JPH06102028B2 - アミノ酸の製造法 - Google Patents
アミノ酸の製造法Info
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- JPH06102028B2 JPH06102028B2 JP60221424A JP22142485A JPH06102028B2 JP H06102028 B2 JPH06102028 B2 JP H06102028B2 JP 60221424 A JP60221424 A JP 60221424A JP 22142485 A JP22142485 A JP 22142485A JP H06102028 B2 JPH06102028 B2 JP H06102028B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
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- Organic Chemistry (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（EC1,2,1,11
aspartate semialdehyde dehydrogenase:以下ASDと略
す）はβ−アスパルチルリン酸からアスパラギン酸β−
セミアルデヒド（以下ASAと略す）への生合成を触媒す
る酵素であり、ASAを前駆体とするアミノ酸、すなわち
リジン、スレオニン、イソロイシンなどの生産に重量な
役割を持っている。また、アスパラギン酸アミノトラン
スフェラーゼ（EC2.6.1.1aspartate aminotransferase:
以下AATと略す）はオキザロ酢酸にアミノ基を転移する
酵素であり、アスパラギン酸の供給に重要な役割を果た
している。従って、アスパラギン酸を前駆体とするアミ
ノ酸、すなわちリジン、スレオニン、イソロイシンなど
の生産にも重要な役割をもっている。本発明は、ASDま
たはAATのコードする遺伝子とベクターDNAとの組換え体
DNAをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属するコリネ型細菌に保有させ、該微生物を培養す
ることによって、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンおよびＬ
−イソロイシンを生産する方法に関する。本発明は医
薬、家畜飼料、食品工業において特に有用な上記アミノ
酸の製造分野に対して有効な手段を提供する。
aspartate semialdehyde dehydrogenase:以下ASDと略
す）はβ−アスパルチルリン酸からアスパラギン酸β−
セミアルデヒド（以下ASAと略す）への生合成を触媒す
る酵素であり、ASAを前駆体とするアミノ酸、すなわち
リジン、スレオニン、イソロイシンなどの生産に重量な
役割を持っている。また、アスパラギン酸アミノトラン
スフェラーゼ（EC2.6.1.1aspartate aminotransferase:
以下AATと略す）はオキザロ酢酸にアミノ基を転移する
酵素であり、アスパラギン酸の供給に重要な役割を果た
している。従って、アスパラギン酸を前駆体とするアミ
ノ酸、すなわちリジン、スレオニン、イソロイシンなど
の生産にも重要な役割をもっている。本発明は、ASDま
たはAATのコードする遺伝子とベクターDNAとの組換え体
DNAをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属するコリネ型細菌に保有させ、該微生物を培養す
ることによって、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンおよびＬ
−イソロイシンを生産する方法に関する。本発明は医
薬、家畜飼料、食品工業において特に有用な上記アミノ
酸の製造分野に対して有効な手段を提供する。
従来の技術 コリネ型細菌を用いた発酵法によるＬ−リジン生産に
は、ホモセリン要求性変異株、リジンのアナログ物質に
対する体制変異株あるいはこれらの変異を併有する菌株
が利用されている。Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイ
シン生産には、それぞれスレオニンおよびイソロイシン
のアナログ物質に対する耐性株が用いられている〔Naka
yama,K.In G.Reed（ed.）,Prescott and Dunn′Ｓイン
ダストリアル・マイクロバイオロジィ（Industrial Mic
robiology）,4th ed.p.748（1982）AV I Publishing C
o.,Westport,Conn.〕。さらに、組換えDNA技術によりコ
リネ型細菌のリジン、スレオニンまたはイソロイシン生
合成に係る遺伝子の組換え体DNAを作成し、該DNAを保有
させた菌株により上記アミノ酸を製造する方法も特許出
願されている（特願昭60−47517および特願昭60−12167
4） 発明が解決しようとする問題点 近年、リジン、スレオニン、イソロイシンの需要が増大
するにつれて、その製造法の改善が強く望まれている。
本発明者らは、このような状況を考慮し、組換えDNA技
術を有効に活用し、すぐれたリジン、スレオニンまたは
イソロイシン生産菌株を造成するため鋭意研究を重ね
た。
は、ホモセリン要求性変異株、リジンのアナログ物質に
対する体制変異株あるいはこれらの変異を併有する菌株
が利用されている。Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイ
シン生産には、それぞれスレオニンおよびイソロイシン
のアナログ物質に対する耐性株が用いられている〔Naka
yama,K.In G.Reed（ed.）,Prescott and Dunn′Ｓイン
ダストリアル・マイクロバイオロジィ（Industrial Mic
robiology）,4th ed.p.748（1982）AV I Publishing C
o.,Westport,Conn.〕。さらに、組換えDNA技術によりコ
リネ型細菌のリジン、スレオニンまたはイソロイシン生
合成に係る遺伝子の組換え体DNAを作成し、該DNAを保有
させた菌株により上記アミノ酸を製造する方法も特許出
願されている（特願昭60−47517および特願昭60−12167
4） 発明が解決しようとする問題点 近年、リジン、スレオニン、イソロイシンの需要が増大
するにつれて、その製造法の改善が強く望まれている。
本発明者らは、このような状況を考慮し、組換えDNA技
術を有効に活用し、すぐれたリジン、スレオニンまたは
イソロイシン生産菌株を造成するため鋭意研究を重ね
た。
問題点を解決するための手段 コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
のASDまたはAATをコードする遺伝子とベクターDNAとの
組換え体DNAをコリネ型細菌に保有させれば、リジン、
スレオニンまたはイソロイシンの生産性が向上すること
を見出し、本発明を完成した。
のASDまたはAATをコードする遺伝子とベクターDNAとの
組換え体DNAをコリネ型細菌に保有させれば、リジン、
スレオニンまたはイソロイシンの生産性が向上すること
を見出し、本発明を完成した。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物のASDまたはAATの合成に関与する
遺伝情報を担うDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNA
を保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−
リジン、Ｌ−ステオニンまたはＬ−イソロイシンを生成
蓄積させ、該培養物から該アミノ酸を採取することを特
徴とするＬ−リジン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロ
イシンの製造法を提供する。
ウム属に属する微生物のASDまたはAATの合成に関与する
遺伝情報を担うDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNA
を保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−
リジン、Ｌ−ステオニンまたはＬ−イソロイシンを生成
蓄積させ、該培養物から該アミノ酸を採取することを特
徴とするＬ−リジン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロ
イシンの製造法を提供する。
宿主微生物としては、コリネバクテリウム属、ブレビバ
クテリウム属などのコリネ型細菌は全て用いることがで
きるが、好適には下記の菌株が用いられる。
クテリウム属などのコリネ型細菌は全て用いることがで
きるが、好適には下記の菌株が用いられる。
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032 コリネバクテリウム・グルタミクムATCC31833 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・ハーキュリスATCC13868 コリネバクテリウム・リリウムATCC15990 コリネバクテリウム・ディバリカツムATCC14020 ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067 ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム ATCC15354 通常、これらの微生物から誘導されるリジン、スレオニ
ンまたはイソロイシン生産性変異株を用いる。これらの
変異株は、アナログ耐性変異の付与などの公知の方法に
よって造成できる。
ンまたはイソロイシン生産性変異株を用いる。これらの
変異株は、アナログ耐性変異の付与などの公知の方法に
