JPH0541640B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、慢性関節リウマチ等のリウマチ血漿
中から単離したリウマチ特異蛋白質（以下RPと
称す）に対して特異的な抗体（以下RP−Abと称
す）に関するものである。 現在リウマチの診断は、医師の所見や患者主訴
に負うところが多く、客観的、定量的診断法が望
まれているのが実情である。この診断法としては
一般に、11項目から成るアメリカリウマチ協会の
診断基準が採用されており、それらのうち、何項
目を満すかによつてリウマチの診断が行われてい
る。その基準項目の一つにリウマチ因子の検出が
あり、測定法が簡便であるためリウマチ因子の検
出は日常検査として広く行われている。 ところで、リウマチ因子はリウマチ患者血漿中
に高率に認められるが（報告によつて異なるがリ
ウマチ患者の40〜70％にリウマチ因子が検出され
ている）、肝疾患患者、癌患者などのリウマチ以
外の患者血漿中においても高頻度に認められ（肝
硬変患者では50％以上、癌患者の20％近くでリウ
マチ因子陽性との報告がある）、また、健常人の
３〜７％にも認められている。このように、リウ
マチにおけるリウマチ因子存在の特異性は低く、
リウマ因子の存在より直ちにリウマチとの診断を
行うことはできない。先のアメリカリウマチ協会
の診断基準においてもリウマ因子の存在は、リウ
マチの診断において、必要なあるいは十分な条件
とは認められていない。つまり、リウマチの確定
診断において、リウマチ因子を測定することは実
際上の有用性は低く、したがつて、リウマチ因子
に代わるリウマチ診断のためのパラメーターが嘱
望されている。 本発明者らは、多数のリウマチ患者および他の
疾患患者、健常人の血漿について研究した結果、
リウマチ患者血漿中に、他の疾患患者や健常人の
血漿中には認められない新規蛋白質（RP）が高
率に発現されていることを、蛋白変性剤を用いな
い２次元電気泳動法（以下の２次元電気泳動はす
べて蛋白変性剤を用いていない）により発見し、
これを単離することに成功し、このRPに特異な
抗体RP−Abを得ることができた。本発明者らの
研究結果によれば、RPはリウマチ患者の70〜80
％において認められ、しかも、健常人や腎不全患
者、肝疾患患者、癌患者では全く認められなかつ
た。従来知られているリウマチ因子がリウマチ患
者の40〜70％で陽性であり、かつ健常人や肝疾患
患者、癌患者らにおいても高率に見られることに
比べて、RPの特異性およびリウマチ患者におけ
る陽性率は共に明らかに高い。したがつて、RP
に特異な抗体RP−Abを作成して、RP−Abを用
いた診断薬によつて、日常の臨床検査としてRP
の検出を行うことは、リウマチの診断の有力な手
段となりうる。このRP−Abの作成に取得された
RPは必要であり、よつてリウマチ診断において
RPおよびRP−Abは共に極めて有用である。 RPは、リウマチ血漿を２次元電気泳動する時、
等電点（pI）7.3〜7.8、移動度（アルプミン最先
端部の移動度を1.0として）0.40〜0.55の範囲にス
ポツトとして認められる、SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による分子量が約170000の蛋白質
である。健常人血漿の２次元電気泳動において
は、等電点（pI）が7.3〜7.8、移動度（アルブミ
ン最先端部の移動度を1.0として）が0.40〜0.55の
範囲には蛋白質は認められず、RPはリウマチ血
漿中にみられる、従来知られていない全く新しい
蛋白質であることがわかる。 次に、RPの取得方法について述べる。RPは、
一般的手法により得たリウマチ血漿を、まずポリ
アクリルアミドゲルにより等電点電気泳動し、続
いて濃度勾配ゲル電気泳動する２次元電気泳動法
によつて２次元電気泳動ゲル上に分離することが
できる。RPは２次元電気泳動ゲル上の等電点
（pI）7.3〜7.8、移動度（アルブミン最先端部の移
動度を1.0として）0.40〜0.55の範囲にあり、これ
を２次元電気泳動ゲル上より分割して緩衝液等に
より抽出し、単離できる。このとき単離したRP
