JPH03218462A

JPH03218462A - 標準曲線における抗原結合率と抗二本鎖ｄｎａ抗体価の比例関係を改善するためのｓｌｅ疾患の検知法及び検知用キット

Info

Publication number: JPH03218462A
Application number: JP29350290A
Authority: JP
Inventors: Masahide Kawamura; 雅英川村
Original assignee: Nippon DPC Corp
Current assignee: Nippon DPC Corp
Priority date: 1990-10-30
Filing date: 1990-10-30
Publication date: 1991-09-26
Anticipated expiration: 2012-09-03
Also published as: JP2649100B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】「産業上の利用分野」本発明は、生物学的液体試料中の抗ＤＮＡ抗体価を測定
する方法および測定用キットに関するものである。

「従来の技術」血清又は血漿等の生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体の測定
は、全身性紅斑狼癒（Ｓ　Ｌ　Ｅ　：　Ｓｙｓｔｃｖｉ
ｃＬｕｐｕｓ　Ｅｒｙｔｈｅｓａｔｏｓｕｓ）の診断に
極めて重要な検査となっている。この抗ＤＮＡ抗体には
、ｌ）二本鎖ＤＮＡのみ反応する抗体、２）二本鎖及び
一本鎖ＤＮＡに反応する抗体、３）一本＃ｔＩＤＮＡに
のみ反応する抗体が知られている。これらのうち、ｌ）
及び２）の抗体はＳＬＥ患者の血中に特異的に見られ、
診断上重要であるか、３）の抗体は他の疾患（慢性関節
リウマチ、シェーグレン症候群等）でも出現する為、診
断の有用性は低い。二本！１ＤＮＡを抗原とすると、■
）及び２）の抗体が反応し、一本ＩＤＮＡを抗原とする
と、２）及び３）の抗体が反応する。この為ＳＬＥに対
し、特異性の高い診断を行う為には、純枠な二本鎖ＤＮ
Ａを抗原とした抗ＤＮＡ抗体測定系が重要である。

このような抗ＤＮＡ抗体価の測定法としては、赤血球凝
集反応法、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定
法（Ｅ　Ｉ　Ａ法）がある。

赤面球凝集反応法は、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法に比べ、安価
なために広く用いられているが、感度．定量性に欠ける
という欠点がある。これに対し、Ｉｔ　ｌ　Ａ法、ＥＩ
Ａ法は感度と定量性がよく、ＳＬＥ患者の重篤度または
回復度とよく相関するために臨床上極めて有効である。

その中で、Ｆａ　ｒ　ｒ法といわれる標識ＤＮＡを用い
た方法は最も高感度で精度の良い手法として現在広く普
及している。Ｆａ　ｒ　ｒ法では、ＤＮＡを放射能で標
識したＤＮＡトレーサーと患者検体中の抗ＤＮＡ抗体を
反応させた後、終濃度が５０％飽和となるように硫安（
硫酸アンモニウム）水溶液を加えて混和後、遠心分離し
、イムノグ口プリンを沈澱させ、イムノグ口プリンと結
合して沈澱した放射能（Ｄ　Ｎ　Ａ量）より抗体価を算
出する。

これは、５０％飽和硫安水溶液中でＤＮＡが沈澱せず、
抗体と結合したＤＮＡは沈澱する、という原理に基づい
ている。

「発明が解決しようとする課題」これまで行われてきた抗ＤＮＡ抗体測定系には下記の問
題点があった。

（イ）測定系内の抗原分子数の管理（口）抗二本鎖ＤＮＡ抗体測定系への一本鎖ＤＮＡの混
入（ハ）抗体価と抗原結合量の直線性、これらの点について、それぞれ従来技術を説明する。

〔従来技術〕

（イ）測定系内の抗原分子数の管理について、これまで
の抗ＤＮＡ抗体測定系においては、その抗原として牛胸
腺ＤＮＡ　　（特開昭５８−５６６９４号公報）ヒト培
養細胞Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｐｉｎｃｕｓら、Ｔｈｅ　Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ．（１９６９）２ｇＩ　　Ｐ　７０１）　、Ｃ　
ｒｉｔｈｆｄｉａ属のネットワークＤＮＡを精製したも
の（特開昭６０−７８３４９号公報）また、牛胸腺ＤＮ
Ａを超音波で切断したもの（特開昭５７−４２６３２号
公報）が用いられてきた，これらのＤＮＡは全て不均一
な長さ　（分子量）のＤＮＡ分子より構成されている。

この不均一性（どういう長さのＤＮＡがどういう割合で
入っているか）は、調製したロットにより異なる為、こ
のようなＤＮＡのモル濃度を管理する事は事実上不可能
である。

抗体の測定系において、系内の抗原の量は測定値にとっ
て非常に重要である。特にＦａ　ｒ　ｒ法のように、抗
体価を結合抗原量から求める測定系では、その抗原量は
モル濃度によって常に一定に管理されなければならない
。通常の抗体測定系、例えばリウマチ因子（変性１ｇＧ
に対する抗体）の測定系では、抗原が一定の分子層を持
つ為、抗原を重量濃度で管理すれば、同時にモル濃度に
よる管理が可能である。これに対し、上述の不均一なＤ
ＮＡ（分子量が広い分布をもって存在しているＤＮＡ）
のような抗原の場合は、重量濃度とモル濃度が一定の関
係を示さない。