よって造成できる。
本発明において、ASDまたはAATをコードする遺伝子の供
給源となる微生物としては、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属し、ASDまたはAATの活性を
有するものであればいかなる微生物でもよく、例えばコ
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032、コリネバ
クテリウム・グルタミクムATCC31833を用いることがで
きる。
給源となる微生物としては、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属し、ASDまたはAATの活性を
有するものであればいかなる微生物でもよく、例えばコ
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032、コリネバ
クテリウム・グルタミクムATCC31833を用いることがで
きる。
ASDまたはAATをコードする遺伝子の供給源となる染色体
DNAは、ASDまたはAATの活性を有する微生物から、本発
明者らが特開昭58−126789に示した方法に従って単離で
きる（具体的には実施例に示す）。
DNAは、ASDまたはAATの活性を有する微生物から、本発
明者らが特開昭58−126789に示した方法に従って単離で
きる（具体的には実施例に示す）。
ベクターとしては、コリネ型細菌中で複製できるもので
あれば特に限定されないが、例えば本発明者が先に開発
したプラスミドpCG1（特開昭57−134500）、pCG2（特開
昭58−35197）、pCG4、pCG11（いずれも特開昭57−1837
99）、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58−105999）、p
CE51（特開昭60−34197）およびpCE52、pCE53〔いずれ
もモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen.Genet）196,175（1984）〕などが用いられ
る。
あれば特に限定されないが、例えば本発明者が先に開発
したプラスミドpCG1（特開昭57−134500）、pCG2（特開
昭58−35197）、pCG4、pCG11（いずれも特開昭57−1837
99）、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58−105999）、p
CE51（特開昭60−34197）およびpCE52、pCE53〔いずれ
もモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen.Genet）196,175（1984）〕などが用いられ
る。
ASDをコードする遺伝子とベクターとの組換え体DNAは、
染色体DNAとベクターDNAとの試験管内組換え混合物を用
いて、通常の変異操作により誘導されるASD活性の欠損
したコリネ型細菌を形質転換し、ASD活性欠損に基づく
ホモセリンおよびジアミノピメリン酸要求性が復帰した
形質転換株を選択することによって取得できる。特にpC
E53のようなエシェリシア・コリとコリネ型細菌の両方
で複製可能なシャトルベクターを使用する場合は、エシ
ェリシア・コリのASD欠損変異の相補性によってASDの遺
伝子をクローニングした後、コリネ型細菌に導入するこ
ともできる。
染色体DNAとベクターDNAとの試験管内組換え混合物を用
いて、通常の変異操作により誘導されるASD活性の欠損
したコリネ型細菌を形質転換し、ASD活性欠損に基づく
ホモセリンおよびジアミノピメリン酸要求性が復帰した
形質転換株を選択することによって取得できる。特にpC
E53のようなエシェリシア・コリとコリネ型細菌の両方
で複製可能なシャトルベクターを使用する場合は、エシ
ェリシア・コリのASD欠損変異の相補性によってASDの遺
伝子をクローニングした後、コリネ型細菌に導入するこ
ともできる。
AATをコードする遺伝子とベクターとの組換え体DNAは、
染色体DNAとベクターDNAとの試験管内組換え混合物を用
いて、通常の変異操作により誘導されるAAT活性の欠損
したコリネ型細菌を形質転換し、AAT活性欠損に基づく
アスパラギン酸要求性が復帰した形質転換株を選択する
ことによって取得できる。特にpCE53のようなエシェリ
シア・コリとコリネ型細菌の両方で複製可能なシャトル
ベクターを使用する場合は、エシェリシア・コリのアミ
ノトランスフェラーゼ欠損変異の相補性によってAATの
遺伝子をクローニングした後、コリネ型細菌に導入する
こともできる。
染色体DNAとベクターDNAとの試験管内組換え混合物を用
いて、通常の変異操作により誘導されるAAT活性の欠損
したコリネ型細菌を形質転換し、AAT活性欠損に基づく
アスパラギン酸要求性が復帰した形質転換株を選択する
ことによって取得できる。特にpCE53のようなエシェリ
シア・コリとコリネ型細菌の両方で複製可能なシャトル
ベクターを使用する場合は、エシェリシア・コリのアミ
ノトランスフェラーゼ欠損変異の相補性によってAATの
遺伝子をクローニングした後、コリネ型細菌に導入する
こともできる。
コリネ型細菌へ組換え体DNAを導入する形質転換法とし
ては本発明者らが開発したプロトプラストを使用する方
法（特開昭57−186492および特開昭57−186489、具体的
には実施例に示す）により実施することができる。
ては本発明者らが開発したプロトプラストを使用する方
法（特開昭57−186492および特開昭57−186489、具体的
には実施例に示す）により実施することができる。
これら組換え体プラスミド保有株によるリジン、スレオ
ニンまたはイソロイシン生産は、従来のこれらアミノ酸
の発酵法に用いられる培養方法に従って行うことができ
る。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機
物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、
好気的条件下に、温度、pHなどを調節しつつ培養を行え
ば、培養物中に目的とするアミノ酸が蓄積するのでこれ
を採取する。
ニンまたはイソロイシン生産は、従来のこれらアミノ酸
の発酵法に用いられる培養方法に従って行うことができ
る。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機
物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、
好気的条件下に、温度、pHなどを調節しつつ培養を行え
ば、培養物中に目的とするアミノ酸が蓄積するのでこれ
を採取する。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、フルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解物、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコー
ル、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有
機酸が使用できる。さらに菌の資化性によって、炭化水
素、アルコール類なども用いうる。特に廃糖蜜が好適に
用いられる。
ス、シュークロース、フルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解物、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコー
ル、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有
機酸が使用できる。さらに菌の資化性によって、炭化水
素、アルコール類なども用いうる。特に廃糖蜜が好適に
用いられる。
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種アンモニウム塩類あるいは尿素等の窒素含
有物質ならびにペプトン、NZ−アミン、肉エキス、酵母
エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解
物、フイッシュミールあるいはその消化物、蛹加水分解
物など種々のものが使用可能である。
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種アンモニウム塩類あるいは尿素等の窒素含
有物質ならびにペプトン、NZ−アミン、肉エキス、酵母
エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解
物、フイッシュミールあるいはその消化物、蛹加水分解
物など種々のものが使用可能である。
さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム、燐酸第
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、
硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどの
塩類を使用する。微生物の成育に必要なビタミン、アミ
ノ酸などは前記したような他の培地成分によって、必要
量が供給されれば特に加えなくてもよい。
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、
硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどの
塩類を使用する。微生物の成育に必要なビタミン、アミ
ノ酸などは前記したような他の培地成分によって、必要
量が供給されれば特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培
養時のpHは中性付近に維持することが望ましい。培養期
