JPS5856694A - 抗核抗体測定用試薬 - Google Patents
抗核抗体測定用試薬Info
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- JPS5856694A JPS5856694A JP15066881A JP15066881A JPS5856694A JP S5856694 A JPS5856694 A JP S5856694A JP 15066881 A JP15066881 A JP 15066881A JP 15066881 A JP15066881 A JP 15066881A JP S5856694 A JPS5856694 A JP S5856694A
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗核抗体のエンザイムノアツセイに用いる測定
試薬に関する。
試薬に関する。
抗核抗体、なかでも抗二本鎖ＤＮＡ抗体は代表的自己免
疫疾患である全身性エリテマトーデス（以下ＳＬＥとい
う）の発症と密接な関連性が予測されている。また抗二
本鎖ＤＮＡ抗体の他に抗ポＩＪ Ａ Ｄ Ｐ −ＩＪボ
ース抗体の存在が明らかにされＳＬＥ患者などに高頻度
に検出されることが実証された。ボＩＪ Ａ Ｄ Ｐ
−！ＪボースはＤＮＡ合成の調節、細胞の分化及びＤＮ
Ａの修復と密接に関連していることが知られている。ポ
ＩＪ Ａ Ｄ Ｐ −ＩＪボースに対する自然抗体がＳ
ＬＨに高頻度で出現することは抗ポリＡＤＰ−リボース
抗体がＳＬＥの病態及びその修飾に密接に関係している
ことを示唆する。したがってこれら抗核抗体の測定方法
が開発されている。
疫疾患である全身性エリテマトーデス（以下ＳＬＥとい
う）の発症と密接な関連性が予測されている。また抗二
本鎖ＤＮＡ抗体の他に抗ポＩＪ Ａ Ｄ Ｐ −ＩＪボ
ース抗体の存在が明らかにされＳＬＥ患者などに高頻度
に検出されることが実証された。ボＩＪ Ａ Ｄ Ｐ
−！ＪボースはＤＮＡ合成の調節、細胞の分化及びＤＮ
Ａの修復と密接に関連していることが知られている。ポ
ＩＪ Ａ Ｄ Ｐ −ＩＪボースに対する自然抗体がＳ
ＬＨに高頻度で出現することは抗ポリＡＤＰ−リボース
抗体がＳＬＥの病態及びその修飾に密接に関係している
ことを示唆する。したがってこれら抗核抗体の測定方法
が開発されている。
抗核抗体の測定方法としてはその感度および定量性の点
よりラジオイムノアッセイ（以下ＲＩＡという）が多く
用いられている。しかしＲＩＡによる測定は放射性物質
を取扱うため法的に許可された施設以外ではこれを行な
うことができずその普及を妨げている。
よりラジオイムノアッセイ（以下ＲＩＡという）が多く
用いられている。しかしＲＩＡによる測定は放射性物質
を取扱うため法的に許可された施設以外ではこれを行な
うことができずその普及を妨げている。
このように使用に制約のあるＲＩＡに代えて、標識剤と
してラジオアイソトープの代りに酵素を用いるエンザイ
ムイムノアツセイ（以下ＥＩＡという）が開発され各分
野で普及しつつある。しかし抗核抗体の測定、特に抗ボ
ＩＪ Ａ Ｄ Ｐ−ＩＪボースの測定はその事例に乏し
く、ＥＩＡによる分析方法の開発が望まれている。
してラジオアイソトープの代りに酵素を用いるエンザイ
ムイムノアツセイ（以下ＥＩＡという）が開発され各分
野で普及しつつある。しかし抗核抗体の測定、特に抗ボ
ＩＪ Ａ Ｄ Ｐ−ＩＪボースの測定はその事例に乏し
く、ＥＩＡによる分析方法の開発が望まれている。
ＲＩＡおよびＥＩＡは標識剤を異にする以外は同じ原理
に基すきその方法は大別すれば競争法とサンドインチ法
に分れるが、抗核抗体の分析には後者の方法が適してい
る。ま斥これらの方法において、抗原抗体反応により生
成した結合物を反応系よ多分離することを容易にするた
め試薬として抗原又は抗体を固体担体に結合させた固相
試薬を用いる固相法が操作の簡便さの点で勝れている。
に基すきその方法は大別すれば競争法とサンドインチ法
に分れるが、抗核抗体の分析には後者の方法が適してい
る。ま斥これらの方法において、抗原抗体反応により生
成した結合物を反応系よ多分離することを容易にするた
め試薬として抗原又は抗体を固体担体に結合させた固相
試薬を用いる固相法が操作の簡便さの点で勝れている。
本発明者はかかる見地より固相試掌を用いるサンドイツ
チ法による抗核抗体の測定について研究し本発明に到達
した。
チ法による抗核抗体の測定について研究し本発明に到達
した。
本発明は抗核抗体のＥＩＡによる測定用試薬において測