の分子量は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動法によつて測定する時、、約170000である。 また、大量にRPを単離するには、リウマチ患
者血漿の25〜35％飽和硫酸アンモニウムで塩析さ
れる沈澱について、DEAE−セフアデツクスＡ−
50（フアイマシア社製、スウエーデン）等のよう
なイオン交換ゲルによるイオン交換クロマトグラ
フイーを行い、0.5M塩化ナトリウムで溶出され
る分画を回収する。さらに、この分画をセフアク
リルＳ−300（フアルマシア社製、スウエーデン）
等のようなゲルによるゲルクロマトグラフイーの
後、再度上記のイオン交換ゲルによるイオン交換
クロマトグラフイーを行うことにより単離でき
る。このとき単離したRPは、２次元電気泳動す
る時、等電点（pI）7.3〜7.8、移動度（アルブミ
ン最先端部の移動度を1.0として）0.40〜0.55の範
囲にあり、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
法によつて測定する時、約170000の分子量を示
す。 RPに特異な抗体RP−Abは、例えば精製した
RPをフロインド（Freund）の完全アジユバント
等と共に免疫可能な動物に免疫して、その免疫動
物から抗血清を採取して精製する、特異抗体作成
の一般的方法によつて得られる。抗血清からの抗
体の精製は、例えば抗原であるRPを臭化シアン
等のリガンドによつてセフアロース4B（フアルマ
シア社製、スウエーデン）等のゲルに結合させ、
そのゲルをつめたカラムに抗血清を通し、よく洗
浄の後、グリシン緩衝液等によりカラムから抗体
を分離する免疫吸着法等によつてできる。このよ
うにして得た抗体RP−Abは、一般的な特異抗体
の確認法、例えば免疫電気泳動や免疫沈降反応等
によつて、精製したRPと特異的に反応して沈降
線を生ずることより確認できる。 RP−Abによる血漿中のRPの測定は、現在一
般に行われている特異抗体を用いた抗原測定の方
法、例えば、寒天等のゲルを用いた二重免疫拡散
法や、ラテツクスや赤血球等にRP−Abを固定し
て行う各種凝集反応、ビーズやマイクロプレート
等の固相にRP−Abを吸着させて酵素やラジオア
イソトープ等を用いる免疫測定法等によりでき
る。このような測定方法等によつてRP−Abを用
いてRPが簡便に測定でき、したがつて、リウマ
チ診断のための日常検査法としてRP−Abは重要
である。 （実施例） ＜RPの単離方法＞ RPを有する慢性関節リウマチ患者における血
漿交換によつて生じた排血漿の、25％飽和硫酸ア
ンモニウムによつて析出した沈澱を、8000×ｇ、
20分の遠心分離によつて除き、上清に更に硫酸ア
ンモニウムを加えて、35％飽和硫酸アンモニウム
により析出した沈澱を8000×ｇ、20分の遠心分離
により回収した。この沈澱を0.02Mリン酸緩衝液
（PH7.2、以下PBNaと称す）で溶解し、セロフア
ン膜により脱イオン水で透析して硫酸アンモニウ
ムを除去し、次に、あらかじめPBNaで緩衝化し
たDEAE−セフアデツクスＡ−50（フアルマシア
社製、スウエーデン）カラムを用いてイオン交換
クロマトグラフイーを行つた。0.5M塩化ナトリ
ウム液によつて溶出される分画にRPが含まれて
いることを２次元電気泳動法によつて確認し、こ
の分画を回収した。回収した分画は、セロフアン
膜により脱イオン水で２回透析して塩化ナトリウ
ムを除去した後、凍結乾燥によつて濃縮し、さら
にセフアクリルＳ−300（フアルマシア社製、スウ
エーデン）カラムによりゲルクロマトグラフイー
を行い、２次元電気泳動法によつてRPが確認さ
れた分画位置に相当する分画を回収することによ
り、イオン交換クロマトグラフイーで混入した
RPと分子ふるいの挙動が異なる物質を分離した。
この後、再度DEAE−セフアデツクスＡ−50（フ
アルマシア社製、スウエーデン）カラムを用いて
イオン交換クロマトグラフイーによるイオン強度
による分離をさらに行い、塩化ナトリウムの
0.0Mから0.6Mの濃度勾配液で溶出させて、２次
元電気泳動法によりRPが確認された分画位置に
相当する分画を回収して、精製したRPを得た。 この精製したRPを検体として以下のように２
