JPH03219890A - アデニレートキナーゼ融合ペプチドの精製方法 - Google Patents
アデニレートキナーゼ融合ペプチドの精製方法Info
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- JPH03219890A JPH03219890A JP2015286A JP1528690A JPH03219890A JP H03219890 A JPH03219890 A JP H03219890A JP 2015286 A JP2015286 A JP 2015286A JP 1528690 A JP1528690 A JP 1528690A JP H03219890 A JPH03219890 A JP H03219890A
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- peptide
- solution
- urea
- fusion peptide
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、ペプチドの製造方法に関する。特に、アデニ
レートキナーゼ融合ペプチドを含有する粗製物、例えば
アデニレートキナーゼ融合ペプチドを発現させた培養物
からアデニレートキナーゼ融合ペプチドを回収、精製す
る方法に関する。
レートキナーゼ融合ペプチドを含有する粗製物、例えば
アデニレートキナーゼ融合ペプチドを発現させた培養物
からアデニレートキナーゼ融合ペプチドを回収、精製す
る方法に関する。
［従来の技術］
遺伝子組換え手段等により大腸菌を用い、異種ペプチド
を生産させる場合、大腸菌のプロテアーゼにより、発現
されたペプチドが分解されるため、往々にして、目的と
するペプチドが得られないことがある。本発明者は、こ
のようなペプチドについては、アデニレートキナーゼと
融合させた状態で発現させることにより、産生できるこ
とを見い出し、提案した（特願平１−２０７２００号、
同１−２７１２５０号）。
を生産させる場合、大腸菌のプロテアーゼにより、発現
されたペプチドが分解されるため、往々にして、目的と
するペプチドが得られないことがある。本発明者は、こ
のようなペプチドについては、アデニレートキナーゼと
融合させた状態で発現させることにより、産生できるこ
とを見い出し、提案した（特願平１−２０７２００号、
同１−２７１２５０号）。
かかる方法で発現されたペプチドは、従来、大腸菌内で
不溶性のペプチドを形成するため、菌体を破砕した後、
遠心分離等により、可溶性のタンパクを分離して固形分
を回収し、塩酸グアニジンや尿素等に溶解し、ゲル濾過
、イオン交換等の手段を用いて精製されていた。しかし
、この方法は、精製効率が悪く、又、大量の処理が困難
であるという問題があった。
不溶性のペプチドを形成するため、菌体を破砕した後、
遠心分離等により、可溶性のタンパクを分離して固形分
を回収し、塩酸グアニジンや尿素等に溶解し、ゲル濾過
、イオン交換等の手段を用いて精製されていた。しかし
、この方法は、精製効率が悪く、又、大量の処理が困難
であるという問題があった。
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、上記問題を解決しようとするもので、本発明
の目的は、アデニレートキナーゼ融合ペプチドを多量に
、しかも収率良く精製処理する方法を提案することにあ
り、これにより有用なポリペプチドを、高純度で、大量
に生産できることになるものである。
の目的は、アデニレートキナーゼ融合ペプチドを多量に
、しかも収率良く精製処理する方法を提案することにあ
り、これにより有用なポリペプチドを、高純度で、大量
に生産できることになるものである。
［課題を解決するための手段］
本発明者は、上記課題解決のため、鋭意、研究を進めた
結果、驚くべきことに、上記アデニレートキナーゼ融合
ペプチドは、塩酸グアニジン或いは尿素溶液として一度
溶解すれば、この塩酸グアニジン或いは尿素の濃度を低
下させても固体として析出せず、他のペプチドから容易
に分離でき、融合ペプチドを高度に濃縮することができ
ることを見出した。
結果、驚くべきことに、上記アデニレートキナーゼ融合
ペプチドは、塩酸グアニジン或いは尿素溶液として一度
溶解すれば、この塩酸グアニジン或いは尿素の濃度を低
下させても固体として析出せず、他のペプチドから容易
に分離でき、融合ペプチドを高度に濃縮することができ
ることを見出した。
本発明は、かかる知見、すなわちアデニレートキナーゼ
融合ペプチドを塩酸グアニジン或いは尿素に溶解し、こ
の溶液中の当該塩酸グアニジン或いは尿素の濃度を低減
するとアデニレートキナーゼ融合ペプチドは溶液の状態
で存在し、他のペプチドが固体として析出し、この性質
の差を利用して両者を効率よく分離することができると
いう知見に基づいてなされたものである。