間は通常１〜５日間で培地中にＬ−リジン、Ｌ−スレオ
ニンまたはＬ−イソロイシンが蓄積する。培養終了後、
菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの
公知の方法で培養物中に蓄積したアミノ酸を回収する。
下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培
養時のpHは中性付近に維持することが望ましい。培養期
間は通常１〜５日間で培地中にＬ−リジン、Ｌ−スレオ
ニンまたはＬ−イソロイシンが蓄積する。培養終了後、
菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの
公知の方法で培養物中に蓄積したアミノ酸を回収する。
このようにして、ASDまたはAATをコードする遺伝子を含
む組換え体DNAを保有させたコリネ型細菌を用いること
により、非保有株に比べ高い収率でＬ−リジン、Ｌ−ス
レオニンおよびＬ−イソロイシンを生産することができ
る。本発明の実施例においてはコリネバクテリウム・グ
ルタミクムのＬ−リジン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イ
ソロイシン生産菌に、それぞれコリネバクテリウム・グ
ルタミクム由来のASDまたはAATをコードする遺伝子を保
有させることで、これらアミノ酸の生産能を強化する方
法について記載してあるが、本発明者らが先に示したよ
うに（特開昭57−183799、特願昭59−68669）、コリネ
バクテリウム属細菌の遺伝子およびプラスミドベクター
がブレビバクテリウム属細菌中でも機能することが知ら
れており、本発明はブレビバクテリウム属細菌にも適用
可能であることは明白である。
む組換え体DNAを保有させたコリネ型細菌を用いること
により、非保有株に比べ高い収率でＬ−リジン、Ｌ−ス
レオニンおよびＬ−イソロイシンを生産することができ
る。本発明の実施例においてはコリネバクテリウム・グ
ルタミクムのＬ−リジン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イ
ソロイシン生産菌に、それぞれコリネバクテリウム・グ
ルタミクム由来のASDまたはAATをコードする遺伝子を保
有させることで、これらアミノ酸の生産能を強化する方
法について記載してあるが、本発明者らが先に示したよ
うに（特開昭57−183799、特願昭59−68669）、コリネ
バクテリウム属細菌の遺伝子およびプラスミドベクター
がブレビバクテリウム属細菌中でも機能することが知ら
れており、本発明はブレビバクテリウム属細菌にも適用
可能であることは明白である。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１ （１）コリネバクテリウム・グルタミクムのASDをコー
ドする遺伝子のクローニング クローニングはエシェリシア・コリK12株の宿主−ベク
ター系にて実施した。供与体DNAである染色体DNAはコリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13032から本発明者
が先に示した方法〔特開昭58−126789〕に従って単離し
た。すなわち、NB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス5
gを水１に含み、pH7.2に調整した培地）で増殖したコ
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032の種培養を4
00mlの反合成培地SSM〔グルコース20g、(NH4)2SO410g、
尿素3g、酵母エキス1g、KH2PO41g、MgCl2・６H2O0.4g、
FeSO4・７H2O10mg、MnSO4・４〜６H2O0.2mg、ZnSO4・７
H2O0.9mg、CuSO4・５H2O0.4mg、Na2B4O7・10H2O0.09m
g、(NH4)6Mo7O24・４H2O0.04mg、ビオチン30μｇ、サイ
アミン塩酸塩1mgを水１に含み、pH7.2に調整した培
地〕に接種して30℃で振盪培養した。東京光電社製比色
計で660nmにおける吸光度（OD）を測定し、ODが0.2にな
った時点でペニシリンＧを0.5単位/mlの濃度となるよう
に添加した。さらに培養を続け、ODが0.6となるまで生
育させた。
ドする遺伝子のクローニング クローニングはエシェリシア・コリK12株の宿主−ベク
ター系にて実施した。供与体DNAである染色体DNAはコリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13032から本発明者
が先に示した方法〔特開昭58−126789〕に従って単離し
た。すなわち、NB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス5
gを水１に含み、pH7.2に調整した培地）で増殖したコ
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032の種培養を4
00mlの反合成培地SSM〔グルコース20g、(NH4)2SO410g、
尿素3g、酵母エキス1g、KH2PO41g、MgCl2・６H2O0.4g、
FeSO4・７H2O10mg、MnSO4・４〜６H2O0.2mg、ZnSO4・７
H2O0.9mg、CuSO4・５H2O0.4mg、Na2B4O7・10H2O0.09m
g、(NH4)6Mo7O24・４H2O0.04mg、ビオチン30μｇ、サイ
アミン塩酸塩1mgを水１に含み、pH7.2に調整した培
地〕に接種して30℃で振盪培養した。東京光電社製比色
計で660nmにおける吸光度（OD）を測定し、ODが0.2にな
った時点でペニシリンＧを0.5単位/mlの濃度となるよう
に添加した。さらに培養を続け、ODが0.6となるまで生
育させた。
菌体を集菌し、TES緩衝液〔0.03Mトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（以下トリスと略す）、0.005M EDT
A（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）、0.05M NaC
l、pH8.0〕で洗浄後、リゾチーム溶液（25％ショ糖、0.
1M NaCl、0.05Mトリス、0.8mg/mlリゾチーム、pH8.0、
以下同じ）10mlに懸濁し、37℃で４時間反応させた。リ
ゾチーム処理菌体を集菌し、斉藤−三浦の方法〔バイオ
キミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim.Biophy
s.Acta），72,6199（1963）〕に従って染色体DNAを単離
した。
チル）アミノメタン（以下トリスと略す）、0.005M EDT
A（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）、0.05M NaC
l、pH8.0〕で洗浄後、リゾチーム溶液（25％ショ糖、0.
1M NaCl、0.05Mトリス、0.8mg/mlリゾチーム、pH8.0、
以下同じ）10mlに懸濁し、37℃で４時間反応させた。リ
ゾチーム処理菌体を集菌し、斉藤−三浦の方法〔バイオ
キミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim.Biophy
s.Acta），72,6199（1963）〕に従って染色体DNAを単離
した。
ベクタープラスミドはエシェリシア・コリとコリネバク
テリウム・グルタミクムのシャトルプラスミドpCE53
〔モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen.Genet.），196,175（1984）〕を用いた。同
プラスミドは、エシェリシア・コリのベクタープラスミ
ドpGA22〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ（J.Bac
teriol.）140,400（1979），同プラスミド保有菌株エシ
ェリシア・コリK57は工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に昭和60年９月４日付でFERM−BP898として
寄託してある〕のカナマイシン耐性遺伝子近傍の制限酵
素BamHI切断部位にコリネバクテリウム・グルタミクム
のベクタープラスミドpCG1（特開昭57−134500）の BglII切断産物を挿入させて作製した多剤耐性（カナマ
イシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ア
ンピシリン）のシャトルプラスミドである（第１図参
照）。pCE53は、同プラスミドを保有するエシェリシア
・コリK12株からジィ・アン（G.An）らの方法〔ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジィ（J.Bacteriol.）140,40
0（1979）〕に従い、単離した。
テリウム・グルタミクムのシャトルプラスミドpCE53
〔モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen.Genet.），196,175（1984）〕を用いた。同
プラスミドは、エシェリシア・コリのベクタープラスミ
ドpGA22〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ（J.Bac
teriol.）140,400（1979），同プラスミド保有菌株エシ
ェリシア・コリK57は工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に昭和60年９月４日付でFERM−BP898として
寄託してある〕のカナマイシン耐性遺伝子近傍の制限酵
素BamHI切断部位にコリネバクテリウム・グルタミクム
