JPS6091998A - 体液及び尿中のｄ―３―ヒドロキシ酪酸の測定法並びにそのための測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、体液中ことに血清又は血漿、あるいは尿中の
Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸の測定を行う
ための改良された酵素による簡易測定方法並びに測定試
薬に関する。

糖質の供給不足あるいは利用障害、ストレス、運動、糖
尿病などで脂質分解および脂肪酸の酸化が六進して命中
および尿中にＤ−３−ヒドロキシ醋酸あるいはアセト酢
酸が増加することが知られている。とくに糖尿病の病態
把握にこれらの化合物を測定することは有用な指標とな
り極めて意義あることとされている。

本発明者等は、すでにＤ−３−ヒドロキシ酪酸あるいは
アセト酢酸の測定法をいくつか提案している。たとえば
（ａ　）血清中のアセト酢酸を、感度および精度の優れ
たＰ−ニトロフェニルジアゾニウムフルオロボレートの
ジアゾニウム塩とのカップリング反応により得られる化
合物の比色分析ニヨり定量ｉｎ方法（特１１１５３−８
６８０３号）、（ｂ）Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸を酵素反
応によってアセト酢酸に変換し、既存のアセト酢酸とと
もに（ａ　）と同様の方法でケ：−ン体化合物総量とし
て測定し、既存のア七ト酢ａｍをそこから減じてＤ−３
−ヒドロキシ醋酸を定量する方法（特願昭５３−１０８
１５３号）、（Ｃ）、これらの改良法として界面活性剤
の存在下でアセト酢酸とＰ−ニトロフェニルジアゾニウ
ムフルオロボレートとを反応させた後、アルカリ化して
宥定なアゾ化合物を生成させこれを比色分析して定量す
る方法（特願１１１５７−１１２５２０号）、および（
ｄ　）Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸を酵素反応により脱水素
するにあたり、電子伝達体およびテトラゾリウム塩を存
在せしめ生成するホルマザンの呈色度の測定によりＤ−
３−ヒドロキシ醋酸を定置する方法（特願昭５８−３９
８１３号）が本発明者等によって示されている。

しかしながら、これらの方法は感度、ｍ度ともすぐれて
いるが（ａ）〜（Ｃ）の方法によれば検体の除蛋白操作
が必要であるという問題点があり、また（ｄ　）の方法
によれば生成するホルマザンによる測定用セルの汚染、
すなわちセル上へのホルマザン色素の沈着がみとめられ
、多数の検体を測定する自動分析では一般に適用がむづ
かしいという問題点がある。

ところで、酵素反応を利用したＤ−３−ヒドロキシ醋酸
あるいはアセ１〜酢酸の測定方法は以下の反応式（Ｉ）
を利用している。

（式中、［）−３−ＯＨＢＡはＤ−３−ヒドロキシ酪酸
であり、ＮＡＤはニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
イドであり、３−０ＨＢＡＤＨは３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素であり、ＡＣＡＯはアセト酢酸であり、ＮＡＤ
Ｈはニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド還元体で
ある。）すなわち、体液および尿中に存在するＤ−３−
ヒドロキシ酪酸は、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の存
在下にＮＡＤと反応して、アセト酢酸に変換され、その
際生ずるＮＡＤＨＩをたとえば波長３４０ｎ−にて吸光
度測定しＮＡＤＨの生成量を測定することによって、Ｄ
−３−ヒドロキシ酪酸の定量が行われている。この際反
応をより完全に進行せしめるため、反応系中に硫酸ヒド
ラジンを添加し、アｔ？Ｉ・酢酸と硫酸ヒドラジンとを
反応させアセ１−酢酸を反応系から除去している。

一方、体液および尿中に存在するアセト酢酸は、３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素の存在下にＮＡＤＨと反応して
、Ｄ−３−ヒドロキシ醋酸に変換され、その際反応前後
のＮＡＤＨ量をたとえば波長３４０ｎｍにて吸光度測定
し、ＮＡＤＩ−１の減少量を測定することによって、ア
セ１〜酢酸の定量が行われている。

