JPH03219885A - Ｌ―リジンの製法、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物、及びｄｎａ―フラグメント - Google Patents
Ｌ―リジンの製法、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物、及びｄｎａ―フラグメントInfo
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- JPH03219885A JPH03219885A JP2061308A JP6130890A JPH03219885A JP H03219885 A JPH03219885 A JP H03219885A JP 2061308 A JP2061308 A JP 2061308A JP 6130890 A JP6130890 A JP 6130890A JP H03219885 A JPH03219885 A JP H03219885A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上のオ（！用分野
本発明は発酵によるＬ −ＩＪレジン製法に関する。
従来技術
］リネパクテリウム会グルタミクム（ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及び類縁の属
、例えばブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツムｒ
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌａｃｔｏｆｅｒｍ
ｅｎｔｕｍ）及びブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ ｆ ｌａｖｕｍ） ｔｄ
７ ミ／酸形成微生物生産性を上昇するためには、人
為的突然変異を実施する。
ｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及び類縁の属
、例えばブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツムｒ
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌａｃｔｏｆｅｒｍ
ｅｎｔｕｍ）及びブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ ｆ ｌａｖｕｍ） ｔｄ
７ ミ／酸形成微生物生産性を上昇するためには、人
為的突然変異を実施する。
このようにして生じた人為的突然変異体の例は、例えば
コリネバクテリウム拳グルタミクムのリジン生産菌株で
あり、この菌株はＡＥＣ耐△ 、 性（ＡＣＥ＝ｂ−２−アミノエチルシスティン）の他に
これと関連するホモセリン−及びロイシン−要求性（米
国特許第３７０８３９５号明細書）を示すか、又はメチ
オニンに対して敏感である（米国特許第３８７１９６０
号１［ｆＮｉＦ）。
コリネバクテリウム拳グルタミクムのリジン生産菌株で
あり、この菌株はＡＥＣ耐△ 、 性（ＡＣＥ＝ｂ−２−アミノエチルシスティン）の他に
これと関連するホモセリン−及びロイシン−要求性（米
国特許第３７０８３９５号明細書）を示すか、又はメチ
オニンに対して敏感である（米国特許第３８７１９６０
号１［ｆＮｉＦ）。
これら古典的な方法の他に、コリネバクテリウム（ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ ） Ｍ 及ヒフレヒハ
クテリｖ） Ａ （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
ノ形質転換を可能とするベクターシステムも開発された
（西独特許公開第３７３７７１９号及び同第３８４１＋
５３４公報、Ｔｈ１ｅｒｂａｃｈ Ｇｏ、Ｓｃｈｗａｒ
ｚｅｒ Ａ、 、Ｐｕｈｌｅｒ Ａ、著、ＡｐｐｌｌＭ
ｉｃｒｏｂｌｏｌ。
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ ） Ｍ 及ヒフレヒハ
クテリｖ） Ａ （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
ノ形質転換を可能とするベクターシステムも開発された
（西独特許公開第３７３７７１９号及び同第３８４１＋
５３４公報、Ｔｈ１ｅｒｂａｃｈ Ｇｏ、Ｓｃｈｗａｒ
ｚｅｒ Ａ、 、Ｐｕｈｌｅｒ Ａ、著、ＡｐｐｌｌＭ
ｉｃｒｏｂｌｏｌ。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ、第２９巻、１９８８年、第３
５６〜３６２頁）。
５６〜３６２頁）。
ヨーロッパ特許公開第０２１９０２７号公報には種々の
アミノ酸の製法が記載されており、ここではｋ・換えＤ
ＮＡでコリネバクテリウム属及びブレビバクテリウム属
の微生物を形質転換し、こうしてアミノ酸の分泌量を上
昇させる。
アミノ酸の製法が記載されており、ここではｋ・換えＤ
ＮＡでコリネバクテリウム属及びブレビバクテリウム属
の微生物を形質転換し、こうしてアミノ酸の分泌量を上
昇させる。
この隙、約換えＤＮＡはアスノ母ルプートセミアルデヒ
ドーデヒドログナーゼ又はアスパルテートーアミノトフ
ンスフエラーゼの合成ｖｃ ａ ｔ。
ドーデヒドログナーゼ又はアスパルテートーアミノトフ
ンスフエラーゼの合成ｖｃ ａ ｔ。
てコードするＤＮＡ−フラグメントを含有する。
米国特許第４３４６１７０号明細書から、リジン形成を
調節する遺伝情報の太陽菌中でのクローン化が公知であ
や、この遺伝情％１Ｌ−ＩＪジンー類似化合物、例えば
ＡＥＣに対する耐性を有する同じ属の菌株からのもので
ある。
調節する遺伝情報の太陽菌中でのクローン化が公知であ
や、この遺伝情％１Ｌ−ＩＪジンー類似化合物、例えば
ＡＥＣに対する耐性を有する同じ属の菌株からのもので
ある。
米国特許第４５６０６５４号明細書の課題は同じ分野で
ある。しかしながら、ここではコリネバクテリウム・グ
ルタミクムのリジン要求性菌株中で同属のＡＥＣ−耐性
菌株からの遺伝情報をクローン化し、その結果としてリ
ジンが分泌される。
ある。しかしながら、ここではコリネバクテリウム・グ
ルタミクムのリジン要求性菌株中で同属のＡＥＣ−耐性
菌株からの遺伝情報をクローン化し、その結果としてリ
ジンが分泌される。
クローン（Ｅ Ｄ Ｎ Ａ−７ラグメントの同定は明ら
かにされていない。
かにされていない。
ヨーロッパ特許公開第８８１６６号公報からは、ＡＥＣ
−耐性の〉」型の形質転換により得られたコリネバクテ
リウム書グルタミクムの菌株がリジンを分泌するという
ことだけがわかる。
−耐性の〉」型の形質転換により得られたコリネバクテ
リウム書グルタミクムの菌株がリジンを分泌するという
ことだけがわかる。
この目的のために使用した組換えプラスミドｐＡｅｃ５
［染色体ＤＮＡの３，９ｋｂフラグメントをベクター１
）ＣＧＩＩのＢｇｔＨ−切断位に挿入して含有する。
［染色体ＤＮＡの３，９ｋｂフラグメントをベクター１
）ＣＧＩＩのＢｇｔＨ−切断位に挿入して含有する。
発明が解決しようとする課題
本発明のり題はコリネバクテリウム属又はブレビバクテ
リウム属の微生物中のリジン生合成の重要な）累の調節
性をリジン分訂体が生じるか、又はリジン分泌速度を高
めるように笈化させることである。
リウム属の微生物中のリジン生合成の重要な）累の調節
性をリジン分訂体が生じるか、又はリジン分泌速度を高
めるように笈化させることである。
課題を解決するための手段
本発明はＬ −ＩＪレジン製法に関し、この製法は、コ
リネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物
から由来する。アスパルチル−β−セミアルデヒド−デ
ヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）活性に導びき、かつ／又はア
スパルテート−キナーゼ（Ｌｙｓｃ）の調節解除に導び
く蛋白質の生理をコードする遺伝配列を示すＤＮＡフラ
グメントから、及びベクターＤＮＡからなる朴換えＤＮ
Ａをコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の
、リジン生産性であってよい微生物中に挿入し、このよ
うにして得られた形質転換体を好適な、自体公知の培地
中で培養し、生じたＬ −ＩＪレジン公知法で分離する
ことを特許とする。
リネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物
から由来する。アスパルチル−β−セミアルデヒド−デ
ヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）活性に導びき、かつ／又はア
スパルテート−キナーゼ（Ｌｙｓｃ）の調節解除に導び
く蛋白質の生理をコードする遺伝配列を示すＤＮＡフラ
グメントから、及びベクターＤＮＡからなる朴換えＤＮ
Ａをコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の