本願発明者は、従来の抗ＤＮＡ抗体の測定法が、測定系
内の抗原量がモル数として一定に管理されていないとこ
ろに、測定の精度を悪化させている大きな原因があるこ
とに気付いたのである。

（口）一本鎖ＤＮＡの混入について既に述べたように、一本鎖ＤＮＡに対する抗体はＳＬＥ
以外の疾患でも出現する為、抗二本鎖ＤＮＡ抗体の測定
系では、一本鎖ＤＮＡの混入ができるだけ少ない二本鎖
ＤＮＡを抗原として用いなければならない。このような
目的の為に、特開昭５７−４２６３２号公報ではＳｌヌ
クレアーゼ処理、特開昭５８−５６６９４号公報ではＳ
ｌヌクレアーゼ処理後ハイドロキシアバタイトによる精
製を行っている。Ｓｌヌクレアーゼは一本ｍＤＮＡを特
異的に分解する酵素として知られているが、実際には二
本鎖ＤＮＡの分子中に一本鎖ＤＮＡ切断（Ｎｉｃｋ）を
入れてしまう。　（宍戸ら、蛋白質核酸酵素，３０　　
，ｐ９８１　　（１９８５））このようなＮｉｃｋを持
った二本鎖ＤＮＡは、保存中に分解して一本鎖ＤＮＡを
生ずる可能性があり、このような抗原の不安定性につい
ては既に指摘されている。（東条ら，日本臨床１９８５
秋季増刊（下），ｐｌ９７）また、Ｓ！ヌクレアーゼ処
理した二本鎖ＤＮＡは末端に若干の一本鎖ＤＮＡ部分を
含んでいる事も知られており　（宍戸ら、前掲）Ｓｌヌ
クレアーゼ処理は、二本鎖ＤＮＡの純度、安定性といっ
た点で必ずしも完全とはいえない。

また、ハイドロキシアバタイトによる精製は、完全な二
本鎖ＤＮＡ分子と完全な一本鎖ＤＮＡ分子の分離には適
ずるが、二本鎖ＤＮＡの末端あるいは中央部等に若干の
一本鎖ＤＮＡ部分を含むような分子を、完全な二本＠Ｄ
ＮＡから分離する事は困難である。

さらに重大な問題は、不均一な分子量を持つＤＮＡ分子
を抗原としている場合、一本鎖ＤＮＡの混入量を評価す
る事か極めて難しいという事である。不均一な二本鎖Ｄ
ＮＡと、それに由来する一本鎖ＤＮＡ又は一部に一本鎖
部分を持つ二本鎖ＤＮＡは、電気泳動、ゲルろ過、超遠
心、ノ＼イドロキソアパタイトカラムといった通常のＤ
ＮＡの分折に用いられる手法では分離分析できない。従
って、従来法では一本鎖ＤＮＡを除く処理をした後、一
本鎖ＤＮＡが存在しないものと見なす事のみが可能であ
った。この為、一本鎖ＤＮＡの抗原への混入あるいは保
存中に一本！ＩＤＮＡが生ずる可能性が常に指摘されて
おり　（東条ら、前掲）それを否定する明確な反論はな
されていない。

（ハ）抗体価と抗原結合量の直線性についてＦａ　ｒ　
ｒ法に於いては、抗体価と抗原結合量の直線性について
も従来法では問題があった。前述した様にＦａ　ｒ　ｒ
法は抗ＤＮＡ抗体の量を抗体に結合した抗原の！（放射
能）より算出する手法である。従って抗体価を正確に求
めるには抗原と抗体が１対１の比で結合する事が最も理
想的で、その様な状態で結合抗原分子数と結合抗体分子
数が等しくなる。抗ＤＮＡ抗体の測定系では抗原ＤＮＡ
に対して抗体が十分に少ない場合は抗原と抗体が監対監
で結合するが、抗体が高濃度になると、一つの抗原に複
数の抗体が結合するようになる。

この上うな状轢では、抗ＤＮＡ抗体量が増加しても、結
合抗原量はさほど増加せず、抗体価と抗原結合量の直線
性が悪くなる。これはいわゆる　“標準曲線が寝る“と
いう状態であり、測定精度を悪化させる大きな原因とな
っている。本願発明者は、これは抗原に用いるＤＮＡの
長さが長すぎる為、一つの抗原に複数の抗体が結合する
確率が高くなることに起因しているということに気付い
たのである。

「課題を解決するだめの手段」上記従来の課題に対し、本願発明者らは鋭意研究を重ね
たところ、ＤＮＡ　トレーサーとして、ブラスミドＤＮ
Ａ等の二本鎖環状ＤＮＡを制限酵素で切断して得られる
直線状二本鎖ＤＮＡを標識して成るＤＮＡ　トレーサー
を用いることにより、前述の各問題点に対し、次のよう
な効果を奏することを見出だした。