融合ペプチドを塩酸グアニジン或いは尿素に溶解し、こ
の溶液中の当該塩酸グアニジン或いは尿素の濃度を低減
するとアデニレートキナーゼ融合ペプチドは溶液の状態
で存在し、他のペプチドが固体として析出し、この性質
の差を利用して両者を効率よく分離することができると
いう知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、アデニレートキナーゼ融合ペプチ
ドを含有する粗製物を、塩酸グアニジン又は尿素水溶液
に溶解し、この溶液中の塩酸グアニジン又は尿素の濃度
を低減し、析出する固形分を分離除去し、溶液を採取す
ることよりなるアデニレートキナーゼ融合ペプチドの精
製方法である。
ドを含有する粗製物を、塩酸グアニジン又は尿素水溶液
に溶解し、この溶液中の塩酸グアニジン又は尿素の濃度
を低減し、析出する固形分を分離除去し、溶液を採取す
ることよりなるアデニレートキナーゼ融合ペプチドの精
製方法である。
本発明において、アデニレートキナーゼ融合ペプチドを
含有する粗製物としてはアデニレートキナーゼ融合ペプ
チドを発現させた培養物が用いられる。特に、このよう
なものとしてアデニレートキナーゼ若しくはその類縁体
のアミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする塩基配
列からなるＤＮＡに被融合ペプチドのアミノ酸配列から
なるＤＮＡを結合させた発現ベクターを微生物または細
胞に導入しアデニレートキナーゼ融合ペプチドを発現さ
せ、得られた微生物または細胞を破砕した後、固液分離
して固形分を回収したものが用いられる。
含有する粗製物としてはアデニレートキナーゼ融合ペプ
チドを発現させた培養物が用いられる。特に、このよう
なものとしてアデニレートキナーゼ若しくはその類縁体
のアミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする塩基配
列からなるＤＮＡに被融合ペプチドのアミノ酸配列から
なるＤＮＡを結合させた発現ベクターを微生物または細
胞に導入しアデニレートキナーゼ融合ペプチドを発現さ
せ、得られた微生物または細胞を破砕した後、固液分離
して固形分を回収したものが用いられる。
このような微生物または細胞としては大腸菌を用いるこ
とが望ましい。また、本発明の方法は被融合ペプチドが
ヒルジンもしくはその類縁体であるアデニレートキナー
ゼ融合ペプチドの精製に用いることが望ましい。
とが望ましい。また、本発明の方法は被融合ペプチドが
ヒルジンもしくはその類縁体であるアデニレートキナー
ゼ融合ペプチドの精製に用いることが望ましい。
上記アデニレートキナーゼとは、アデニル酸の末端リン
酸基を、受容体となる化合物の水酸基、カルボキシル基
、リン酸基などに転移し、リン酸化合物を触媒する酵素
で、動物の筋肉、肝臓等或いは酵母、植物、細菌等に含
まれているものである。この酵素のアミノ酸配列は、多
くのもので知られており、１９４のアミノ酸からなって
いる。本発明では、これらの全てのアデニレートキナー
ゼを用いることができる。というのも、これらの酵素の
すべては、大腸菌等で発現させた場合、大腸菌内で不溶
であり、しかも塩酸グアニジンや尿素等の溶液に溶解す
ると、このアデニレートキナーゼが本来の立体構造をと
るため、塩酸グアニジンや尿素等の濃度を低下させても
析出してこないという共通の性質を有するためである。
酸基を、受容体となる化合物の水酸基、カルボキシル基
、リン酸基などに転移し、リン酸化合物を触媒する酵素
で、動物の筋肉、肝臓等或いは酵母、植物、細菌等に含
まれているものである。この酵素のアミノ酸配列は、多
くのもので知られており、１９４のアミノ酸からなって
いる。本発明では、これらの全てのアデニレートキナー
ゼを用いることができる。というのも、これらの酵素の
すべては、大腸菌等で発現させた場合、大腸菌内で不溶
であり、しかも塩酸グアニジンや尿素等の溶液に溶解す
ると、このアデニレートキナーゼが本来の立体構造をと
るため、塩酸グアニジンや尿素等の濃度を低下させても
析出してこないという共通の性質を有するためである。
本発明では、このアデニレートキナーゼの全アミノ酸配
列を用いる必要はなく、その断片部分でも、上記性質を
保持する限り、本発明に適用することができることはい
うまでもない。この性質は、アミノ末端から６５までの
アミノ酸からなるペプチドであれば、完全に保持してお
り、少なくとも、アミノ末端から６５までのペプチドか
らなるものであれば十分用いることができる。又、上記
性質を有するのであれば、これらの類縁体を用いること
ができることは、いうまでもない。
列を用いる必要はなく、その断片部分でも、上記性質を
保持する限り、本発明に適用することができることはい
うまでもない。この性質は、アミノ末端から６５までの
アミノ酸からなるペプチドであれば、完全に保持してお
り、少なくとも、アミノ末端から６５までのペプチドか