定対象である抗核抗体の産生を惹起する抗原をグラスチ
ック担体に１結合せしめた不溶化抗原と該抗原には特異
反応をせず測定対象である抗核抗体と特異反応をする第
二の抗体又はプロティンＡに酵素を結合せしめた標識試
薬との組み合わせよりなることを特徴とする抗核抗体測
定用試薬に関する。
定対象である抗核抗体の産生を惹起する抗原をグラスチ
ック担体に１結合せしめた不溶化抗原と該抗原には特異
反応をせず測定対象である抗核抗体と特異反応をする第
二の抗体又はプロティンＡに酵素を結合せしめた標識試
薬との組み合わせよりなることを特徴とする抗核抗体測
定用試薬に関する。
さらｔで詳細に説明すれば、抗ボ！ｊ Ａ Ｄ Ｐ −
！ｊボース抗体、抗二本鎖ＤＮＡ抗体などの抗核抗体の
ＥＩＡによる測定において、測定対象である抗核抗体と
免疫反応すべき相手方試薬として該抗核抗体産生を惹起
するポ’Ｊ Ａ Ｄ Ｐ−リボース、ＤＮＡなどの抗原
をポリスチレンなどのプラスチック担体と結合せしめた
不溶化抗原をその試薬とし、さらに通常のサンドインチ
法で採用される該抗原を、酵素で標識した標識抗原に代
え、該抗原とは特異反応をせず測定対象とは特異反応を
する第二の抗体又はプロティンＡを酵素で標識した試薬
を組み合わせて使用する抗核抗体測定用試薬である。
！ｊボース抗体、抗二本鎖ＤＮＡ抗体などの抗核抗体の
ＥＩＡによる測定において、測定対象である抗核抗体と
免疫反応すべき相手方試薬として該抗核抗体産生を惹起
するポ’Ｊ Ａ Ｄ Ｐ−リボース、ＤＮＡなどの抗原
をポリスチレンなどのプラスチック担体と結合せしめた
不溶化抗原をその試薬とし、さらに通常のサンドインチ
法で採用される該抗原を、酵素で標識した標識抗原に代
え、該抗原とは特異反応をせず測定対象とは特異反応を
する第二の抗体又はプロティンＡを酵素で標識した試薬
を組み合わせて使用する抗核抗体測定用試薬である。
ポリＡＤＰ−リポースなどの抗原は高価なものであるた
めその効果的な使用が好ましい。プラスチックは固相担
体として特に結合剤を用いなくても抗原と結合する能力
があるが一層の効率の良い結合方法が望ましく本発明者
は鋭意研究の結果実施例１により詳述するようにプラス
チック表面をポＩＪ Ｌ −ＩＪジョン前処理した後抗
原溶液と接触させこれを蒸発乾固するこ七によシブラス
チック表面（（抗原を結合させる方法を用いその目的を
達することかできた。この方法によシ製造した不溶化抗
原は測定の妨害となる非特異反応が少なく良好な測定結
果が得られる。非特異反応を防止するためには通常牛血
清アルブミンを用い後処理を行なうが本発明の不溶化抗
原においては通常使用される１〜２％の濃度に比して０
００５〜０．１％程度の極めて低い濃度の牛血清アルブ
ミン処理で非特異反応を防止することができる。
めその効果的な使用が好ましい。プラスチックは固相担
体として特に結合剤を用いなくても抗原と結合する能力
があるが一層の効率の良い結合方法が望ましく本発明者
は鋭意研究の結果実施例１により詳述するようにプラス
チック表面をポＩＪ Ｌ −ＩＪジョン前処理した後抗
原溶液と接触させこれを蒸発乾固するこ七によシブラス
チック表面（（抗原を結合させる方法を用いその目的を
達することかできた。この方法によシ製造した不溶化抗
原は測定の妨害となる非特異反応が少なく良好な測定結
果が得られる。非特異反応を防止するためには通常牛血
清アルブミンを用い後処理を行なうが本発明の不溶化抗
原においては通常使用される１〜２％の濃度に比して０
００５〜０．１％程度の極めて低い濃度の牛血清アルブ
ミン処理で非特異反応を防止することができる。
本発明の不溶化抗原に用いる固相担体としては、ポリビ
ニル、ポリアミド、ポリオレフィン、ポリエーテル、ポ
リエステル、ポリカーボネート、ポリウレタンなど各種
のプラスチックを用い得る。
ニル、ポリアミド、ポリオレフィン、ポリエーテル、ポ
リエステル、ポリカーボネート、ポリウレタンなど各種
のプラスチックを用い得る。
担体の形状としてはビーズ、ロッド、チューブなど任意
の形状のものを用い得る。近時、測定の微量化を図る目
的でマイクロタイトレージョンブレートが良く用いられ
るが本発明においても好適なものである。実施例１で示
すように３００μｔべの容量のマイクロタイトレージョ
ンプレートを使用し１測定当り僅かに１００ ｎｆ （
２μｆ ／ｍｌの溶液５０μｔ）のボＩＪ Ａ Ｄ Ｐ
−ＩＪボースの使用で測定が可能である。
の形状のものを用い得る。近時、測定の微量化を図る目
的でマイクロタイトレージョンブレートが良く用いられ