、リジン生産性であってよい微生物中に挿入し、このよ
うにして得られた形質転換体を好適な、自体公知の培地
中で培養し、生じたＬ −ＩＪレジン公知法で分離する
ことを特許とする。
供与菌としては、すべての、有第１にはＬ −ＩＪレジ
ン産性のブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム
属の、相応するＤＮＡ−配列を有する菌を使用すること
ができるが、特にコリネバクテリウムＡＴＣＣ１３０３
２ｔエチルメタンスルホネートを用いて突然変異誘発す
ることにより生じ、かつＡＥＣ−耐性を示すコリネバク
テリウム・グルタミクムＤＭ５８−１を使用することが
できる。この菌株はプラスミドｐＤｆＶ＋６に関する宿
主菌として用いられる、番号ＤＳＭ４６９７として寄託
されている。これは専門家に公知の方法で分離され、菌
株ＤＭ５８−１が得うレル。（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ。
ン産性のブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム
属の、相応するＤＮＡ−配列を有する菌を使用すること
ができるが、特にコリネバクテリウムＡＴＣＣ１３０３
２ｔエチルメタンスルホネートを用いて突然変異誘発す
ることにより生じ、かつＡＥＣ−耐性を示すコリネバク
テリウム・グルタミクムＤＭ５８−１を使用することが
できる。この菌株はプラスミドｐＤｆＶ＋６に関する宿
主菌として用いられる、番号ＤＳＭ４６９７として寄託
されている。これは専門家に公知の方法で分離され、菌
株ＤＭ５８−１が得うレル。（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ。
第３２巻、１９８６年、第１４９〜１５７頁）。
染色体ＤＮＡを公知法で供与体から抽出し、制限エンド
ヌクレアーゼで処理する。
ヌクレアーゼで処理する。
ベクター中への染色体ＤＮＡ−７ラダメントの導入によ
る組換えＤＮＡの製造の後、このようにして得られたプ
ラスミド、本弁明による例においてはその制限地図が第
２図中に示されているｐＣＳ２で微生物の形質転換を行
ない、かつコリネバクテリウム・グルタミクム中でプラ
スミドＤＭ２−１ ／ｐＣＳ２はドイツ微生物保存機関
ＫＤＳＭ５０８６という番号で寄託された。
る組換えＤＮＡの製造の後、このようにして得られたプ
ラスミド、本弁明による例においてはその制限地図が第
２図中に示されているｐＣＳ２で微生物の形質転換を行
ない、かつコリネバクテリウム・グルタミクム中でプラ
スミドＤＭ２−１ ／ｐＣＳ２はドイツ微生物保存機関
ＫＤＳＭ５０８６という番号で寄託された。
有利なベクターシステムＬ／１ｐＺｌ（コリネバクテリ
ウム・グルタミグ１０Ｍ２フ４−２中で番号ＤＳＭ４２
４１ として寄託）であるか、又はｐＣＶ３４、ｐＣＶ
３６、ｐＣＶＸ４、ｐｃｖｘｌｏ、ｐｃｖｘ１５、ｐＺ
９及びｐＺ８−１（西独特許公開第３８４号 １４５４、 ｆｆ’；＝’ｎ報） 又ｔｄ ｐＣＶ３５
、ｐＥＭ３、ｐＥＣＭｌ（西独特許公開第３８４１４５
３．８号公報）である。ヨーロッパ特許公開第９３６１
１号公報から公知の集められたプラスミドも、コリネバ
クテリウム又ｈブレビバクテリウム中で自体Ｖｉ製する
かぎり便用可能である。特にｐＡＪ６５５、ｐＡＪ ６
１１．ｐＡＪ ４４０、ｐＡＪ １８４４及びｐＡＪ
３１４８並びにｐｃ（３１１、ｐＣＥ ５４ （ヨーロ
ツノ母特許公開＄２３３５８１号公報参照）、同ＴｈＫ
ｐＵＬ ３３０（Ｓａｎｔａｍａｒ ｌａ 、 Ｒ，
１，＠ Ｉ’、Ｊ、 Ｂａｃｔｅ′ｒ Ｉｏ ｌｏｇｙ
１第１６２号、１９８５年、第４６３〜４６７頁）も使
用可能である。
ウム・グルタミグ１０Ｍ２フ４−２中で番号ＤＳＭ４２
４１ として寄託）であるか、又はｐＣＶ３４、ｐＣＶ
３６、ｐＣＶＸ４、ｐｃｖｘｌｏ、ｐｃｖｘ１５、ｐＺ
９及びｐＺ８−１（西独特許公開第３８４号 １４５４、 ｆｆ’；＝’ｎ報） 又ｔｄ ｐＣＶ３５
、ｐＥＭ３、ｐＥＣＭｌ（西独特許公開第３８４１４５
３．８号公報）である。ヨーロッパ特許公開第９３６１
１号公報から公知の集められたプラスミドも、コリネバ
クテリウム又ｈブレビバクテリウム中で自体Ｖｉ製する
かぎり便用可能である。特にｐＡＪ６５５、ｐＡＪ ６
１１．ｐＡＪ ４４０、ｐＡＪ １８４４及びｐＡＪ
３１４８並びにｐｃ（３１１、ｐＣＥ ５４ （ヨーロ
ツノ母特許公開＄２３３５８１号公報参照）、同ＴｈＫ
ｐＵＬ ３３０（Ｓａｎｔａｍａｒ ｌａ 、 Ｒ，
１，＠ Ｉ’、Ｊ、 Ｂａｃｔｅ′ｒ Ｉｏ ｌｏｇｙ
１第１６２号、１９８５年、第４６３〜４６７頁）も使
用可能である。
同様に本願の１１１題はこの紅換えＤＮＡを含有するコ
リネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物
並びに該微生物を使用した発酵によるＬ−リジンの製法
に関する。
リネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物
並びに該微生物を使用した発酵によるＬ−リジンの製法
に関する。
クローン化したＤＮＡ−フラグメント（第２図診照）は
配列分析から認識されるようにアスパルテート−キナー
ゼ遺伝子（ＬｙｓＣ）の断片並びにアルパルチル−β−
セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）の完全遺
伝子を含有する。
配列分析から認識されるようにアスパルテート−キナー
ゼ遺伝子（ＬｙｓＣ）の断片並びにアルパルチル−β−
セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）の完全遺
伝子を含有する。
このアスパルテート−キナーゼ遺伝子の断片はブレビバ
クテリウム・ズブチリス（Ｂ、 ５ｕｂ−ｔｆｌｉＳ）
からのアスパルテート−キナーゼ■のβ−サブユニット
に相同のＤＮＡ−配列を有する。
クテリウム・ズブチリス（Ｂ、 ５ｕｂ−ｔｆｌｉＳ）
からのアスパルテート−キナーゼ■のβ−サブユニット
に相同のＤＮＡ−配列を有する。
そのグラスミドが該配列を有するすべての形質転排体（
ｐＣＳ２、ｐＣＳ２１、ｐＣＳ２２、ｐＣＳ２３、ｐＣ
Ｓ２４、ｐＣＳ２６、ｐＣＳ２３３）は、フィード・バ
ック抑制物質Ｌ−リジン及びし−スレオニンに関して、
ＡＴＣＣ１３０３２からの染色体によりコードされた酵
素と比較して明らかに感度の低下したアスパルテートキ
ナーゼを含有し、ＡＥＣ−耐性を示す。
ｐＣＳ２、ｐＣＳ２１、ｐＣＳ２２、ｐＣＳ２３、ｐＣ
Ｓ２４、ｐＣＳ２６、ｐＣＳ２３３）は、フィード・バ
ック抑制物質Ｌ−リジン及びし−スレオニンに関して、
ＡＴＣＣ１３０３２からの染色体によりコードされた酵
素と比較して明らかに感度の低下したアスパルテートキ
ナーゼを含有し、ＡＥＣ−耐性を示す。
ＤＩＶ１５８−１からのＰｓｔ Ｉ−ＸｈｏＩ遺伝子フ
ラグメントはＬｙｓＣ遺伝子（八に）の１部のみを、し
かし完全ａｓｄ−遺伝子を包含するという、相同比較か
ら出された推論は嘗素測足により明らかに確認すること
ができた。
ラグメントはＬｙｓＣ遺伝子（八に）の１部のみを、し
かし完全ａｓｄ−遺伝子を包含するという、相同比較か
ら出された推論は嘗素測足により明らかに確認すること
ができた。
ｐＣ３２又けｐＣ３２−誘導体で形質転換されたコリネ
バクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣＩ ３Ｏ３２菌株
のいずれも、意外にも受容菌に対して高めらｈたアスパ
ルテート−キナーゼ活性を有さない（第４夛、第３ａ）
。
バクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣＩ ３Ｏ３２菌株
のいずれも、意外にも受容菌に対して高めらｈたアスパ
ルテート−キナーゼ活性を有さない（第４夛、第３ａ）
。
これに対して、プラスミドがａｓｄ−構造遺伝子を有す
るすべての形質転換体においてはアスパルチル−β−セ
ミアルデヒドーデヒトログナーゼ（ＡＳＡ−ＤＨ）
の強い過剰表現が検出可能である（第４衣、第２欄、第
３及び第４図）。
るすべての形質転換体においてはアスパルチル−β−セ
ミアルデヒドーデヒトログナーゼ（ＡＳＡ−ＤＨ）
の強い過剰表現が検出可能である（第４衣、第２欄、第
３及び第４図）。
プラスミドｐＣＳ２３及びｐＣＳ２３−＆橋体は予期し
たようにＡＳＡ−ＤＨの過剰表現に導ひかない。
たようにＡＳＡ−ＤＨの過剰表現に導ひかない。
ｐＣ３２及びこれから訓導された誘導体を有する本発明
によるＤＮＡ−フラグメントをクローンイヒする際に生
じるＡＳＡ−ＤＨの著しい過剰発現はアスパルテート−
キナーゼ反応の生成物のβ−アスパルチルホスフェート
への十分なＲ換を保証し、これによりもはや抑制不可能
なアスパルテート−キナーゼ反応の促進が生じる。
によるＤＮＡ−フラグメントをクローンイヒする際に生
じるＡＳＡ−ＤＨの著しい過剰発現はアスパルテート−
キナーゼ反応の生成物のβ−アスパルチルホスフェート
