殊抗䜓は前
蚘の抗アストロシチンたたは抗マリグニンのごず
き抗血枅すなわちアストロシチンたたはマリグ
ニン自䜓を泚射しお埗られる抗血枅ず同様、そ
の抗原ずの間の反応における単䞀盎線関係を瀺す
こずが明らかである。泚意すべきこずは、家兎の
内のあるものはタヌゲツトを泚射する前にある量
の抗タヌゲツトを保持しおいる。これらの抗タヌ
ゲツト物質は人血枅のテストにおいお蚘茉された
ように特にタヌゲツト詊薬ず反応させるずき、
TAG、−TAGおよび−TAGの玄圓モル量
タむプを生成する埌蚘実斜䟋参照。 実斜䟋  生物孊的液䜓からタヌゲツト−アタツチング−
グロブリンTAGを詊隓管内で定量的に生
成させるこずによる悪性腫瘍の怜出− 実斜䟋により補せられたタヌゲツト詊薬の劣
化により存圚するこずもある未結合レコグニンを
陀去するため、これを掗浄する。その満足すべき
方法は次のずおりである。タヌゲツト詊薬を酢酞
ず共に37℃で時間撹拌し、遠沈し、䞊柄液を傟
瀉分離し、この䞊柄液の266Όにおける光孊密
床を枬定する。もしその波長における吞収が存圚
するならば、物質が溶解しなくなるたで䞊蚘のご
ずき掗浄を反埩実斜する。次いでこのタヌゲツト
をリン酞緩衝食塩溶液PH7.2に再懞濁する
タヌゲツト詊薬を詊隓するための暙準法を参照
し、もし他のタヌゲツト補剀により−TAGお
よび−TAGを含むこずが詊隓により明らかず
な぀た家兎党血枅を埗るこずができるならば、埌
蚘方法により人血枅の反応から粟補した暙準的
−TAGおよび−TAGを䜿甚するこずができ
る。 次の方法によりスロヌ−バむンデング−
TAGを決定する数日間保存した凍結血枅は
これを䜿甚すべきでない。垞套の方法により、新
しく埗られた党血液もしくは他の䜓液から泚意し
ながら血枅を぀くる。満足すべき方法を述べれば
次のずおりである。採取した血液をガラス補詊隓
管䞭、宀枩で時間攟眮し、凝血させる。ガラス
補撹拌棒を甚い、凝血を詊隓管壁から分離し、こ
の血液を℃で最䜎時間もしくは䞀倜攟眮
する。℃で45分間遠心分離20000rpmする
こずにより凝血を血枅から分離し、血枅を遠心分
離管䞭に傟瀉分離し、曎に℃で45分間遠心分離
2000rpmする。この血枅を傟瀉し、メチオレ
ヌト溶液氎95mlおよび0.2M炭酞氎玠塩緩
衝液PH10ml䞭、を血枅に察しお
容量の限床で加える。 䞊蚘方法たたは他の方法で埗られた血枅それぞ
れ0.2mlを、タヌゲツト詊薬0.25ml圓りレコグニ
ン100〜200mg含有のタヌゲツト懞濁液詊薬それぞ
れ0.25mlに加え、個の怜査詊料ずする。ペレツ
ト生成が避けられるような方法により、䞊蚘懞濁
液を℃で混合する。たずえば小さいゎム補キダ
ツプを甚いお〜秒間匷く振りたぜた埌、管を
ゆるやかに傟瀉させおこれをトヌマスシ゚ヌカ
䞭、玄時間たたはそれ以䞊振盪させる。タヌゲ
ツト詊薬ずそれに結合した蛋癜を血枅から分離す
る。この発明で芋出された満足すべき方法によ
り、䞊蚘管を℃で20分間遠沈2000rpm、䞊
柄を傟瀉した埌、これを0.15M食塩氎0.2〜0.3ml
ず再混合し、宀枩で振盪し、遠沈しお䞊柄液を分
離する操䜜を回行うこずにより生成したペレツ
トを掗浄する。 タヌゲツトに付着しお残留する蛋癜をそれから
分離し、この蛋癜を定量する。たずえば0.25M酢
酾0.2mlを加え、この懞濁液を37℃のふ卵噚䞭で
〜時間振りたぜる。管を℃で30分間遠沈
2000rpmする。粒状物が移行するのを避ける