しかしながら上記の測定法は、検体の前処理として除蛋
白や透析等の操作を加えなければ、Ｄ−３−ヒドロキシ
酪酸あるいはアセ１−酢酸を特異的に定置することがで
きない。この原因は、主とし・　て体液および尿中に存
在する乳酸脱水素酵素、乳酸、ピルビン酸等が前記反応
式＜１）に干渉を与えているためであろうと考えられる
。本発明者らは、上記の点に着目して鋭意研究した結果
、測定系中に乳酸脱水素酵素阻害剤を存在させることに
よって、検体の前処理としての除蛋白透析等の操作を加
えることなく、体液および尿中のＤ−３−ヒドロキシ酪
酸あるいはアセ本酢酸を正確に定量することができるこ
とを見出して、本発明を完成するに至った。また、本発
明によりこれまでの除蛋白透析等での検体希釈による感
度の低下も改善され、より感度の良い簡易測定法が確立
し得た。

本発明に係る体液および尿中のＤ−３−ヒドロキシ酪酸
の測定方法は、Ｄ−３−ヒドロキシ醋酸をＮＡＤ、３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の存在下で、アセト酢酸に変
換させ、ぞの際生成するＮＡＤＨの量変化を測定するこ
とにより、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸を定量するに際して
、測定系中に乳酸脱水素酵素阻害剤を存在させることを
特徴としている。

また、本発明に係る体液及び尿中のアセト酢酸の測定方
法は、アセト酢酸をＮＡＤＨ，３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素の存在下でＤ−３−ヒドロキシ酪酸に変換させ、
その際減少するＮＡＤＨの量変化を測定することにより
、アセト酢酸を測定するに際して、測定系中に乳酸脱水
素酵素阻害剤を存在させることを特徴としている。

一方、本発明に係る体液および尿中のＤ−３−ヒドロキ
シ酪酸の測定用試薬は、ＮＡＤ、３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素および乳酸脱水素酵素阻害剤を含んで構成され
る。

また本発明に係る体液および尿中のアセ１〜酢酸の測定
用試薬は、ＮＡＤＨ，３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素お
よび乳酸脱水素酵素阻害剤を含んで構成される。

本発明に使用しうる乳酸脱水素酵素阻害剤としては、オ
キサミン酸のほかにＳＨ阻害剤たとえばヨードアセトア
ミド、ヒドロキシ水銀安息香酸、３価のヒ素化合物など
が用いられるが、動物由来の乳酸脱水素酵素への阻害効
果の点からオキサミン酸が特に好ましい。

この乳酸脱水素酵素は測定系中に５６１１ｔＪ／ｄＵ位
の濃度で存在することが望ましい。

また、オキサミン酸を測定系中に共存させ、波長３４０
ｎ−におけるＮＡＤＨの吸光度への影響を、標準検量線
を用いた実験から調べたが、第１０．１１図に示す通り
影響はない。更に、血清検体について先に提案したジア
ゾニウム塩Ｃアゾ化合物を生成させ比色定量する方法（
特願昭５７−１１２５２０＠）と本発明方法との相関関
係は第７図、第８図のグラフに示す如くであり、また、
オキサミン酸による血清中の乳酸脱水素酵素阻害率は第
９図のグラフに示す如くであった。なお、測定に使用し
た濃度は乳酸脱水素酵素を９５％以上阻害する５６＋１
１０／ｄ　Ｑ、とじた。

３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素としては、ロドスピリラ
ム・ルブラム（ＲｂｏｄｏＳｐｉｒ；、１１ｕ＋ｎ　ｒ
ｕｂｚｕｍ　）、シュウトモナス番レモイグネエイ（Ｐ
Ｓｅｄｏ＋ｎｏｎａｓ　ｌｅ−ｍｏｉｇｎｅｉ）などの
細菌以外に、動物起源のものも用いることができる。