への十分なＲ換を保証し、これによりもはや抑制不可能
なアスパルテート−キナーゼ反応の促進が生じる。
ＡＳＡ−ＤＨの高い崩壊性のために特異的活性から予期
可能な３１〜６５の過剰発現のファクターは変動する。
可能な３１〜６５の過剰発現のファクターは変動する。
公知技術に対する著しい単純イ１が得られたが、このこ
とは第１に、リジン分泌に作用するか、又は分泌を改良
するためにアスパルテート−キナーゼの調節解除に導び
＜Ｌｙｓｃ遺伝子の断片のみを単離すればよいというこ
とから、第２にオペロン中でのＬｙｓＣとａＳｄの＃Ｉ
成のために、突然変異Ｌｙｓ−遺伝子と丼に生じるＡＥ
Ｃ−耐性によりａＳｄ−遺伝子を角加的な実験なしにＬ
ｙｓＣ−遺伝子と共に単離することができるということ
から得られた。反対にａｉｄ−突然変異体を用いて、Ｌ
ｙｓＣ＋ａｓｄを含有ｊる［ＪＮＡ−７ラグメントを単
離することもできる；すなわちＬｙｓＣが突然変異した
かしないかということとは独立して単離することもでき
る。
とは第１に、リジン分泌に作用するか、又は分泌を改良
するためにアスパルテート−キナーゼの調節解除に導び
＜Ｌｙｓｃ遺伝子の断片のみを単離すればよいというこ
とから、第２にオペロン中でのＬｙｓＣとａＳｄの＃Ｉ
成のために、突然変異Ｌｙｓ−遺伝子と丼に生じるＡＥ
Ｃ−耐性によりａＳｄ−遺伝子を角加的な実験なしにＬ
ｙｓＣ−遺伝子と共に単離することができるということ
から得られた。反対にａｉｄ−突然変異体を用いて、Ｌ
ｙｓＣ＋ａｓｄを含有ｊる［ＪＮＡ−７ラグメントを単
離することもできる；すなわちＬｙｓＣが突然変異した
かしないかということとは独立して単離することもでき
る。
１ 遺伝子受容菌［ＪＭ５８−１及び遺伝子受容菌ＡＴ
ＣＣ１３０３２の特命付け １、１ 菌株ＤＭ５８−１の４生及び表現型コリネバ
クテリウム―グルヨミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２を通
常濃度のエチルメタンスルホネートで突然変異誘発を行
なうことにより菌株Ｄｔｖ＋５８−１が生じた。
ＣＣ１３０３２の特命付け １、１ 菌株ＤＭ５８−１の４生及び表現型コリネバ
クテリウム―グルヨミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２を通
常濃度のエチルメタンスルホネートで突然変異誘発を行
なうことにより菌株Ｄｔｖ＋５８−１が生じた。
選択はこのように得られた突然ｆＪＩ体の混合物を最少
培地上に塗布することにより行なった。
培地上に塗布することにより行なった。
この最少培地の１成は蒸留水（ｐｉ”１７．０ ） ｌ
ｔあたりｆｈコ−ｘ ２Ｑｆ、（ＮＨ４）２Ｓｏ４１
０？、尿素２５１Ｐ％ＫＨ２ＰＯ４１ｙ、Ｍｇ Ｓｏ
４・７Ｈ２００，４Ｐ、Ｆｅ５０ −７ＨＯ２ｍｙ、Ｍ
ｎ５Ｏ４−Ｈ２Ｏ１゜２ ５■、ビオチン３００μ？、チアミン ９００μノ及び
寒天２０Ｊ’であり、これは好適な濃度のＳ−アミノエ
チル−Ｄ、Ｌ−システィン（ＡＥＣ）を含有する。この
ような培地上で分裂能力を有する、選択培地から単離さ
れたクローンはＡＥＣ−耐性の他に全く他の遺伝的％俟
を有さない。これをＤｆＶＩ５８−１と名分する。
ｔあたりｆｈコ−ｘ ２Ｑｆ、（ＮＨ４）２Ｓｏ４１
０？、尿素２５１Ｐ％ＫＨ２ＰＯ４１ｙ、Ｍｇ Ｓｏ
４・７Ｈ２００，４Ｐ、Ｆｅ５０ −７ＨＯ２ｍｙ、Ｍ
ｎ５Ｏ４−Ｈ２Ｏ１゜２ ５■、ビオチン３００μ？、チアミン ９００μノ及び
寒天２０Ｊ’であり、これは好適な濃度のＳ−アミノエ
チル−Ｄ、Ｌ−システィン（ＡＥＣ）を含有する。この
ような培地上で分裂能力を有する、選択培地から単離さ
れたクローンはＡＥＣ−耐性の他に全く他の遺伝的％俟
を有さない。これをＤｆＶＩ５８−１と名分する。
１．２ ＡＴＣＣ１３０３２及びＤｒｖ＋５８−１
中のアスパルテート−キナーゼ及びアスパルチル−β−
セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼに関する酵素含量 菌株ＡＴＣＣ１３０３２とＤＭ５８−１をスタンダード
Ｉブイヨン（Ｍｅｒｋ社、種類番号７８８２）中、付加
的にグルコース４？／を及び１ｍＭｔｖ１ｇＣｔ２ト共
に、３０°Ｃ及び１５０ ｒ、 ｐ、 ｍで直接比較可
能な条件下に早期定常期に斎するまで培養し、培地の遠
心分離により分離する。１００ｍＦｖ１ ト リ ｘ／
ト１（、；Ｌ（ｐＨ７，５） ； １ｍＭ Ｄ
ＴＴで３回洗浄し、湿潤１細胞塊を同じ緩衝液の容積中
に懸濁させる。
中のアスパルテート−キナーゼ及びアスパルチル−β−
セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼに関する酵素含量 菌株ＡＴＣＣ１３０３２とＤＭ５８−１をスタンダード
Ｉブイヨン（Ｍｅｒｋ社、種類番号７８８２）中、付加
的にグルコース４？／を及び１ｍＭｔｖ１ｇＣｔ２ト共
に、３０°Ｃ及び１５０ ｒ、 ｐ、 ｍで直接比較可
能な条件下に早期定常期に斎するまで培養し、培地の遠
心分離により分離する。１００ｍＦｖ１ ト リ ｘ／
ト１（、；Ｌ（ｐＨ７，５） ； １ｍＭ Ｄ
ＴＴで３回洗浄し、湿潤１細胞塊を同じ緩衝液の容積中
に懸濁させる。
このように懸濁した細胞をが一ルミル（Ｅｌ。
Ｂｒａｕｎ Ｍｅ ｌ ｓｕｎｇｅｎ−ＭＳに−ｈｏｍ
ｏｇｅｎ ｉ ５ａｔｏｒ。
ｏｇｅｎ ｉ ５ａｔｏｒ。
ＩＭＡ−Ｄｉｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ 参照）中テ
ｉｆｉノｆｆラス球と攪拌することにより破砕する。こ
の細胞均質物をガラスフィルターを用いてガラス球から
分離し、３００００ＸＰで３０分間遠心分離して澄明に
する。
ｉｆｉノｆｆラス球と攪拌することにより破砕する。こ
の細胞均質物をガラスフィルターを用いてガラス球から
分離し、３００００ＸＰで３０分間遠心分離して澄明に
する。
酵素を安定什する緩衝液中で１５時間の透析の債、次の
テスト−ｍ合物中で酵素活性が測定さｆＩた： アスパルテートーキナーゼテス） ： １００ｍＭト
リ Ｘ／ＨＣｌ （ｐＨ７，５’） 、 １
ｍＭ ｏｏ Ｔ Ｓ ４００ｍＭ （’
ＮＨ４）２Ｓｏ４．２０ｍＭ ＭｇＣｚ２．４ＱＱｍ
ｆＶｉＮＨ２０Ｈ・ＨＣｔ、 ３００ｒｎＮ’ｌ Ｌ
−７スｚ４ ルテー）、４０ｍＭ ＡＴＰ及び種々の
量の酵素調剤酵素反応を３７°０で３０分間恰温保持し
た後、酵素テスト混合物５００ μｌに１０４ ＦｅＣ
ｌ３−６１−１２０； ３．３ ％ ＴＣＡ； ０．
７ ｒＳ４Ｈｃｔカラナルｆｇ液７５０μｔを添加する
ことにより酸素反応を中断する。検量線法により測光法
（ΔＥ５４０ｎｍ）で測定したアスパルチル−β−ヒド
ロキサメート濃度から、μＭｏ ｔ ／ Ｈ９・分（Ｕ
／■）で救わず酵素活性を計算する。所属の蛋白質濃度
はローリイ（Ｌｏｗｒｙ）等の方法（ローリイ雛、Ｊ。
テスト−ｍ合物中で酵素活性が測定さｆＩた： アスパルテートーキナーゼテス） ： １００ｍＭト
リ Ｘ／ＨＣｌ （ｐＨ７，５’） 、 １
ｍＭ ｏｏ Ｔ Ｓ ４００ｍＭ （’
ＮＨ４）２Ｓｏ４．２０ｍＭ ＭｇＣｚ２．４ＱＱｍ
ｆＶｉＮＨ２０Ｈ・ＨＣｔ、 ３００ｒｎＮ’ｌ Ｌ
−７スｚ４ ルテー）、４０ｍＭ ＡＴＰ及び種々の
量の酵素調剤酵素反応を３７°０で３０分間恰温保持し
た後、酵素テスト混合物５００ μｌに１０４ ＦｅＣ
ｌ３−６１−１２０； ３．３ ％ ＴＣＡ； ０．
７ ｒＳ４Ｈｃｔカラナルｆｇ液７５０μｔを添加する
ことにより酸素反応を中断する。検量線法により測光法
（ΔＥ５４０ｎｍ）で測定したアスパルチル−β−ヒド
ロキサメート濃度から、μＭｏ ｔ ／ Ｈ９・分（Ｕ
／■）で救わず酵素活性を計算する。所属の蛋白質濃度
はローリイ（Ｌｏｗｒｙ）等の方法（ローリイ雛、Ｊ。
Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、第１９３巻、第２６５頁、１
９５１年）又Ｈブ７７ドフオード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ；
Ａｎａｌ、 Ｂｌｏｃｈｅｍ、 ＩＥ ７２巻、第
２４８頁、１９７６年）の方法により実旅した。アスパ
ルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼテスト
Ｈ１２ｏｍＭジェタノールアミン（ｐＨ９，０）； ４
０ｍＭ ＮａＡＳ０４； １ｍＭ ＮＡＤＰ”；５ｍＭ
Ｌ−スレオニン：１．３ｍＭアスパルチル−β−セ
ミアルデヒド及び種々の量の酵素調剤を全容量１１中に
含有する。μｌ’ｌ／ｊＯｔ／〜・分（Ｕ／〜）で示し
た活性を測光法（ΔＥ５４０ｎｍ）により測定したＮＡ
［ＪＰＨ合成速度を介して計算する。
９５１年）又Ｈブ７７ドフオード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ；
Ａｎａｌ、 Ｂｌｏｃｈｅｍ、 ＩＥ ７２巻、第
２４８頁、１９７６年）の方法により実旅した。アスパ
ルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼテスト
Ｈ１２ｏｍＭジェタノールアミン（ｐＨ９，０）； ４