（イ）抗原のモル濃度による管理前述したように特異抗体の測定系に於いては、その測定
系内の抗原量がモル濃度で管理されなければならない。

この事を解決するためには、抗原を製造する際に、常に
抗原の単位重量中に含まれる抗原分子数を一定にコント
ロールできなければならない。この目的の為、本顆発明
者は遺伝子組換え型又は天然型ブラスミドＤＮＡ等の二
本鎖環状ＤＮＡを制限酵素で切断したものを用いた。こ
の方法によれば、抗原ＤＮＡの単位重量あたりの抗原分
子数を常に一定なものとする事ができる。

例えば、実施例ｌでは、１４４２ｂ，と９８９ｂｐの長
さを持つＤＮＡのｔｉｔの混合物が得られる。

一定分子量のＤＮＡを調製する方法として高分子ＤＮＡ
を超音波や酵素により切断した後、電気泳動、ゲルろ過
又は超遠心等を用いた分子量分画も理論的には考えられ
る。しかし、これらの手法では、最も理想的な状態で分
離して得られたＤＮＡ分子でも、ある程度の分子量の分
布をもっており、本発明で用いるＤＮＡのような単位重
量中に常に一定分子数を含むものにはなり得ない。さら
に、これらの分子量分画法では極く少飛の抗原ＤＮＡＬ
，か分画できず、手法も煩雑であって、測定キットの商
業スケールでの製造という点では極めて困難な手法であ
る。従って、単位重量中常に一定の分子数を含むＤＮＡ
の製造方法としては、組換え型又は天然型ブラスミド等
の二本鎖環状ＤＮＡを材料として用いるのが最らよい。

（口）一本鎖ＤＮＡの混入一本鎖ＤＮＡの混入を最小にする方法としても組換え型
又は天然型のブラスミドＤＮＡ等の二本鎖環状ＤＮＡ（
二本鎖閉環状ＤＮＡ）は最適である。

二本鎖閉環状Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｃｃｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ　）は
最初から一本鎖ＤＮＡを全く含まない分子である。ｃｃ
ｃＤＮＡは、染色体又はｃｃｃ−ＤＮＡの分解に由来す
る直線状ＤＮＡとは、浮遊密度等の物理的性質が大きく
異なる為、ＣｓＣＣ密度勾配超遠心、電気泳動、ゲルろ
過等の遺伝子組換えでよく用いられる手法で精製すれば
、極めて高純度の二本鎖環状ＤＮＡとして得る事が可能
である。またこれを材料として実施例にあげた　Ｂａｎ
ｌ，　　Ｃｆｒ１，　　Ａｖａｌのような制限酵素で切
断すると、末端に最大で４　　ｂａｓｅの一本鎖部分が
生じる。、このような短い一本鎖ＤＮＡ部分は後述する
実施例で用いているクレノー酵素等により、簡単に完全
な二本鎖ＤＮＡへと修復できる。

さらに、このようなＤＮＡ分子の利用により、一本鎖Ｄ
ＮＡあるいは他のＤＮＡ分子の混入量の管理が極めて明
確になる。組換え型又は天然型プラスミド等の二本鎖環
状ＤＮＡは、電気泳動、超遠心、ゲルろ過等の物理的手
法によって他のＤＮＡと簡単にしかも明確に分別分析で
きる。また、電気泳動では、二本鎖環状ＤＮＡそのもの
のみならず、それを制限酵素で切断した断片もその他の
ＤＮＡと区別できる。従ってＤＮＡを標識後、電気泳動
を行い、ＤＮＡのバンドの放射能等を測定することによ
り、目的とするＤＮＡ　トレーサー以外のＤＮＡ　（一
本鎖ＤＮＡもこの中に含まれる）の混入度を正確に管理
する事が可能となる。

以上のように、遺伝子組換え型又は天然型ブラスミド等
の二本鎖環状ＤＮＡに由来する一定の長さのＤＮＡを用
いる事により、抗二本鎖ＤＮＡ測定系における一本鎖Ｄ
ＮＡの混入という問題が克服される事を見出した。

（ハ）抗体価と抗原結合量の直線性前記したように抗原として長いＤＮＡ分子を用いると、
一つの抗原に複数の抗体が結合する確率が高くなり、こ
れが従来法で抗体価と抗原結合量の直線性を悪くし、ひ
いては測定の精度を落とす原因となる。

本願発明者は、組換え型又は天然型ブラスミド等の二本
鎖環状ＤＮＡを制限酵素で切断すれば、任意で一定の長
さのＤＮＡが得られる事に注目し、様々な長さのＤＮＡ
抗原を用いて、抗体価と結合抗原量の直線性を検討した
。その結果、ＤＮＡ抗原はその長さが十分に短いと、抗
原と抗体がＩ対ｌで結合する確率が高くなる。（すなわ
ち、良好な直線性を示す領域が長くなる。）そして、こ
のようなＤＮＡとしては、長さが０．１〜６　．　６　
ｋｂｐのものが好ましく、０．１〜１　．　４　ｋｂｐ
のものが最も好ましいことを知見した。

以上述べた様に、本発明は、抗原とするＤＮＡトレーサ
ーとして、二本鎖環状ＤＮＡを制限酵素で切断して得ら
れる直線状二本鎖ＤＮＡを標識して成るＤＮＡトレーサ
ーを用いることを、課題解決の手段とした。

