JPH03218464A

JPH03218464A - リウマチ特異蛋白質に対する抗体

Info

Publication number: JPH03218464A
Application number: JP24249090A
Authority: JP
Inventors: Naoki Yamanaka; 直樹山中; Osamu Oda; 小田　治; Toshihisa Kanamono; 金物　寿久
Original assignee: MEDEKUSU KK; Asahi Medical Co Ltd
Current assignee: MEDEKUSU KK; Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 1990-09-14
Filing date: 1990-09-14
Publication date: 1991-09-26
Also published as: JPH0541640B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、慢性関節リウマチ等のリウマチ血漿中から単
離したリウマチ特異蛋白質（以下ＲＰと称す）に対して
特異的な抗体（以下ＲＩ”Ａｂと称す）に関するもので
ある。

現在リウマチの診断は、医師の所見や患者主訴に負うと
ころが多く、客観的、定量的診断法が望まれているのが
実情である。この診断法としては一般に、１１項目から
成るアメリカリウマチ協会の診断基準が採用されており
、それらのうち、何項目を満たすかによってリウマチの
診断が行われている。その基準項目の一つにリウマチ因
子の検出があり、測定法が簡便であるためリウマチ因子
の検出は日常検査として広く行われている。

ところで、リウマチ因子はリウマチ患者血漿中に高率に
認められるが（報告によって異なるがリウマチ患者の４
０〜７０％でリウマチ因子が検出されている）、肝疾患
患者、癌患者などのリウマチ以外の患者血漿中において
も高頻度に認められ（肝硬変患者では５０％以上、癌患
者の２０％近くでリウマチ因子陽性との報告がある）、
また、健常人の３〜７％にも認められている。このよう
に、リウマチにおけるリウマチ因子存在の特異性は低く
、リウマチ因子の存在より直ちにリウマチとの診断を行
うことはできない。先のアメリカリウマチ協会の診断基
準においてもリウマチ因子の存在は、リウマチの診断に
おいて、必要なあるいは十分な条件とは認められていな
い。つまり、リウマチの確定診断において、リウマチ因
子を測定することは実際上の有用性は低く、したがって
、リウマチ因子に代わるリウマチ診断のためのパラメー
ターが嘱望されている。

本発明者らは、多数のりウマチ患者および他の疾患患者
、健常人の血漿について研究した結果、リウマチ患者血
漿中に、他の疾患患者や健常人の血漿中には認められな
い新規蛋白質（ＲＰ）が高率に発現されていることを、
蛋白変性剤を用いない２次元電気泳動法（以下の２次元
電気泳動はすべて蛋白変性剤を用いていない）により発
見し、これを単離することに成功し、このＲＰに特異な
抗体ＲＰ−Ａｂを得ることができた。本発明者らの研究
結果によれば、ＲＰはリウマチ患者の７０〜８０％にお
いて認められ、しかも、健常人や腎不全患者、肝疾患患
者、癌患者では全く認められなかった。従来知られてい
るリウマチ因子がリウマチ患者の４０〜７０％で陽性で
あり、かつ健常人や肝疾患患者、癌患者らにおいても高
率に見られることに比べて、ＲＰの特異性およびリウマ
チ患者における陽性率は共に明らかに高い。したがって
、ＲＰに特異な抗体ＲＰ−Ａｂを作成して、ＲＰ−Ａｂ
を用いた診断薬によって、日常の臨床検査としてＲＰの
検出を行うことは、リウマチの診断の有力な手段となり
うる。このＲＰ−Ａｂの作成に取得されたＲＰは必要で
あり、よってリウマチ診断においてＲＰおよびＲＰ−Ａ
ｂは共に極めて有用である。