ように泚意しながら䞊柄液を傟瀉し、280Όに
おける䞊柄液の光孊密床を枬定する。血枅蛋癜
−TAGml圓りmgの結果を埗るため、䞊蚘光
孊密床の枬定倀を1.46の因子で割る。怜査資料
個の間に以䞊の差があ぀おはならない。蛋癜
含量を怜査するため、他の方法たずえばフオリン
−ロりリむ怜査法を甚いるこずができるが、察照
詊料の濃床ず−TAG−−TAG濃床の
倀の範囲を暙準法においお特定しおおかねばなら
ない。 フアスト−バむンデング−TAG倀は次
のように怜査する数日以䞊凍結しお保存された
血枅は䜿甚すべきではない。垞套の方法により、
新しく埗られた党血液もしくはその他の䜓液から
泚意しお血枅を䜜成する。血枅を぀くる方法はこ
の実斜䟋の前郚に蚘茉した方法で充分である。 䞊蚘の又は他の手法で䜜成された血枅芋本は、
−TAG血枅枬定剀が䞊蚘のTARGET詊剀ず
接觊させられる党時間よりも10分間少ない時間の
間、℃で攟眮する䟋えば「時間」の−
TAG枬定をしたならば時間50分。この方法で
は−TAGず−TAGの枬定剀の枩床履歎が平
衡される。 枩床平衡した血枅の芋本0.2mlを、二重枬定に
おいお、TARGET詊剀0.25mlに぀き
RECOGNIN100乃至200マむクログラムを含有す
るTARGETけん濁詊剀の0.25ml敎陀数のそれぞ
れに加える。けん濁物は、顆粒圢成を避けるよう
にしお玄10分間℃で混合する。䟋えば、急速に
振り動かした小ゎムキダツプを〜秒間甚い
お、それから管を僅かに傟けおこれらをトヌマス
振ずう噚で玄10分間振ずうすればよい。それに぀
いおいるTARGET詊剀及び蛋癜質は血枅から分
離される。満足であるず認められた手法の䞀぀は
䞋蚘のものである。次に管を2000rpmで20分間
℃で遠心分離し、䞊柄液を静泚し、遠心分離で圢
成した顆粒を0.15Må¡©æ°Ž0.2〜0.3mlず再混合し宀
枩で振ずうするこずによ぀お回掗浄し、遠心分
離しお、䞊柄液を廃棄する。 暙的に付着したたゝにな぀おいる蛋癜質をそこ
から開裂し、定量的に枬定する。−TAG濃床
を枬定するための本芋本における䞊蚘の手法は満
足なものである。フオリン・ロりリヌ枬定法のよ
うな、蛋癜質含有量を枬定するのに効果のある他
の手法を甚いおもよい、しかし制埡の範囲及び
−TAGマむナス−TAG濃床の腫瘍倀を決定す
るため基準を定めなければならない。 最終結果は血枅mlに぀きTAGマむクログラ
ムずしお衚わされ、これは−TAGマむナス
−TAGに等しい。非脳腫瘍患者及び他の制埡に
おけるTAG倀は珟圚のずころ血枅mlに぀きれ
ロ又は負数から135マむクログラムたでの範
囲に亘る。mlに぀き100Όを越える結果に぀
いおは、反芆枬定を衚瀺する。他の腫瘍のあるも
のは高いTAG倀を衚わすこずがある、特に脳内
に二次的転移した腫瘍がある堎合にそうであ
る。脳腫瘍患者のTAG倀は珟圚では血枅mlに
぀き136乃至500以䞊マむクログラムに及ぶ。アス
トロシチン及びブロモアセチルセルロヌズから調
敎したTARGET詊剀を利甚する本実斜䟋の手法
に埓぀お行な぀た50の血液芋本に぀いおの最初の
「盲怜」においおは、11の脳腫瘍のうち11、及び
32の正垞のものゝうち28が正確に刀別された。
件の正垞ず思われおいたもの即ち、非脳腫瘍制
埡のうち件は、明らかに䜕幎か前に良く手圓
した甲状腺癌のあるこずが刀明した。残りの件
の正垞者は健康のすぐれない、倚分蚺断の぀いお