本発明に於いては、まず、組換え型又は天然型ブラスミ
ドＤＮＡ等の二本鎖環状ＤＮＡを含む生物を選択する。

このような生物としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ，
　Ｐｓｅｕｄｏｉｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａのような細菌
、Ｓａｃｃｈａｒｏｅ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａ
ｅ等の酵母が利用可能である。ここでは大腸菌のブラス
ミドを例にとり説明する。ブラスミドをもつ大腸菌を適
当な培地で培養し、菌体を遠心、ろ過等の方法で集める
。次に菌体を、リゾチームのような溶菌酵素、ドデシル
硫酸ナトリウムのような界面活性剤、フェノールのよう
なタンパク変性剤等によって溶菌し、フェノール抽出等
により除タンパクを行い、核酸を抽出する。この核酸は
ＤＮＡとＲＮＡを含むので、ＲＮＡ分解酵素でＲＮＡを
分解し粗ＤＮＡ画分を得る。この粗ＤＮＡ画分は、プラ
スミドＤＮＡおよび染色体由来ＤＮＡ及びブラスミド由
来の断片化したＤＮＡを含むので、ＣｓＣｌ２平衡密度
勾配超遠心、ゲルろ過、ノ１イドロキノアパタイト力ラ
ム、電気泳動等の方法でｃｃｃ−ＤＮＡ（ブラスミドＤ
ＮＡ）を分離する。

このようにして得られたＣＣＣ−ＤＮＡは極めて高純度
の二本鎖ＤＮＡであり、この事はアガロースゲル電気泳
動や、ゲルろ過等を利用したＨＰＬＣ等で確認できる。

続いて、このＣＣＣ−ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し
、好ましくは０．１〜６　．　６　ｋｂｐ，最も好まし
くは０．１〜１．４ｋｂＰのＤＮＡ断片を生ぜしめる。

この時の制限酵素は、ＥｃｏＲＩ、Ｉ｛ｉｎｄｌ［ｌ、
Ｂａｇ＋Ｉ｛　　Ｉ，　Ｂａｎ　Ｉ等のあらゆる制限酵
素が利用可能であるが、目的の長さのＤＮＡ断片を生じ
るよう慎重に選ぶ必要がある。得られたＤＮＡ断片は　
ｉｎ　　ｖｉｔｒｏで標識する。従来はｌ″Ｓｔシチヂ
ン、１０−チミジン、３Ｈ−チミジン等をヒト培養細胞
や大腸菌細胞等にとり込ませ、ＤＮＡを標識ずるいわゆ
る　ｉｎ　　ｖｉｖｏ標識法がよく用いられていた。こ
の　ｉｎ　　ｖｉｖｏ標識法も本発明に応用可能である
が、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ標識法は標識しない抗原の大量
の在庫が可能である為、製造の手間が大巾に省略され、
また、抗原ロット間の誤差という問題も少なくできるこ
と、更には放射能を取り扱う作業時間が短縮されること
等、ｉｎ　　ｖｉｖｏ標識法に比べて様々な利点がある
。

ＤＮＡの　ｉｎ　　ｖｉｔｒｏの標識法としては、所謂
［ニックトランスレーション法」に代表されるＤＮＡ分
子の中ほどに標識する方法と、ＤＮＡ末端のみに標識す
る方法とがある。このうちニックトランスレーンヨン法
は、最も比活性の高いＤＮＡが得られる良い標識法であ
り、通常最もよく用いられる。しかし、この標識法では
、ＤＮＡ分子の中ほどに一本鎖切断（いわゆるニック）
を入れる結果となり、二本鎖ＤＮＡの安定性が悪化して
しまう。これに対し、末端のみに標識する方法は、ＤＮ
Ａ分子にニック等のキズをつける事がない為、二本鎖Ｄ
ＮＡが最も安定した状態で標識される。このような末端
標識法としてはポリヌクレオチドキナーゼを用いる方法
、ＤＮＡポリメラーゼ・ラージフラグメント　（クレノ
ー酵素）を用いる方法、Ｔ　４　−Ｄ　Ｎ　Ａポリメラ
ーゼを用いる方法、ターミナルデオキノトランスフエラ
ーゼ（Ｔ　ｄＴ　）を用いる方法が可能である。

標識は、ＩｔＪ、”Ｃ，３１−１、３１１）等の放射性
物質、パー才キシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ
、β−ガラクトシダーゼ等の酵素、蛍光物質、化学的発
光物質で標識されたデオキシリボヌクレオヂドリン酸等
を用いて行い得る。又はビオチン化デオキシリボヌクレ
オチドリン酸などを用い、放射性物質、酵素、蛍光物質
、化学的発光物質で標識したアビジンを用いて間接的に
標識する事も可能である。

測定は標識されたＤＮＡトレーサーと患者検体中の抗Ｄ
ＮＡ抗体を適当な緩衝液中で反応させる。

反応後、抗体と結合したトレーサー（結合トレーサー）
と抗体結合しなかったトレーサー（遊離トレーサー）を
分離する。Ｆａ　ｒ　ｒ法においては、終濃度５０％飽
和の硫安水溶液により結合トレーサーのみを沈澱さける
が、ポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｉ法、抗ヒ
トイムノグロプリン抗体等を用いた２抗体法、あるいは
ＰＥＧ法と２抗体法を組み合せた方法によって結合トレ
ーサーのみを沈澱させる事も可能である。又、ゲルろ過
等のカラム、超遠心、電気泳動等の結合トレーサーと遊
離トレーサーを分離できる全ての方法が利用可能である
。