０ｍＭ ＮａＡＳ０４； １ｍＭ ＮＡＤＰ”；５ｍＭ
Ｌ−スレオニン：１．３ｍＭアスパルチル−β−セ
ミアルデヒド及び種々の量の酵素調剤を全容量１１中に
含有する。μｌ’ｌ／ｊＯｔ／〜・分（Ｕ／〜）で示し
た活性を測光法（ΔＥ５４０ｎｍ）により測定したＮＡ
［ＪＰＨ合成速度を介して計算する。
第１着はＣ，グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２及びυ〜
＋５８−１の同じに培養し、かつ処理した細胞の粗抽出
物中の両方の酵素の％異的酵素活性を示す。両方の菌株
のアスパルテート−キナーゼに関する比較可能な含量の
他に、ＡＥＣ耐性突然変異体り藺５８−１は野生型に比
較して約５倍高められたアスパルチル−β−セミアルデ
ヒド−デヒドロゲナーゼ活性を有する。
＋５８−１の同じに培養し、かつ処理した細胞の粗抽出
物中の両方の酵素の％異的酵素活性を示す。両方の菌株
のアスパルテート−キナーゼに関する比較可能な含量の
他に、ＡＥＣ耐性突然変異体り藺５８−１は野生型に比
較して約５倍高められたアスパルチル−β−セミアルデ
ヒド−デヒドロゲナーゼ活性を有する。
１．３
Ｃ，グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２及びＤＩＶ１５８
−１からのアスパルテート−キナーゼの試験管内抑制性 第１％は、すでにに、ナカヤマ船（Ｋ、ナカヤマ表、Ａ
ｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、第３０巻、第６１
１頁、１９６６年）により示唆され、かつＳ。
−１からのアスパルテート−キナーゼの試験管内抑制性 第１％は、すでにに、ナカヤマ船（Ｋ、ナカヤマ表、Ａ
ｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、第３０巻、第６１
１頁、１９６６年）により示唆され、かつＳ。
Ｎ、 カーｙ−ムルｆ年（Ｓ、 Ｎ、にａｒａ−Ｍｕｒ
ｚａ。
ｚａ。
Ｐｒ１ｋｌａｄｎａｙａ Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ ；Ｍ
ｉｋｒｏｂｉｏｌ。
ｉｋｒｏｂｉｏｌ。
ｇｉａ、第１４巻、第３４５頁、１９７８年）により更
に正確に笑験されたし、グルタミクム野生型か素の抑制
性が我々により←抄されることができたを示す。これに
対して、アスパルテート−キナーゼがもはや協調してＬ
−Ｉ＋ジン＋Ｌ−スレオニンにより抑制可能でないＡ
ＥＣ耐性突然変異細胞Ｄｋ１５８−１の酵素の明らかに
異なる性質を示す。ＡＴＣＣ１３０３２からの酸素にリ
ジン−類似に作用する物質Ｓ−アミノエチル−〇、Ｌ−
システィン（ＡＥＣ）により、突然変異体の酵素は同ト
に僅かに影響をうけるにすぎない。
に正確に笑験されたし、グルタミクム野生型か素の抑制
性が我々により←抄されることができたを示す。これに
対して、アスパルテート−キナーゼがもはや協調してＬ
−Ｉ＋ジン＋Ｌ−スレオニンにより抑制可能でないＡ
ＥＣ耐性突然変異細胞Ｄｋ１５８−１の酵素の明らかに
異なる性質を示す。ＡＴＣＣ１３０３２からの酸素にリ
ジン−類似に作用する物質Ｓ−アミノエチル−〇、Ｌ−
システィン（ＡＥＣ）により、突然変異体の酵素は同ト
に僅かに影響をうけるにすぎない。
第１衣
Ｃ，グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２及びＤ〜１５８−
１からのアスパルテート−キナーゼ（八に）及びアスパ
ルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ＡＳ
Ａ−ＤＨ）の酵素含量及び特性菌株 ＡＫ（Ｌｌ／〜） ＡＳＡ−Ｌ）Ｈ ＡＴＣＣ１３０３２ ０，０１６ Ｍ５８−１ ０．０１１ 組合わせ １０ｍＭ ＡＥＣ １ＱｍｔｖｌＡＥｃ １００ｍＭＡＥＣ ＡＥに＝Ｓ−（アミノエテル）−Ｄ、Ｌ−システィン２
フィードバック耐性アスパルテート−キナーゼに関し
てコードするＣ、グルタミクＪ−菌株Ｄ〜１５８−１の
ＤＮＡ−フラグメントのクローン化 ｚｌ クローン化 全ＤＮＡｆチーｖｐ −（Ｃｈａｔｅｒ） 等Ｋｊ ？
）記載さレテイルＬ ウｉｃ （Ｃｈａｔｅｒ 苓、Ｃ
ｕｒｒ。
１からのアスパルテート−キナーゼ（八に）及びアスパ
ルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ＡＳ
Ａ−ＤＨ）の酵素含量及び特性菌株 ＡＫ（Ｌｌ／〜） ＡＳＡ−Ｌ）Ｈ ＡＴＣＣ１３０３２ ０，０１６ Ｍ５８−１ ０．０１１ 組合わせ １０ｍＭ ＡＥＣ １ＱｍｔｖｌＡＥｃ １００ｍＭＡＥＣ ＡＥに＝Ｓ−（アミノエテル）−Ｄ、Ｌ−システィン２
フィードバック耐性アスパルテート−キナーゼに関し
てコードするＣ、グルタミクＪ−菌株Ｄ〜１５８−１の
ＤＮＡ−フラグメントのクローン化 ｚｌ クローン化 全ＤＮＡｆチーｖｐ −（Ｃｈａｔｅｒ） 等Ｋｊ ？
）記載さレテイルＬ ウｉｃ （Ｃｈａｔｅｒ 苓、Ｃ
ｕｒｒ。
Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、第９
６巻、第６９頁、１９８２年）単離し、部分的に制限酵
素ＰＳｔｌ で消イヒする。ドイツ特許出願第３７３
７７２９、９号明細舎中に記載されているベクターｐａ
ｌ（第１図）をＰＳｔｌで＠緑とし、アルカリ性ホスフ
ァターゼで処理することにより脱ホスホリル化する。ベ
クターＤＮＡとＤＭ５８−１ＤＮＡを混合し、？ ＝
７−ｙ−イｘ （Ｍａｎｉａｔｉｓ）箒により記載され
ているように（Ｍａｎｉａｔｉｓ、■、勢著、〜＋ｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｆｖ＋ａｎｕａ１％Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２年）
Ｔ４ＬｊＮＡ−リガーゼで処理した。Ｃ，グルタミクム
ＡＴ（、Ｃ１３０３２の連結混合物を用いる形質転換は
ティーヤバツハ（Ｔｈ１ｅｒｂａｃｈ）苓により記載さ
れている！ ウＫ （Ｔｈ １ｅｒｂａｃｈ 、 Ｇ、
智者、Ａｐｐｌｉｅｄ ｆｖ＋ｌｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ、 第２
９巻、第３５６頁、１ｇ８８年）実施した。
６巻、第６９頁、１９８２年）単離し、部分的に制限酵
素ＰＳｔｌ で消イヒする。ドイツ特許出願第３７３
７７２９、９号明細舎中に記載されているベクターｐａ
ｌ（第１図）をＰＳｔｌで＠緑とし、アルカリ性ホスフ
ァターゼで処理することにより脱ホスホリル化する。ベ
クターＤＮＡとＤＭ５８−１ＤＮＡを混合し、？ ＝
７−ｙ−イｘ （Ｍａｎｉａｔｉｓ）箒により記載され
ているように（Ｍａｎｉａｔｉｓ、■、勢著、〜＋ｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｆｖ＋ａｎｕａ１％Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２年）
Ｔ４ＬｊＮＡ−リガーゼで処理した。Ｃ，グルタミクム
ＡＴ（、Ｃ１３０３２の連結混合物を用いる形質転換は
ティーヤバツハ（Ｔｈ１ｅｒｂａｃｈ）苓により記載さ
れている！ ウＫ （Ｔｈ １ｅｒｂａｃｈ 、 Ｇ、
智者、Ａｐｐｌｉｅｄ ｆｖ＋ｌｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ、 第２
９巻、第３５６頁、１ｇ８８年）実施した。
第１図はプラスミドｐｚ１の制限地図である。
太イ？＠ｎ ｐｈ ｌＶ＋ ：１５１９ 部分’ｃ 示
Ｌ、１ＬＪｉ５ｉｉｊｐＺＩＲ１ のｐＡｃＹｃ１７７部分を示す。Ａｐ 、アンピシリン
耐性遺伝子；ＫｍＲ；カナマイシン耐性遺伝子。
Ｌ、１ＬＪｉ５ｉｉｊｐＺＩＲ１ のｐＡｃＹｃ１７７部分を示す。Ａｐ 、アンピシリン
耐性遺伝子；ＫｍＲ；カナマイシン耐性遺伝子。
形質転換混合物をカナマイシン３００μノ／１を有する
ＲＣＧ／ヒー寒天培地上に塗り、この慈天培地を１週間
３０℃で０温保持した。引き続きこの寒天培地を５０ｍ
ＭＡＥＣ及び５０ｍＭＬ−スレオニンを含有するｔｖ＋
ｆＶｌ−寒天培地（カツマタ、８１本、Ｊ、Ｂａｃｔ
、第１５９巻、第３０６頁、１９８４年）土にスタンス
を押すように木し、１日間３０℃で培養した。この給入
上でが：長することのできたコロニーを０加的にＡＥＣ
，Ｌ−スレオニン及びカナマイシフ１０μノ１Ｉｌｌを
含有するＭ ｔｖ＋−寒天上に塗布し、個別のコロニー
を得る。プラスミドＬ）ＮＡをこの種のクローンから単
離し、ｐＣＳ２と名づけ、Ｃ。
ＲＣＧ／ヒー寒天培地上に塗り、この慈天培地を１週間
３０℃で０温保持した。引き続きこの寒天培地を５０ｍ
ＭＡＥＣ及び５０ｍＭＬ−スレオニンを含有するｔｖ＋
ｆＶｌ−寒天培地（カツマタ、８１本、Ｊ、Ｂａｃｔ
、第１５９巻、第３０６頁、１９８４年）土にスタンス
を押すように木し、１日間３０℃で培養した。この給入
上でが：長することのできたコロニーを０加的にＡＥＣ
，Ｌ−スレオニン及びカナマイシフ１０μノ１Ｉｌｌを
含有するＭ ｔｖ＋−寒天上に塗布し、個別のコロニー