いない癌を持぀た、幎什60〜70の個人であ぀た。
残りの䟋のうち、ホゞキンス病の件䞭の件
は正確に刀別された。腫瘍の範囲に入る䟋
136〜500ΌTAGmlはひどい神経膠症を持
぀患者に該圓し、非腫瘍の範囲〜135Ό
TAGmlに入る䟋は、それぞれ䞍明確では
あるが腫瘍ではない頭蓋内塊の蚺断、及び骚肉腫
非脳腫瘍及び黒皮肉腫非脳腫瘍を持぀た
患者に盞圓した。 MALIGNIN及び悪性脳腫瘍及び党正垞者から
調補したTARGET詊剀を利甚しお本実斜䟋の手
法に埓぀おその埌の怜蚎を行な぀た。 本実斜䟋の手法に埓぀お行な぀た曎にそれ以䞊
の怜蚎では詊隓した人間の腫瘍の芋本の総数が50
から114に及んだ。これらの補品及び手法の有甚
性を第衚に瀺すが、これはこれらの詊隓の結果
を蚘録するものである。 実斜䟋  むムノフルオレンセンスによる腫瘍现胞の蚺断 化合物抗−アストロシチン、抗−マリグニンお
よび−TAGは腫瘍现胞に優先的に付着するこ
ずを瀺す。この特異性は組織孊の郚門においお染
料たたは攟射性物質を抗−アストロシチン、抗−
マリグニンたたは−TAGに結合させおこれら
の化合物を腫瘍现胞の蚺断に甚い埗る。暙準の暙
識技術がそれゆえ甚いられる。−TAGの䜿甚
法は次のずおりである。 満足であるず認められた䞀぀の方法はセント・
マリヌSt.Marie法の倉圢である。人間の脳
腫瘍怜䜓を凍結しミクロンの厚さに切る。これ
らを湿容噚䞭に染色前に−70℃に〜週間貯え
る。結合䜓は山矊の抗−りサギ結合䜓のような暙
準の抗血枅である。結合䜓はフルオレツセントた
たは他の暙準物質でこの技術分野で既知の技法に
よ぀お暙識される。垂販のフルロ゚ツセむン暙識
山矊抗−りサギ結合䜓を甚い埗る。甚いるフルオ
レツセント技法は暙準のものであ぀お、TAGの
200〜400溶液を腫瘍切片䞊に30分間たた
はそれ以䞊保枩し、次に掗浄しお付着しない
TAGを陀く。燐酞緩衝食塩氎で回掗浄するの
がよい。フルオレツセむン−暙識結合䜓で結合保
枩し、掗浄したら顕埮鏡怜査をする。正芏の现胞
およびその突起は腫瘍切片および正芏の非腫瘍脳
の察照切片共に染色されない。フルオレツセンス
は腫瘍神経膠およびその突起に明るく存圚する。 実斜䟋 10 組織培逊で増殖する腫瘍现胞に察しお抗−アス
トロシチン、抗−マリグニンおよび−TAG
が现胞毒性を有するこずの実隓 现胞毒性を枬定する暙準詊隓を甚いる。䞀般
に、固定した蚈算箱䞭の现胞の数、普通玄100の
生きた现胞を含有するように準備されるが、これ
を蚈算する。次にこれらの现胞を詊隓する詊剀で
凊理し、なお生きおいる现胞の数を蚈算する。 実斜䟋の方法で埗られた−TAG溶液の、
神経膠発生が十分に特城づけられる、神経膠芜现
胞〜玚の患者からの組織培逊䞭の现胞に察す
る现胞毒性の暙準詊隓においお、−TAGは溶
æ¶²ml圓り−TAG0.2および0.02Όのような少量
に盞圓する100および1000の高垌釈床の
堎合でも蚈算箱䞭のすべおの现胞を死滅させる。
同様な結果が抗−アストロシチンおよび抗−マリ
グニンの高垌釈液で埗られる。 実斜䟋で瀺す特異性および実斜䟋10で瀺す现
胞毒性は共に人間の脳腫瘍に察する抗−アストロ
シチン、抗−マリグニンおよび−TAGの治療
可胜性に非垞に関係がある。これらの治療的䜿甚
は手術で陀去された腫瘍組織に察するこれらの䞡
方の珟象の実際の蚺断可胜性に加えお既に蚌明し
た組織孊による蚺断を必芁ずする。
【衚】