次元電気泳動を行い、確認した。精製した
RP60μl（蛋白濃度0.40mg／ml）を、アンフオライ
ン〔Ampholine：フアルマシア社製、6.25w／ｖ
％（PH3.5−10：PH3.5−５＝４：１）〕を含むポ
リアクリルアミドゲル上で、0.01Mリン酸液と
0.04M水酸化ナトリウム液を用いて、はじめ一定
電流（2mA）で泳動し、電圧が220Vに達した
後、220Vの一定電圧で20時間泳動した。。次に、
この泳動ゲルを４％から17％の濃度勾配をもつポ
リアクリルアミド・スラブゲル上に置いて、一定
電流（24mA）で20時間泳動した。この時の泳動
液には、0.05Mトリス−0.384Mグリシン緩衝液
を用いた。以上のようにして２次元電気泳動した
後、0.025％コマシー・ブリリアント・ブルー
（Coomersie Brilliant Blue Ｒ−250），50v／ｖ
％メタノール、７％酢酸液で８時間染色し、７％
酢酸、10％メタノール液で３日間脱色して得た泳
動像を第１図に示す。泳動像は等電点7.3〜7.8、
移動度（アルブミン最先端部の移動度を1.0とし
て）0.40〜0.55の範囲内にあることよりRPである
ことを確認した。また、この時得たRPは、SDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて、分子
量約170000と測定できた。 参考までに、慢性関節リウマチ患者血漿および
健常人血漿を同時に２次元電気泳動を行つた場合
の泳動像を、それぞれ第２図および第３図に示
す。慢性関節リウマチ患者血漿の２次元電気泳動
像には、等電点7.3〜7.8、移動度（アルブミン最
先端部の移動度を1.0として）0.40〜0.55の範囲内
にRPのスポツトがみられる（破線で囲んだ部
分）。しかしながら、健常人血漿の２次元電気泳
動像には、等電点7.3〜7.8、移動度（アルブミン
最先端部の移動度を1.0として）0.40〜0.55の範囲
内には、RPはもとより蛋白質のスポツトは全く
認められない。 精製したRPは、UVスペクトル280nmに極大
吸収を持ち、ニンヒドリン陽性であり、また、
RAテスト、RAHA、Immune Complexテスト
を行い、RPが従来知られているリウマチ因子や
Immune Complexでないことも時に確認した。 さらに、精製したRPを6N塩酸で110℃で24時
間加水分解後、アミノ酸分析機（日立KLH−５）
によつてアミノ酸の分析を行つた。この時得た結
果は、次のようであつた（単位はmole％）。 Lys6.6，His1.9，Arg4.0，Asp7.0，Thr8.5，
Ser10.0，Glu10.4，Pro7.9，Gly10.4，Ala4.7，
Cys／２ 1.0，Val7.5，Met1.6，Ile2.9，
Leu8.3，Tyr4.5，Phe2.9 ＜RP−Abの作成＞ 免疫動物として家兎を用いて、精製したRP1ml
（蛋白量0.32mg）とフロインド（Freund）完全ア
ジユバント１mlを混ぜ合わせて、安定な油中水型
エマルジヨンを作成し、成熟家兎皮下に注射し
た。一ケ月後に、精製したRP1ml（蛋白量0.40
mg）とフロインド（Freund）完全アジユバント
１mlを混ぜ合わせて、安定な油中水型エマルジヨ
ンを再度作成し、同じ家兎に皮下注射した。さら
に１週間後に採血して抗血清を得た。 抗血清からの抗体の精製は次のようにして行つ
た。まずセフアロース4B（フアルマシア社製、ス
ウエーデン）20mlをブツフナー（Buchner）漏斗
上で蒸留水であらかじめ洗浄しておき、それに蒸
留水20mlと臭化シアン水溶液（2g／40ml）を加
えて、4N水酸化ナトリウムで直ちにPHを11.0と
した。これをPHを11.0〜11.3に保つたまま８分間
撹拌し、８分後にゲルをブツフナー漏斗で吸引濾
過し、漏斗上のゲルを氷冷しておいた0.1mol炭
酸ナトリウム緩衝液（PH9.0）で３回洗浄し、吸
引濾過して水をきつて氷水浴中に置いた。別に、
精製したRP20mlを炭酸ナトリウム緩衝液でセロ
フアン膜を用いて透析し、氷冷しておいたもの
を、作成しておいた氷水浴中のゲルに加えて10分
間撹拌して抗原結合ゲルを作成した。。この抗原
結合ゲルをカラムにつめ、PBNaで洗浄した後、