のベクタープラスミドpCG1（特開昭57−134500）の BglII切断産物を挿入させて作製した多剤耐性（カナマ
イシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ア
ンピシリン）のシャトルプラスミドである（第１図参
照）。pCE53は、同プラスミドを保有するエシェリシア
・コリK12株からジィ・アン（G.An）らの方法〔ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジィ（J.Bacteriol.）140,40
0（1979）〕に従い、単離した。
上記で調整したpCE53プラスミドDNA4μｇを含む制限酵
素反応液（10mMトリス−塩酸、6mMMgCl2、100mMNaCl、2
mM 2−メルカプトエタノール、pH8.0）50μｌに８単位
の制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加え37℃で60分間反
応させた。同様に、染色体DNA4μｇを含む制限酵素反応
液50μｌに８単位の制限酵素BglII（宝酒造社製）を加
え、37℃で60分間反応させた。各々65℃で10分間加温し
て反応を停止させた後、混和し、さらにT4リガーゼ用緩
衝液（660mMトリス−塩酸、66mMMgCl2、100mMジチオス
レイトール、pH7.6）30μｌ、5mM ATP30μl,T4リガーゼ
１単位（宝酒造社製）およびH2O140μｌを加え、４℃で
24時間反応させた。反応後65℃で10分間加温して反応を
停止させた。
素反応液（10mMトリス−塩酸、6mMMgCl2、100mMNaCl、2
mM 2−メルカプトエタノール、pH8.0）50μｌに８単位
の制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加え37℃で60分間反
応させた。同様に、染色体DNA4μｇを含む制限酵素反応
液50μｌに８単位の制限酵素BglII（宝酒造社製）を加
え、37℃で60分間反応させた。各々65℃で10分間加温し
て反応を停止させた後、混和し、さらにT4リガーゼ用緩
衝液（660mMトリス−塩酸、66mMMgCl2、100mMジチオス
レイトール、pH7.6）30μｌ、5mM ATP30μl,T4リガーゼ
１単位（宝酒造社製）およびH2O140μｌを加え、４℃で
24時間反応させた。反応後65℃で10分間加温して反応を
停止させた。
同リガーゼ反応混合物を形質転換に供する。受容菌とし
てはASD欠損変異および宿主特異的制限欠損変異を併せ
持つエシェリシア・コリK12株亜株K58（F-asd hsd R）
を用いた。同株は微工研に昭和60年９月４日付きFERM−
BP899として寄託されている。同株のコンピテントな細
胞はエム・ダジェルト（M.Dagert）らの方法〔ジーン
（Gene）、６,23,（1979）〕に従って調整した。
てはASD欠損変異および宿主特異的制限欠損変異を併せ
持つエシェリシア・コリK12株亜株K58（F-asd hsd R）
を用いた。同株は微工研に昭和60年９月４日付きFERM−
BP899として寄託されている。同株のコンピテントな細
胞はエム・ダジェルト（M.Dagert）らの方法〔ジーン
（Gene）、６,23,（1979）〕に従って調整した。
コンピテントな細胞109/mlを含む液0.2mlに上記で調製
したリガーゼ反応混合物100μｌを加え、氷冷下10分間
放置した。次いで37℃で５分間加温処理した後、LB培地
（バクトトリプトン10g、酵母エキス5g、塩化ナトリウ
ム5gおよびブドウ糖1gを水１に含み、pH7.2に調整し
た培地）2mlを加え30℃で120分間静置した。菌体を生理
食塩水で２回遠心洗浄後、50μg/mlのアジピシリンを含
むM9平板培地（ブドウ糖2g、NH4Cl1g、Na2HPO46g、KH2P
O43g、MgSO4・７H2O0.1g、CaCl2・２H2O15mg、サイアミ
ン塩酸塩4mgおよび寒天15gを水１に含み、pH7.2に調
整した培地）に塗布した。M9平板培地に生育したコロニ
ーを各々アンピシリン100μg/mlあるいはテトラサイク
リン20μg/mlを含むLB平板培地に塗布し、アンピシリン
含有培地で生育し、テトラサイクリン含有培地で生育し
ないコロニーを選択した。
したリガーゼ反応混合物100μｌを加え、氷冷下10分間
放置した。次いで37℃で５分間加温処理した後、LB培地
（バクトトリプトン10g、酵母エキス5g、塩化ナトリウ
ム5gおよびブドウ糖1gを水１に含み、pH7.2に調整し
た培地）2mlを加え30℃で120分間静置した。菌体を生理
食塩水で２回遠心洗浄後、50μg/mlのアジピシリンを含
むM9平板培地（ブドウ糖2g、NH4Cl1g、Na2HPO46g、KH2P
O43g、MgSO4・７H2O0.1g、CaCl2・２H2O15mg、サイアミ
ン塩酸塩4mgおよび寒天15gを水１に含み、pH7.2に調
整した培地）に塗布した。M9平板培地に生育したコロニ
ーを各々アンピシリン100μg/mlあるいはテトラサイク
リン20μg/mlを含むLB平板培地に塗布し、アンピシリン
含有培地で生育し、テトラサイクリン含有培地で生育し
ないコロニーを選択した。
選択した形質転換株から前記のジィ・アン（G.An）らの
方法に従いプラスミドを単離した。形質転換株の一株か
ら得たプラスミドpASD2を各種制限酵素で消化後、アガ
ロースゲル電気泳動で解析した結果、pCE53の唯一ケ所
のBamHI切断部位に約7.7KbのBglII DNA断片が挿入した
構造を有していることが判明した（第１図参照）。
方法に従いプラスミドを単離した。形質転換株の一株か
ら得たプラスミドpASD2を各種制限酵素で消化後、アガ
ロースゲル電気泳動で解析した結果、pCE53の唯一ケ所
のBamHI切断部位に約7.7KbのBglII DNA断片が挿入した
構造を有していることが判明した（第１図参照）。
さらに、pASD2を用いてK58株を再形質転換したとき、同
株のホモセリンおよびジアミノピメリン酸要求性が回復
することからpASD2プラスミド上にはコリネバクテリウ
ム・グルタミクム由来のASDをコードする遺伝子がクロ
ーン化されていることが明らかとなった。
株のホモセリンおよびジアミノピメリン酸要求性が回復
することからpASD2プラスミド上にはコリネバクテリウ
ム・グルタミクム由来のASDをコードする遺伝子がクロ
ーン化されていることが明らかとなった。
（２）コリネバクテリウム・グルタミクムRH6株へのpAS
D2プラスミドの導入 リジン生産性菌株、コリネバクテリウム・グルタミクム
RH6（特願昭60−47517、FERM BP−704）をNB培地にて30
℃で16時間振盪培養した。同培養液にホモセリン200μg
/mlを補ったSSM培地に接種し、30℃で振盪培養した。OD
が0.2になった時点でペニシリンＧを0.5単位/mlになる
ように添加した。さらに培養を続け、ODが0.6になった
時点で集菌し、RCGP培地〔グルコース5g、カザミノ酸5
g、酵母エキス2.5g、KH2PO41.5g、K2HPO43.5g、MgCl2・
６H2O0.41g、FeSO4・７H2O10mg、MnSO4・４〜６H2O2m
g、ZnSO4・７H2O0.9mg、CuSO4・５H2O0.4mg、Na2B4O7・
10H2O0.09mg、(NH4)6Mo7O24・４H2O0.04mg、ビオチン30
μｇ、サイアミン塩酸塩2mg、コハク酸２ナトリウム135
g、ポリビニルピロリドンK15（東京化成社製）30gを水
１に含みpH7.3に調整した培地〕に1mg/mlのリゾチー
ムを添加した液に約109細胞/mlとなるように懸濁し、Ｌ
型試験管に移して30℃で14時間緩やかに振盪してプロト
プラスト化した。このプロトプラスト懸濁液0.5mlの小
試験管にとり、2,500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩
衝液（10mM塩化マグネシウム、30mM塩化カルシウム、50
mMトリス−塩酸、400mMショ糖、pH7.5）1mlに再懸濁し
て遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1mlの再懸濁した。
D2プラスミドの導入 リジン生産性菌株、コリネバクテリウム・グルタミクム
RH6（特願昭60−47517、FERM BP−704）をNB培地にて30
℃で16時間振盪培養した。同培養液にホモセリン200μg
/mlを補ったSSM培地に接種し、30℃で振盪培養した。OD
が0.2になった時点でペニシリンＧを0.5単位/mlになる
ように添加した。さらに培養を続け、ODが0.6になった
時点で集菌し、RCGP培地〔グルコース5g、カザミノ酸5
g、酵母エキス2.5g、KH2PO41.5g、K2HPO43.5g、MgCl2・
６H2O0.41g、FeSO4・７H2O10mg、MnSO4・４〜６H2O2m
g、ZnSO4・７H2O0.9mg、CuSO4・５H2O0.4mg、Na2B4O7・
10H2O0.09mg、(NH4)6Mo7O24・４H2O0.04mg、ビオチン30
μｇ、サイアミン塩酸塩2mg、コハク酸２ナトリウム135
g、ポリビニルピロリドンK15（東京化成社製）30gを水
１に含みpH7.3に調整した培地〕に1mg/mlのリゾチー
ムを添加した液に約109細胞/mlとなるように懸濁し、Ｌ
型試験管に移して30℃で14時間緩やかに振盪してプロト
プラスト化した。このプロトプラスト懸濁液0.5mlの小
試験管にとり、2,500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩
衝液（10mM塩化マグネシウム、30mM塩化カルシウム、50
mMトリス−塩酸、400mMショ糖、pH7.5）1mlに再懸濁し
て遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1mlの再懸濁した。
この懸濁液に２倍濃度のTSMC緩衝液と上記pASD2プラス