次に実施例を用いて、具体的に説明する。

「実施例１」（Ｉ）　　試薬の調製（ｉ）ＤＮＡトレーサーの作製 ■　ブラスミドｐＮＤＰｃＩを持つＥ　ｃｏｌｉ　Ｋ１
２ＪＭｌ０９株をＬＢ培地（１％トリブトン、０．５％
酵母エキス、０．５％ＮａＣｇ）で培養し、通常の方法
でブラスミドを精製する。ｐＮＤＰｃｌの制限酵素地図
は、第１図に示すようである。すなわち、この地図に示
すように、ブラスミドｐＮＤＰｃｌは、ｐＵ　Ｃ　１　
Ｂ　（Ｙａｎｉｓｃｈ　Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．　ｅｔ　ａ
ｌ．　，Ｇｅｎｅ　　３３：１０３（１９８５））が部
分的にＣｆｒｌにより切断され、その後、そのままＴ４
−ＤＮＡリガーゼにより結合されてなるものである。こ
の場合の選択マーカは　ＡｐＲおよびＩａｃ−であった
。

■　ｐＮＤＰｃＩを［１０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　・Ｈ　Ｃ
　（！（ｐＨ　８．　５）、７ｍＭ　Ｍ９ＣＬ、２０ｉ
Ｍ　ＮａＣｌ，　７ｎＭ　　２メルカプトエタノール、
ｏ．ｏｉ％牛血清アルブミン］を含む水溶液中で、制限
酵素Ｃｔｒｌにより切断する。

■　このＤＮＡ断片を、［５ｈＭ　Ｔ　ｒｉｓ−Ｈ　Ｃ
　（！（ｐ｝｛７．２）、１０ｍＭ　　Ｍ９Ｓ　Ｏ　．
．　Ｉ　ｍＭジチオスレイトール、５００μ９／ｘ（ｌ
牛血清アルブミン、１ｗ＋ＭｄＧＴＰ］を含む水溶液中
に溶解し、”’Ｉ−ｄＣＴＰとＤＮＡポリメラーゼＩ・
ラージフラグメント（クレノー酵素）を加え、標識を行
う。

■　この反応液をセファデックスＧ２５カラムにより標
識ＤＮＡを未反応１″５１−ｄＣＴＰから分離する。こ
れを［５０ｍＭホウ酸ナトリウム、１５ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ，　０．０１％ＮａＮ３］を含む水溶液に終濃度０．
１μＣｉ／ｍｉ２となるように溶解する。これをトレー
サー溶液とする。

（ＩＩ）標準溶液の作製Ｉ　ｐ　ｍｏｌｅのＤＮＡに結合するタンパク量を１０
００Ｕと定義した。

赤血球凝集反応法で抗ＤＮＡ抗体価＋＋十＋の患者の血
清をそれぞれ０、６、ｌ２、４５、８７、１７８Ｕ／ｍ
ｆｆとなるように馬血清にて希釈し、標準溶液とした。

（山）硫酸アンモニウム水溶液の作製硫酸アンモニウム３９０９をＩｆｆの蒸留水に溶解する
。

（ＩＩ）　　測定操作（ｉ）　　試験管に標準溶液または血清（サンプル）を
２０μｇ入れる。

（ｉｉ）　　トレーサー溶液を２００μｇ加え、３７℃
、２時間保温する。

（ｉｉｉ）　　硫酸アンモニウム溶液をｌｌＩＱ加え、
よく混和する。

（ｉｖ　）　　１５００Ｇ　，　１　５分遠心し、上澄
みを吸引除去する。

（Ｖ）　　井戸型シンチレーションカウンターを用いて
、各試験管の放射能を測定する。

（ｖ１）標準曲線を作製し、血清（サンプル）の抗ＤＮ
Ａ抗体価を読み取る。第２図は、このようにして得た抗
ＤＮＡ抗体価の標準曲線である。

実際に本測定法で測定した値と、従来の抗ＤＮＡ抗体価
測定用キット（アマーシャム社製の抗ＤＮＡ抗体価測定
用キット）で測定した値を表ｌに示す。

［表　ｌ］「実施例２」この実施例は、１　．　１　ｋｂＰと１．２ｋｂｌ）の
ＤＮＡ断片を＋宜ｓｒにより標識して、これをトレーサ
ーとし、Ｓ　Ｌ，　Ｅ患各血清を標準物質とした例であ
る。

（１）　　試薬の調整（　ｉ　）　　Ｄ　Ｎ　Ａ　トレーサーの作製■　前記
実施例ｌで用いたプラスミドｐＮ　Ｄ　ＰＣｌを［　１
０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−｝｛　Ｃ　（！（ＰＨ　８．５）
、７ＩＩＩＭＭ９Ｃａｔ１　７ＩＩＩＭ　２−メルカプ
トエタノール、０．１％牛血清アルブミン（ｐＨ　８．
０）］を含む水溶液中で制限酵素Ｂ　ａｎ　ｒにより切
断する。この切断によりρＮＤＰＣ　ｌは、１．ｌｋｂ
ｐＳｌ．２ｋｂｐの２本のＤＮＡ断片となる。