なお、以下に示す本発明の実施例においてＮＡＤＨの量
変化を測定する方法として最も基本となる波長３４０ｎ
ｍにおける吸光度測定を例に示したが、このほか既に本
発明者等により提案している電子伝達体およびデトラゾ
リウム塩をさらに存在せしめ生成するホルマザンの呈色
度を水溶液あるいは試験紙などで測定する方法（特願昭
５８−３９８１３号）や同様にＮＡＤＨを直接またはそ
の還元力を利用した螢光法等があげられる。

以下、本発明に係る体液中のＤ−３−ヒドロキシ醋酸お
よびアセト酢酸の測定方法を用手法と遠心方式自動分析
装置（セントリフィヶム・システム５００）に適用した
具体例について説明する。

■、試薬 （１）Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸測定用補酵素試薬０．２
Ｍ／Ｌｌ−リス塩酸緩衝液（ＰＨ８，５）２３．７１１
ＩＱに２０ｍ　Ｍ／Ｌ　ＮＡＤ　３．ＯａＵ、上記トリ
ス塩酸緩衝液で溶かした０、　５　（ｗ／Ｖ　）％硫酸
ヒドラジン溶液３．０ＩｌＩＱ、を加えて混和し、さら
にオキサミン酸２５ｍΩを加えて溶解した後、蒸留水で
全１１３３．５ｍ　Ｑ、とじた溶液を調製して使用する
。

■　アセト酢酸測定用補酵素試薬 ０．２５Ｍ／Ｌトリエタノールアミン溶液（ＰＨ７，０
＞の２４．７ｔａＱに３＋ｎ　Ｍ／Ｌ　ＮＡＤＨ５，０
１１Ｉｌを加えて混和し、さらにオキザミン酸２５ａＱ
を加え溶解した後、蒸留水で全量３３゜５ｍ１ｌｊとし
た溶液をＩＱ製して使用する。

（３）　Ｗｆ素試薬 西ドイツ国ベーリンガー・マンハイム社製のものくグレ
ード■）約１５単位／ＩＩＱ、を使用する。

■、用千手法よる測定方法 （１）Ｄ−３−ヒドロキシ醋酸の算出方法０−３−ヒト
ＯキシＷ！ｌｌ１Ｉ測定用補酵素試液と酵素試液を６７
＝３の割合で混合した試液１０５０、μＱに検体３００
μ悲を加えて測定液とし、直ちに波長３４０　ｎｍにて
吸光度ＡＸを測定する。次いでこの測定液を３７℃で５
分間振とうした後、再度波長３４０　ｎ１ｌｌにて吸光
度Ａｙを測定する。同様にして検体の代りに蒸留水、６
％アルブミン溶液を用いて調製した５００μＭ／ＬＤ−
３−ヒドロキシ酪酸ナトリウム標準液での３７℃、５分
間反応前後の各測定液の吸光度ＢＸ　Ｂｙおよび５ｘＳ
ｙを測定し、式 により、検体中のＤ−３−ヒドロキシ醋酸の含有量Ｅａ
＠算出する。なお、酵素試液を別途添加する場合はＤ−
３−ヒドロキシ酪酸測定用補酵素試液１００５μｇに検
体３００μＱを加えた後に吸光度Ａ　Ｘ／を測定し、そ
の後酵素試液４５μＱを加え３７℃で５分間振どうする
。、蒸留水、６％アルブミン溶液を用いて調製した５０
０μＭ／ＬのＤ−３−ヒドロキシ酪酸ナトリウム標準液
についても同様に行う。の場合、算出式においてはＡＸ
、Ｂ×、ＳＸの代りにそれぞれ を用いる。