ＲＰは、リウマチ血漿を２次元電気泳動する時、等電点
（ｐ！）７．３〜７．８、移動度（アルブミン最先端部
の移動度を１．０として）０．４０〜０．５５の範囲に
スポットとして認められる、ＳＤＳボリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量が約１７０，０００の蛋白質
である。健常人血漿の２次元電気泳動においては、等電
点（ｐｉ）が７．３〜７．８、移動度（アルブミン最先
端部の移動度を１．　　０として）が０．４０〜０．５
５の範囲には蛋白質は認められず、ＲＰはリウマチ血漿
中にみられる、従来知られていない全く新しい蛋白質で
あることがわかる。

次に、ＲＰの取得方法について述べる。ＲＰは、一Ｃ的
手法により得たりウマチ血漿を、まずポリアクリルアミ
ドゲルにより等電点電気泳動し、続いて濃度勾配ゲル電
気泳動する２次元電気泳動法によって２次元電気泳動ゲ
ル上に分離することができる。ＲＰは２次元電気泳動ゲ
ル上の等電点（ｐｌ）７．３〜７．８、移動度（アルブ
ミン最先端部の移動度を１．０として）０．４０〜０．
５５の範囲にあり、これを２次元電気泳動ゲル上より分
割して緩衝液等により抽出し、単離できる。

このとき単離したＲＰの分子量は、ＳＤＳボリアクリル
アミドゲル電気泳動法によって測定する時、約１７０．
０００である。

また、大量にＲＰを単離するには、リウマチ患者血漿の
２５〜３５％飽和硫酸アンモニウムで塩析される沈澱に
ついて、ＤＥＡＥ−セファデツクスＡ−５０（ファルマ
シア社製、スウェーデン）等のようなイオン交換ゲルに
よるイオン交換クロマトグラフィーを行い、０．５Ｍ塩
化ナトリウムで溶出される分画を回収する。さらに、こ
の分画をセフアクリルＳ−３００　（ファルマシア社製
、スウェーデン）等のようなゲルによるゲルクロマトグ
ラフィーの後、再度上記のイオン交換ゲルによるイオン
交換クロマトグラフィーを行うことにより単離できる。

このとき単離したＲＰは、２次元電気泳動する時、等電
点（ｐｉ）７．３〜７．８、移動度（アルブミン最先端
部の移動度を１．０として）０．４０〜０．５５の範囲
にあり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
って測定する時、約１７０，０００の分子量を示す。

ＲＰに特異な抗体ＲＰ−Ａｂは、例えば精製したＲＰを
フロインド（　Ｆｒｅｕｎｄ　）の完全アジュハン１・
等と共に免疫可能な動物に免疫して、その免疫動物から
抗血清を採取して精製する、特異抗体作成の一般的方法
によって得られる。抗血清からの抗体の精製は、例えば
抗原であるＲＰを臭化シアン等のリガンドによってセフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア社製、スウェーデン）等の
ゲルに結合させ、そのゲルをつめたカラムに抗血清を通
し、よく洗浄の後、グリシン緩衝液等によりカラムから
抗体を分離する免疫吸着法等によってできる。

このようにして得た抗体ＲＰ−Ａｂは、一般的な特異抗
体の確認法、例えば免疫電気泳動や免疫沈降反応等によ
って、精製したＲＰと特異的に反応して沈降線を生ずる
ことより確認できる。

ＲＰ−Ａｂによる血漿中のＲＰの測定は、現在一般に行
われている特異抗体を用いた抗原測定の方法、例えば、
寒天等のゲルを用いた二重免疫拡散法や、ラテックスや
赤血球等にＲＰ−Ａｂを固定して行う各種凝集反応、ビ
ーズやマイクロプレート等の固相にＲＰ−Ａｂを吸着さ
せて酵素やラジオアイソトープ等を用いる免疫測定法等
によりできる。このような測定方法等によってＲＰ−Ａ
ｂを用いてＲＰが簡便に測定でき、したがって、リウマ
チ診断のための日常検査法としてＲＰ−Ａｂは重要であ
る。