家兎から得た抗血清10mlを流して抗血清中のRP
−Abを抗原結合ゲルに吸着させた。PBNaで十
分に洗浄した後、RP−AbはPH2.3のグリシン緩
衝液（0.17M）をカラムに流して回収し、直ちに
１／１０量のPH11.5のグリシン緩衝液（1M）を加え
て中和し、RP−Abを精製・単離した。精製した
RP−Abは、次のようにして確認した。まず精製
したRPを２次元電気泳動で展開した後、あらか
じめ１％寒天に0.5mlの精製したRP−Abを混合
した液を、２次元電気泳動によつて展開しておい
たゲル上に流し、寒天が固化後、１日室温に放置
して免疫沈降反応を行つた。 免疫沈降反応後寒天に生じた沈降スポツトは、
等電点7.3〜7.8、移動度（アルブミンの最先端部
移動度を1.0として）0.40〜0.55の範囲内にあつ
た。この時得た沈降スポツトを第４図に示す。
RPに特異な抗体RP−Abが精製できたことを示
された。 ＜RP−Abによるリウマチ診断例＞ 医師による総合的診断結果により確認された慢
性関節リウマチ患者60例、健常人30例、腎不全患
者20例、肝疾患患者（肝硬変など）12例、癌患者
（胃癌、大腸癌など）40例について、RP−Abを
用いた二重免疫拡散法と、市販のRAテストキツ
ト（日水製薬製）によるリウマチ因子の測定の両
法（以下それぞれRP−Ab法とRAテストと称す
る）によつてリウマチの診断を行つた。RP−Ab
法における陽性・陰性は沈降線の有無により判定
した。この時、精製したRPを陽性対照、RPを含
まないことを確認ずみの血漿を陰性対照として各
テスト毎においた。RAテストは製造元能書にし
たがつて判定した。結果を第１表に示す。
中から単離したリウマチ特異蛋白質（以下RPと
称す）に対して特異的な抗体（以下RP−Abと称
す）に関するものである。 現在リウマチの診断は、医師の所見や患者主訴
に負うところが多く、客観的、定量的診断法が望
まれているのが実情である。この診断法としては
一般に、11項目から成るアメリカリウマチ協会の
診断基準が採用されており、それらのうち、何項
目を満すかによつてリウマチの診断が行われてい
る。その基準項目の一つにリウマチ因子の検出が
あり、測定法が簡便であるためリウマチ因子の検
出は日常検査として広く行われている。 ところで、リウマチ因子はリウマチ患者血漿中
に高率に認められるが（報告によつて異なるがリ
ウマチ患者の40〜70％にリウマチ因子が検出され
ている）、肝疾患患者、癌患者などのリウマチ以
外の患者血漿中においても高頻度に認められ（肝
硬変患者では50％以上、癌患者の20％近くでリウ
マチ因子陽性との報告がある）、また、健常人の
３〜７％にも認められている。このように、リウ
マチにおけるリウマチ因子存在の特異性は低く、
リウマ因子の存在より直ちにリウマチとの診断を
行うことはできない。先のアメリカリウマチ協会
の診断基準においてもリウマ因子の存在は、リウ
マチの診断において、必要なあるいは十分な条件
とは認められていない。つまり、リウマチの確定
診断において、リウマチ因子を測定することは実
際上の有用性は低く、したがつて、リウマチ因子
に代わるリウマチ診断のためのパラメーターが嘱
望されている。 本発明者らは、多数のリウマチ患者および他の
疾患患者、健常人の血漿について研究した結果、
リウマチ患者血漿中に、他の疾患患者や健常人の
血漿中には認められない新規蛋白質（RP）が高
率に発現されていることを、蛋白変性剤を用いな
い２次元電気泳動法（以下の２次元電気泳動はす
べて蛋白変性剤を用いていない）により発見し、
これを単離することに成功し、このRPに特異な
抗体RP−Abを得ることができた。本発明者らの
研究結果によれば、RPはリウマチ患者の70〜80
％において認められ、しかも、健常人や腎不全患
者、肝疾患患者、癌患者では全く認められなかつ
た。従来知られているリウマチ因子がリウマチ患
者の40〜70％で陽性であり、かつ健常人や肝疾患
患者、癌患者らにおいても高率に見られることに
比べて、RPの特異性およびリウマチ患者におけ
る陽性率は共に明らかに高い。したがつて、RP
に特異な抗体RP−Abを作成して、RP−Abを用
いた診断薬によつて、日常の臨床検査としてRP