ミドDNAの１対１混和液100μｌを加え、次いでTSMC緩衝
液中に20％ポリエチレングリコール6,000を含む液0.8ml
を混合した。３分後、RCGF培地2mlを添加し、2,500×ｇ
で５分間遠心分離にかけ、沈澱したプロトプラストを1m
lのRCGP培地に再懸濁した。30℃で２時間放置した後、
同プロトプラスト懸濁液の0.2mlをカナマイシン300μg/
mlを含むRCGP寒天培地（RCGP培地に寒天1.4％を含む培
地）に塗布し、30℃で10日間培養した。出現したコロニ
ーの中からカナマイシン20μg/mlを含むNB寒天培地上で
生育できる株が得られた。
ミドDNAの１対１混和液100μｌを加え、次いでTSMC緩衝
液中に20％ポリエチレングリコール6,000を含む液0.8ml
を混合した。３分後、RCGF培地2mlを添加し、2,500×ｇ
で５分間遠心分離にかけ、沈澱したプロトプラストを1m
lのRCGP培地に再懸濁した。30℃で２時間放置した後、
同プロトプラスト懸濁液の0.2mlをカナマイシン300μg/
mlを含むRCGP寒天培地（RCGP培地に寒天1.4％を含む培
地）に塗布し、30℃で10日間培養した。出現したコロニ
ーの中からカナマイシン20μg/mlを含むNB寒天培地上で
生育できる株が得られた。
カナマイシン耐性の形質転換株から、先に本発明者が示
した方法〔特開昭57−134500〕に従ってプラスミドを単
離した。すなわち、上記の形質転換株をNB培地にて30℃
で16時間振盪培養した。
した方法〔特開昭57−134500〕に従ってプラスミドを単
離した。すなわち、上記の形質転換株をNB培地にて30℃
で16時間振盪培養した。
同培養液を400mlのSSM培地に接種し、30℃で振盪培養し
た。ODが0.2になった時点でペニシリンＧを0.5単位/ml
となるように添加し、さらにODが0.6になるまで培養を
続けた。菌体を集菌し、TES緩衝液で洗浄後、リゾチー
ム溶液10mlに懸濁し、37℃で２時間反応させた。反応液
に5M NaCl2.4ml、0.5M EDTA（pH8.5）0.6ml、４％ラウ
リル硫酸ナトリウムと0.7M NaClからなる溶液4.4mlを順
次加え、緩やかに混和してから氷水上に15時間放置し
た。４℃で60分間69,400×ｇの遠心にかけ上清を回収し
た。これに重量百分率10％相当のポリエチレングリコー
ル（PEG）6,000（半井化学薬品社製）を加え、静かに混
和して溶解後、氷水上に置いた。10時間後、1,500×ｇ
で10分間遠心した。沈澱物にTES緩衝液5mlを加えて、再
溶解した後、1.5mg/mlエチジウムブロマイド2.0mlを添
加した。さらに塩化セシウムを加え、密度を1.580に合
わせた。同溶液を105,000×ｇ、18℃で48時間遠心し、
紫外線照射下に検知される遠心チューブ下方の密度の高
い位置の螢光バンドを分取することでプラスミドDNAを
分離した。同分画液に等容量のイソプロピルアルコール
液（容量百分率90％イソプロピルアルコール、10％TES
緩衝液）を加えてエチジウムブロマイドを抽出除去し
た。同抽出操作を５回繰り返した後、DNA液をTES緩衝液
に対して透析して、最終的なプラスミドDNA標品を得
た。得られたプラスミドを制限酵素で切断後、アガロー
スゲル電気泳動で解析した結果、pASD2と同一構造を有
していることがわかった。
た。ODが0.2になった時点でペニシリンＧを0.5単位/ml
となるように添加し、さらにODが0.6になるまで培養を
続けた。菌体を集菌し、TES緩衝液で洗浄後、リゾチー
ム溶液10mlに懸濁し、37℃で２時間反応させた。反応液
に5M NaCl2.4ml、0.5M EDTA（pH8.5）0.6ml、４％ラウ
リル硫酸ナトリウムと0.7M NaClからなる溶液4.4mlを順
次加え、緩やかに混和してから氷水上に15時間放置し
た。４℃で60分間69,400×ｇの遠心にかけ上清を回収し
た。これに重量百分率10％相当のポリエチレングリコー
ル（PEG）6,000（半井化学薬品社製）を加え、静かに混
和して溶解後、氷水上に置いた。10時間後、1,500×ｇ
で10分間遠心した。沈澱物にTES緩衝液5mlを加えて、再
溶解した後、1.5mg/mlエチジウムブロマイド2.0mlを添
加した。さらに塩化セシウムを加え、密度を1.580に合
わせた。同溶液を105,000×ｇ、18℃で48時間遠心し、
紫外線照射下に検知される遠心チューブ下方の密度の高
い位置の螢光バンドを分取することでプラスミドDNAを
分離した。同分画液に等容量のイソプロピルアルコール
液（容量百分率90％イソプロピルアルコール、10％TES
緩衝液）を加えてエチジウムブロマイドを抽出除去し
た。同抽出操作を５回繰り返した後、DNA液をTES緩衝液
に対して透析して、最終的なプラスミドDNA標品を得
た。得られたプラスミドを制限酵素で切断後、アガロー
スゲル電気泳動で解析した結果、pASD2と同一構造を有
していることがわかった。
（３）pASD2を保有するコリネバクテリウム・グルタミ
クムRH6株によるリジン生産 上記の工程で得られた形質転換株RH6/PASD2および親株
のプラスミド非保有株RH6のＬ−リジン生産試験を行っ
た。NB培地中で30℃、16時間振盪培養した種培養0.5ml
を5mlの生産培地L1〔グルコース100g、(NH4)2SO430g、K
H2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4・７H2O1g、FeSO4・７H2
O10mg、MnSO4・４〜６H2O10mg、ビチオン100μｇ、ホモ
セリン200mg、炭酸カルシウム30gを水１に含み、pH7.
2に調整した培地〕に接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養後、培養液中のＬ−リジン生成量を酸性銅ニ
ンヒドリン法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリィ（J.Biol.Chem.），199,91（1952）〕により
比色定量した。結果を第１表に示す。第１表からASDを
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミドpASD2がＬ
−リジン生産能増強効果を示すことが明らかである。
クムRH6株によるリジン生産 上記の工程で得られた形質転換株RH6/PASD2および親株
のプラスミド非保有株RH6のＬ−リジン生産試験を行っ
た。NB培地中で30℃、16時間振盪培養した種培養0.5ml
を5mlの生産培地L1〔グルコース100g、(NH4)2SO430g、K
H2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4・７H2O1g、FeSO4・７H2
O10mg、MnSO4・４〜６H2O10mg、ビチオン100μｇ、ホモ
セリン200mg、炭酸カルシウム30gを水１に含み、pH7.
2に調整した培地〕に接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養後、培養液中のＬ−リジン生成量を酸性銅ニ
ンヒドリン法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリィ（J.Biol.Chem.），199,91（1952）〕により
比色定量した。結果を第１表に示す。第１表からASDを
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミドpASD2がＬ
−リジン生産能増強効果を示すことが明らかである。
（４）pASD2を導入したコリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC21660によるスレオニンの生産 スレオニン生産性菌株、コリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC21660を上記（２）と同様にして、メチオニン2
00μg/mlを補ったSSM培地にて培養し、プロトプラスト
を調製して、形質転換を行い、pASD2の形質転換株ATCC2
1660/pASD2を得た。形質転換株がプラスミドを保有する
ことは前記と同様にして確認した。
クムATCC21660によるスレオニンの生産 スレオニン生産性菌株、コリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC21660を上記（２）と同様にして、メチオニン2
00μg/mlを補ったSSM培地にて培養し、プロトプラスト
を調製して、形質転換を行い、pASD2の形質転換株ATCC2
1660/pASD2を得た。形質転換株がプラスミドを保有する
ことは前記と同様にして確認した。
親株と形質転換株のスレオニン生産試験を次のように行
った。BN培地で30℃、16時間振盪培養した種培養0.5ml
を生産培地T1〔グルコース100g、(NH4)2SO420g、KH2PO4
0.5g、K2HPO40.5g、MgSO4・７H2O1g、FeSO4・７H2O10m
g、MnSO4・４〜６H2O10mg、ビオチン100μｇ、メチオニ
ン100mgおよび炭酸カルシウム20gを水１に含み、pH7.
2に調整した培地〕5mlに接種し、30℃で72時間振盪培養
した。培養後、培養液をペーパークロマトグラフィー
にかけ、ニンヒドリン発色による比色定量法を用いてＬ
−スレオニン生成量を測定した、結果を第２表に示す。
第２表からASDをコードする遺伝子を含む組換え体プラ
スミドpASD2がスレオニン生産能を増強することがわか
る。
った。BN培地で30℃、16時間振盪培養した種培養0.5ml
を生産培地T1〔グルコース100g、(NH4)2SO420g、KH2PO4
0.5g、K2HPO40.5g、MgSO4・７H2O1g、FeSO4・７H2O10m
g、MnSO4・４〜６H2O10mg、ビオチン100μｇ、メチオニ
ン100mgおよび炭酸カルシウム20gを水１に含み、pH7.