（実施例）＜ＲＰの単離方法〉ＲＰを有する慢性関節リウマチ患者における血漿交換に
よって生じた排血漿の、２５％飽和硫酸アンモニウムに
よって析出した沈澱を、８０００Ｘｇ．２０分の遠心分
離によって除き、上清に更に硫酸アンモニウムを加えて
、３５％飽和硫酸アンモニウムにより析出した沈澱を８
０００Ｘｇ，２０分の遠心分離により回収した。この沈
澱を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２，以下ＰＢＮ
ａと称す）で溶解し、セロファン膜により脱イオン水で
透析して硫酸アンモニウムを除去し、次に、あらかじめ
ＰＢＮａで緩衝化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５
０（ファルマシア社製．スウェーデン）カラムを用いて
イオン交換クロマトグラフィーを行った。０．５Ｍ塩化
ナトリウム液によって溶出される分画にＲＰが含まれて
いることを２次元電気泳動法によって確認し、この分画
を回収した。回収した分画は、セロファン膜により脱イ
オン水で２回透析して塩化ナトリウムを除去した後、凍
結乾燥によって濃縮し、さらにセフアクリルＳ−３００
　（ファルマシア社製，スウエーデン）カラムによりゲ
ルクロマトグラフィーを行い、２次元電気泳動法によっ
てＲＰが確認された分画位置に相当する分画を回収する
ことにより、イオン交換クロマトグラフィーで混入した
ＲＰと分子ふるいの挙動が異なる物質を分離した。この
後、再度ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（ファルマ
シア社製，スウェーデン）カラムを用いてイオン交換ク
ロマトグラフィーによるイオン強度による分離をさらに
行い、塩化ナトリウムの０．０Ｍから０．６Ｍの濃度勾
配液で溶出させて、２次元電気泳動法によりＲＰが確認
された分画位置に相当する分画を回収して、精製したＲ
Ｐを得た。

この精製したＲＰを検体として以下のように２次元電気
泳動を行い、確認した．精製したＲＰ６０ｕｌ　（蛋白
濃度０．　　４　０ｍｇ／ＩＩ１）を、アンフォライン
（　Ａｓ＋ｐｈｏｌｉｎｅ　：ファルマシア社製，６．
２５　ｗ　／　ｖ％（ｐＨ３．５−１　０　：　ｐＨ３
．５−５＝４　：　１）　）を含むポリアクリルアミド
ゲル上で、０．ＯＩＭリン酸液と０．０４Ｍ水酸化ナト
リウム液を用いて、はじめ一定電流（２ｍＡ）で泳動し
、電圧が２２０Ｖに達した後、２２０ｖの一定電圧で２
０時間泳動した。次に、この泳動ゲルを４％から１７％
の濃度勾配をもつポリアクリルアミド・スラブゲル上に
置いて、一定電流（２４ｍＡ）で２０時間泳動した。こ
の時の泳動液には、０．０５Ｍ｝リス−０．３８４Ｍグ
リシン緩衝液を用いた。以上のようにして２次元電気泳
動した後、０．０２５％コマシー・ブリリアント・ブル
−　（　Ｃｏｏａ＋ｅｒｓｉｅ　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　
Ｂｌｕｅ　Ｒ　　２　５　０　）　＋５　０　ｖ　／　
ｖ％メタノール，７％酢酸液で８時間染色し、７％酢酸
、１０％メタノール液で３日間脱色して得た泳動像を第
１図に示す。泳動像は等電点７．３〜７．８、移動度（
アルブミン最先端部の移動度を１．０として）０．４０
〜０．５５の範囲内にあることよりＲＰであることを確
認した。

また、この時得たＲＰは、ＳＤＳボリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって、分子量約１７０．０００と測定で
きた。