の検出を行うことは、リウマチの診断の有力な手
段となりうる。このRP−Abの作成に取得された
RPは必要であり、よつてリウマチ診断において
RPおよびRP−Abは共に極めて有用である。 RPは、リウマチ血漿を２次元電気泳動する時、
等電点（pI）7.3〜7.8、移動度（アルプミン最先
端部の移動度を1.0として）0.40〜0.55の範囲にス
ポツトとして認められる、SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による分子量が約170000の蛋白質
である。健常人血漿の２次元電気泳動において
は、等電点（pI）が7.3〜7.8、移動度（アルブミ
ン最先端部の移動度を1.0として）が0.40〜0.55の
範囲には蛋白質は認められず、RPはリウマチ血
漿中にみられる、従来知られていない全く新しい
蛋白質であることがわかる。 次に、RPの取得方法について述べる。RPは、
一般的手法により得たリウマチ血漿を、まずポリ
アクリルアミドゲルにより等電点電気泳動し、続
いて濃度勾配ゲル電気泳動する２次元電気泳動法
によつて２次元電気泳動ゲル上に分離することが
できる。RPは２次元電気泳動ゲル上の等電点
（pI）7.3〜7.8、移動度（アルブミン最先端部の移
動度を1.0として）0.40〜0.55の範囲にあり、これ
を２次元電気泳動ゲル上より分割して緩衝液等に
より抽出し、単離できる。このとき単離したRP
の分子量は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動法によつて測定する時、、約170000である。 また、大量にRPを単離するには、リウマチ患
者血漿の25〜35％飽和硫酸アンモニウムで塩析さ
れる沈澱について、DEAE−セフアデツクスＡ−
50（フアイマシア社製、スウエーデン）等のよう
なイオン交換ゲルによるイオン交換クロマトグラ
フイーを行い、0.5M塩化ナトリウムで溶出され
る分画を回収する。さらに、この分画をセフアク
リルＳ−300（フアルマシア社製、スウエーデン）
等のようなゲルによるゲルクロマトグラフイーの
後、再度上記のイオン交換ゲルによるイオン交換
クロマトグラフイーを行うことにより単離でき
る。このとき単離したRPは、２次元電気泳動す
る時、等電点（pI）7.3〜7.8、移動度（アルブミ
ン最先端部の移動度を1.0として）0.40〜0.55の範
囲にあり、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
法によつて測定する時、約170000の分子量を示
す。 RPに特異な抗体RP−Abは、例えば精製した
RPをフロインド（Freund）の完全アジユバント
等と共に免疫可能な動物に免疫して、その免疫動
物から抗血清を採取して精製する、特異抗体作成
の一般的方法によつて得られる。抗血清からの抗
体の精製は、例えば抗原であるRPを臭化シアン
等のリガンドによつてセフアロース4B（フアルマ
シア社製、スウエーデン）等のゲルに結合させ、
そのゲルをつめたカラムに抗血清を通し、よく洗
浄の後、グリシン緩衝液等によりカラムから抗体
を分離する免疫吸着法等によつてできる。このよ
うにして得た抗体RP−Abは、一般的な特異抗体
の確認法、例えば免疫電気泳動や免疫沈降反応等
によつて、精製したRPと特異的に反応して沈降
線を生ずることより確認できる。 RP−Abによる血漿中のRPの測定は、現在一
般に行われている特異抗体を用いた抗原測定の方
法、例えば、寒天等のゲルを用いた二重免疫拡散
法や、ラテツクスや赤血球等にRP−Abを固定し
て行う各種凝集反応、ビーズやマイクロプレート
等の固相にRP−Abを吸着させて酵素やラジオア
イソトープ等を用いる免疫測定法等によりでき
る。このような測定方法等によつてRP−Abを用
いてRPが簡便に測定でき、したがつて、リウマ
チ診断のための日常検査法としてRP−Abは重要
である。 （実施例） ＜RPの単離方法＞ RPを有する慢性関節リウマチ患者における血
漿交換によつて生じた排血漿の、25％飽和硫酸ア
ンモニウムによつて析出した沈澱を、8000×ｇ、
20分の遠心分離によつて除き、上清に更に硫酸ア
ンモニウムを加えて、35％飽和硫酸アンモニウム