を得る。プラスミドＬ）ＮＡをこの種のクローンから単
離し、ｐＣＳ２と名づけ、Ｃ。
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の形質転換のために使
用する。審査したカナマイシン耐性突然倹異体６２のう
ち５９は５０ｍ〜＋ＡＥＣ及び５０ｍＭＬ−スレオニン
による抑制に対して耐性であることが判明した。このプ
ラスミドｐＣ３２を更に制限地図に書くことにより％色
付けした。これは長さ６．９ｋｂを有するベクターｐｚ
１のＰｓｔ Ｉ−ν・断位中に長さ約９．９ｋｂの挿
入体を有する。ｐＣＳ２の制限地図を第２図中に示す。
用する。審査したカナマイシン耐性突然倹異体６２のう
ち５９は５０ｍ〜＋ＡＥＣ及び５０ｍＭＬ−スレオニン
による抑制に対して耐性であることが判明した。このプ
ラスミドｐＣ３２を更に制限地図に書くことにより％色
付けした。これは長さ６．９ｋｂを有するベクターｐｚ
１のＰｓｔ Ｉ−ν・断位中に長さ約９．９ｋｂの挿
入体を有する。ｐＣＳ２の制限地図を第２図中に示す。
第２図はシラスミドｐＣＳ２の直線形での制限地図であ
る。図面の上部は種々の制限切断位の位置を再たび示す
。図面の下部中にはプラスミドｐＣ３２の種々の領域が
示されている。Ｄ ｆｖ＋ ５８−ｌＤＮＡの挿入は白
地の部分として示されている。ｐＺｌのアンピシリン耐
性遺伝子に黒く目たたせてｈｖ、カナマイシン耐性遺伝
子は点で示した。ｐＣＳ２のその他のｐＺｌ一部分は斜
線で示シタ。略語： ＢａｍＨ７，Ｂ ； Ｂｃｌｌ、
Ｃ；Ｓａｌ Ｌ Ｓ ； Ｓｃａ、Ａ ； Ｓｍ
ａ Ｌ 〜＋ ； Ｘｈｏ Ｉ。
る。図面の上部は種々の制限切断位の位置を再たび示す
。図面の下部中にはプラスミドｐＣ３２の種々の領域が
示されている。Ｄ ｆｖ＋ ５８−ｌＤＮＡの挿入は白
地の部分として示されている。ｐＺｌのアンピシリン耐
性遺伝子に黒く目たたせてｈｖ、カナマイシン耐性遺伝
子は点で示した。ｐＣＳ２のその他のｐＺｌ一部分は斜
線で示シタ。略語： ＢａｍＨ７，Ｂ ； Ｂｃｌｌ、
Ｃ；Ｓａｌ Ｌ Ｓ ； Ｓｃａ、Ａ ； Ｓｍ
ａ Ｌ 〜＋ ； Ｘｈｏ Ｉ。
０
２．２ ７スバルテートーキナーゼー活性の特弔付は
アスパルテート−キナーゼ−活性を菌株ＡＴＣＣ１３０
３２／１）Ｃ５２中で測定したが、この際プラスの対照
として菌株０Ｍ５８−１中で、かつマイナスの対照とし
て菌株ＡＴＣＣ１３０３２中でこの活性を測定した。こ
のト°目株をグルコース４ノ／１．カナマイシン１０μ
ノ／紅及びｆＶ１ｇｃｔ２１ｍ藺を追加した標準Ｉブイ
ヨン中で培養した。培養条件、細胞収穫、細胞破砕及び
７ス／４’ルテートーキナーゼの測定は１．２に記載し
たように実施した。有効物質Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｔｈｒ及
びＡＥＣＨそれぞれＰｌｉ ７．５ （Ｄ １００ ｍ
Ｍトリス／ＨＣ１緩衝沿中の原計として使用する。
３２／１）Ｃ５２中で測定したが、この際プラスの対照
として菌株０Ｍ５８−１中で、かつマイナスの対照とし
て菌株ＡＴＣＣ１３０３２中でこの活性を測定した。こ
のト°目株をグルコース４ノ／１．カナマイシン１０μ
ノ／紅及びｆＶ１ｇｃｔ２１ｍ藺を追加した標準Ｉブイ
ヨン中で培養した。培養条件、細胞収穫、細胞破砕及び
７ス／４’ルテートーキナーゼの測定は１．２に記載し
たように実施した。有効物質Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｔｈｒ及
びＡＥＣＨそれぞれＰｌｉ ７．５ （Ｄ １００ ｍ
Ｍトリス／ＨＣ１緩衝沿中の原計として使用する。
ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣ３２からの酵゛素のアスパル
テート−キナーゼ含量及び抑制性を第４玉に示す。この
菌株が全く高められた特異的活性を示さないにもかかわ
らず、前記抑制物質に対する明らかな鋭敏感性を証明す
ることができた。ただしその程度は遺伝子供給体Ｄｋ＋
５８−１からの１素の抑制解除の度合には遅しない（部
分的抑制解除）。
テート−キナーゼ含量及び抑制性を第４玉に示す。この
菌株が全く高められた特異的活性を示さないにもかかわ
らず、前記抑制物質に対する明らかな鋭敏感性を証明す
ることができた。ただしその程度は遺伝子供給体Ｄｋ＋
５８−１からの１素の抑制解除の度合には遅しない（部
分的抑制解除）。
２．３ し−リジン−分泌の測定
リジンを分泌する能力を菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣ
３２において測定し、かつ菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ
Ｚｌ中でマイナス対照として測定した。カナマイシン１
０μＩＩＰ／Ｍｌの添加後、該培養を下記のように実施
した。実験の結果を第２表中にまとめる。
３２において測定し、かつ菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ
Ｚｌ中でマイナス対照として測定した。カナマイシン１
０μＩＩＰ／Ｍｌの添加後、該培養を下記のように実施
した。実験の結果を第２表中にまとめる。
第２夛
れ々のＣ，グルタミクＪ、に株によるＬ−リジンの分泌
ＡＴＣＣ１３０３２／ｐｚ１
０．０
隔壁を備える１００ＩＩ７三角フラスコをこの除法の培
地１０ｍで満たす：切酸アンモニウム１２ノ／ｌ、糖蜜
２４０ＪＩＰ／ｌ、大豆粉加水分解物５ Ｑ ｒｔｒｌ
／ ｌ及びＣａＣ０，ｌＯ？／１０１棟した後、この
培養体を３０°ｃ、５ｏｏｒ、ｐ。
地１０ｍで満たす：切酸アンモニウム１２ノ／ｌ、糖蜜
２４０ＪＩＰ／ｌ、大豆粉加水分解物５ Ｑ ｒｔｒｌ
／ ｌ及びＣａＣ０，ｌＯ？／１０１棟した後、この
培養体を３０°ｃ、５ｏｏｒ、ｐ。
ｍで７２時間恒温保持する。リジン測距は遠心分離上澄
液中でアミノ酸分析装置を用いて行なった。
液中でアミノ酸分析装置を用いて行なった。
３、 フィード・バック耐性アスパルテートーキナーゼ
に曲してコードするｐにＳ２のＤＮＡ −フラグメント
の欠失地図化 低いＬＩＮＡ濃度において、ｐＣＳ２を種々の制限ヒ素
で完全に、又は部分的に消什し、引き続＠Ｔ４ＤＮＡ−
リガーゼで処理することにより神々の欠失Ｐ一体を製造
した。〜々の欠失か導体の製造は第３夛′中にまとめら
れており、権々のＦか体中の欠失の位１ｍを第３図中に
示す・第３図中にはＣ，グルタミクムＡＴＣＣ１３０３
２から訃濤さｈた菌株のＡＥＣに対する耐性挙動が示さ
れている。このようにしてＡＥＣ−耐性を示すＤＮＡ−
城はプラスミドルＣＳ２３３中のＰｓｔＩ−クローン化
切断位とＥｃｏＲＩ−切断位により限定される長さ約１
．５ｋｂのフラグメント上に限定される。
に曲してコードするｐにＳ２のＤＮＡ −フラグメント
の欠失地図化 低いＬＩＮＡ濃度において、ｐＣＳ２を種々の制限ヒ素
で完全に、又は部分的に消什し、引き続＠Ｔ４ＤＮＡ−
リガーゼで処理することにより神々の欠失Ｐ一体を製造
した。〜々の欠失か導体の製造は第３夛′中にまとめら
れており、権々のＦか体中の欠失の位１ｍを第３図中に
示す・第３図中にはＣ，グルタミクムＡＴＣＣ１３０３
２から訃濤さｈた菌株のＡＥＣに対する耐性挙動が示さ
れている。このようにしてＡＥＣ−耐性を示すＤＮＡ−
城はプラスミドルＣＳ２３３中のＰｓｔＩ−クローン化
切断位とＥｃｏＲＩ−切断位により限定される長さ約１
．５ｋｂのフラグメント上に限定される。
ノジンもしくｔ／１ＡＥＣ及びスレオニンの混合物によ
り、アスパルテート−キナーゼ−活性及び酵素活性の抑
制性は構成されたクローン中で測定された。培養、破砕
及び活性測定を前記のように実施した。更に、Ｌ−リジ
ンを分泌する能力ｆｐＪ々のクローンについて調べた。
り、アスパルテート−キナーゼ−活性及び酵素活性の抑
制性は構成されたクローン中で測定された。培養、破砕
及び活性測定を前記のように実施した。更に、Ｌ−リジ
ンを分泌する能力ｆｐＪ々のクローンについて調べた。
このためにはＣ，グルタミクムのし一すジン要求性指示
酬株を用いる寒天プレート拡散テス）ｆ使用した。第４
皆からは、すべてのＡＥＣ酎性耐株が部分的に抑制解除
されたアスノ＋ルテートーキナーゼー活性を有し、かつ
Ｌ −ＩＩレジン分泌することができることがわかる。
酬株を用いる寒天プレート拡散テス）ｆ使用した。第４
皆からは、すべてのＡＥＣ酎性耐株が部分的に抑制解除
されたアスノ＋ルテートーキナーゼー活性を有し、かつ
Ｌ −ＩＩレジン分泌することができることがわかる。
第３表
プラスミドｐｃＳ２の種々の欠失トネ体の製造及びＡ
Ｅ ＣＲ／ Ｓ−依胡型 により製造 ｐＣＳ２１ＢａｍＨＩ及びＢｃｌｌで消化することによ
Ｖ製造 １）Ｃ３２を５ａｌＩで部分消化することにより製造 ｐ（、，５２をＸｈｏＩで部分牟化することにより製造 ｐＣＳ２を５ＣａＩでＹｉ化することにより製造 ｐＣＳ２３をＰｓｔＩで部分消化することにより製造 ｐＣＳ２３２ｐＣ３２３をり、１ｒ ａ Ｉ”１３分？
’ｒ’（ｔ、ｊルコとにより製造 ρＣｂ２３をＬｃｏＲＩで部分箱イｉすることによ仄製