2に調整した培地〕5mlに接種し、30℃で72時間振盪培養
した。培養後、培養液をペーパークロマトグラフィー
にかけ、ニンヒドリン発色による比色定量法を用いてＬ
−スレオニン生成量を測定した、結果を第２表に示す。
第２表からASDをコードする遺伝子を含む組換え体プラ
スミドpASD2がスレオニン生産能を増強することがわか
る。
（５）pASD2を導入したコリネバクテリウム・グルタミ
クムK40によるイソロイシンの生産 イソロイシン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミ
クムK40（FERM P−7160として微工研に寄託されてい
る）を上記（２）と同様にして、SSM培地にて培養、プ
ロトプラストを調製して形質転換を行い、pASD2の形質
転換株、K40/pASD2を得た。形質転換株がプラスミドを
保有することは前記と同様にして確認した。
クムK40によるイソロイシンの生産 イソロイシン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミ
クムK40（FERM P−7160として微工研に寄託されてい
る）を上記（２）と同様にして、SSM培地にて培養、プ
ロトプラストを調製して形質転換を行い、pASD2の形質
転換株、K40/pASD2を得た。形質転換株がプラスミドを
保有することは前記と同様にして確認した。
親株と形質転換株のイソロイシン生産試験を生産培地I1
〔生産培地T1からメチオニンを除いた培地〕を用いて上
記（４）と同様にして行った。結果を第３表に示す。第
３表から、pASD2プラスミドがイソロイシン生産性を増
大させることがわかる。
〔生産培地T1からメチオニンを除いた培地〕を用いて上
記（４）と同様にして行った。結果を第３表に示す。第
３表から、pASD2プラスミドがイソロイシン生産性を増
大させることがわかる。
実施例２ （１）コリネバクテリウム・グルタミクムのAATをコー
ドする遺伝子のクローニング 供与体DNAである染色体DNAとして、コリネバクテリウム
・グルタミクムATCC31833を用いる他は、実施例１の
（１）と同様の方法で染色体DNAを単離した。また、ベ
クタープラスミドも実施例１で用いたエシェリシア・コ
リとコリネバクテリウム・グルタミクムのシャトルプラ
スミドpCE53を、実施例１の（１）と同様の方法で調製
して用いた。
ドする遺伝子のクローニング 供与体DNAである染色体DNAとして、コリネバクテリウム
・グルタミクムATCC31833を用いる他は、実施例１の
（１）と同様の方法で染色体DNAを単離した。また、ベ
クタープラスミドも実施例１で用いたエシェリシア・コ
リとコリネバクテリウム・グルタミクムのシャトルプラ
スミドpCE53を、実施例１の（１）と同様の方法で調製
して用いた。
単離した染色体DNAと調製したpCE53プラスミドDNAを用
い、実施例１の（１）と同様の方法で制限酵素反応を行
い、さらにT4リガーゼ反応を行い、このリガーゼ反応混
合物を形質転換に供した。受容菌としては、アミノトラ
ンスフェラーゼの多重欠損変異および宿主特異的制限欠
損変異を併せ持つエシェリシア・コリK12株DG30（F-thr
leu thi proA argE hisG recD recB sbcB hsdS hppT i
lvE tyrB aspC）〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ィ（J.Bacteriol.）130,429（1977）〕を用いた。同株
は微工研に昭和60年９月４付でEscherichia coli K59 F
ERM BP−900として寄託されている。同株のコンピテン
トな細胞はエム・ダジェルト（M.Dagert）らの方法〔ジ
ーン（Gene），６,23（1979）〕に従って調製した。
い、実施例１の（１）と同様の方法で制限酵素反応を行
い、さらにT4リガーゼ反応を行い、このリガーゼ反応混
合物を形質転換に供した。受容菌としては、アミノトラ
ンスフェラーゼの多重欠損変異および宿主特異的制限欠
損変異を併せ持つエシェリシア・コリK12株DG30（F-thr
leu thi proA argE hisG recD recB sbcB hsdS hppT i
lvE tyrB aspC）〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ィ（J.Bacteriol.）130,429（1977）〕を用いた。同株
は微工研に昭和60年９月４付でEscherichia coli K59 F
ERM BP−900として寄託されている。同株のコンピテン
トな細胞はエム・ダジェルト（M.Dagert）らの方法〔ジ
ーン（Gene），６,23（1979）〕に従って調製した。
コンピテントな細胞109/mlを含む液0.2mlに上記で調製
したリガーゼ反応混合物100μｌを加え、氷冷下10分間
放置した。次いで37℃で５分間加温処理した後、LB培地
2mlを加え30℃で120分間静置した。菌体を生理食塩水で
２回遠心洗浄後、50μg/mlのアンピシリン、スレオニ
ン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、アル
ギニン、ヒスチジン、フェニルアラニンおよびチロシン
を含むM9平板培地に塗布した。M9平板培地に生育したコ
ロニーを各々アンピリシン100μg/mlあるいはテトラサ
イクリン20μg/mlを含むLB平板培地に塗布し、アンピシ
リン含有培地で生育し、テトラサイクリン含有培地で生
育しないコロニーを選択した。
したリガーゼ反応混合物100μｌを加え、氷冷下10分間
放置した。次いで37℃で５分間加温処理した後、LB培地
2mlを加え30℃で120分間静置した。菌体を生理食塩水で
２回遠心洗浄後、50μg/mlのアンピシリン、スレオニ
ン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、アル
ギニン、ヒスチジン、フェニルアラニンおよびチロシン
を含むM9平板培地に塗布した。M9平板培地に生育したコ
ロニーを各々アンピリシン100μg/mlあるいはテトラサ
イクリン20μg/mlを含むLB平板培地に塗布し、アンピシ
リン含有培地で生育し、テトラサイクリン含有培地で生
育しないコロニーを選択した。
選択した形質転換株から前記のジィ・アン（G.An）らの
方法に従いプラスミドを単離した。形質転換株の一株か
ら得たプラスミドpAT1を各種制限酵素で消化後、アガロ
ースゲル電気泳動で解析した結果、pCE53の唯一ケ所のB
amHIで切断部位に約6.3KbのBglII DNA断片が挿入した構
造を有していることが判明した（第２図参照）。
方法に従いプラスミドを単離した。形質転換株の一株か
ら得たプラスミドpAT1を各種制限酵素で消化後、アガロ
ースゲル電気泳動で解析した結果、pCE53の唯一ケ所のB
amHIで切断部位に約6.3KbのBglII DNA断片が挿入した構
造を有していることが判明した（第２図参照）。
さらに、pAT1を用いてK59株を再形質転換したとき、ア
ミノトランスフェラーゼ欠損に基づく、アスパラギン酸
要求性が回復することおよびゲルファンド（Gelfand）
らの方法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ（J.Ba
cteriol.）130,429（1977）〕に従ってAAT活性の測定を
行うと、親株のK59株では同活性が検出されないのに対
し、再形質転換株では、同活性が観察されたこととか
ら、pAT1プラスミド上にはコリネバクテリウム・グルタ
ミクム由来のAAT遺伝子がクローン化されていることが
明らかとなった。
ミノトランスフェラーゼ欠損に基づく、アスパラギン酸
要求性が回復することおよびゲルファンド（Gelfand）
らの方法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ（J.Ba
cteriol.）130,429（1977）〕に従ってAAT活性の測定を
行うと、親株のK59株では同活性が検出されないのに対
し、再形質転換株では、同活性が観察されたこととか
ら、pAT1プラスミド上にはコリネバクテリウム・グルタ
ミクム由来のAAT遺伝子がクローン化されていることが
明らかとなった。
（２）コリネバクテリウム・グルタミクムRH6株へのpAT
1プラスミドの導入 実施例１の（２）と同様の方法で、pAT1プラスミドをコ
リネバクテリウム・グルタミクムRH6株へ導入した。
1プラスミドの導入 実施例１の（２）と同様の方法で、pAT1プラスミドをコ
リネバクテリウム・グルタミクムRH6株へ導入した。
得られたカナマイシン耐性の形質転換株のプラスミド
を、実施例１の（２）と同様の方法で単離し、制限酵素
で切断後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、pA
T1と同一構造を有していることがわかった。
を、実施例１の（２）と同様の方法で単離し、制限酵素
で切断後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、pA
T1と同一構造を有していることがわかった。
（３）pAT1を保有するコリネバクテリウム・グルタミク
ムRH6株によるリジン生産 上記の工程で得られた形質転換株RH6/pAT1および親株の
プラスミド非保有株RH6のＬ−リジン生産試験を行っ
た。NB培地中で30℃、16時間振盪培養した種培養0.5ml
を5mlの生産培地L1に接種し、30℃で７時間振盪培養し
た。培養後、培養液中のＬ−リジン生成量を酸性銅ニ
ンヒドリン法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリィ（J.Biol.Chem.），199,91（1952）〕により
比色定量した。結果を第４表に示す。第４表からAATを
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミドpAT1がＬ−
リジン生産能増強効果を示すことが明らかである。
ムRH6株によるリジン生産 上記の工程で得られた形質転換株RH6/pAT1および親株の
プラスミド非保有株RH6のＬ−リジン生産試験を行っ
た。NB培地中で30℃、16時間振盪培養した種培養0.5ml
を5mlの生産培地L1に接種し、30℃で７時間振盪培養し
た。培養後、培養液中のＬ−リジン生成量を酸性銅ニ
ンヒドリン法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリィ（J.Biol.Chem.），199,91（1952）〕により
比色定量した。結果を第４表に示す。第４表からAATを
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミドpAT1がＬ−
リジン生産能増強効果を示すことが明らかである。
（４）pAT1を導入したコリネバクテリウム・グルタミク
ムATCC21660によるスレオニンの生産 スレオニン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミク
ムATCC21660を実施例１の（２）と同様にして、メチオ
ニン200μg/mlを補ったSSM培地にて培養し、プロトプラ
ストを調製して、形質転換を行い、pAT1の形質転換株AT
CC21660/pAT1を得た。形質転換株がプラスミドを保有す
ることは前記と同様にして確認した。
ムATCC21660によるスレオニンの生産 スレオニン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミク
ムATCC21660を実施例１の（２）と同様にして、メチオ
ニン200μg/mlを補ったSSM培地にて培養し、プロトプラ
ストを調製して、形質転換を行い、pAT1の形質転換株AT
CC21660/pAT1を得た。形質転換株がプラスミドを保有す
ることは前記と同様にして確認した。
親株と形質転換株のスレオニン生産試験を次のように行
った。NB培地で30℃、16時間振盪培養した種培養0.5ml
を生産培地T1 5mlに接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養後、培養液をペーパークロマトグラフィーに
かけ、ニンヒドリン発色による比色定量法を用いてＬ−
スレオニン生成量を測定した。結果を第５表に示す。第
５表からAATをコードする遺伝子を含む組換え体プラス
ミドpAT1がスレオニン生産能を増強することが示され
る。
った。NB培地で30℃、16時間振盪培養した種培養0.5ml
を生産培地T1 5mlに接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養後、培養液をペーパークロマトグラフィーに
かけ、ニンヒドリン発色による比色定量法を用いてＬ−