らなるものであれば十分用いることができる。又、上記
性質を有するのであれば、これらの類縁体を用いること
ができることは、いうまでもない。
一方、被融合ペプチドは、目的とする生理活性を有する
ペプチドで、特には、制限はないが、大腸菌等の微生物
や細胞のプロテアーゼにより、発現されたペプチドが分
解され、大腸菌等の微生物や細胞により生産ができない
ような、例えば、ヒルジンや細胞成長因子（ＴＧＦ−α
）等を用いることが好ましい。
ペプチドで、特には、制限はないが、大腸菌等の微生物
や細胞のプロテアーゼにより、発現されたペプチドが分
解され、大腸菌等の微生物や細胞により生産ができない
ような、例えば、ヒルジンや細胞成長因子（ＴＧＦ−α
）等を用いることが好ましい。
本発明のアデニレートキナーゼ若しくはその類縁体のア
ミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする塩基配列か
らなるＤＮＡに被融合ペプチドのアミノ酸配列からなる
ＤＮＡを結合させた発現ベクターを大腸菌に導入し、ア
デニレートキナーゼ融合ペプチドを発現させる具体的な
方法は、アデニレートキナーゼとして、ブタ−アデニレ
ートキナーゼを用い、被融合ペプチドとしてヒルジン或
いはＴＧＦ−αを用いた場合について、特願平１−２０
７２００号及び同１−２７１２５０号に詳細に記載して
いる。
ミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする塩基配列か
らなるＤＮＡに被融合ペプチドのアミノ酸配列からなる
ＤＮＡを結合させた発現ベクターを大腸菌に導入し、ア
デニレートキナーゼ融合ペプチドを発現させる具体的な
方法は、アデニレートキナーゼとして、ブタ−アデニレ
ートキナーゼを用い、被融合ペプチドとしてヒルジン或
いはＴＧＦ−αを用いた場合について、特願平１−２０
７２００号及び同１−２７１２５０号に詳細に記載して
いる。
すなわち、特願平１−２０７２００号には、ｔａｃプロ
モーターまたはｔｒｐプロモーターのフラグメント、市
販のプラスミドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフ
ラグメント、ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配
列の一部もしくは全部をコードする塩基配列からなるＤ
ＮＡ及びヒルジンもしくはその類縁体のアミノ酸配列を
コードする塩基配列からなるＤＮＡを含み、かつ前記両
ＤＮＡが結合されていてブタ−アデニレートキナーゼの
アミノ酸配列の一部もしくは全部とヒルジンもしくはそ
の類縁体との融合蛋白を発現するようにされているヒル
ジン発現ベクターを大腸菌に形質導入し、この大腸菌を
培養し、ヒルジン融合蛋白を発現させ、これを採取する
方法が記載されている。
モーターまたはｔｒｐプロモーターのフラグメント、市
販のプラスミドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフ
ラグメント、ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配
列の一部もしくは全部をコードする塩基配列からなるＤ
ＮＡ及びヒルジンもしくはその類縁体のアミノ酸配列を
コードする塩基配列からなるＤＮＡを含み、かつ前記両
ＤＮＡが結合されていてブタ−アデニレートキナーゼの
アミノ酸配列の一部もしくは全部とヒルジンもしくはそ
の類縁体との融合蛋白を発現するようにされているヒル
ジン発現ベクターを大腸菌に形質導入し、この大腸菌を
培養し、ヒルジン融合蛋白を発現させ、これを採取する
方法が記載されている。
また、特願平１−２７１２５０号には、ｔａｃプロモー
ターのフラグメント、市販のプラスミドｐＵｃ１８の複
製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ブタ−アデニレー
トキナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部をコード
する塩基配列からなるＤＮＡ及びＴＧＦ−αのアミノ酸
配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含み、かつ
前記両ＤＮＡが結合されていて、ブタ−アデニレートキ
ナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部とＴＧＦ−α
との融合蛋白を発現するようにされているＴＧＦ−α発
現ベクターを大腸菌に形質導入し、この大腸菌を培養し
、ＴＧＦ−α融合蛋白を発現させ、これを採取する方法
が記載されている。
ターのフラグメント、市販のプラスミドｐＵｃ１８の複
製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ブタ−アデニレー
トキナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部をコード
する塩基配列からなるＤＮＡ及びＴＧＦ−αのアミノ酸
配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含み、かつ
前記両ＤＮＡが結合されていて、ブタ−アデニレートキ
ナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部とＴＧＦ−α
との融合蛋白を発現するようにされているＴＧＦ−α発
現ベクターを大腸菌に形質導入し、この大腸菌を培養し
、ＴＧＦ−α融合蛋白を発現させ、これを採取する方法
が記載されている。
本発明では、このようにして培養した大腸菌等を、培養
液のままで破砕機で破砕する。この破砕は、ホモジナイ
ザー、超音波破砕或いはフレンチプレス等の通常の手段
により行うことができる。この破砕は、光学密度が６０
〜９０％減少するまで行うことが好ましい。この場合、
アデニレートキナーゼ融合ペプチドは固体で存在してい
る。そこで、この破砕された菌から固液分離して、可溶
性のペプチドを除去するとともに、アデニレートキナー
ゼ融合ペプチドを含む固形分を回収する。この固液分離
は、遠心分離や濾過分離等の手段を用いると簡便である
。回収された固形物は、洗浄され、４〜６Ｍ塩酸グアジ
ニン又は３〜７Ｍ尿素を含む１０〜１００ｍＭのトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５〜８．５）に溶解される。この
場合、ジチオスレトール、β−メルカプトエタノール、
グルタチオン或いはシスティン等還元剤を添加すると溶
解は容易になる。この溶液に対し、上記固形物を５〜２
０重量％になるように溶解すると良い。次に、この溶液
中の塩酸グアニジン又は尿素の濃度を低減させる。この
濃度を低減させる方法としては、透析、希釈等によるの
が簡便で好ましい。透析による方法は、セルロース、コ
ロジオン膜、ホローファイバー等の半透膜を用い、水に
対して行うことが好ましい。また希釈による場合は、水
又はトリス塩酸緩衝液等を用いると良い。この濃度の低
減は塩酸グアニジン又は尿素が０．１〜１．ＯＭ濃度に
なるまで行うと良い。これにより、大部分のペプチドが
固形物として析出してくるが、アデニレートキナーゼ融
合ペプチドは溶解状態で存在している。これを固液分離
して、溶液を回収し、シアノゼンブロマイド等を用い、
アデニレートキナーゼ融合ペプチドを切断し、アデニレ
ートキナーゼと被融合ペプチドとに分離する。得られた
被融合ペプチドを必要により、ジチオスレトール、β−
メルカプトエタノール、グルタチオン或いはシスティン
等によりホールディングし、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー或いは高速液体クロ
マトグラフィーで精製することにより、目的のペプチド
を得ることができる。
液のままで破砕機で破砕する。この破砕は、ホモジナイ
ザー、超音波破砕或いはフレンチプレス等の通常の手段
により行うことができる。この破砕は、光学密度が６０
〜９０％減少するまで行うことが好ましい。この場合、
アデニレートキナーゼ融合ペプチドは固体で存在してい
る。そこで、この破砕された菌から固液分離して、可溶
性のペプチドを除去するとともに、アデニレートキナー
ゼ融合ペプチドを含む固形分を回収する。この固液分離
は、遠心分離や濾過分離等の手段を用いると簡便である
。回収された固形物は、洗浄され、４〜６Ｍ塩酸グアジ
ニン又は３〜７Ｍ尿素を含む１０〜１００ｍＭのトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５〜８．５）に溶解される。この
場合、ジチオスレトール、β−メルカプトエタノール、
グルタチオン或いはシスティン等還元剤を添加すると溶
解は容易になる。この溶液に対し、上記固形物を５〜２
０重量％になるように溶解すると良い。次に、この溶液
中の塩酸グアニジン又は尿素の濃度を低減させる。この
濃度を低減させる方法としては、透析、希釈等によるの
が簡便で好ましい。透析による方法は、セルロース、コ
ロジオン膜、ホローファイバー等の半透膜を用い、水に
対して行うことが好ましい。また希釈による場合は、水
又はトリス塩酸緩衝液等を用いると良い。この濃度の低
減は塩酸グアニジン又は尿素が０．１〜１．ＯＭ濃度に
なるまで行うと良い。これにより、大部分のペプチドが
固形物として析出してくるが、アデニレートキナーゼ融
合ペプチドは溶解状態で存在している。これを固液分離
して、溶液を回収し、シアノゼンブロマイド等を用い、
アデニレートキナーゼ融合ペプチドを切断し、アデニレ
ートキナーゼと被融合ペプチドとに分離する。得られた
被融合ペプチドを必要により、ジチオスレトール、β−
メルカプトエタノール、グルタチオン或いはシスティン