造 ｃｓ２３３ ｃｓ２６ Ｃ５２２ ｃｓ２３１ ｃｓ２４ Ｃ５２３ Ｒ＝耐性 Ｓ＝敏感 第３図はプラスミドｐＣ３２の欠失地図である。
Ｅ ＣＲ／ Ｓ−依胡型 により製造 ｐＣＳ２１ＢａｍＨＩ及びＢｃｌｌで消化することによ
Ｖ製造 １）Ｃ３２を５ａｌＩで部分消化することにより製造 ｐ（、，５２をＸｈｏＩで部分牟化することにより製造 ｐＣＳ２を５ＣａＩでＹｉ化することにより製造 ｐＣＳ２３をＰｓｔＩで部分消化することにより製造 ｐＣＳ２３２ｐＣ３２３をり、１ｒ ａ Ｉ”１３分？
’ｒ’（ｔ、ｊルコとにより製造 ρＣｂ２３をＬｃｏＲＩで部分箱イｉすることによ仄製
造 ｃｓ２３３ ｃｓ２６ Ｃ５２２ ｃｓ２３１ ｃｓ２４ Ｃ５２３ Ｒ＝耐性 Ｓ＝敏感 第３図はプラスミドｐＣ３２の欠失地図である。
図面の上方はｐＣＳ２から誘導されたト導体を示し、下
方はｐＣ３２３から誘導された訃導体を示す。ｐｚｌの
アンピシリン耐性遺伝子は黒く示さねており、カナマイ
シン耐性遺伝子は点で示されている； ｐＣＳ２の他の
９２１部分は斜線により示されている。ＤＭ５８− ｌ
ＤＮＡの挿入は白地の帯状に示されている。欠失は線
として示した。略＠： ＳａｍＨ１，Ｂ ； Ｂｃｌｌ
、Ｃ；Ｄｒａｌ。
方はｐＣ３２３から誘導された訃導体を示す。ｐｚｌの
アンピシリン耐性遺伝子は黒く示さねており、カナマイ
シン耐性遺伝子は点で示されている； ｐＣＳ２の他の
９２１部分は斜線により示されている。ＤＭ５８− ｌ
ＤＮＡの挿入は白地の帯状に示されている。欠失は線
として示した。略＠： ＳａｍＨ１，Ｂ ； Ｂｃｌｌ
、Ｃ；Ｄｒａｌ。
Ｄ ；ＥｃｏＲｌ、 Ｅ ；Ｓａ ｌ Ｉ、 Ｓ ；Ｓ
ｃａ Ｉ、 Ａ ；ＳｍａＩ。
ｃａ Ｉ、 Ａ ；ＳｍａＩ。
Ｍ；ＸｈｏＩ、Ｘ。
第４衣
ｇ換ｃ、グルタミクム菌株の微生物学的及び生化学的特
徴 ４、表歩型ＡＥＣ−耐性を示す、プラスミドｐにＳ２４
のＤＮＡ−フラグメントの配列決定４、１ 配列決定
法 ２１ｋｂ ｏＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ−ＤＮＡ−７ラグ）ン
トのヌクレオチド配列をマクサム及びギルパートノ方法
（Ｍａｘａｍ、 Ａ、 Ｍ、等著、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
。
徴 ４、表歩型ＡＥＣ−耐性を示す、プラスミドｐにＳ２４
のＤＮＡ−フラグメントの配列決定４、１ 配列決定
法 ２１ｋｂ ｏＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ−ＤＮＡ−７ラグ）ン
トのヌクレオチド配列をマクサム及びギルパートノ方法
（Ｍａｘａｍ、 Ａ、 Ｍ、等著、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ第７４巻、５６０−５６
４１．１９７７年）によＦ）７−ノルド（ａｒｎｏｌｄ
）及びビューラ−（Ｐｕｂｌｅｒ ）Ｏｆ法（Ａｒｎｏ
ｌｄ、 Ｖｖ、 ％、Ｇｅｎｅ、 第７０巻、第１
７１頁以降、１９８８年）で測定した。配列決定のため
のサブクローン化はこの際シラスミドｐＣ３２４（第４
図）から出発した。これらは大腸菌Ｍν１２９４（〜１
ｅｒｅＩｓｏｎ Ｍ、 婢著、ＮａｔＬＩｒｅ第２１７
頁、第１１１０〜１１１４頁、１９６８年）により形質
転換され、相応する７ラグメントを配列決定ベクターρ
５ＶＢ２１．２５及び２６ （Ａｒｎｏｌｄ、Ｗ。
４１．１９７７年）によＦ）７−ノルド（ａｒｎｏｌｄ
）及びビューラ−（Ｐｕｂｌｅｒ ）Ｏｆ法（Ａｒｎｏ
ｌｄ、 Ｖｖ、 ％、Ｇｅｎｅ、 第７０巻、第１
７１頁以降、１９８８年）で測定した。配列決定のため
のサブクローン化はこの際シラスミドｐＣ３２４（第４
図）から出発した。これらは大腸菌Ｍν１２９４（〜１
ｅｒｅＩｓｏｎ Ｍ、 婢著、ＮａｔＬＩｒｅ第２１７
頁、第１１１０〜１１１４頁、１９６８年）により形質
転換され、相応する７ラグメントを配列決定ベクターρ
５ＶＢ２１．２５及び２６ （Ａｒｎｏｌｄ、Ｗ。
等、Ｇｅｎｅ 、第７０巻、第１７１頁以降、１９８８
年）中でクローン化した。大！＆徊株Ｊ ｔｖ＋ ８３
（Ｍｅｓｓｉｎｇ Ｊ、 Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｕｔ
Ｄ Ｎ ＡＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＡ７９〜９９、第２巻
、第４３〜４８頁、１９７９年）中でＸＧａ ｌ−テス
ト（５−ブロモ−牛−クロルーインドリルーβ−Ｄ−ガ
２クトビラノシド）により挿入不活化を証明することが
できた。
年）中でクローン化した。大！＆徊株Ｊ ｔｖ＋ ８３
（Ｍｅｓｓｉｎｇ Ｊ、 Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｕｔ
Ｄ Ｎ ＡＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＡ７９〜９９、第２巻
、第４３〜４８頁、１９７９年）中でＸＧａ ｌ−テス
ト（５−ブロモ−牛−クロルーインドリルーβ−Ｄ−ガ
２クトビラノシド）により挿入不活化を証明することが
できた。
配列決定計画を第４図に示す。ヌクレオチド配列を重な
りあうクローンを有する両方のＤＮＡ−鎖により調べた
。
りあうクローンを有する両方のＤＮＡ−鎖により調べた
。
第４図はプラスミドｐＣＳ２の染色体フラグメントの欠
失分析及び配列決定計画を示す図である。
失分析及び配列決定計画を示す図である。
欠失分析ニブラスミドｐＣＳ２３及びｐＣＳ２４はクロ
ーンｐＣ３２と同様にＡＥＣ−耐性とリジン生産を示す
。斜線の帯はプラスミドのベクタ一部をボす。
ーンｐＣ３２と同様にＡＥＣ−耐性とリジン生産を示す
。斜線の帯はプラスミドのベクタ一部をボす。
配列決定計画：シラスミドｐＣ３２４の２．１ｋｂＰｓ
ｔＩ−ＸｈｏＩ−７ラダメントを示した制限し、断位で
サブクローン化した。矢印は配列決定した領域と読み則
り方向を示す。酵素ＤｒａＩ（Ｄ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）
、Ｂｇｌｌ（Ｇ）、ＨｉｎｄＩ［Ｉ（Ｈ）、Ｎａｅｌ（
Ｎ）、ＰＳｔＩ（Ｐ）、５ａｌｌ（Ｓ）及びＸｈｏ Ｉ
（Ｘ ）の制限切断位を書き入れた。その下には２つ
の開放醗み耳・シ枠が示されており、これらはアスパル
テート−キナーゼのサブユニット及びアスノンルテート
ーβ−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼに関してコー
ドする。
ｔＩ−ＸｈｏＩ−７ラダメントを示した制限し、断位で
サブクローン化した。矢印は配列決定した領域と読み則
り方向を示す。酵素ＤｒａＩ（Ｄ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）
、Ｂｇｌｌ（Ｇ）、ＨｉｎｄＩ［Ｉ（Ｈ）、Ｎａｅｌ（
Ｎ）、ＰＳｔＩ（Ｐ）、５ａｌｌ（Ｓ）及びＸｈｏ Ｉ
（Ｘ ）の制限切断位を書き入れた。その下には２つ
の開放醗み耳・シ枠が示されており、これらはアスパル
テート−キナーゼのサブユニット及びアスノンルテート
ーβ−セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼに関してコー
ドする。
４．２ ２．１ｋｂ ＯＦ’５ｔＩ−ＸｈｏＩ−ＤＮＡ
フラグメントのＤＮＡ配列 ＾・列決定されるＤＮＡ−片は長さ２１１２ｂｐテアル
。こｈｕ＞素Ｂｇ１ｍ、Ｌ）ｒａＩ、ＥｃｏＲＬＨｉｎ
ｄＩ［Ｉ、Ｉ’１ａｅ１． Ｐｓ ｔ Ｉ、 Ｓａ ｌ
Ｉ及びＸｈｏＩに関する制限９．断位を有し、これら
を用いてサブクローンを製造した（第５図）。ヌクレオ
チド＾［列を自「列分析−プログラムパックＡＮＡＬＹ
ＳＥ Ｑ （５ｔａｃｉｅｎ 、 Ｒ，等著、Ｎｕｃｌ
、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
フラグメントのＤＮＡ配列 ＾・列決定されるＤＮＡ−片は長さ２１１２ｂｐテアル
。こｈｕ＞素Ｂｇ１ｍ、Ｌ）ｒａＩ、ＥｃｏＲＬＨｉｎ
ｄＩ［Ｉ、Ｉ’１ａｅ１． Ｐｓ ｔ Ｉ、 Ｓａ ｌ
Ｉ及びＸｈｏＩに関する制限９．断位を有し、これら
を用いてサブクローンを製造した（第５図）。ヌクレオ
チド＾［列を自「列分析−プログラムパックＡＮＡＬＹ
ＳＥ Ｑ （５ｔａｃｉｅｎ 、 Ｒ，等著、Ｎｕｃｌ
、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
第１４巻、第２１７〜２３２頁、１９８６年）で処理し
た。
た。
配列決定しＮＡ−片上にＩ／′ｉ２本の長い開放読みん
す粋（（ＪＲＦ）が存在する。両方ともＰｓｔＩ−切断
位から×ｈＯ！−切断位の間に配置されている。両方の
間にＦｉ２ａｂｐの小さい領琥のみが存在する。すメソ
ーム結合位（ＲＢＳ）が第２０ＲＦの前に存在する。同
材に第１（ＪＲＦの中にＲＢＳが局在する（開始コドン
ＧＴＧを有するＡＧＧＡ、２６８〜２７１）。０ｋＦ１
はＰＳｔＩ−切断位から計算してアミノ醗（ＡＳ）２６
４の長さを有し、内部ＲＢＳから１７２ＡＳ （１８，