■　これらのＤＮＡ断片を、それぞれ［　５０ｓ＋ＭＴ
　ｒｉｓ−｝｛　Ｃ　（（ｐｆｌ　７．２）、１０ｍＭ
　Ｍ９Ｓ　Ｏ　．，　ｌ　ｍＭジチオスレイトール、５
００μ９／ＩＩＩＱ牛血清アルブミン、ｌｍＭ−ｄＧＴ
Ｐ，１ｍＭ　ｄＡＴＰＳ　１ｍＭ　　ｄＴＴ　ｐ　（ｐ
ｉ−＋　７．２）］を含む水溶液中に溶解し、目５■−
ｄＣ　Ｔ　ＰとＤＮＡポリメラーゼ１・ラージフラグメ
ント（クレノー酵素）を加え、標識を行う。

■　これらの反応液をセファデックスＧ２５カラムによ
り標識ＤＮＡを未反応１″５１　−ｄＣ　Ｔ　Ｐから分
離する。これを［　５０ｍＭホウ酸ナトリウム、１５ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ，０．０１％ＮａＮｓ］を含む水溶液に
終濃度０．１μＣｉ／ｗＩＱとなるように溶解する。こ
れらをトレーサー溶液とする。

（１１）標準溶液の作製抗ＤＮＡ抗体価６００Ｕ／ｍｌ２のＳＬＥ患者血清を馬
血清に、それぞれ０、５、ＩＯ、２５、５０、１００Ｕ
／ｍｌ２となるように溶解した。

（ロ１）硫酸アンモニウム水溶液の作製硫酸アンモニウ
ム３９０ｇをｔＣの蒸留水に溶解する。

（ＩＩ）　　測定操作（１）試験管に標準溶液または血清（サンプル）を２５
μｇ入れる。

（ｉｉ）　　トレーサー溶液を２００μＱ加え、３７℃
　２時間保温する。

（ｉｉｉ）　　硫酸アンモニウム溶液をｌｘ（加え、よ
く混和する。

（ｉｖ）　　１５００Ｇ，１５分遠心し、上澄みを吸引
除去する。

（ｖ１）標準曲線を作製し、血清（サンプル）の抗ＤＮ
Ａ抗体価を読み取る。第３図は、このようにして得た抗
ＤＮＡ抗体価の標準曲線である。図に見るように、全領
域にわたって良好な標準曲線が得られる。

「実施例３」この実施例は、天然に存在するブラスミドＤＮＡから調
製した　６　．　６　ｉｔｂｐのＤＮＡ断片を口５ｌに
より標識して、これをトレーサーとし、ＳＬＥ患者の血
清を標準物質とした例である。

（１）試薬の調整（ｉ）ＤＮＡトレーサーの作製 ■　大腸菌由来　Ｃ　ｏｌＥＩ、Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｃｈａ
ｎ　Ｐ．■．ｅｔａｌｌ．Ｂｉｄ．ｃｈｅｗ．　２６０
　　８９２５−８９３５，（１９８５））を［１．Ｏｉ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ２、７　ｍＭ　　Ｍ　ｇＣ　Ｑ＊Ｓ
ＩＯｍＭ　　Ｎ　ａＣ　（！−７ｓＭ２−メルカブトエ
タノール　（ｐＨ　　７．３）コを含む水溶液中で、制
限酵素Ａ　ｖａ　Ｉにより切断する。

この切断によりＤＮＡは、６　．　６　ｋｂｐの断片と
なる。

■　このＤＮＡ断片を、［　５０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　・
Ｈ　Ｃ　Ｏ（ｐ１−１　７．２）、１０ａ＋Ｍ　ＭｇＳ
　０　４＋　Ｉ　ｍＭジチオスレイトール、５００μｇ
／　ｘ（ｌ牛血清アルブミン、１ｍＭ　　ｄＧＴＰ，ｌ
ｍＭ　ｄＡＴＰ、Ｉ　ｎ＋Ｍ　ｄＴ　’ｌ”　Ｐ　（ｐ
Ｈ　７．２）］を含む水溶液中に溶解し、”’　Ｉ　−
ｄＣ　Ｔ　ＰとＤＮＡポリメラーゼ１・ラージフラグメ
ント（クレノー酵素）を加え、標識を行う。

■　この反応液をセファデックスＧ２５カラムにより標
識ＤＮＡを未反応”’　Ｉ　−ｄＣ　Ｔ　Ｐから分離す
る。これを［　５０ｍＭホウ酸ナトリウム、１５ａ＋Ｍ
ＥＤＴＡ，０．０１％ＮａＮ３］を含む水溶液に終濃度
０．１μＣｉ／＊１２となるように溶解する。これをト
レーサー溶液とする。

（＋１）標準溶液の作製抗ＤＮＡ抗体価６　０　０　Ｕ／峠のＳ　Ｌ　Ｅ患者血
清を馬血清に、それぞれ０、５、１０，２５、５０、＋
０００／ｊｌｃとなるように溶解した。