により析出した沈澱を8000×ｇ、20分の遠心分離
により回収した。この沈澱を0.02Mリン酸緩衝液
（PH7.2、以下PBNaと称す）で溶解し、セロフア
ン膜により脱イオン水で透析して硫酸アンモニウ
ムを除去し、次に、あらかじめPBNaで緩衝化し
たDEAE−セフアデツクスＡ−50（フアルマシア
社製、スウエーデン）カラムを用いてイオン交換
クロマトグラフイーを行つた。0.5M塩化ナトリ
ウム液によつて溶出される分画にRPが含まれて
いることを２次元電気泳動法によつて確認し、こ
の分画を回収した。回収した分画は、セロフアン
膜により脱イオン水で２回透析して塩化ナトリウ
ムを除去した後、凍結乾燥によつて濃縮し、さら
にセフアクリルＳ−300（フアルマシア社製、スウ
エーデン）カラムによりゲルクロマトグラフイー
を行い、２次元電気泳動法によつてRPが確認さ
れた分画位置に相当する分画を回収することによ
り、イオン交換クロマトグラフイーで混入した
RPと分子ふるいの挙動が異なる物質を分離した。
この後、再度DEAE−セフアデツクスＡ−50（フ
アルマシア社製、スウエーデン）カラムを用いて
イオン交換クロマトグラフイーによるイオン強度
による分離をさらに行い、塩化ナトリウムの
0.0Mから0.6Mの濃度勾配液で溶出させて、２次
元電気泳動法によりRPが確認された分画位置に
相当する分画を回収して、精製したRPを得た。 この精製したRPを検体として以下のように２
次元電気泳動を行い、確認した。精製した
RP60μl（蛋白濃度0.40mg／ml）を、アンフオライ
ン〔Ampholine：フアルマシア社製、6.25w／ｖ
％（PH3.5−10：PH3.5−５＝４：１）〕を含むポ
リアクリルアミドゲル上で、0.01Mリン酸液と
0.04M水酸化ナトリウム液を用いて、はじめ一定
電流（2mA）で泳動し、電圧が220Vに達した
後、220Vの一定電圧で20時間泳動した。。次に、
この泳動ゲルを４％から17％の濃度勾配をもつポ
リアクリルアミド・スラブゲル上に置いて、一定
電流（24mA）で20時間泳動した。この時の泳動
液には、0.05Mトリス−0.384Mグリシン緩衝液
を用いた。以上のようにして２次元電気泳動した
後、0.025％コマシー・ブリリアント・ブルー
（Coomersie Brilliant Blue Ｒ−250），50v／ｖ
％メタノール、７％酢酸液で８時間染色し、７％
酢酸、10％メタノール液で３日間脱色して得た泳
動像を第１図に示す。泳動像は等電点7.3〜7.8、
移動度（アルブミン最先端部の移動度を1.0とし
て）0.40〜0.55の範囲内にあることよりRPである
ことを確認した。また、この時得たRPは、SDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて、分子
量約170000と測定できた。 参考までに、慢性関節リウマチ患者血漿および
健常人血漿を同時に２次元電気泳動を行つた場合
の泳動像を、それぞれ第２図および第３図に示
す。慢性関節リウマチ患者血漿の２次元電気泳動
像には、等電点7.3〜7.8、移動度（アルブミン最
先端部の移動度を1.0として）0.40〜0.55の範囲内
にRPのスポツトがみられる（破線で囲んだ部
分）。しかしながら、健常人血漿の２次元電気泳
動像には、等電点7.3〜7.8、移動度（アルブミン
最先端部の移動度を1.0として）0.40〜0.55の範囲
内には、RPはもとより蛋白質のスポツトは全く
認められない。 精製したRPは、UVスペクトル280nmに極大
吸収を持ち、ニンヒドリン陽性であり、また、
RAテスト、RAHA、Immune Complexテスト
を行い、RPが従来知られているリウマチ因子や
Immune Complexでないことも時に確認した。 さらに、精製したRPを6N塩酸で110℃で24時
間加水分解後、アミノ酸分析機（日立KLH−５）
によつてアミノ酸の分析を行つた。この時得た結
果は、次のようであつた（単位はmole％）。 Lys6.6，His1.9，Arg4.0，Asp7.0，Thr8.5，
Ser10.0，Glu10.4，Pro7.9，Gly10.4，Ala4.7，
Cys／２ 1.0，Val7.5，Met1.6，Ile2.9，