るが本発明においても好適なものである。実施例１で示
すように３００μｔべの容量のマイクロタイトレージョ
ンプレートを使用し１測定当り僅かに１００ ｎｆ （
２μｆ ／ｍｌの溶液５０μｔ）のボＩＪ Ａ Ｄ Ｐ
−ＩＪボースの使用で測定が可能である。
通常のサンドインチ法では標識試薬として不溶化抗原に
使用する抗原に標識剤を結合したものを用いるが、本発
明においては、ボＩＪ Ａ Ｄ Ｐ−リボースなどの抗
原に代えて測定対象である抗核抗体とは特異的に反応す
るが該抗原とは特異反応を示さない物質に酵素を結合さ
せたものを標識試薬として用いる。このような物質とし
ては、抗免疫グロブリン抗体などの第二の抗体やプロテ
ィンＡなどを用いることができる。
使用する抗原に標識剤を結合したものを用いるが、本発
明においては、ボＩＪ Ａ Ｄ Ｐ−リボースなどの抗
原に代えて測定対象である抗核抗体とは特異的に反応す
るが該抗原とは特異反応を示さない物質に酵素を結合さ
せたものを標識試薬として用いる。このような物質とし
ては、抗免疫グロブリン抗体などの第二の抗体やプロテ
ィンＡなどを用いることができる。
本発明の標識試薬は高価な抗原を使用しないので経済的
であるとともに標識剤である酵素の試薬中の結合量が多
く極めて高い活性を示し感度を向上させることができる
利点を有する。
であるとともに標識剤である酵素の試薬中の結合量が多
く極めて高い活性を示し感度を向上させることができる
利点を有する。
酵素としては一般にＥＩＡで使用されるものより選定し
て差支えないが仔牛小腸から得たアルカリフォスファタ
ーゼが活性が高く酵素基質との反応が迅速であり酵素反
応時間を１０分間にまで短縮することができ極めて好適
である。本発明の標識試薬は第二の抗体又はプロティン
Ａを使用するため検体中にある測定対象以外の抗体とも
結合する可能性がある。そのため不溶化抗原に非特異反
応がちシ目的外の抗体が結合する場合は測定が妨害され
る。しかし前述のよりに本発明の不溶化抗原は非特異反
応が少なく、これを組み合わせて使用することにより良
好な測定を行なうことができる。
て差支えないが仔牛小腸から得たアルカリフォスファタ
ーゼが活性が高く酵素基質との反応が迅速であり酵素反
応時間を１０分間にまで短縮することができ極めて好適
である。本発明の標識試薬は第二の抗体又はプロティン
Ａを使用するため検体中にある測定対象以外の抗体とも
結合する可能性がある。そのため不溶化抗原に非特異反
応がちシ目的外の抗体が結合する場合は測定が妨害され
る。しかし前述のよりに本発明の不溶化抗原は非特異反
応が少なく、これを組み合わせて使用することにより良
好な測定を行なうことができる。
本発明の測定試薬を使用する抗核抗体の測定によりＳＬ
Ｈの迅速な診断かり能であるのみならず、例えばリンパ
系細胞の培養により抗体を生産する過程において、培養
液を濃縮することなく容易に抗体を測定することも可能
であり極めて有益である。以下実施例及び試験例により
本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は例に示した
抗ポＩＪ ＡＤ Ｐ −ＩＪボース抗体及び抗二本鎖Ｄ
ＮＡ抗体に限定されるものでなく抗ヒストンＪ’＋’＋
：体、抗ＳｍＫ体、抗ＲＮＰ抗体などの他の種類の抗咳
抗体に関してもこれを包含する。
Ｈの迅速な診断かり能であるのみならず、例えばリンパ
系細胞の培養により抗体を生産する過程において、培養
液を濃縮することなく容易に抗体を測定することも可能
であり極めて有益である。以下実施例及び試験例により
本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は例に示した
抗ポＩＪ ＡＤ Ｐ −ＩＪボース抗体及び抗二本鎖Ｄ
ＮＡ抗体に限定されるものでなく抗ヒストンＪ’＋’＋
：体、抗ＳｍＫ体、抗ＲＮＰ抗体などの他の種類の抗咳
抗体に関してもこれを包含する。
実施例１ 不溶化ボ’） Ａ Ｄ Ｐ −ＩＪ ｇ−ス
（不溶化抗原） （１）固相担体の前処理 ｌ穴あたＤ３００ｂｌの容量を有する９６大のプラスチ
ック製マイクロタイトレージ゛ヨンプレート（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ社、Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌｐｌａｔｅＵ型）を固
相担体として用いた。強陽電荷電のポＩＪ Ｌ −ＩＪ
ジョン分子量：４Ｘ１０’、シグマ社）を蒸留水に溶解