（■）硫酸アンモニウム水溶液の作製硫酸アンモニウム３９０９をＩｆｆの蒸留水に溶解する
。

（ＩＩ）　　測定操作（ｉ）　　試験管に標準溶液または血清（サンプル）を
２５μＱ入れる。

（ｉｉ）　　トレーサー溶液を２００μＣ加え、３７℃
　２時間保温する。

（ｉｉｉ）　　硫酸アンモニウム溶液を１１加え、よく
混和する。

（ｖ１）標準曲線を作製し、血清（サンプル）の抗ＤＮ
Ａ抗体価を読み取る。第４図は、このようにして得た抗
ＤＮＡ抗体価の標準曲線である。図に見るように、抗Ｄ
ＮＡ抗体価５００／ｘ（以上の領域で標準曲線がなだら
かとなる。

「実施例４」この実施例は、１４１、３！３、３１５、３６８、４７
５、ｌ３０７、１　４　４　４　ｂｐのＤＮＡ断片を１
１８１により標識して、これをトレーサーとし、ＳＬＥ
患各血清を標準物質とした例である。

（！）試薬の調整（ｉ　）　　ＤＮＡ　トレーサーの作製■　プラスミド
ｐＢ　Ｒ　３２２（Ｓａｎｇｅｒ．Ｆ，ｅｔ　ａｌ，Ｊ
，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．１２５　２２５−２４６．（１９
７ｇ））を［　ｌｏｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−Ｈ　Ｃ（ｌ，　
ｌＯｍＭ　Ｍ９Ｃ（１＊％ｌＯｈＭ　ＮａＣＩ２，　ｌ
ＯｍＭ　　２メルカブトエタノール（ｐｌ−１　７．３
）　］を含む水溶液中で、制限酵素Ｔ　ｔｈＨＢ８　［
により切断する。この切断によりＤＮＡは、１４１、３
１３、３１５、３６８、４７５、１３０７、Ｉ　４　４
　４　ｂｐの７本の断片となる。

■これらのＤＮＡ断片を、［　５０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−
ＨＣ　Ｃ（ｐＨ　７．２）、ｌｈＭ　Ｍ９Ｓ　Ｏ　．．
　１　ｇ＋Ｍジチオスレイトール、５００μ９／肩Ｑ牛
血清アルブミン、ｌｍＭｄＧＴＰ，　　　監　ｍＭ　　
ｄＡＴＰ，　　　ｌａ＋Ｍ　　ｄＴＴＰ（ｐＨ７．２）
］を含む水溶液中に溶解し、”５１　−ｄＣ　Ｔ　Ｐと
ＤＮＡポリメラーゼＩ・ラージフラグメント（クレノー
酵素）を加え、標識を行う。

■これらの反応液をセファデックス０２５カラムにより
標識ＤＮＡを未反応”’　Ｉ　−ｄＣ　Ｔ　Ｐから分離
する。これを［　５０ａＭホウ酸ナトリウム、１５ｒＬ
ＩＭ　ＥＤＴＡ，　０．０１％ＮａＮｓ］を含む水溶液
に終濃度０，１ｕＣｉ／ｘ（２となるように溶解する。

これをトレーサー溶液とする。

（ｉｉ）　　標準溶液の作製抗ＤＮＡ抗体価６００Ｕ／ｚ＆のＳＬＥ患者血清を馬血
清に、それぞれ０、５、ＩＯ、２５、５０、１００Ｕ／
ｊ１１２となるように溶解した。

（山）硫酸アンモニウム水溶液の作製硫酸アンモニウム３９０９をＩｇの蒸留水に溶解する。

（ＩＩ）　　測定操作（−）試験管に標準溶液または血清（サンプル）を２５
μＱ入れる。

（ｉｉ）　　｝Ｌ／−サー溶液を２００μｆｆ加え、３
７℃　２時間保温する。

（ｉｉｉ）　　硫酸アンモニウム溶液をＩＲ（ｌ加え、
よく混和する。

（ｉｖ）　　１５００Ｇ　　１　５分遠心し、上澄みを
吸引除去する。

（ｖ）　　井戸型ノンヂレーションカウンターを用いて
、各試験管の放射能を測定する。

（ｖｉ）　　標準曲線を作製し、血清（サンプル）の抗
ＤＮＡ抗体価を読み取る。第５図は、このようにして得
た抗ＤＮＡ抗体価の標準曲線である。図に見るように、
抗ＤＮＡ抗体価１０Ｕ／ｉｌ２以下の領域で標準曲線が
なだらかとなる。

前記したように、本発明の実施例１、２、３、５では、
遺伝子組換プラスミド由来のＤＮＡで０．１〜ｌ．４ｋ
ｂｐまでのものを示し、また実施例４では６　．　６　
ｋｂｐのものが可能であることを示した。

これによって、本発明においてはＤＮＡの長さとして、
０．１〜６　．　６　ｋｂｌ）のものが可能であると判
断した。というのは、当業者には明らかなように、本発
明の技術分野では、抗原物質として、天然型ブラスミド
由来のＤＮＡも、遺伝子組換型ＤＮＡも同等に使用でき
るからである。