等によりホールディングし、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー或いは高速液体クロ
マトグラフィーで精製することにより、目的のペプチド
を得ることができる。
［実施例］
本発明のより好ましい一実施態様を、ヒルジンを用いた
場合を例として説明する。
場合を例として説明する。
陪１
特願平１−２０７２００号に記載される次の方法で、プ
ラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１で形質転換された大腸菌を得
た。
ラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１で形質転換された大腸菌を得
た。
すなわち、市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３ （ファ
ルマシア社製）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＮｒｕＩで切
断したＰ ｔａｃサイト部と市販のｐＵｃ１８を制限酵
素Ｐｖｕ １及びＰｖｕ Ｉｆで切断した複製開始点（
Ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子を含むサイト部と
を１４リガーゼで接合した。これを大腸菌ＪＭ１０９株
に導入して培養し、アンピシリン耐性によりスクリーニ
ングして、ｔａｃプロモーター とｐＵｃ１８の複製開
始点（Ｏｒｉ）とを有するベクターを得た。このプラス
ミドをｐＭＫ２とした。このプラスミドｐｌｉｌＫ２１
０μｇを３Ｏ単位のＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩで
消化し、ｔａｃプロモーターを含む断片を除去し、複製
開始点を含む断片をアガロースゲル電気泳動によって回
収した。
ルマシア社製）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＮｒｕＩで切
断したＰ ｔａｃサイト部と市販のｐＵｃ１８を制限酵
素Ｐｖｕ １及びＰｖｕ Ｉｆで切断した複製開始点（
Ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子を含むサイト部と
を１４リガーゼで接合した。これを大腸菌ＪＭ１０９株
に導入して培養し、アンピシリン耐性によりスクリーニ
ングして、ｔａｃプロモーター とｐＵｃ１８の複製開
始点（Ｏｒｉ）とを有するベクターを得た。このプラス
ミドをｐＭＫ２とした。このプラスミドｐｌｉｌＫ２１
０μｇを３Ｏ単位のＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩで
消化し、ｔａｃプロモーターを含む断片を除去し、複製
開始点を含む断片をアガロースゲル電気泳動によって回
収した。
一方、ｔｒｐプロモーターの塩基配列をＤＮＡ合成機で
合成した。これを逆相Ｃ１８カラムを用いた高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製し、各々１０１００ｐ １
をアニーリングして二重鎖ＤＮＡを得た。この断片と前
記ｐＭＫ２とをＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７ｎ［で消化し
た断片はＴ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃で一晩反応さ
せた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、
ｔｒｐプロモーターとｐＭＫ２の複製開始点（Ｏｒｉ）
とを有するベクターを調整した。このプラスミドの塩基
配列はサンガー等の方法で確認し、ｐＭＴ １と命名し
た。このプラスミドｐＭＴ１１μｇを１Ｏ単位の制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｍで切断し、ベクタ一部分を
アガロースゲル電気泳動法により回収した。一方ｐＭＡ
ＫＨＶＩ １ｏμｇ４３ｏ単位のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化し、融合蛋白質をコードする遺伝子断片
をゲルから回収した。この断片と上記ｐＭＴ１のＥｃｏ
ＲＩ及びＥｃｏＲ４７ｍで消化した断片を、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼにより１６℃で一晩反応させた。これを用い
て大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、目的の組換え体プ
ラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１をもつ菌種を得た。この菌種