し濃度５０μｆ／ｍｌに調製した液を各穴１００μｔず
つ加え室温で１時間放置した後トリス−食塩緩衝液（２
５ｍＭ）リス、１４０ｍＭ食塩。
（不溶化抗原） （１）固相担体の前処理 ｌ穴あたＤ３００ｂｌの容量を有する９６大のプラスチ
ック製マイクロタイトレージ゛ヨンプレート（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ社、Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌｐｌａｔｅＵ型）を固
相担体として用いた。強陽電荷電のポＩＪ Ｌ −ＩＪ
ジョン分子量：４Ｘ１０’、シグマ社）を蒸留水に溶解
し濃度５０μｆ／ｍｌに調製した液を各穴１００μｔず
つ加え室温で１時間放置した後トリス−食塩緩衝液（２
５ｍＭ）リス、１４０ｍＭ食塩。
ｐＨ７，４以下ＴＢＳ と略称する）を用い４回洗浄し
た。
た。
（１１） ポリＡＤＰ−リポースの結合全弁らの方法
（Ｋａｎａｉ、 Ｙ−ｅｔ ａｌ、 Ｊ−Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ−。
（Ｋａｎａｉ、 Ｙ−ｅｔ ａｌ、 Ｊ−Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ−。
８８．９１７〜９２０．１９８０）により製造したポリ
ＡＤＰ−リボースをＴＢＳを用い２μｆ／ｍｔとなるよ
う濃度を調整した溶液を（１〕で得たマイクロタイトレ
ージョンプレートの各穴に５０μｔずつ加え３７℃で一
夜を要して蒸発乾固させた後ＴＢＳで４回洗浄した。
ＡＤＰ−リボースをＴＢＳを用い２μｆ／ｍｔとなるよ
う濃度を調整した溶液を（１〕で得たマイクロタイトレ
ージョンプレートの各穴に５０μｔずつ加え３７℃で一
夜を要して蒸発乾固させた後ＴＢＳで４回洗浄した。
（Ｉｉｉ） 後処理
（１１）で得たプレ２トの抗原で満たされていない表面
を遮閉する目的で０．０１％Ω牛血清アルブミンを添加
したＴＢＳを各穴：３００μｔずつ加え１時間放置後Ｔ
ＢＳで３回洗浄し不溶化ポＩＪ ＡＤ Ｐ −ＩＪボー
ス（不溶化抗原）を得た。このものは加湿下４℃で１ケ
月は安定である。
を遮閉する目的で０．０１％Ω牛血清アルブミンを添加
したＴＢＳを各穴：３００μｔずつ加え１時間放置後Ｔ
ＢＳで３回洗浄し不溶化ポＩＪ ＡＤ Ｐ −ＩＪボー
ス（不溶化抗原）を得た。このものは加湿下４℃で１ケ
月は安定である。
実施例２ 不溶化二本鎖ＤＮＡ （不溶化抗原）市販の
仔牛胸線ＤＮＡをマーマーの方法（Ｍａｒ−ｍｕｒ、
Ｊ−Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ・、 ３ ＋ ２０８．１９６
１ ）に従って除蛋白質精製した後、ストラー・パパリ
アンの方法（５ｔｏｌｌａｒ、 Ｂ、Ｄ、ａｎｄ Ｐａ
ｐａｌｉａｎ、 Ｍ、、 Ｊ−ＣＩｉｎ、 Ｉｎ−ｖｅ
ｓｔ・、６６．２１０〜２１９．１９８０）に従ってＳ
ｌ−ヌクレアーゼ処理し、一本鎖ＤＮＡの部分を完全切
断する。次いでこのＤＮＡを合弁らの方法（Ｋａｎａｉ
、 Ｙ−ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８
８．９１７〜９２（Ｌ１９８０）に従ってハイドロキシ
アパタイトカラムにかけ０．２ Ｍのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，８）で溶出される二本鎖ＤＮＡのみを採取した。
仔牛胸線ＤＮＡをマーマーの方法（Ｍａｒ−ｍｕｒ、
Ｊ−Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ・、 ３ ＋ ２０８．１９６
１ ）に従って除蛋白質精製した後、ストラー・パパリ
アンの方法（５ｔｏｌｌａｒ、 Ｂ、Ｄ、ａｎｄ Ｐａ
ｐａｌｉａｎ、 Ｍ、、 Ｊ−ＣＩｉｎ、 Ｉｎ−ｖｅ
ｓｔ・、６６．２１０〜２１９．１９８０）に従ってＳ
ｌ−ヌクレアーゼ処理し、一本鎖ＤＮＡの部分を完全切
断する。次いでこのＤＮＡを合弁らの方法（Ｋａｎａｉ
、 Ｙ−ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８
８．９１７〜９２（Ｌ１９８０）に従ってハイドロキシ
アパタイトカラムにかけ０．２ Ｍのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，８）で溶出される二本鎖ＤＮＡのみを採取した。
この二本鎖ＤＮＡをさらＫＳＩ−ヌクレアーゼ処理し、