参考までに、慢性関節リウマチ患者血漿および健常人血
漿を同様に２次元電気泳動を行った場合の泳動像を、そ
れぞれ第２図および第３図に示す．慢性関節リウマチ患
者血漿の２次元電気泳動像には、等電点７．３〜７．８
、移動度（アルブミン最先端部の移動度を１．　　０と
して）０．４０〜０．５５の範囲内にＲＰのスポットが
みられる（破線で囲んだ部分）。しかしながら、健常人
血漿の２次元電気泳動像には、等電点７．３〜７．８、
移動度（アルブミン最先端部の移動度を１．０として）
０．４０〜０．５５の範囲内には、ＲＰはもとより蛋白
質のスボントは全く認められない。

精製したＲＰは、Ｕｖスペクトル２８０ｎ■に極大吸収
を持ち、ニンヒドリン陽性であり、また、ＲＡテスト、
Ｒ　Ａ　Ｈ　Ａ　ｓ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘテ
ストを行い、ＲＰが従来知られているリウマチ因子や！
霧ｍｕｎｅ　Ｃｏｎ＋ｐｌｅｘでないことも同時に確認
した。

さらに、精製したＲＰを６Ｎ塩酸で１１０゜Ｃで２４時
間加水分解後、アミノ酸分析機（日立ＫＬＨ−５）によ
ってアミノ酸の分析を行った。この時得た結果は、次の
ようであった（単位はｓｏｌｅＸ）。

Ｌｙｓ　６．６，　　旧ｓ　１．９．　　Ａｒｇ　４．
０，　　Ａｓｐ　７．０，Ｔｈｒ　８．５，　　Ｓｅｒ
　１０．帆　Ｇｌｕ　１０．４，　　Ｐｒｏ　７．９，
Ｇｌｙ　　１０．４，　　Ａｌａ　４．７．　　Ｃｙｓ
／２１．０，　　Ｖａｌ　　７．５．Ｍｅｔ　１．６，
　　ｌｉｅ　２．９，　　Ｌｅｕ　８．３，　　Ｔｙｒ
　４．５，Ｐｈｅ　　２．９＜ＲＰ−Ａｂの作成〉免疫動物として家兎を用いて、精製したＲＰＩｍｌ　（
蛋白量０．３２ｍｇ）とフロインド（　Ｆｒｅｕｎｄ　
）完全アジュバントＩＩｊＩ１を混ぜ合わせて、安定な
油中水型エマルジョンを作成し、成熟家兎皮下に注射し
た。一ケ月後に、精製したＲＰ１ｄ（蛋白量０．４０＋
ａｇ）とフロインド（　Ｆｒｅｕｎｄ　）完全アジュハ
ント１−を混ぜ合わせて、安定な油中水型エマルジョン
を再度作成し、同じ家兎に皮下注射した。

さらに１週間後に採血して抗血清を得た。

抗血清からの抗体の精製は次のようにして行った。まず
セファロース４Ｂ（ファルマシア社製スウェーデン）２
０ｄをブッフナー（　Ｂｕｃｈｎｅｒ　）漏斗上で蒸留
水であらかじめ洗浄しておき、それに蒸留水２０ａ！１
！と臭化シアン水溶液（２ｇ／４０ｄ）を加えて、４Ｎ
水酸化ナトリウムで直ちにｐＨを１１．０とした。これ
をｐＨを１１，０〜１１．３に保ったまま８分間攪拌し
、８分後にゲルをブッフナー漏斗で吸引濾過し、漏斗上
のゲルを氷冷しておいた０．１＋ｏｆ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．０）で３回洗浄し、吸引濾過して水をき
って氷水浴中に置いた。別に、精製したＲＰ２０ａｄ！
を炭酸ナトリウム緩衝液でセロファン膜を用いて透析し
、氷冷しておいたものを、作成しておいた氷水浴中のゲ
ルに加えて１０分間撹拌して抗原結合ゲルを作成した。