スレオニン生成量を測定した。結果を第５表に示す。第
５表からAATをコードする遺伝子を含む組換え体プラス
ミドpAT1がスレオニン生産能を増強することが示され
る。
（５）pAT1を導入したコリネバクテリウム・グルタミク
ムK40によるイソロイシンの生産 イソロイシン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミ
クムK40（FERM P−7160）を実施例１の（２）と同様に
して、SSM培地にて培養し、プロトプラストを調製して
形質転換を行い、pAT1の形質転換株K40/pAT1を得た。形
質転換株がプラスミドを保有することは前記と同様にし
て確認した。
ムK40によるイソロイシンの生産 イソロイシン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミ
クムK40（FERM P−7160）を実施例１の（２）と同様に
して、SSM培地にて培養し、プロトプラストを調製して
形質転換を行い、pAT1の形質転換株K40/pAT1を得た。形
質転換株がプラスミドを保有することは前記と同様にし
て確認した。
親株と形質転換株のイソロイシン生産試験を生産培地I1
を用いて上記（４）と同様にして行った。結果を第６表
に示す。第６表から、pAT1プラスミドがイソロイシン生
産性を増大させることがわかる。
を用いて上記（４）と同様にして行った。結果を第６表
に示す。第６表から、pAT1プラスミドがイソロイシン生
産性を増大させることがわかる。
発明の効果 本発明によれば、コリネバクテリウム属、ブレビバクテ
リウム属などのコリネ型細菌のASDまたはAATの合成に関
与する遺伝子とベクタープラスミドとの組換え体DNAを
作製し、該組換え体DNAをコリネ型細菌に保有させて、
Ｌ−リジジ、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの
生産性を工場させることができる。
リウム属などのコリネ型細菌のASDまたはAATの合成に関
与する遺伝子とベクタープラスミドとの組換え体DNAを
作製し、該組換え体DNAをコリネ型細菌に保有させて、
Ｌ−リジジ、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの
生産性を工場させることができる。
第１図はpASD2の制限酵素BglII、BamHIおよびSalIの切
断点地図と同プラスミドの作製工程を示す。 第２図はpAT1の制限酵素BglII、BamHIおよびSalIの切断
点地図と同プラスミドの作製工程を示す。 プラスミドの大きさはキロベース（Kb）で示されてい
る。pASD2およびpAT1の太い実線部分は、染色体DNAに由
来し、それぞれASD、AATをコードする遺伝子を含むクロ
ーン化DNA部分を示す。Ba/Bgは、BamHIとBglIIの同一粘
着末端での結合部位を示す。
断点地図と同プラスミドの作製工程を示す。 第２図はpAT1の制限酵素BglII、BamHIおよびSalIの切断
点地図と同プラスミドの作製工程を示す。 プラスミドの大きさはキロベース（Kb）で示されてい
る。pASD2およびpAT1の太い実線部分は、染色体DNAに由
来し、それぞれASD、AATをコードする遺伝子を含むクロ
ーン化DNA部分を示す。Ba/Bgは、BamHIとBglIIの同一粘
着末端での結合部位を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ 2121−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:15） (56)参考文献 特開 昭60−30693（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−893（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−126789（ＪＰ，Ａ) アミノ酸、核酸集談会編「アミノ酸発酵 （下）各論」共立出版株式会社（昭47. ４．５）Ｐ．95〜97
Claims (2)
- 【請求項１】コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物のアスパラギン酸セミアルデヒ
ド脱水素酵素またはアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼの合成に関与する遺伝情報を担うDNA断片とベク
ターDNAとの組換え体DNAを保有するコリネバクテリウム
属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−リジ
ン、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを生成蓄積
させ、該培養物から該アミノ酸を採取することを特徴と
するアミノ酸の製造法。 - 【請求項２】ベクターが、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物内で複製可能なpC
G1、pCG2、pCG4、pCG11、pCE51、pCE52、pCE53、pCE5
4、pCB101およびそれから誘導されるプラスミドから選
ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60221424A JPH06102028B2 (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | アミノ酸の製造法 |
| EP86113808A EP0219027A3 (en) | 1985-10-04 | 1986-10-06 | Process for producing amino acids |
| DE1986113808 DE219027T1 (de) | 1985-10-04 | 1986-10-06 | Verfahren zur herstellung von aminosaeuren. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60221424A JPH06102028B2 (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6279788A JPS6279788A (ja) | 1987-04-13 |
| JPH06102028B2 true JPH06102028B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=16766524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60221424A Expired - Fee Related JPH06102028B2 (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | アミノ酸の製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0219027A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06102028B2 (ja) |
| DE (1) | DE219027T1 (ja) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007088970A1 (ja) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジンの製造法 |
| WO2008093829A1 (ja) | 2007-02-01 | 2008-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2009088049A1 (ja) | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵法による目的物質の製造法 |
| WO2009093703A1 (ja) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| EP2202299A1 (en) | 2008-12-22 | 2010-06-30 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing L-lysine |
| WO2010092959A1 (ja) * | 2009-02-10 | 2010-08-19 | 協和発酵バイオ株式会社 | アミノ酸の製造法 |
| WO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2011-02-03 | 味の素株式会社 | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| CN102816804A (zh) * | 2003-12-05 | 2012-12-12 | 味之素株式会社 | 属于埃希氏菌属的产l-苏氨酸细菌以及生产l-苏氨酸的方法 |
| EP2559754A2 (en) | 2011-08-18 | 2013-02-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having enhanced expression of the flagella formation and motility cascade genes |
| EP2818556A2 (en) | 2004-10-07 | 2014-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing a basic substance |
| WO2015041265A1 (ja) | 2013-09-17 | 2015-03-26 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのｌ－アミノ酸の製造方法 |
| WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3737729A1 (de) * | 1987-11-06 | 1989-05-18 | Degussa | Pendelvektor pz1, rekombinantes, ein aspartasegen enthaltendes plasmid, seine verwendung zur herstellung von aminosaeuren der aspartat-familie aus fumarat-haltigem naehrmedium und es enthaltende mikroorganismen |
| DE3823451C2 (de) * | 1988-07-11 | 1997-02-20 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Rekombinante DNA, damit transformierte Mikrooganismen und Verwendung dieser Mikroorganismen zur Herstellung von L-Lysin mit Hilfe dieser Mikroorganismen |
| DE3908201A1 (de) * | 1989-03-14 | 1990-09-27 | Degussa | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin |
| DE3942947A1 (de) * | 1989-12-23 | 1991-06-27 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-isoleucin und dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
| DE3943117A1 (de) * | 1989-12-27 | 1991-07-04 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
| JP3078312B2 (ja) * | 1990-11-22 | 2000-08-21 | 協和醗酵工業株式会社 | 物質の製造法 |
| JP2540672Y2 (ja) * | 1992-10-15 | 1997-07-09 | 株式会社福島製作所 | リフティングマグネット付電動油圧式グラブバケット |
| JP2003135066A (ja) * | 1999-03-19 | 2003-05-13 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−リジンの製造法 |