６ｋＤａｌに相応する）の長さを有する。０ＨＦ２は３
４２ＡＳ（ａ６．１ｋＤａｌ）ｔｖ長サすアル。
す粋（（ＪＲＦ）が存在する。両方ともＰｓｔＩ−切断
位から×ｈＯ！−切断位の間に配置されている。両方の
間にＦｉ２ａｂｐの小さい領琥のみが存在する。すメソ
ーム結合位（ＲＢＳ）が第２０ＲＦの前に存在する。同
材に第１（ＪＲＦの中にＲＢＳが局在する（開始コドン
ＧＴＧを有するＡＧＧＡ、２６８〜２７１）。０ｋＦ１
はＰＳｔＩ−切断位から計算してアミノ醗（ＡＳ）２６
４の長さを有し、内部ＲＢＳから１７２ＡＳ （１８，
６ｋＤａｌに相応する）の長さを有する。０ＨＦ２は３
４２ＡＳ（ａ６．１ｋＤａｌ）ｔｖ長サすアル。
０ＲＦ２のすぐ後方には可能な転写終結構造、いわゆる
ヘヤビンループが存在し、多くのチミン基が続＜ （１
８６４〜１９００）。この配置は大腸菌及び他のを種牛
のρ−独立終結シグナルに特徴的である（ Ａｈｙｄａ
等著、Ａｎｎ、 Ｒｅｖ。
ヘヤビンループが存在し、多くのチミン基が続＜ （１
８６４〜１９００）。この配置は大腸菌及び他のを種牛
のρ−独立終結シグナルに特徴的である（ Ａｈｙｄａ
等著、Ａｎｎ、 Ｒｅｖ。
Ｂｉｃｈｅｍ、第４７巻、第９６７頁〜９９６頁、１９
７８年）。ここに存在するターミネータ−は３０℃で−
４０ｋｃａｌ／ｍｏｔｈり大きい安定性を有する。
７８年）。ここに存在するターミネータ−は３０℃で−
４０ｋｃａｌ／ｍｏｔｈり大きい安定性を有する。
０ＲＦ２に可能なプロモーター１１０ＲＦ１の中に見い
出される（４０９〜４３７、ＴＴＧＡＣＡ−１７ｂｐ−
ＴＡＴＴＣＴ）。−３５−領域及び−１０−領域への間
隔はまさに大腸菌共通プロモーターに相ｋ、Ｌ （Ｈａ
ｗｌｅｙ、 Ｄ、に、等著、Ｎｕｃ ｌ、 Ａｃ １ｄ
ｓＲｅｓ、ｉｌ１巻、第２２３７〜２２５５頁、１９８
３年）、この−１０−領域は大腸缶尖通域（ＴＡＴＡＡ
Ｔ ’）に非常に似ている。
出される（４０９〜４３７、ＴＴＧＡＣＡ−１７ｂｐ−
ＴＡＴＴＣＴ）。−３５−領域及び−１０−領域への間
隔はまさに大腸菌共通プロモーターに相ｋ、Ｌ （Ｈａ
ｗｌｅｙ、 Ｄ、に、等著、Ｎｕｃ ｌ、 Ａｃ １ｄ
ｓＲｅｓ、ｉｌ１巻、第２２３７〜２２５５頁、１９８
３年）、この−１０−領域は大腸缶尖通域（ＴＡＴＡＡ
Ｔ ’）に非常に似ている。
第５図ｉ”ｊ２．ｌ ｋｂ ノＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ−７
ラクメントのＤＮＡ配列及び訃導されたアミノ酸配列の
図である。０ＲＦＩ（１〜７９４）及び０ＲＦ２（８２
１〜１８４６’）のアミノ酸配列に関してＦ１３文字コ
ードを記載した。ＤＮＡ鎖の下の数字はＤＮＡ−配列に
関して示す。配列決足のために使用したクローン化９１
断位は同様に下に記載した。
ラクメントのＤＮＡ配列及び訃導されたアミノ酸配列の
図である。０ＲＦＩ（１〜７９４）及び０ＲＦ２（８２
１〜１８４６’）のアミノ酸配列に関してＦ１３文字コ
ードを記載した。ＤＮＡ鎖の下の数字はＤＮＡ−配列に
関して示す。配列決足のために使用したクローン化９１
断位は同様に下に記載した。
ＩＪ ＆ソーム結合位は星印で、開始コドンは矢印（−
→）で、かつターミネータ−構造は線（−）により記載
した。
→）で、かつターミネータ−構造は線（−）により記載
した。
４．３ アミノ酸Ｎ「列の分析
０ＲＦｌ及びＱＲＦ２から翻訳されたアミノ酸配列を大
＆ｌＥ＋からのアスパルテート−キナーゼ（Ａに）Ｉ（
２）公知配列（Ｃａ５ｓａｎ、 Ｍ、本署、Ｊ、 Ｂｉ
ｏｌ。
＆ｌＥ＋からのアスパルテート−キナーゼ（Ａに）Ｉ（
２）公知配列（Ｃａ５ｓａｎ、 Ｍ、本署、Ｊ、 Ｂｉ
ｏｌ。
Ｃｈｅｍｌ、第２６１巻、第１０５２〜１０５７頁、１
９８６年）及びＢ、ズブチリｘ （Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
から（ＤＡＫＭ７）公知配列（Ｃｈｅｎ、 Ｎ、 −Ｙ
、 Ｉｋ著、Ｊ。
９８６年）及びＢ、ズブチリｘ （Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
から（ＤＡＫＭ７）公知配列（Ｃｈｅｎ、 Ｎ、 −Ｙ
、 Ｉｋ著、Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、第２６２巻、第８７３７〜２２５
５頁、１９８７年）もしくは大腸菌のアスバルテートセ
ミアルデヒドーデヒドログナーゼ（ＡＳＡ−ＤＨ）（Ｄ
ＡＳ−配列（Ｈａｚｉｚａ、 Ｃ，本署、Ｅｍｂｏ Ｊ
、第１巻、第３７９〜３８４頁、１９８２年）及びスト
レプトコッカス・ムタン（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｕｔａｎ；Ｃａｒｄｉｎｅａｕ、 Ｇ、 Ａ、＃著
、Ｊ、 Ｂ ｉ ｏ １．Ｃｈｅｒ＋ｔ、第２６２巻、
第７号、第３３４４〜３３５３頁、１９８７年）と比較
する。このｔ、ニー メＫ Ｈプｏ ｙ ラＡ〜＋ＡＬ
ＩＧＮ（５ｏｂｅ ｌ 、Ｅ、 本署、Ｎｕｃｌ、Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、第１４巻、第３６３〜３７４頁、１
９８６年）及びＤＩＡＧＯＮ（Ｓｔａｄｅｎ、Ｒ０娯著
、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 、第１４巻、第
２１７〜２３２頁、１９８６年）を使用した。
５頁、１９８７年）もしくは大腸菌のアスバルテートセ
ミアルデヒドーデヒドログナーゼ（ＡＳＡ−ＤＨ）（Ｄ
ＡＳ−配列（Ｈａｚｉｚａ、 Ｃ，本署、Ｅｍｂｏ Ｊ
、第１巻、第３７９〜３８４頁、１９８２年）及びスト
レプトコッカス・ムタン（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｕｔａｎ；Ｃａｒｄｉｎｅａｕ、 Ｇ、 Ａ、＃著
、Ｊ、 Ｂ ｉ ｏ １．Ｃｈｅｒ＋ｔ、第２６２巻、
第７号、第３３４４〜３３５３頁、１９８７年）と比較
する。このｔ、ニー メＫ Ｈプｏ ｙ ラＡ〜＋ＡＬ
ＩＧＮ（５ｏｂｅ ｌ 、Ｅ、 本署、Ｎｕｃｌ、Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、第１４巻、第３６３〜３７４頁、１
９８６年）及びＤＩＡＧＯＮ（Ｓｔａｄｅｎ、Ｒ０娯著
、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 、第１４巻、第
２１７〜２３２頁、１９８６年）を使用した。
１方では０ＲＦＩとＡＫ−配列との間の、及び他方では
０ＲＦ２とＳ、ムタンのＡＳＡ−ＤＨ−配列との間の明
らかな一致が示された。大！＆菌ＡＳＡ−ＤＨに対して
は弱い相同性のみを示した、じっさいとくに活性中心の
領域中で示した（Ｈａｚｉｚａ、Ｃ１勢著、Ｅｍｂｏ
Ｊ、、第１巻、第３７９〜３８４貞、１９８２年）。
０ＲＦ２とＳ、ムタンのＡＳＡ−ＤＨ−配列との間の明
らかな一致が示された。大！＆菌ＡＳＡ−ＤＨに対して
は弱い相同性のみを示した、じっさいとくに活性中心の
領域中で示した（Ｈａｚｉｚａ、Ｃ１勢著、Ｅｍｂｏ
Ｊ、、第１巻、第３７９〜３８４貞、１９８２年）。
コンピューター分析から次のことが明らかになるニ
ー（ＪＲＦＩＨアスパルテート−キナーゼのＣ末端に和
えする、すなわちへ−末端の約１６０ＡＳ並ひに完全プ
ロモーター領域が欠失する。
えする、すなわちへ−末端の約１６０ＡＳ並ひに完全プ
ロモーター領域が欠失する。
−０ＲＦ２はアスパルテートセミアルデヒドーデヒドロ
グナーゼに相応する。
グナーゼに相応する。
０ＲＦＩとＢ、ズブチリス−ＡＫｌ［との相同は専門家
にとって目につくことである。ＡＫＩＩＩ／ｉ重なり合
うサブユニットからなる（ Ｃｈｅｎ 、 Ｎ、−Ｙ、
冬ｉ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、第２６２巻、第８７８
７〜８７９８頁、１９８７年）。この際、β−ヤブユニ
ットはα−サブユニットのＣ−末端に相斤、する。０Ｒ
ＦＩ中で見い出されるＲＢＳはその位貢で正確にこの八
にのＲＢＳと同一であるので、その結果Ｃ，グｈｐミｙ
ｂ （ｇｌｕｔａｍｉｃＬｒｎ）のＡにのクローンイ
ヒβ−サブユニットが存在するということが推論される
。
にとって目につくことである。ＡＫＩＩＩ／ｉ重なり合
うサブユニットからなる（ Ｃｈｅｎ 、 Ｎ、−Ｙ、
冬ｉ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、第２６２巻、第８７８
７〜８７９８頁、１９８７年）。この際、β−ヤブユニ
ットはα−サブユニットのＣ−末端に相斤、する。０Ｒ
ＦＩ中で見い出されるＲＢＳはその位貢で正確にこの八
にのＲＢＳと同一であるので、その結果Ｃ，グｈｐミｙ
ｂ （ｇｌｕｔａｍｉｃＬｒｎ）のＡにのクローンイ
ヒβ−サブユニットが存在するということが推論される
。
５、弁状実験
５１ 大＆ｉｉのａｓａ−及びＩｙｓＣ−マイナス菌株
の相袖性 ０ＲＦ２とａｓｄ−遺伝子との同一性はプラスミドｐＣ
３２とｐＣＳ２４によるａＳｄ−マイナス大腸菌株ＲＡ