は、受託番号微工研条寄第２５３８号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−２５３８）として微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。
合成した。これを逆相Ｃ１８カラムを用いた高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製し、各々１０１００ｐ １
をアニーリングして二重鎖ＤＮＡを得た。この断片と前
記ｐＭＫ２とをＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７ｎ［で消化し
た断片はＴ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃で一晩反応さ
せた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、
ｔｒｐプロモーターとｐＭＫ２の複製開始点（Ｏｒｉ）
とを有するベクターを調整した。このプラスミドの塩基
配列はサンガー等の方法で確認し、ｐＭＴ １と命名し
た。このプラスミドｐＭＴ１１μｇを１Ｏ単位の制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｍで切断し、ベクタ一部分を
アガロースゲル電気泳動法により回収した。一方ｐＭＡ
ＫＨＶＩ １ｏμｇ４３ｏ単位のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化し、融合蛋白質をコードする遺伝子断片
をゲルから回収した。この断片と上記ｐＭＴ１のＥｃｏ
ＲＩ及びＥｃｏＲ４７ｍで消化した断片を、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼにより１６℃で一晩反応させた。これを用い
て大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、目的の組換え体プ
ラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１をもつ菌種を得た。この菌種
は、受託番号微工研条寄第２５３８号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−２５３８）として微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。
このようにして特願平１−２０７２００号の方法で得た
プラスミドｐＭＴＡＫＨＶ １で形質転換された大腸菌
［受託番号微工研条寄第２５３８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２５３８）］を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ
９培地（グルコース５ｇ／ｌ、カザミノ酸５ｇ／ｌ、
ＮａＪＰＯ４６ｇ／ｌ、ＫＨ２Ｐ０゜３ｇ／ｌ、 Ｎａ
Ｃ１０，５ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌ ０．５ｇ／ｌ、チアミ
ン塩酸塩１０ｍｇ／ｌ、Ｍｇ５Ｏ，ｉｏ１ｇ／ｌ、Ｃａ
Ｃｌ２１００．ｃｚ ｇ／ｌ、トリプトファン５０ｍｇ
／ｌ、 ｐＨ７，２） １５１を用いて、３７℃で一晩
培養する。
プラスミドｐＭＴＡＫＨＶ １で形質転換された大腸菌
［受託番号微工研条寄第２５３８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２５３８）］を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ
９培地（グルコース５ｇ／ｌ、カザミノ酸５ｇ／ｌ、
ＮａＪＰＯ４６ｇ／ｌ、ＫＨ２Ｐ０゜３ｇ／ｌ、 Ｎａ
Ｃ１０，５ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌ ０．５ｇ／ｌ、チアミ
ン塩酸塩１０ｍｇ／ｌ、Ｍｇ５Ｏ，ｉｏ１ｇ／ｌ、Ｃａ
Ｃｌ２１００．ｃｚ ｇ／ｌ、トリプトファン５０ｍｇ
／ｌ、 ｐＨ７，２） １５１を用いて、３７℃で一晩
培養する。
融合ペプチドの回 。
培養終了後に、この培養液を５〜１０℃、４５０〜５０
０ｋｇ／ｃｒｒｒ 、供給速度２００〜３００ｍ１／ｍ
ｉｎの条件で、ホモジナイザー（Ｍａｎｔｏｎ Ｇａｕ
ｌｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）に約３回通し、大
腸菌を破砕し、遠心分離器により、固液分離を行なう。
０ｋｇ／ｃｒｒｒ 、供給速度２００〜３００ｍ１／ｍ
ｉｎの条件で、ホモジナイザー（Ｍａｎｔｏｎ Ｇａｕ
ｌｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）に約３回通し、大