この段階ではもはや８１−ヌクレアーゼで切断されない
ことを２６０ ｎｍにおける紫外吸収で確かめた。
この段階ではもはや８１−ヌクレアーゼで切断されない
ことを２６０ ｎｍにおける紫外吸収で確かめた。
その後、またノ・イドロキシアパタイトカラムにかけ上
記の方法で溶出させた二本鎖ＤＮＡを採取した、 このようにして得た二本鎖ＤＮＡをポリＡＤＰ−リボー
スの代シに用いその他は実施例１と同様の方法に従い、
二本鎖ＤＮＡをマイクロタイトレージロンプレートに結
合せしめて不醇化二本鎖ＤＮＡ（不溶化抗原）を得た。
記の方法で溶出させた二本鎖ＤＮＡを採取した、 このようにして得た二本鎖ＤＮＡをポリＡＤＰ−リボー
スの代シに用いその他は実施例１と同様の方法に従い、
二本鎖ＤＮＡをマイクロタイトレージロンプレートに結
合せしめて不醇化二本鎖ＤＮＡ（不溶化抗原）を得た。
実施例３ アルカリフォスファターゼ・プロティンＡ結
合物（標識試薬） 仔牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ（シグマ社製
品、Ｔｙｐ４１ ） １．９ｒｌとプロティンＡ（ファ
ルマシア社製品）０．７５ｍｆを食塩加リン酸緩衝液（
リン酸ＩＱｍＭ、食塩１４０ｍＭ、ｐＨ７，４，以下Ｐ
ＢＳと略記する）１ｍｚＫ溶解した溶液をＰＢＳに対し
て透析した後、グルタルアルデヒド（シグマ社製；濃度
２５％）を終濃度０２％となるように加え室温で２時間
かきまぜ結合を行った後、ゲル口過装置（Ｕｅｔｒｏｇ
ｅｌ ＡｃＡ ３４充ｊ［１，ＩＸ５４ｃｍ）にかけア
ルカリフォスファターゼとプロティンＡとの結合物を分
離し蛋白質として２２０ ｔｒｆ／ｍｔの標識試薬１０
ｍ１を得た。
合物（標識試薬） 仔牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ（シグマ社製
品、Ｔｙｐ４１ ） １．９ｒｌとプロティンＡ（ファ
ルマシア社製品）０．７５ｍｆを食塩加リン酸緩衝液（
リン酸ＩＱｍＭ、食塩１４０ｍＭ、ｐＨ７，４，以下Ｐ
ＢＳと略記する）１ｍｚＫ溶解した溶液をＰＢＳに対し
て透析した後、グルタルアルデヒド（シグマ社製；濃度
２５％）を終濃度０２％となるように加え室温で２時間
かきまぜ結合を行った後、ゲル口過装置（Ｕｅｔｒｏｇ
ｅｌ ＡｃＡ ３４充ｊ［１，ＩＸ５４ｃｍ）にかけア
ルカリフォスファターゼとプロティンＡとの結合物を分
離し蛋白質として２２０ ｔｒｆ／ｍｔの標識試薬１０
ｍ１を得た。
この結合物の酵素比活性は蛋白質１ｍｆあたシ２００Ｕ
（基質２５ｍＭパラニトロフェニルフォスフェート、ｐ
Ｈ９，５，３７℃の測定条件下にて）であり、酵素単独
のそれが９００〜ｌ１００Ｕであることから極めて活性
の高い標識試薬である。このものは牛血清アルブミン０
５％及び窒化ソーダ００２％の存在下４℃で４ケ月以上
安定であった。
（基質２５ｍＭパラニトロフェニルフォスフェート、ｐ
Ｈ９，５，３７℃の測定条件下にて）であり、酵素単独
のそれが９００〜ｌ１００Ｕであることから極めて活性
の高い標識試薬である。このものは牛血清アルブミン０
５％及び窒化ソーダ００２％の存在下４℃で４ケ月以上
安定であった。
実施例４ アルカリフォスファターゼ・抗マウス免疫グ
ロブリン抗体結合物（標識試薬）抗マウス免疫グロブリ
ン（ＩｆＧ＋ＩｆＭ）抗体（Ｔｕｆｔｓ大学、Ｓ ｔｏ
ｌ ｆａｒ教授よシ供与された）をプロティンＡの代り
に用い、実施例３と同様の方法に従い、アルカリフォス
ターゼ・抗マウス免疫グロブリン抗体結合物（標識試薬
）を得た。（収量ｔｏｍｔ、蛋白質とし”Ｃ１４０ｎｆ
ｉ’ｍｌ ） 。
ロブリン抗体結合物（標識試薬）抗マウス免疫グロブリ
ン（ＩｆＧ＋ＩｆＭ）抗体（Ｔｕｆｔｓ大学、Ｓ ｔｏ
ｌ ｆａｒ教授よシ供与された）をプロティンＡの代り
に用い、実施例３と同様の方法に従い、アルカリフォス
ターゼ・抗マウス免疫グロブリン抗体結合物（標識試薬
）を得た。（収量ｔｏｍｔ、蛋白質とし”Ｃ１４０ｎｆ
ｉ’ｍｌ ） 。
参考例１ 対照グレート
実施例１の（１１）におけるポＩＪ Ａ Ｄ Ｐ −Ｉ
ＪボースのＴＢＳ溶液の代シにＴＢＳのみを用い、その
他は実施例１と同様の方法によりポＩＪ Ａ Ｄ Ｐ
−ＩＪボース（抗原）を結合しないマイクロタイトレー
ジョンプレートを得、対照プレートとして用いた。
ＪボースのＴＢＳ溶液の代シにＴＢＳのみを用い、その
他は実施例１と同様の方法によりポＩＪ Ａ Ｄ Ｐ
−ＩＪボース（抗原）を結合しないマイクロタイトレー
ジョンプレートを得、対照プレートとして用いた。