ＳＡ６ （Ｒ１ｃｈａｕｄ、 Ｆ、 ％、Ｃ，ＨｌＡｃ
ａｄ。
の相袖性 ０ＲＦ２とａｓｄ−遺伝子との同一性はプラスミドｐＣ
３２とｐＣＳ２４によるａＳｄ−マイナス大腸菌株ＲＡ
ＳＡ６ （Ｒ１ｃｈａｕｄ、 Ｆ、 ％、Ｃ，ＨｌＡｃ
ａｄ。
Ｓｃ、Ｐａｒ ｉｓ、第２９３巻、第５０７〜５１２頁
、１９８１年）の相補性により証明されることができた
。ＡＳＡ−［：ＪＨのＣ−末端の約５０個のアミノ酸が
欠けているのでｐＣＳ２３は相和・性ではない。これら
のプラスミドのいずれもがＡＫＩ〜■マイナス大！！５
相ＧｉｆｌＱ５階＋１（Ｂｏｙ、 Ｅ、本署、Ｂ ｉ
ｏｃｈｅｍｉ ｅ、第６１巻、第１１５１〜１１６０頁
、１９７９年）を相補することができる立場ではなかっ
た。
、１９８１年）の相補性により証明されることができた
。ＡＳＡ−［：ＪＨのＣ−末端の約５０個のアミノ酸が
欠けているのでｐＣＳ２３は相和・性ではない。これら
のプラスミドのいずれもがＡＫＩ〜■マイナス大！！５
相ＧｉｆｌＱ５階＋１（Ｂｏｙ、 Ｅ、本署、Ｂ ｉ
ｏｃｈｅｍｉ ｅ、第６１巻、第１１５１〜１１６０頁
、１９７９年）を相補することができる立場ではなかっ
た。
５．２ｆｉｉ々のｐＣＳ２欠失誘導体を有する八■ＣＣ
ｌ３０３２の形質転換体中の特異的アスパルテートーキ
ナーゼ（ＡＫ ’）及びアスパルチル〜β−セミアルデ
ヒド−デヒドロゲナーゼ（ＡｓＡ−Ｌ）Ｈ）の測定 Ｌ）Ｍ５８−１からのＰｓ ｔ Ｉ −Ｘｈｏ Ｉ遺伝
子フラグメントがＩｙｓＣ遺伝子（八に）の１ｓのみ、
しかし完全なａＳａ−遺伝子を有するという、屯３にお
ける相同体比較からひき出された推論が酵素測定により
明らかに保証された。
ｌ３０３２の形質転換体中の特異的アスパルテートーキ
ナーゼ（ＡＫ ’）及びアスパルチル〜β−セミアルデ
ヒド−デヒドロゲナーゼ（ＡｓＡ−Ｌ）Ｈ）の測定 Ｌ）Ｍ５８−１からのＰｓ ｔ Ｉ −Ｘｈｏ Ｉ遺伝
子フラグメントがＩｙｓＣ遺伝子（八に）の１ｓのみ、
しかし完全なａＳａ−遺伝子を有するという、屯３にお
ける相同体比較からひき出された推論が酵素測定により
明らかに保証された。
ｐＣＳ２又はｐ ＣＳ ２ ｐ、、泌体で形袈転換した
Ｃ。
Ｃ。
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ｉ株は受容菌株に対し
て楠められたアスパルテート−キナーゼ活性を有する（
第４老第３欄）。
て楠められたアスパルテート−キナーゼ活性を有する（
第４老第３欄）。
これに対して、グラスミドがａＳ（ｊ−構造遺伝子を有
するすべての形質転換体中ではＡＳＡ−ＤＨの大過剰発
現が検出可能であった（第４蓼、第２欄、第、３及び第
４図）。プラスミドｐＣＳ２３とｐＣＳ２３−Ｕ、ｉ体
とは予期されていたようにＡＳＡ−ＤＨの過剰に％に導
びかない。ＡｓＡ−［ＪＨの高い崩壊性のために、特異
的活性から計算口］能な過剰弁ト、のファクターは３１
〜６５で揺れる。
するすべての形質転換体中ではＡＳＡ−ＤＨの大過剰発
現が検出可能であった（第４蓼、第２欄、第、３及び第
４図）。プラスミドｐＣＳ２３とｐＣＳ２３−Ｕ、ｉ体
とは予期されていたようにＡＳＡ−ＤＨの過剰に％に導
びかない。ＡｓＡ−［ＪＨの高い崩壊性のために、特異
的活性から計算口］能な過剰弁ト、のファクターは３１
〜６５で揺れる。
６、配素特性及びＬ −ＩＩジン分泌
こうして、ＡＴＣＣ１３０３２ｐＣ３２に関して検出さ
れるＬ−リジン分泌７．１ノ／１（７２時間、第２隻）
は２つの遺伝工学的に実施した変換に起因する。
れるＬ−リジン分泌７．１ノ／１（７２時間、第２隻）
は２つの遺伝工学的に実施した変換に起因する。
ａ）細胞性酸素含蓄の土昇なしに、Ｄ ｒｖ＋ ５８１
からのアスパルテート・キナーゼの調節サブユニットの
クローン什 ｂ）細胞性酸素含蓄の３１〜６５倍土昇に導びく、Ｄ〜
１５８−１からのアスパルチル−５−β−セミアルデヒ
ド−デヒドロゲナーゼのクローン什
からのアスパルテート・キナーゼの調節サブユニットの
クローン什 ｂ）細胞性酸素含蓄の３１〜６５倍土昇に導びく、Ｄ〜
１５８−１からのアスパルチル−５−β−セミアルデヒ
ド−デヒドロゲナーゼのクローン什
第１図はグラスミドｐｚ１の制限地図を示す図である。
ＡＲ，アンピシリン耐性遺伝子：にｍＲ：カナマイシン
耐性遺伝子。 第２図はグラスミドｐＣ３２の直線形での制限地図を示
す図である。略語： ＢａｍＨＩ、Ｂ ；ｂｃｌｌ、Ｃ
；５ａｌｌ、Ｓ；Ｓｃａ、Ａ；ＳｍａＩ、〜Ｉ；ＸｈＯ
Ｉ、Ｘ。 第３図はプラスミドｐＣＳ２の欠失地図を示す図で１６
゜略語： ＢａｍＨＩＳＢ；ＢｃｌＩ、Ｃ；ＤｒａＩ、
Ｄ；ＬｃｏＲＩ、Ｅ；５ａｌＩ、Ｓ；５ｃａＩ、Ａ ；
ＳｍａＩ、 Ｍ；ＸｈｏＩ、ｘｏ 第４図ｒｒｉｆラスミドｐｃＳ２の染色体フラグメント
の欠失分析及び配列決定計画を示す図である。 第５図ｈ２．ｌ ｋｂ のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ−７ラグ
メントのＤＮＡ配列及びお導されたアミノ酸配列の図で
ある。 第１図 Ｈｉｒ＋＋ｊｌｌｌ 第２図 第３図 Ｃ３２３Ｒ ｐＣＳ２３ｌ Ｓ
耐性遺伝子。 第２図はグラスミドｐＣ３２の直線形での制限地図を示
す図である。略語： ＢａｍＨＩ、Ｂ ；ｂｃｌｌ、Ｃ
；５ａｌｌ、Ｓ；Ｓｃａ、Ａ；ＳｍａＩ、〜Ｉ；ＸｈＯ
Ｉ、Ｘ。 第３図はプラスミドｐＣＳ２の欠失地図を示す図で１６
゜略語： ＢａｍＨＩＳＢ；ＢｃｌＩ、Ｃ；ＤｒａＩ、
Ｄ；ＬｃｏＲＩ、Ｅ；５ａｌＩ、Ｓ；５ｃａＩ、Ａ ；
ＳｍａＩ、 Ｍ；ＸｈｏＩ、ｘｏ 第４図ｒｒｉｆラスミドｐｃＳ２の染色体フラグメント
の欠失分析及び配列決定計画を示す図である。 第５図ｈ２．ｌ ｋｂ のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ−７ラグ
メントのＤＮＡ配列及びお導されたアミノ酸配列の図で
ある。 第１図 Ｈｉｒ＋＋ｊｌｌｌ 第２図 第３図 Ｃ３２３Ｒ ｐＣＳ２３ｌ Ｓ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の
微生物から由来する、アスパルチル−β−セミアルデヒ
ド−デヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）活性に導びき、かつ／
又はアスパルテート−キナーゼ（ＬｙｓＣ）の調節解除
に導びく蛋白質の生産をコードする遺伝配列を示すＤＮ
Ａフラグメントから、及びベクターＤＮＡからなる組換
えＤＮＡをコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウ
ム属の微生物中に挿入し、このようにして得られた形質
転換体を好適な培地中で培養し、生じたＬ−リジンを分
離することを特徴とするＬ−リジンの製法。 ２、書換えＤＮＡがコリネバクテリウム属又はブレビバ
クテリウム属の微生物中で複製可能なプラスミドからな
る請求項１記載の方法。 ３、プラスミド中に含有されるベクターがコリネバクテ
リウム属又はブレビバクテリウム属の微生物中で複製可
能であり、ｐＺｌ、ｐＣＶ３４、ｐＣＶ３６、ｐＣＶＸ
４、ｐＣＶＸ１０、ｐＣＶＸ１５、ｐＺ９、ｐＺ８−１
、ｐＣＶ３５、ｐＥＣＭｌ、ｐＥＣＭ３の群から選択さ
れる請求項２記載の方法。 ４、組換えＤＮＡがプラスミドｐＣＳ２からなり、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＤＳＭ５０８６中に含有
されている請求項１から３のいずれか１項記載の方法。 ５、組換えＤＮＡがプラスミドｐＣＳ２から誘導された
誘導体ｐＣＳ２１、ｐＣＳ２２、ｐＣＳ２４、ｐＣＳ２
６からなる請求項４記載の方法。 ６、組換えＤＮＡがプラスミドｐＣＳ２から誘導された
誘導体ｐＣＳ２３又はｐＣＳ２３３からなる請求項４記
載の方法。 ７、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の
微生物から由来する、アスパルチル−β−セミアルデヒ
ド−デヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）活性に導びき、かつ／
又はアスパルテート−キナーゼ（ＬｙＳＣ）の調節解除
に導びく蛋白質の生産をコードする遺伝配列を示すＤＮ
Ａフラグメントから 及びベクターＤＮＡからなる組換
えＤＮＡを含有するコリネバクテリウム属又はブレビバ
クテリウム属の微生物。 ８、アスパルチル−β−セミアルデヒド−デヒドロゲナ
ーゼ（ａｓｄ）活性に導びき、かつ／又はアスパルテー
ト−キナーゼ（ＬｙｓＣ）の調節解除に導びく蛋白質を
コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生
物中で生産することに関してコードする遺伝配列を含有
し、長さ９．９ｋｂの第２図に示したＤＮＡ−フラグメ
ント。 ９、Ｐｓｔ I −及びＸｈｏ I −切断位により仕切られ
た、長さ２．１ｋｂの、主に遺伝配列からなる、第５図
に示されたアミノ配列を有する請求項８記載のＤＮＡ−
フラグメント。
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