腸菌を破砕し、遠心分離器により、固液分離を行なう。
得られた固形分を１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含
む１％のトリトンＸ−１００水溶液１０１に再分散して
洗浄し、遠心分離して、ペレットを得る。この洗浄後の
ペレットを６Ｍの塩酸グアニジン又は尿素、５０ｍＭの
トリス塩酸及び１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸含有水
溶液（ｐＨ８，５）１２１に分散し、これにβ−メルカ
プトエタノールを０．１Ｍになるように添加して、室温
で１時間攪拌して、還元を行なう。これを水または５０
ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）で、当該塩酸グ
アニジンまたは尿素が０．５Ｍになるまで希釈するか、
又は、半透膜に入れ、２００Ｉの水を対象液とし、これ
を２回交換して塩酸グアニジン又は尿素が０．３Ｍ濃度
になるまで約１８時間透析し、透析後の液を遠心分離し
て、析出した固形分を除去し、溶液骨をホーローファイ
バーを用いて、２１以下になるまで濃縮する。
む１％のトリトンＸ−１００水溶液１０１に再分散して
洗浄し、遠心分離して、ペレットを得る。この洗浄後の
ペレットを６Ｍの塩酸グアニジン又は尿素、５０ｍＭの
トリス塩酸及び１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸含有水
溶液（ｐＨ８，５）１２１に分散し、これにβ−メルカ
プトエタノールを０．１Ｍになるように添加して、室温
で１時間攪拌して、還元を行なう。これを水または５０
ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）で、当該塩酸グ
アニジンまたは尿素が０．５Ｍになるまで希釈するか、
又は、半透膜に入れ、２００Ｉの水を対象液とし、これ
を２回交換して塩酸グアニジン又は尿素が０．３Ｍ濃度
になるまで約１８時間透析し、透析後の液を遠心分離し
て、析出した固形分を除去し、溶液骨をホーローファイ
バーを用いて、２１以下になるまで濃縮する。
ヒルジンの回 １
上記濃縮液を、最終的に７０％になるようにギ酸を加え
て５〜１０１の水溶液とし、これに、融合ペプチドの１
／２量程度のシアノセンブロマイドを加え、室温で１２
〜１８時間インキュベートする。この液をエバポレータ
を用いて、４０°Ｃで、濃縮乾固し、これに、６Ｍの尿
素、５０ｒｎＭのトリス塩酸及び１ｍＭのエチレンジア
ミン四酢酸含有水溶液（ｐＨ８、５）をペプチドの濃度
が１０ｍｇ１０＋１になるように加え、これにさらに、
０．１Ｍになるようにβ−メルカプトエタノールを添加
する。これを１０〜２０倍量の５０ｍＭのトリス塩酸及
び１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸含有水溶液（ｐＨ８
，５）に対し、室温で、１２〜１８時間透析する。さら
に、２００〜３００！の水を対象液とし、４℃で、水を
３〜４回交換し、−回当り６〜１２時間かけて、透析を
行なう。透析後の液を遠心分離して、析出した固形分を
除去し、ＤＥＡＥセファセル（ファルマシア社製）充填
カラムを用い、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）に塩化ナトリウムを加えて展開液とし、この塩化ナト
リウム濃度を０１から０．４Ｍにグラシュエンドさせな
がら、アニオン交換クロマトグラフィーにより溶出分離
する。ヒルジンが含まれる画分を取り、凍結乾燥する。
て５〜１０１の水溶液とし、これに、融合ペプチドの１
／２量程度のシアノセンブロマイドを加え、室温で１２
〜１８時間インキュベートする。この液をエバポレータ
を用いて、４０°Ｃで、濃縮乾固し、これに、６Ｍの尿
素、５０ｒｎＭのトリス塩酸及び１ｍＭのエチレンジア
ミン四酢酸含有水溶液（ｐＨ８、５）をペプチドの濃度
が１０ｍｇ１０＋１になるように加え、これにさらに、
０．１Ｍになるようにβ−メルカプトエタノールを添加
する。これを１０〜２０倍量の５０ｍＭのトリス塩酸及
び１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸含有水溶液（ｐＨ８
，５）に対し、室温で、１２〜１８時間透析する。さら
に、２００〜３００！の水を対象液とし、４℃で、水を
３〜４回交換し、−回当り６〜１２時間かけて、透析を
行なう。透析後の液を遠心分離して、析出した固形分を
除去し、ＤＥＡＥセファセル（ファルマシア社製）充填
カラムを用い、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）に塩化ナトリウムを加えて展開液とし、この塩化ナト
リウム濃度を０１から０．４Ｍにグラシュエンドさせな