| US6927046B1 (en) * | 1999-12-30 | 2005-08-09 | Archer-Daniels-Midland Company | Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria |
| DE10109690A1 (de) * | 2000-09-02 | 2002-03-14 | Degussa | Neue für das metY-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| US6812016B2 (en) | 2000-09-02 | 2004-11-02 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the metY gene |
| AU2001285878A1 (en) | 2000-09-12 | 2002-03-26 | Degussa A.G. | Nucleotide sequences which code for the roda gene |
| WO2002022670A1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-03-21 | Degussa Ag | Nucleotide sequences coding for the ftsx gene |
| DE10046625A1 (de) * | 2000-09-20 | 2002-04-11 | Degussa | Neue für das ndkA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| DE10047864A1 (de) * | 2000-09-27 | 2002-04-11 | Degussa | Neue für das truB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| AU2002218223A1 (en) * | 2000-10-28 | 2002-05-06 | Degussa A.G. | Nucleotide sequences encoding the hemd and hemb genes |
| AR032570A1 (es) | 2001-02-08 | 2003-11-12 | Archer Daniels Midland Co | Construcciones de polinucleotidicas para aumentar la produccion de lisina |
| RU2244007C2 (ru) * | 2002-02-27 | 2005-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты) |
| CA2549298C (en) * | 2003-12-05 | 2014-02-25 | Ajinomoto Co., Inc. | L-threonine producing bacterium belonging to the genus escherichia and method for producing l-threonine |
| US7915018B2 (en) | 2004-10-22 | 2011-03-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family |
| ATE525457T1 (de) | 2004-12-06 | 2011-10-15 | Sage Biosciences Inc | Verfahren zur züchtung von bakterien zur abgabe von bioaktiven verbindungen an das intestinum von wiederkäuern |
| EP3170889A1 (en) * | 2006-09-15 | 2017-05-24 | CJ Cheiljedang Corporation | A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same |
| KR100830826B1 (ko) * | 2007-01-24 | 2008-05-19 | 씨제이제일제당 (주) | 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법 |
| US8932861B2 (en) | 2008-04-10 | 2015-01-13 | Cj Cheiljedang Corporation | Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism |
| KR101126041B1 (ko) | 2008-04-10 | 2012-03-19 | 씨제이제일제당 (주) | 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법 |
| KR101012590B1 (ko) * | 2008-06-25 | 2011-02-07 | 씨제이제일제당 (주) | 라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 및 이를 이용한 라이신 생산방법 |
| KR101500073B1 (ko) * | 2013-04-23 | 2015-03-06 | 씨제이제일제당 (주) | L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법 |
| EP3467099A1 (en) | 2017-10-05 | 2019-04-10 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
| RU2019128538A (ru) | 2018-09-26 | 2021-03-11 | Эвоник Оперейшенс ГмбХ | Способ ферментативного получения l-лизина |
| US20250340893A1 (en) | 2022-05-18 | 2025-11-06 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof |
| CN119212691A (zh) | 2022-05-18 | 2024-12-27 | 赢创运营有限公司 | 比苏卡林、去铁胺及其类似物的生物技术生产 |
| CN119212692A (zh) | 2022-05-18 | 2024-12-27 | 赢创运营有限公司 | 比苏卡林、去铁胺及其类似物的单体的生物技术生产 |
| CN114835783B (zh) * | 2022-06-01 | 2024-06-25 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | NCgl2747基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0691827B2 (ja) * | 1981-12-17 | 1994-11-16 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規ベクタ−プラスミド |
| JPS58126789A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | レースレオニンの製造法 |
| DE3486229T2 (de) * | 1983-02-17 | 1994-03-31 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin. |
| JPH0732711B2 (ja) * | 1983-07-29 | 1995-04-12 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
| AU3187984A (en) * | 1983-08-16 | 1985-02-21 | Genentech Inc. | Recombinant process for preparing l-amino acids |
-
1985
- 1985-10-04 JP JP60221424A patent/JPH06102028B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-10-06 EP EP86113808A patent/EP0219027A3/en not_active Withdrawn
- 1986-10-06 DE DE1986113808 patent/DE219027T1/de active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| アミノ酸、核酸集談会編「アミノ酸発酵（下）各論」共立出版株式会社（昭４７．４．５）Ｐ．９５〜９７ |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102816804A (zh) * | 2003-12-05 | 2012-12-12 | 味之素株式会社 | 属于埃希氏菌属的产l-苏氨酸细菌以及生产l-苏氨酸的方法 |
| EP2818554A2 (en) | 2004-10-07 | 2014-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing a basic substance |
| EP2818556A2 (en) | 2004-10-07 | 2014-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing a basic substance |
| WO2007088970A1 (ja) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジンの製造法 |
| WO2008093829A1 (ja) | 2007-02-01 | 2008-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| EP2749652A2 (en) | 2008-01-10 | 2014-07-02 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing a target substance by fermentation |
| WO2009088049A1 (ja) | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵法による目的物質の製造法 |
| WO2009093703A1 (ja) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| EP2202299A1 (en) | 2008-12-22 | 2010-06-30 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing L-lysine |
| WO2010092959A1 (ja) * | 2009-02-10 | 2010-08-19 | 協和発酵バイオ株式会社 | アミノ酸の製造法 |
| WO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2011-02-03 | 味の素株式会社 | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| WO2013024904A1 (en) | 2011-08-18 | 2013-02-21 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having enhanced expression of the flagella formation and motility cascade genes |
| EP2559754A2 (en) | 2011-08-18 | 2013-02-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having enhanced expression of the flagella formation and motility cascade genes |
| WO2015041265A1 (ja) | 2013-09-17 | 2015-03-26 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのｌ－アミノ酸の製造方法 |
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