試験例１ 抗ポＩＪ Ａ Ｄ Ｐ −ＩＪボース抗体の
測定ＳＬＥ、轡者および正常人の各血清中の抗ポＩＪ
ＡＤ Ｐ −ＩＪボース抗体を測定した。
測定ＳＬＥ、轡者および正常人の各血清中の抗ポＩＪ
ＡＤ Ｐ −ＩＪボース抗体を測定した。
（１）第１反応（不溶化抗原と抗体との反応）実施例１
の方法によシ製造した不溶化ポＩＪ ＡＤ Ｐ −リボ
ース（不溶化抗原）の各穴に００１％の牛血清アルブミ
ンを加えたＴＢＳで２０倍に希釈した非動化血清１００
μＬを加え、微振とう下、室温にて６０分間インキュベ
ートした。
の方法によシ製造した不溶化ポＩＪ ＡＤ Ｐ −リボ
ース（不溶化抗原）の各穴に００１％の牛血清アルブミ
ンを加えたＴＢＳで２０倍に希釈した非動化血清１００
μＬを加え、微振とう下、室温にて６０分間インキュベ
ートした。
反応液を除去した後、プレートをＴＢＳで４回洗浄した
。
。
（１１）第２反応（標識試薬゛との反応）実施例３の方
法で得たアルカリフォスターゼ・−ゼ・プロティンＡ結
合物（標識試薬）をＴＢＳで１００倍に希釈した液を第
１反応を終ったプレートの各穴Ｋ １００ ｐｌ加え、
室温で６０分間インキュベートした。反応液を除去し、
プレートをＴＢＳで４回洗浄した。
法で得たアルカリフォスターゼ・−ゼ・プロティンＡ結
合物（標識試薬）をＴＢＳで１００倍に希釈した液を第
１反応を終ったプレートの各穴Ｋ １００ ｐｌ加え、
室温で６０分間インキュベートした。反応液を除去し、
プレートをＴＢＳで４回洗浄した。
（ｉｉｉ） 第３反応（酵素基質反硲）及び測定２、
５ ｍＭのハラニトロフェニルフォスフェートを２ｍＭ
のＭグＣｔ！を添加した５ ０ ｍＭカーボネート緩衝
液（ｐＨ９，５） １０ｍｔに溶解した液を基質とし、
第２反応を終ったグレートの各穴に１００ ｐｌ加え、
３７℃で１０分間反応させた後、この溶液１００μｔを
取り出し０． Ｉ Ｎのカセイソーダ水溶液４００μｔ
に加えて酵素反応を止めた。
５ ｍＭのハラニトロフェニルフォスフェートを２ｍＭ
のＭグＣｔ！を添加した５ ０ ｍＭカーボネート緩衝
液（ｐＨ９，５） １０ｍｔに溶解した液を基質とし、
第２反応を終ったグレートの各穴に１００ ｐｌ加え、
３７℃で１０分間反応させた後、この溶液１００μｔを
取り出し０． Ｉ Ｎのカセイソーダ水溶液４００μｔ
に加えて酵素反応を止めた。
得られた各穴の反応液５００μｔのそれぞれ４１０ｎｍ
Ｋおける紫外吸収を測定した。
Ｋおける紫外吸収を測定した。
非特異反応に基ずく酵素活性を補正するため、参考例１
の方法で製造した対照プレートを不溶化抗原の代りに用
いその他は前記と同様にして第１、第２及び第３反応を
行い紫外吸収を測定した。
の方法で製造した対照プレートを不溶化抗原の代りに用
いその他は前記と同様にして第１、第２及び第３反応を
行い紫外吸収を測定した。
各血清について不溶化抗原を用いたときの紫外吸収よシ
対照グレートを用いたときの紫外吸収を減じたものを真
の抗体活性としこれを表１に示す。
対照グレートを用いたときの紫外吸収を減じたものを真
の抗体活性としこれを表１に示す。
ＳＬＥ患者と正常人との測定値の間にはｔ−検定で、０
．００１＜Ｐ＜０．０１の有意差が認められた。
．００１＜Ｐ＜０．０１の有意差が認められた。
対照プレートを用いたときの紫外吸収を表２に示す。Ｓ
ＬＥ患者と正常人との間には差はなく、また非特異反応
も極めて少ないことが表１の正常人の測定値との比較よ
り明らかである。
ＬＥ患者と正常人との間には差はなく、また非特異反応
も極めて少ないことが表１の正常人の測定値との比較よ
り明らかである。
試験例２ 抗二本鎖ＤＮＡ抗体の測定
ＳＬＥ患者及び正常人の各血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体
の測定を行なった。
の測定を行なった。
試験例１の不溶化ポＩｊ Ａ Ｄ Ｐ −リボースに代
えて実施例２の方法により製造した不溶化二本鎖ＤＮＡ
を不溶化抗原に用い、その他は試験例１と同様の測定方
法により血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体を測定した。
えて実施例２の方法により製造した不溶化二本鎖ＤＮＡ
を不溶化抗原に用い、その他は試験例１と同様の測定方
法により血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体を測定した。
測定結果を表３に示す。
”Ｓ Ｌ Ｅ患者と正常人との測定値の間にはｔ−検定
で０．００１＜Ｐ＜０．０１の有意差が認められた。