■　アセト酢酸の算出方法 アセ１−酢酸測定用補酵素試液とＷｌ素試液を６７：３
の割合で混合した試液１０５０μＱに検体３００μＱを
加えて測定液とし、直ちに波長３４　Ｑ　ｎｍにて吸光
ｖＣ×を測定する。次いでこの測定液を３７℃で５分間
振とうした後、再度波長３４０　ｎｍにて吸光度Ｃｖを
測定する。同様にして検体の代わりに蒸留水、６％アル
ブミン溶液を用いて調製した５００μＭ／Ｌリヂウムア
セト酢酸標準液での３７℃、５分間反応前後の各測定液
の吸光度Ｂ′Ｘ　％　Ｂ’ｙおよび３’ｘ　、Ｓ’Ｖを
測定し、式により、検体中のアセト酢酸含有ＩＥＩ、を
斡出す、る。なお、酵素試液を別途添加する場合はアセ
ト酢酸用補酵素試液１００５μ艶に検体３００μＱを加
えた後に吸光度Ｃ×′を測定し、その後酵素試液４５μ
Ｕを加え３７℃で５分間振とつする。蒸留水、６％アル
ブミン溶液を用いて調製した５００μＭ／Ｌリチウムア
セト酢ｍ標準液についても同様に行なう。この場合、搾
出式においてはＣｘ。

Ｂ′ｘ、Ｓ′ｘの代わりにそれぞれ を用いる。

ここで血清中Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸の測定系中に乳酸
が存在している場合にＮＡＤＨの波長３４Ｑｎｍでの吸
光度がどのように変化するかを調べ第１図に示し、同様
に乳酸を添加した場合の変化を第２図に示す。

図中向Ｉ！１は３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を添加し
、オキサミン酸を添加しない場合に得られる曲線を示し
、曲線２は３−ヒドロキシ醋酸脱水素酵素およびオキサ
ミン酸を添加しない場合に得られる曲線を示し、曲線３
は３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素およびオキサミン酸を
添加した場合に得られる曲線を示している。

この第１図および第２図から、測定系中に乳酸が存在す
ると波長３４０ｎｗ＋でのＮ　Ａ　Ｄ　１」の吸光度に
変化が認められるが、この変化は乳酸脱水素酵素阻害剤
であるオキサミン酸を測定系中に存在させることによっ
てほぼ完全に阻止されていることがわかる。

同様に血清中のアセト酢酸の測定系中に、ピルビン酸が
少量存在している場合にＮＡＤＨの波長３４０ｎＩ％で
の吸光度がどのように変化するかを調べ８ｆ！３図に示
し、そしてピルビン酸を添加した場合の変化を第４図に
示す。

図中面１１．２．３は第１図と同じ意味を有している。

この第３図および第４図から、測定系中にピルビン酸が
存在すると、ＮＡＤＨの吸光度に変化が認められるが、
この変化は乳酸脱水素酵素阻害剤であるオキサミン酸の
存在により、はぼ完全に阻止されていることがわかる。

また同様に尿中のＤ−３−ヒドロキシ醋酸の測定系中に
、乳酸を添加した場合に、ＮＡＤＨの波長３４０ｒｖで
の吸光度がどのように変化するかを調べ第５図に示し、
さらに尿中のアセト酢酸の測定系中に、ピルビン酸を添
加した場合に、ＮＡＤＨの波長３４０．ｎ１ｌｌでの吸
光度がどのように変化（るかを調べ、第６図に示す。図
中、曲線１．２゜３は、第１図と同様の意味を有する。

第５図は尿中孔６！１１１２水素酵素活性が血中に比べ
て低く、乳酸の干渉が血中より低いため、オキサミン酸
の阻止効果がはっきりしないが第６図は乳ＩｌＩ脱水素
酵素阻害剤であるオキサミン酸の存在により、ピルビン
酸によるＮＡＤＨの吸光度、の変化がほぼ完全に阻止さ
れていることがわかる。