【衚】 実斜䟋 11 レコグニンの加氎開裂 レコグニンの溶液、この堎合はアストロシチン
かマリグニンをPH〜で冷眮する。〜14日埌
に薄局クロマトグラフむヌでこの生成物は分子量
が玄200枛少するこずを瀺す。この溶液を曎に長
く攟眮するず玄200分子量の単䜍が〜10日に開
裂する。すなわちアストロシチンでは8000から分
子量が枛少し、マリグニンでは10000から分子量
が枛少し、各堎合匕続いお玄200の単䜍枛少する。 アストロシチンの生理化孊的特異性は各生成物
で4000分子量たで維持される。マリグニンの生理
化孊的特異性は各生成物で5000分子量たで維持さ
れる。これは抗−アストロシチンおよび抗−マリ
グニンのそれぞれに察するオりクテルロニヌ・ゲ
ル拡散詊隓で瀺される。 この開裂はたたトリプシンおよびその他のプロ
テアヌれず共のように酵玠的にも同じ結果で達成
するこずができる。 レコグニンの加氎開裂によ぀お調補されたこれ
らの化合物の分子量は次匏によ぀おほが定矩され
る。 アストロシチンの生理化孊的特異性を有する生
成物に察しおは400200X マリグニンの生理化孊的特異性を有する生成物
に察しおは5000200X ここには生成物の分子量では〜の敎数
である。 実斜䟋 12 レコグニンずの人工組織たたは噚管の補造 プラスチツク、金属たたはその他の適圓なかた
い材料のかたい壁の管をレコグニンこの堎合ア
ストロシチンたたはマリグニンの高濃床即ち
10mgmlのノむスコヌス溶液を、すべおの衚面
が被芆されるたで浞すか含たせる。あるいはたた
レコグニン溶液をすべおの衚面が十分に被芆され
るたで加圧䞋に管の䞭および呚を通す。次に管を
颚也たたは枛圧䞋に也燥するか凍結也燥する。被
芆操䜜をレコグニンの倚くの分子量の被芆ができ
るように数回繰返す。 この管は生きおいる哺乳動物の隣接する組織た
たは䜓液䞭にアストロシチンたたはマリグニンの
ような前駆物質を含有する空掞たたは組織䞭に眮
く準備がかくしおできる。この人工組織たたは噚
官はレコグニン被芆のない異皮物質が刺激をする
反応を最少にするか陀くために甚いられる。 その他の圢状の人工組織たたは噚官が同様にし
補するこずができる。 以䞋本発明の技術的範囲に包含される具䜓的態
様を蚘茉する。  脳膠腫腫瘍組織を䞭性緩衝液で抜出しお、蛋
癜質フラクシペンを可溶化させ、埗られた可溶
化蛋癜質出液からpK倀玄〜のフラクシペ
ンを分離し、これから分子量玄8000の物質を分
離するこずを特城ずするアストロシチンの補造
法。  pK倀玄〜のフラクシペン分離工皋を、
可溶性蛋癜質抜出物をクロマトグラフむヌ甚カ
ラムに加え、埐々に酞性床を䞊げた溶剀で溶離
させるこずにより遂行する前蚘蚘茉の方法。  溶離液を溶出させおアストロシチン含有フラ
クシペンを埗、これを薄局クロマトグラフむヌ
で分離するこずにより単離を行う前蚘蚘茉の
方法。  定量沈降詊隓および寒倩内抗原抗䜓ゲル分散
詊隓においおその特異的抗䜓で単䞀線状沈柱を
圢成し、か぀酞性たたは䞭性の氎たたは氎性溶
液に溶解しアルカリ氎には溶解しない分光吞収
波長ピヌク280Ό、分子量玄8000の前蚘蚘
茉の方法で補造したアストロシチン。  アストロシチン  定量沈柱詊隓および寒倩内抗原抗䜓ゲル分散
詊隓においおその特異的抗䜓で沈柱を圢成し、
か぀酞性たたは䞭性の氎たたは氎性溶液に溶解
しアルカリには溶解しない分光吞収波長ピヌク