で０．００１＜Ｐ＜０．０１の有意差が認められた。
試験例３ ハイブリドーマの産生ずる抗ポリＡＤＰ−リ
ボース抗体の測定 マウス骨髄腫細胞５Ｐ２１０−ＡＰ−１４とポリＡＤＰ
−リボースで免疫したＣ３Ｈ／Ｈｅマウス牌細胞をアン
ドレジュルフスキーらの方法（Ａｎｄｒｚｅｊｅｒｖｓ
ｋｉ 。
ボース抗体の測定 マウス骨髄腫細胞５Ｐ２１０−ＡＰ−１４とポリＡＤＰ
−リボースで免疫したＣ３Ｈ／Ｈｅマウス牌細胞をアン
ドレジュルフスキーらの方法（Ａｎｄｒｚｅｊｅｒｖｓ
ｋｉ 。
Ｃ，Ｊｒ、 ｅｔａｔ、 Ｊ−Ｉｍｍｕｎｏｌ−、１２
４，１４９９〜１５０２゜１９８０）によって細胞融合
を行った。得られたハイプリドーマ１１株について、そ
の培養上清をと９濃縮せずに抗ボＩＪＡＤＰ−リボース
抗体を標識試薬として実施例４の標識試薬を用い、その
他は試験例１と同様の方法によシ測定した。
４，１４９９〜１５０２゜１９８０）によって細胞融合
を行った。得られたハイプリドーマ１１株について、そ
の培養上清をと９濃縮せずに抗ボＩＪＡＤＰ−リボース
抗体を標識試薬として実施例４の標識試薬を用い、その
他は試験例１と同様の方法によシ測定した。
測定結果を表４に示す。表４に示すようにハイブリドー
マの産生するポＩＪＡＤＰ−リボースを培養上清を濃縮
することなく直接に測定することができた。
マの産生するポＩＪＡＤＰ−リボースを培養上清を濃縮
することなく直接に測定することができた。
表１ 血清中の抗ボ！ＪＡＤＰ−リボース抗体、表２
対照プレートでの紫外吸収（Ａ ４１０１５μｔ）表３
血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体 、表４ ハイプリドーマの産生ずる抗ポリＡＤＰ−リポ
ーース抗体 Ｂ １００１ ０．０４５Ｃ９０１
０，８４０ Ｄ ６０１ ０．２５０Ｄ
９０１ ０．８８５Ｄ ９０２
０．０５０Ｅ ９０２
０．１５５Ｆ ５０３ ０．８６
０Ｆ ７０２ ０．１３０Ｆ
８０１ ０．１１５Ｆ １００
３ ０．０５５Ｇ １００１
０．１２、特許出願人 三井製薬工業株式会社 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５６年特許願第１５０６６８号 ２ 発明の名称 抗核抗体測定用試薬 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願←人 ４、補正命令の日付 昭和５７年１月５日 ５、補正の対象 明細書 別紙の通シ
対照プレートでの紫外吸収（Ａ ４１０１５μｔ）表３
血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体 、表４ ハイプリドーマの産生ずる抗ポリＡＤＰ−リポ
ーース抗体 Ｂ １００１ ０．０４５Ｃ９０１
０，８４０ Ｄ ６０１ ０．２５０Ｄ
９０１ ０．８８５Ｄ ９０２
０．０５０Ｅ ９０２
０．１５５Ｆ ５０３ ０．８６
０Ｆ ７０２ ０．１３０Ｆ
８０１ ０．１１５Ｆ １００
３ ０．０５５Ｇ １００１
０．１２、特許出願人 三井製薬工業株式会社 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５６年特許願第１５０６６８号 ２ 発明の名称 抗核抗体測定用試薬 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願←人 ４、補正命令の日付 昭和５７年１月５日 ５、補正の対象 明細書 別紙の通シ
Claims (1)
- 抗Ｍ抗体のエンザイムイムノアッセイによる測定用試薬
において、測定対象で、ある抗核抗体の産生を惹起する
抗原をプラスチック担体に結合せしめた不溶化抗原と、
該抗原には特異反応釜せず測定対象である抗核抗体と特
異反応をする第二の抗体又はプロティンＡに酵素を結合
せしめた標識試薬との組み合わせよシなることを特徴と
する抗核抗体測定用試薬
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15066881A JPS5856694A (ja) | 1981-09-25 | 1981-09-25 | 抗核抗体測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15066881A JPS5856694A (ja) | 1981-09-25 | 1981-09-25 | 抗核抗体測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5856694A true JPS5856694A (ja) | 1983-04-04 |