■、遠心方式自動分析装置（米国リチャードソン・ヴイ
ツクス社製セントリフイクム・システム５００）による
測定方法。

（１）Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸の算出方法検体１００μ
Ｑ、６％アルブミン溶液を用いてｇＩ製した５００μＭ
／Ｌ　Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸ナトリウム標準液１００
μＵおよび試薬ブランクとしての蒸留水１００μＱをセ
ントリフイケム・システム５００アナライザーのトラン
スファーディスク上の所定のサンプル・キャビティへ正
確に分注する。同様にしてＤ−３−ヒドロキシ酪酸測定
用補酵素試液と酵素試液を６７＝３の割合で混合した試
液３５０μＱをシステム５００ピペッタ−によりトラン
スファーディスク上の試薬キャビティへ分注する。分注
後トランスファーディスクを表１に示した条件に設定し
たセントリフイケム・システム５００アナライザーのロ
ーター・チェンバー内のローターにセットし測定する。

検体１００μＱ、６％アルブミン溶液を用いて調製した
５００μＭ／Ｌリチウムアセト酢酸標準液１００μＱお
よび試薬ブランクとして蒸留水１００μＵをセントリフ
ィケム・システム５００アナライザーのトランスファー
ディスク上の所定のサンプル・キャビティへ正確に分注
する。同様にしてアセト酢酸測定用補酵素試液と酵素試
液を６７：３の割合で混合した試液３５０μＱをシステ
ム５００ピペッタ−によりトランスファーディスク上の
試薬キャビティへ分注する。分注後トランスファーディ
スクを表１にした条件に設定したセントリフィケム・シ
ステム５００アナライザーのローター・チェンバー内の
ローターにセットし測定する。

以上により、体液および尿中Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、
アセト酢酸を除蛋白、透析等の操作をすることなく、波
長３４０　ｎ１ｌｌにおけるＮ　Ａ　Ｄ　ｌ−１の増加
、減少度をエンドポイント法で測定し直接定量すること
が可能である。直線性はＤ−３−ヒドロキシ酪酸系で８
００μＭ／Ｌ、アセト酢酸系で１０００μＭ／Ｌまで認
められ、同時再現性は０７２〜４％、添加回収率は両反
応系で血清、尿で９８〜１０８％であった。また血清検
体について先に提案したジアゾニウム塩でアゾ化合物を
生成させ比色分析し定量する方法（特願昭５７−１１２
５２０号）との相関はＤ−３−ヒドロキシ酪酸系で相関
係数γ−０．９９＋アセト酢酸系では相関係数γ−０，
９７と良好な相関が得られた。そのことから乳酸脱水素
酵素阻害剤の存在は検体の除蛋白、透析等の操作を不要
ならしめることがわかる。

なお、検体分注をシステム５００ピペッタ−により実施
する際は、サンプル量４５μＱ、トータル量９５μＱに
設定して行なう。この場合、感度は約半分となるが直紗
性は約２倍に拡大する。

このようにして健常人２０名の血清中に含まれるアセト
酢酸およびＤ−３−ヒドロキシ酪酸の分別定量を行ない
、その１１度を平均値上５−Ｄ（ｆｆｌ準偏差値以下同
じ）μＭ／Ｌで第２表に示す。さらに、ケトアシド−シ
ス検体１例を含む糖尿病患者の血清中のアセ１〜酢酸お
よびＤ−３−ヒドロキシ酪酸の分別定量を行ない、その
１１度を平均値子Ｓ−ＤμＭ／Ｌで第３表に示す。また
ニトロプルジッド法により陽性を示した尿検体１例を含
む尿検体５例について本発明方法によって分別定量した
結果を第４表に示す。