Leu8.3，Tyr4.5，Phe2.9 ＜RP−Abの作成＞ 免疫動物として家兎を用いて、精製したRP1ml
（蛋白量0.32mg）とフロインド（Freund）完全ア
ジユバント１mlを混ぜ合わせて、安定な油中水型
エマルジヨンを作成し、成熟家兎皮下に注射し
た。一ケ月後に、精製したRP1ml（蛋白量0.40
mg）とフロインド（Freund）完全アジユバント
１mlを混ぜ合わせて、安定な油中水型エマルジヨ
ンを再度作成し、同じ家兎に皮下注射した。さら
に１週間後に採血して抗血清を得た。 抗血清からの抗体の精製は次のようにして行つ
た。まずセフアロース4B（フアルマシア社製、ス
ウエーデン）20mlをブツフナー（Buchner）漏斗
上で蒸留水であらかじめ洗浄しておき、それに蒸
留水20mlと臭化シアン水溶液（2g／40ml）を加
えて、4N水酸化ナトリウムで直ちにPHを11.0と
した。これをPHを11.0〜11.3に保つたまま８分間
撹拌し、８分後にゲルをブツフナー漏斗で吸引濾
過し、漏斗上のゲルを氷冷しておいた0.1mol炭
酸ナトリウム緩衝液（PH9.0）で３回洗浄し、吸
引濾過して水をきつて氷水浴中に置いた。別に、
精製したRP20mlを炭酸ナトリウム緩衝液でセロ
フアン膜を用いて透析し、氷冷しておいたもの
を、作成しておいた氷水浴中のゲルに加えて10分
間撹拌して抗原結合ゲルを作成した。。この抗原
結合ゲルをカラムにつめ、PBNaで洗浄した後、
家兎から得た抗血清10mlを流して抗血清中のRP
−Abを抗原結合ゲルに吸着させた。PBNaで十
分に洗浄した後、RP−AbはPH2.3のグリシン緩
衝液（0.17M）をカラムに流して回収し、直ちに
１／１０量のPH11.5のグリシン緩衝液（1M）を加え
て中和し、RP−Abを精製・単離した。精製した
RP−Abは、次のようにして確認した。まず精製
したRPを２次元電気泳動で展開した後、あらか
じめ１％寒天に0.5mlの精製したRP−Abを混合
した液を、２次元電気泳動によつて展開しておい
たゲル上に流し、寒天が固化後、１日室温に放置
して免疫沈降反応を行つた。 免疫沈降反応後寒天に生じた沈降スポツトは、
等電点7.3〜7.8、移動度（アルブミンの最先端部
移動度を1.0として）0.40〜0.55の範囲内にあつ
た。この時得た沈降スポツトを第４図に示す。
RPに特異な抗体RP−Abが精製できたことを示
された。 ＜RP−Abによるリウマチ診断例＞ 医師による総合的診断結果により確認された慢
性関節リウマチ患者60例、健常人30例、腎不全患
者20例、肝疾患患者（肝硬変など）12例、癌患者
（胃癌、大腸癌など）40例について、RP−Abを
用いた二重免疫拡散法と、市販のRAテストキツ
ト（日水製薬製）によるリウマチ因子の測定の両
法（以下それぞれRP−Ab法とRAテストと称す
る）によつてリウマチの診断を行つた。RP−Ab
法における陽性・陰性は沈降線の有無により判定
した。この時、精製したRPを陽性対照、RPを含
まないことを確認ずみの血漿を陰性対照として各
テスト毎においた。RAテストは製造元能書にし
たがつて判定した。結果を第１表に示す。
【表】
慢性関節リウマチ患者におけるRP−Ab法によ
る陽性率が76.7％（偽陰性23.3％）であつたのに
対して、RAテストによる陽性率は60.0％（偽陰
性40.0％）であり、感度はRAテストに比べてRP
−Ab法の方が明らかに高かつた。また、健常人、
腎不全患者、肝疾患患者および癌患者において
は、RP−Ab法では全く偽陽性が認められなかつ
たのに対して、RAテストでは疾患によつて異な
るものの6.0〜33.3％もの偽陽性が認められ、RA
テストに比べてRP−Ab法の方が明らかに特異性
は高かつた。以上の結果より、従来用いられてい
るリウマチ因子の測定による方法に比べて、RP
−Ab法によるリウマチ診断法は明らかに優れて
おり、RP−Abがリウマチ診断における日常検査
に非常に有用であることが示された。
る陽性率が76.7％（偽陰性23.3％）であつたのに
対して、RAテストによる陽性率は60.0％（偽陰
性40.0％）であり、感度はRAテストに比べてRP
−Ab法の方が明らかに高かつた。また、健常人、