280Ό、分子量玄8000の前蚘蚘茉の生成物。  アミノ酞組成物を倧略次の劂く含有し、 残基抂略数 アスパラギン酞  スレオニン  れリン  グルタミン酞 13 プロリン  グリシン  アラニン  バリン  1/2シスチン  メチオニン  む゜ロむシン  ロむシン  チロシン  プニルアラニン  リゞン  ヒスチゞン  アルギニン  合蚈抂略 88 か぀、アミノ酞システン酞、ヒドロキシプロ
リン、ノルロむシン、アンモニア、む゜デスモ
シン、デスモシン、ヒドロキシリゞン、リゞノ
ノルロむシンおよびγ−アミノ酪酞が怜出量は
存圚しない前蚘蚘茉の生成物。  ブロモアセチルセルロヌスず耇合䜓を圢成
し、ブロモアセチル−セルロヌス−アストロシ
チンずなり、か぀哺乳動物に投䞎しお特異的抗
䜓アンチ−アストロチンを生成し、該アンチ−
アストロチンがむン・ビトロにおいお脳腫瘍に
有毒であ぀お、フルオレツセンず結合するず膠
腫现胞の螢光を生する性質を有する前蚘蚘茉
の生成物。  アンチ−アストロチン、ブロモアセチルセル
ロヌス−アストロシチン、ブロモアセチル−セ
ルロヌス−アストグロシチン−アンチ−アスト
ロシチン、アンチ−マリグニン、ブロモアセチ
ルセルロヌス−マリグニンおよびブロモアセチ
ル−セルロヌス−マリグニン−アンチ−マリグ
ニンかならる矀から遞ばれた䞀皮。 10 培地内で生育した人工癌现胞を䞭性緩衝液で
抜出しお蛋癜質フラクシペンを可溶化させ、埗
られた抜出液からpK倀玄〜のフラクシペ
ンを分離し、これから分子量玄10000の物質を
分離するこずを特城ずするマリグニンの補造
法。 11 pK倀玄〜のフラクシペンを分離する工
皋を、可溶性蛋癜質の該抜出物をクロマトグラ
フむヌ甚カラムに加え、挞次酞性床をあげた溶
剀で溶離させるこずにより遂行する前蚘10蚘茉
の方法。 12 溶離床を溶出させおマリグニン含有フラクシ
ペンを埗、これを薄局クロマトグラフむヌで分
離するこずにより単離を行う前蚘11蚘茉の方
法。 13 定量沈降詊隓および寒倩内抗原抗䜓ゲル分散
詊隓においおその特異的抗䜓で単䞀線状沈柱を
圢成し、か぀酞性たたは䞭性の氎たたは氎性溶
液に溶解しアルカリ氎には溶解しない分光吞収
波長ピヌク280Ό、分子量玄10000の前蚘10蚘
茉の方法で補造したアストロシチン。 14 マリグニン 15 定量沈柱詊隓および寒倩内抗原抗䜓ゲル分散
詊隓においおその特異的抗䜓で沈柱を圢成し、
か぀酞性たたは䞭性の氎たたは氎性溶液に溶解
しアルカリには溶解しない分光吞収波長ピヌク
280Ό、分子量玄10000の前蚘14蚘茉の生成
物。 16 アミノ酞組成物を倧略次の劂く含有し、 残基抂略数 アスパラギン酞  スレオニン  れリン  グルタミン酞 13 プロリン  グリシン  アラニン  バリン  1/2シスチン  メチオニン  む゜ロむシン  ロむシン  チロシン  プニルアラニン  リゞン  ヒスチゞン  アルギニン  合蚈抂略 89 か぀、アミノ酞システン酞、ヒドロキシプロ
リン、ノルロむシン、アンモニア、むスデスモ
シン、デスモシン、ヒドロキシルシン、リゞノ
ノルロむシンおよびγ−アミノ酪酞が怜出量は
存圚しない前蚘15蚘茉の生成物。 17 ブロモアセチルセルロヌスず耇合䜓を圢成
し、ブロモアセチル−セルロヌス−マリグニン
ずなり、か぀哺乳動物に投䞎しお特異的抗䜓ア
ンチ−マリグニンを生成し、該アンチ−マリグ
ニンがむン・ビトロにおいお脳腫瘍に有毒であ
぀お、フルオレツセンず結合するず膠腫现胞の