「実施例５」この実施例では、補体ＣＩＱの影響を調べた。

正常者の血清における捕体の影響を検討した。

ｌＯ例の正常考の血清を、 ■　そのまま（補体が活性を持った状態）■　５６℃３
０分処理による非働化後（補体が失活した状態）、のそ
れぞれでＤＮＡ　トレーサーへの結合を調べた。ＤＮＡ
　ｌ−レーサーは、（ａ）前記実施例３で用いたトレー
サー（二本鎖ＤＮＡトレーサー、ｄｓＤＮＡ）、（ｂ）
前記実施例３のトレーサーを９５゜Ｃｌ分間処理した後
、水中で急冷することにより作製した一本鎖ＤＮＡ　ト
レーサー（ＳＳＤＮＡ）、の２種類を用いた。

谷トレーサーＤＮＡへの結合率（Ｂ　／Ｔ　）は、（５
０％飽和硫安沈澱中のカウント）／（全カウント）で表
した。これを表２に示した。この表のＢ／Ｔ値よ、（Ｍ
　ｅａｎ±ＳＤ）値であり、単位は％である。

表から明らかなように、本発明の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤ
　Ｎ　Ａ　）では、補体失活（非働化）の効果は全く見
られず、このトレーサーを用いた測定法がＣｌｑ等の補
体の影響を受けないことがわかる。

一方、一本Ｉ′ｉＤ　Ｎ　Ａ（ｓｓＤ　Ｎ　Ａ）では、
非働化前後で結合率に大きな差が見られ、血清検体中の
補体成分が測定に影響していることが明確に示されてい
る。

［表２１Ｂ　／　Ｔ（Ｍｅａｎ＋　Ｓ　Ｄ　）「実施例６」　臨床的検討この実施例では、健常者およびＳＬＥを含む種々の疾患
の患者の計２１３例を前記実施例３に述べた方法により
測定した。その結果を第６図に示す。

健常者！４０例の測定により、正常値を．６Ｕ／ｍＱ以
下に設定したところ、活動期ＳＬＥでは９６．４％（２
７例７２８例中）、非活動期ＳＬＥでは６２．５％（３
０例／４８例中）、その他の膠原病では４．４％（２例
／４６例中）が陽性であった。

［−発明の効果」以上説明したように、本願発明に係る生物学的液体中の
抗ＤＮＡ抗体価の測定法および測定用キ・ソトによれば
、試薬の安定供給が容易で、測定誤差が少なく、正確な
測定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例で用いたブラスミドｐＮＤＰＣ
Ｉの制限酵素地図を示すもので、第２図は本発明の第１
の実施例で得た抗ＤＮＡ抗体の標準曲線、第３図は本発
明の第２の実施例で得た抗ＤＮＡ抗体の標準曲線、第４
図は本発明の第３の実施例で得た抗ＤＮＡ抗体の標準曲
線、第５図は本発明の第４の実施例で得た抗ＤＮＡ抗体
の標準曲線、第６図は本発明の臨床的効果を確認するた
めに行った第６の実施例の結果を示すもので、各種疾先
における抗ＤＮＡ抗体価をプロットしたグラフである。出顆人　　ニッポン・ディービーシー・コーボレーンヨ
ン０／２６８Ｂ第２図（ｃ　ｏ　ｍ）抗ＤＮＡ抗体価（Ｕ／ｍｌ？）（％）第３図抗ＤＮＡ抗体価（Ｌｌ／ｒｒｌ　）第４図（％）抗ＤＮＡ抗体価（ｕ／ｍＱ）第６図各種疾患における抗ＤＮＡ抗体価

Claims

【特許請求の範囲】

（１）抗原とするＤＮＡトレーサーと、このＤＮＡトレ
ーサーに対して結合し得る標準物質とを用い、免疫学的
方法により生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価を測定する
測定法であって、前記ＤＮＡトレーサーとして、二本鎖環状ＤＮＡを制限
酵素で切断して得られる直線状二本鎖ＤＮＡを標識して
成るＤＮＡトレーサーを用いることを特徴とする生物学
的液体中の抗ＤＮＡ抗体価の測定法。
（２）前記二本鎖環状ＤＮＡが、細菌または酵母に由来
し、遺伝子組換法によって調製された二本鎖環状ＤＮＡ
である請求項１に記載の生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体
価の測定法。
（３）前記二本鎖環状ＤＮＡが、細菌または酵母に由来
し、天然に存在する二本鎖環状ＤＮＡである請求項１に
記載の生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価の測定法。
（４）抗原とするＤＮＡトレーサーと、このＤＮＡトレ
ーサーに対して結合し得る標準物質とを有し、免疫学的
方法により生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価を測定する
ための測定用キットであって、前記ＤＮＡトレーサーと
して、二本鎖環状ＤＮＡを制限酵素で切断して得られる
直線状二本鎖ＤＮＡを標識して成るＤＮＡトレーサーを
用いたことを特徴とする生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体
価の測定用キット。
（５）前記二本鎖環状ＤＮＡが、細菌または酵母に由来
し、遺伝子組換法によって調製された二本鎖環状ＤＮＡ
である請求項４に記載の生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体
価の測定用キット。
（６）前記二本鎖環状ＤＮＡが、細菌または酵母に由来
し、天然に存在する二本鎖環状ＤＮＡである請求項４に
記載の生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価の測定用キット
。