腎不全患者、肝疾患患者および癌患者において
は、RP−Ab法では全く偽陽性が認められなかつ
たのに対して、RAテストでは疾患によつて異な
るものの6.0〜33.3％もの偽陽性が認められ、RA
テストに比べてRP−Ab法の方が明らかに特異性
は高かつた。以上の結果より、従来用いられてい
るリウマチ因子の測定による方法に比べて、RP
−Ab法によるリウマチ診断法は明らかに優れて
おり、RP−Abがリウマチ診断における日常検査
に非常に有用であることが示された。
第１図は精製RPの２次元電気泳動像、第２図
は慢性関節リウマチ患者血漿の２次元電気泳動
像、第３図は健常人血漿の２次元電気泳動像、第
４図はRP−Abの沈降スポツトである。
は慢性関節リウマチ患者血漿の２次元電気泳動
像、第３図は健常人血漿の２次元電気泳動像、第
４図はRP−Abの沈降スポツトである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で約
170000の分子量を示し、蛋白変性剤を用いない２
次元電気泳動における等電点が7.3〜7.8、移動度
（アルブミン最先端部の移動度を1.0として）が
0.40〜0.55の範囲にあり、アミノ酸組成が下記の
とおりである、リウマチ血漿中より取得されたリ
ウマチ特異蛋白質により作成されたリウマチ特異
蛋白質に対する抗体。 （アミノ酸組成） Lys6.6、His1.9、Arg4.0、Asp7.0、Thr8.5、
Ser10.0、Glu10.4、Pro7.9、Gly10.4、Ala4.7、
Cys／２ 1.0、Val7.5、Met1.6、Ile2.9、Leu8.3、
Tyr4.5、Phe2.9
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24249090A JPH03218464A (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | リウマチ特異蛋白質に対する抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24249090A JPH03218464A (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | リウマチ特異蛋白質に対する抗体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58053922A Division JPS59180363A (ja) | 1983-03-31 | 1983-03-31 | リウマチ特異蛋白質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03218464A JPH03218464A (ja) | 1991-09-26 |
| JPH0541640B2 true JPH0541640B2 (ja) | 1993-06-24 |
Family
ID=17089863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24249090A Granted JPH03218464A (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | リウマチ特異蛋白質に対する抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03218464A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5475358B2 (ja) * | 2009-08-04 | 2014-04-16 | ホーユー株式会社 | ２次元電気泳動方法 |
-
1990
- 1990-09-14 JP JP24249090A patent/JPH03218464A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03218464A (ja) | 1991-09-26 |
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