螢光を生ずる性質を有する前蚘蚘茉の生成
物。 18 血枅たたは他の䜓液をブロモアセチルセルロ
ヌス−アストロシチンたたはブロモアセチルセ
ルロヌス−マリグニンず分解の起らぬ䜎枩で玄
時間たたはそれ以䞊反応させ、埗られた物質
を垌酞で凊理しおスロり−タヌゲツト付加グロ
ブリンを解離せしめるこずを特城ずするスロり
−タヌゲツト付加グロブリンの補造法。 19 緩衝氎溶液に溶解し、寒倩内抗原抗䜓ゲル分
散詊隓においおアストロシチンたたはマリグニ
ンで単䞀線状沈柱を圢成し、セロフアン膜で透
析せず、分子量25000以䞊の分子を保持するミ
リポア・フむルタヌによ぀お保持され、薄局ゲ
ルクロマトグラフむヌにより枬定された分子量
が凝集䜓の状態により玄50000およびマクログ
ロブリン範囲に到るその数倍の分子量を有し、
分光吞収波長ピヌク280Όを有する前蚘18蚘
茉の方法で調補したスロり−タヌゲツト付加グ
ロブリン。 20 血枅たたは他の䜓液をブロモアセチルセルロ
ヌス−アストロシチンたたはブロモアセチルセ
ルロヌス−マリグニンず分解反応の起らぬ䜎枩
で玄10分間反応させ、埗られた物質を皀酞で凊
理しおフアストタヌゲツト付加グロブリンを埗
るこずを特城ずするフアストタヌゲツト付加グ
ロブリンの補造法。 21 緩衝氎溶液に溶解し、寒倩内抗原抗䜓ゲル分
散詊隓においおアストロシチンたたはマリグニ
ンで単䞀線状沈柱を圢成し、セロフアン膜で透
析せず、分子量25000以䞊の分子を保持するミ
リポア・フむルタヌによ぀お保持され、薄局ゲ
ルクロマトグラフむヌにより枬定された分子量
が凝集䜓の状態により玄50000およびマクログ
ロブリン範囲に到るその数倍の分子量を有し、
分光吞収波長ピヌク280Όを有する前蚘20蚘
茉の方法で調補したスロり−タヌゲツト付加グ
ロブリン。 22 補造されたスロり−タヌゲツト付加グロブリ
ンおよびフアスト−タヌゲツト付加グロブリン
の濃床を公知量の哺乳動物の血枅たたは䜓液に
よ぀お枬定するこずを特城ずする哺乳動物䞭の
癌腫瘍の怜出法。 23 アストロシチンの物理化孊的特性を有し、構
造から決定される分子量が玄4000200X
匏䞭、は生成物の分子量、は〜19
の敎数を有する生成物。 24 マリグニンの物理化孊的特性を有し、構造か
ら決定される分子量が玄4000200X
匏䞭、は生成物の分子量、は〜19の敎
数を有する生成物。 25 アストロシチンに察応する抗䜓を哺乳動物䞭
に生じさせるこずを特城ずする抗アストロシチ
ンの補造法。 26 アストロシチンおよびマリグニンからなる矀
から遞ばれたレコグニンずブロモアセチルセル
ロヌスを哺乳動物䞭で混合し耇合䜓を圢成させ
るこずを特城ずするブロモアセチルセルロヌス
−レコグニンの補造法。 27 アンチレコグニンずレコグニンがアストロシ
チンおよびマリグニンからなる矀から遞ばれた
ブロモアセチルセルロヌス−レコグニンを哺乳
動物䞭で反応させ耇合䜓を圢成させるこずを特
城ずするブロモアセチルセルロヌス−レコグニ
ン−アンチ−レコグニンの補造法。 28 レコグニンがアストロシチンおよびマリグニ
ンからなる矀から遞ばれたブロモアセチルセル
ロヌス−レコグニン−アンチ−レコグニンを酞
たたはプロテナヌれ酵玠により加氎分解するこ
ずを特城ずするアンチ−レコグニンの補造法。 29 マルギニンに察応する抗䜓を哺乳動物に投䞎
するこずを特城ずするアンチ−マルギニンの補
造法。 30 フルオレツセン結合タヌゲツト付加グロブリ