表　１ 第　２　表　単位　μＭ／Ｌ 平均領土Ｓ−Ｄ 第　３　表　単位　μＭ／Ｌ ＊：Ｎ０．５検体を除く９例についての平均値士Ｓ−Ｄ
第４表

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、血清中のＤ−３−ヒドロキシｆ
ｉ！Ｆ酸の測定系中に乳酸が存在あるいは添加されてい
る場合、ＮＡＤＨの吸光度がどのように変化するかを示
すグラフ、第３図および第４図は、血清中のアセト酢酸
の測定系中にピルビン酸が存在あるいは添加されている
場合に、ＮＡＤＨの吸光度がどのように変化するかを示
すグラフ、第５図は尿中のＤ−３−ヒドロキシ酪酸の測
定系中に乳酸を添加した場合にＮＡＤＨの吸光度がどの
ように変化するかを示すグラフ、第６図は尿中のアセト
酢酸の測定系中にピルビン酸を添加した場合、ＮＡＤＨ
の吸光型がどのように変化するかを示すグラフ、第７図
および第８図は血清検体について先に提案したジアゾニ
ウム塩でアゾ化合物を生成させ分析する定量方法（特願
昭５７−１１２５２０号）と本発明方法との相関を示す
ものであり、！′％７図はＤ−３−ヒドロキシ醋酸、第
８図はアセＩ〜酢酸についての相関グラフ、第９図はオ
キ勺ミン酸による血清中の乳酸脱水素酵素ｌ！１１害率
を示したグラフ、第１０図および第１１図はＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸、アセト酢酸の各ｌ１ｌｌ準液を用いての
標準検量線をオキサミン酸添加の有無の場合について示
したグラフである。 特　許　出　願　人　繁　１）　幸　方向　原　納　優 同　株式会社三和化学研究所 第１図 第２図 第６図 第４図 第７図 苓発８８方５太 アセ１−西乍酉莞　（兄＋ｌ’ｌ） 木登明方５７゜ 第９図 ｆ代■ミン爵処　（仇許公Ｉ） 第１０図 Ｃ１Ｃ１−３−ｌ［ｌｆｆ′７ｂ１Ｇ受（ん１司／り第
１１図 リナウム了マド酢自梵ＣｅＭ／Ｌ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　体液および尿中のＤ−３−ヒドロキシ酪酸をニ
   コヂンアミドアデニンジヌクレオタイド、３−ヒドロキ
   シ酪酸脱水素酵素の存在下でアセト酢酸に変換させ、そ
   の際生成するニコヂンアミドアデニンジヌクレオタイド
   還元体の量変化の測定により、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸
   を定量するに際して、測定系中に乳酸脱水酵素阻害剤を
   存在さけ、除蛋白あるいは透析操作等を省略することを
   特徴とするＤ−３−ヒドロキシ酪酸の測定方法。 ■　体液および尿中のアセ１〜酢酸をニコヂンアミドア
   デニンジヌクレオタイド還元体、３−ヒドロキシ酪酸脱
   水素酵素の存在下でＤ−３−ヒドロキシ醋酸に変換させ
   、その際減少するニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
   イド渾元体の量変化の測定により、アセト酢酸を定量す
   るに際して、測定系中に乳酸脱水素酵素阻害剤を存在さ
   せ、除予白あるいは透析操作等を省略することを特徴と
   するアセト酢酸の測定方法。 （３）乳酸脱水素酵素阻害剤がオキサミン酸である特許
   請求の範囲第１項または第２項に記載の測定方法。 （４）　ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド、３
   −ヒドロキシ醋酸脱水素酵素および乳酸脱水酵素阻害剤
   を含むことを特徴とする体液および尿中のＤ−３−ヒド
   ロキシ醋酸の測定試薬。 （５）　ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド還元
   体、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素および乳酸脱水素酵
   素阻害剤を含むことを特徴とする体液および尿中のアセ
   １〜酢酸の測定試薬。 （６）乳酸脱水素酵素阻害剤がオキ丈ミン酸である特許
   請求の範囲第４項または第５項に記載の測定試薬。