| JPH0440662B2 JPH0440662B2 (ja) | 1992-07-03 |
Family
ID=15501862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15066881A Granted JPS5856694A (ja) | 1981-09-25 | 1981-09-25 | 抗核抗体測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5856694A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6488155A (en) * | 1987-06-22 | 1989-04-03 | Ruijiana State Univ Found The | Immunological inspection for detecting antibody against antigen |
| JPH0192660A (ja) * | 1987-01-30 | 1989-04-11 | Nippon Dpc Corp | 生物学的液体中の抗ｄｎａ抗体価の測定法および測定用キット |
| JPH03167473A (ja) * | 1989-11-08 | 1991-07-19 | Nippon Dpc Corp | 抗ｄｎａ抗体結合活性測定法および測定用キット |
| JPH03218462A (ja) * | 1990-10-30 | 1991-09-26 | Nippon Dpc Corp | 標準曲線における抗原結合率と抗二本鎖ｄｎａ抗体価の比例関係を改善するためのｓｌｅ疾患の検知法及び検知用キット |
| WO2005040798A1 (ja) * | 2003-10-29 | 2005-05-06 | Eisai Co., Ltd. | アルツハイマー病の診断方法 |
| CN104007266A (zh) * | 2013-02-27 | 2014-08-27 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 含有6-n-甲基赖氨酸残基的抗原在制备辅助诊断系统性红斑狼疮试剂中的应用 |
-
1981
- 1981-09-25 JP JP15066881A patent/JPS5856694A/ja active Granted
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0192660A (ja) * | 1987-01-30 | 1989-04-11 | Nippon Dpc Corp | 生物学的液体中の抗ｄｎａ抗体価の測定法および測定用キット |
| JPS6488155A (en) * | 1987-06-22 | 1989-04-03 | Ruijiana State Univ Found The | Immunological inspection for detecting antibody against antigen |
| JPH03167473A (ja) * | 1989-11-08 | 1991-07-19 | Nippon Dpc Corp | 抗ｄｎａ抗体結合活性測定法および測定用キット |
| JPH03218462A (ja) * | 1990-10-30 | 1991-09-26 | Nippon Dpc Corp | 標準曲線における抗原結合率と抗二本鎖ｄｎａ抗体価の比例関係を改善するためのｓｌｅ疾患の検知法及び検知用キット |
| WO2005040798A1 (ja) * | 2003-10-29 | 2005-05-06 | Eisai Co., Ltd. | アルツハイマー病の診断方法 |
| CN104007266A (zh) * | 2013-02-27 | 2014-08-27 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 含有6-n-甲基赖氨酸残基的抗原在制备辅助诊断系统性红斑狼疮试剂中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0440662B2 (ja) | 1992-07-03 |
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