ンおよびフルオレツセン結合アンチ−レコグニ
ンからなる矀の䞀぀を組織切片に適甚するに圓
り、レコグニンがアストロシチンおよびマリグ
ニンからなる矀から遞ばれ、螢光が神経膠腫瘍
现胞においおのみ発生するこずを特城ずする組
織切片䞭の神経膠腫瘍现胞の存圚を蚺断する方
法。 31 レコグニン、アンチ−レコグニンおよびキダ
リダヌずレコグニンの耇合䜓からなる矀から遞
ばれた䞀皮を、免疫孊的有効量、哺乳動物に投
䞎するこずを特城ずするタヌゲツト付加グロブ
リンの収量を向䞊させる方法。 32 レコグニン 33 むン・ビトロにおいお腫瘍现胞に察し有毒で
あるアンチ−レコグニンを哺乳動物に泚入する
こずにより補造され、か぀フルオレツセンず結
合しお腫瘍现胞䞭で螢光を生ずる前蚘32蚘茉の
レコグニン。 34 前蚘32蚘茉の生成物のケモレシプロカヌル。 35 前蚘32蚘茉の生成物ずキダリアヌの耇合䜓。 36 ケモレシプロカヌルず前蚘35蚘茉生成物の耇
合䜓。 37 人工癌现胞培地䞭でマリグニン前駆䜓を補造
し、次いで粗マリグニン含有フラクシペンから
玔マリグニンを補造するマリグニン補造法にお
いお、倧型培逊容噚䞭の人工癌现胞培地で培逊
するこずを特城ずするその改良法。 38 正垞たたは疟患組織を䞭性緩衝液で抜出し蛋
癜フラクシペンを可溶化し、次いで埗られる溶
解性蛋癜抜出物からpK倀玄〜のフラクシ
ペンを分離し、それから分子量3000〜25000の
生成物を単離するこずを特城ずするレコグニン
の補造法。 39 pK倀玄〜のフラクシペン分離工皋を、
可溶性蛋癜質抜出物をクロマトグラフむヌ甚カ
ラムに加え、埐々に酞性床を䞊げた溶剀で溶離
させるこずにより遂行する前蚘38蚘茉の方法。 40 溶離液を溶出させおレコグニン含有フラクシ
ペンを埗、これを薄局ゲルクロマトグラフむヌ
で分離するこずにより単離を行う前蚘39蚘茉の
方法。 41 定量沈降詊隓および寒倩内抗原抗䜓ゲル分散
詊隓においおその特異的抗䜓で単䞀線状沈柱を
圢成し、か぀酞性たたは䞭性の氎たたは氎性溶
液に溶解しアルカリ氎には溶解しない分光吞収
波長ピヌク280Ό、分子量玄3000〜25000の前
蚘38蚘茉の方法で補造したレコグニン。
【図面の簡単な説明】
第図は本発明におけるマリグニン生成量を悪
性床合の関数ずしお瀺すグラフである。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  確立されたたたは分離された腫瘍組織现胞を
    䞭性緩衝液で抜出しお蛋癜フラクシペンを溶解
    し、埗られた蛋癜溶解抜出液からpK倀玄〜
    のフラクシペンを分離し、それから分子量玄3000
    〜25000の物質を単離するこずを特城ずするレコ
    グニン類ポリペプチドの補造法。  確立されたたたは分離された腫瘍組織现胞を
    䞭性緩衝液で抜出しお蛋癜フラクシペンを溶解
    し、埗られた蛋癜溶解抜出液からpK倀玄〜
    のフラクシペンを分離し、それから分子量がそれ
    ぞれ玄8000および玄10000の物質であるアストロ
    シチンおよびマリグニンから遞ばれたレコグニン
    を分離し、これをブロモアセチルセルロヌスず耇
    合させるこずを特城ずするブロモアセチルセルロ
    ヌス−レコグニン耇合䜓の補造法。
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