この抗原結合ゲルをカラムにつめ、ＰＢＮａで洗浄した
後、家兎から得た抗血清１０ＩＩｉを流して抗血清中の
ＲＰ−Ａｂを抗原結合ゲルに吸着させた。ＰＢＮａで十
分に洗浄した後、ＲＰ−ＡｂはｐＨ２．３のグリシン緩
衝液（０．１７Ｍ）をカラムに流して回収し、直ちに】
／】０量のｐＨ１１．５のグリシン緩衝液（ＩＭ）を加
えて中和し、ＲＰ−Ａｂを精製・単離した．精製したＲ
Ｐ−Ａｂは、次のようにして確認した。まず精製したＲ
Ｐを２次元電気泳動で展開した後、あらかじめ１％寒天
に０．５ｄの精製したＲＰ−Ａｂを混合した液を、２次
元電気泳動によって展開しておいたゲル上′に流し、寒
天が固化後、１日室温に放置して免疫沈降反応を行った
。

免疫沈降反応後寒天に生じた沈陳スポットは、等電点７
．３〜７．８、移動度（アルブミンの最先端部移動度を
１．０として）０．４０〜０．５５の範囲内にあった。

この時得た沈降スポットを第４図に示す。ＲＰに特異な
抗体ＲＰ−Ａｂが精製できたことが示された。

＜ＲＰ−Ａｂによるリウマチ診断例〉医師による総合的診断結果により確認された慢性関節リ
ウマチ患者６０例、健常人３０例、腎不全患者２０例、
肝疾患患者（肝硬変など）１２例、癌患者（胃癌、大腸
癌など）４０例について、ＲＰ−Ａｂを用いた二重免疫
拡散法と、市販のＲＡテストキット（日水製薬製）によ
るリウマチ因子の測定の両法（以下それぞれＲＰ−Ａｂ
法とＲＡテストと称する）によってリウマチの診断を行
った。ＲＰ−Ａｂ法における陽性・陰性は沈降線の有無
により判定した。この時、精製したＲＰを陽性対照、Ｒ
Ｐを含まないことを確認ずみの血漿を陰性対照として各
テスト毎においた。ＲＡテストは製造元能書にしたがっ
て判定した。結果を第１表に示す。

第表（注）Ａ；慢性関節リウマチ患昔Ｂ：健常人Ｃ：腎不全患者Ｄ＝肝疾患患者Ｅ：ｌｉＪ患者慢性関節リウマチ患者におけるＲＰ−Ａｂ法による陽性
率が７６．７％（偽陰性２３．３％）であったのに対し
て、ＲＡテストによる陽性率は６０．０％（偽陰性４０
．０％）であり、惑度はＲＡテストに比べてＲＰ−Ａｂ
法の方が明らかに高かった。また、健常人、腎不全患者
、肝疾患患者および癌患者においては、ＲＩ”Ａｂ法で
は全く偽陽性が認められなかったのに対して、ＲＡテス
トでは疾患によって異なるものの６．７〜３３．３％も
の偽陽性が認められ、ＲＡテストに比べてＲＰ−Ａｂ法
の方が明らかに特異性は高かった。

以上の結果より、従来用いられているリウマチ因子の測
定による方法に比べて、ＲＰ−Ａｂ法によるリウマチ診
断法は明らかに優れており、ＲＰＡｂがリウマチ診断に
おける日常検査に非常に有用であることが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は精製ＲＰの２次元電気泳動像、第２図は慢性関
節リウマチ患者血漿の２次元電気泳動像、第３図は健常
人血漿の２次元電気泳動像、第４図はＲＰＡｂの沈降スポットである．

Claims

【特許請求の範囲】

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で約１７０，０
００の分子量を示し、蛋白変性剤を用いない２次元電気
泳動における等電点が７．３〜７．８、移動度（アルブ
ミン最先端部の移動度を１．０として）が０．４０〜０
．５５の範囲にある、リウマチ血漿中より取得されたリ
ウマチ特異蛋白質により作成されたリウマチ特異蛋白質
に対する抗体。