がら、アニオン交換クロマトグラフィーにより溶出分離
する。ヒルジンが含まれる画分を取り、凍結乾燥する。
これを水に溶解し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（バイダック社
製）充填カラムを用い、０．０６５％濃度トリフルオロ
酢酸水溶液に、アセトニトリルを１５→３０％にグラシ
ュエンドさせるか、又は２１％アセトニトリル濃度の０
．０６５％濃度トリフルオロ酢酸水溶液で、高速液体ク
ロマトグラフィーにより溶出分離する。
製）充填カラムを用い、０．０６５％濃度トリフルオロ
酢酸水溶液に、アセトニトリルを１５→３０％にグラシ
ュエンドさせるか、又は２１％アセトニトリル濃度の０
．０６５％濃度トリフルオロ酢酸水溶液で、高速液体ク
ロマトグラフィーにより溶出分離する。
（実験例）
特願平１−２０７２００号の方法で得たプラスミドｐＭ
ＴＡＫＨＶ １で形質転換された大腸菌［受諾番号微工
研条寄第２５３８号（ＦＥＲＭ ＢＰ”２５３８）］を
５０ ｐ ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９培地１５
１を用いて、３７℃で１晩培養した。
ＴＡＫＨＶ １で形質転換された大腸菌［受諾番号微工
研条寄第２５３８号（ＦＥＲＭ ＢＰ”２５３８）］を
５０ ｐ ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９培地１５
１を用いて、３７℃で１晩培養した。
培養終了後に、この培養液を１０℃、４５０ｋｇ／ｃｒ
ｒｌ’、供給速度３００ｍ１／ｍｉｎの条件で、ホモジ
ナイザーに３回通し、大腸菌を破砕し、遠心分離器によ
り、固液分離を行った。得られた固形分を１ｍＭのエチ
レンジアミン四酢酸を含む１％のトリトンＸ−１００水
溶液１０１に再分散して洗浄し、遠心分離して、ペレッ
トを得た。
ｒｌ’、供給速度３００ｍ１／ｍｉｎの条件で、ホモジ
ナイザーに３回通し、大腸菌を破砕し、遠心分離器によ
り、固液分離を行った。得られた固形分を１ｍＭのエチ
レンジアミン四酢酸を含む１％のトリトンＸ−１００水
溶液１０１に再分散して洗浄し、遠心分離して、ペレッ
トを得た。
上記操作を繰返し、５種類のペレットを得、これをそれ
ぞれペプチドの濃度が１０〜１５ｇ／ｌとなるように６
Ｍの塩酸グアニジン（実験Ｎｏ１〜３）又は６Ｍの尿素
（実験Ｎｏ４〜５ ） 、５０ｍＭのトリス塩酸及び１
ｍＭのエチレンジアミン四酢酸含有水溶液（ｐＨ８，５
）１２１に分散、溶解した。このうち、塩酸グアニジン
溶液３種と尿素溶液１種（実験Ｎ０４）を半透膜に入れ
、２００１の水を対象液とし、水を２回交換して透析し
、透析後の液を遠心分離して、上清を採取した。また、
他方の尿素溶液（実験Ｎ０５）は、水で１２倍に希釈し
、これを遠心分離して、上清を採取した。
ぞれペプチドの濃度が１０〜１５ｇ／ｌとなるように６
Ｍの塩酸グアニジン（実験Ｎｏ１〜３）又は６Ｍの尿素
（実験Ｎｏ４〜５ ） 、５０ｍＭのトリス塩酸及び１
ｍＭのエチレンジアミン四酢酸含有水溶液（ｐＨ８，５
）１２１に分散、溶解した。このうち、塩酸グアニジン
溶液３種と尿素溶液１種（実験Ｎ０４）を半透膜に入れ
、２００１の水を対象液とし、水を２回交換して透析し
、透析後の液を遠心分離して、上清を採取した。また、
他方の尿素溶液（実験Ｎ０５）は、水で１２倍に希釈し
、これを遠心分離して、上清を採取した。
このペレット及び上清中の融合ペプチドを１７．５％の
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析、デン
シトメーターで測定、定量した。この結果及び回収率を
第１表に示した。
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析、デン
シトメーターで測定、定量した。この結果及び回収率を
第１表に示した。
第１表
（比較実験例）
上記実験例のＮｏ３のベレットについて、ペプチドの濃
度が１０〜１５ｇ／ｌとなるように６Ｍの塩酸グアニジ
ン、５０ｍＭのトリス塩酸及び１ｍＭのエチレンジアミ
ン四酢酸含有水溶液（ｐＨ８，５）１２１に分散、溶解
した溶液を、セファクリルＳ−２００（ファルマシア社
製）充填カラムを用いたゲル濾過を行い、融合ペプチド
が含まれる画分を得、上記と同様の方法で、この両分中
の融合ペプチドの量を測定し、回収率を求めた。この結
果、画分中の融合ペプチドの濃度を４２％まで高めると
、回収率は３６％しかならず、また逆に、回収率を８３
％まで上げると、融合ペプチドの濃度は２５％しかなら
ないことが分かった。
度が１０〜１５ｇ／ｌとなるように６Ｍの塩酸グアニジ
ン、５０ｍＭのトリス塩酸及び１ｍＭのエチレンジアミ
ン四酢酸含有水溶液（ｐＨ８，５）１２１に分散、溶解
した溶液を、セファクリルＳ−２００（ファルマシア社
製）充填カラムを用いたゲル濾過を行い、融合ペプチド
が含まれる画分を得、上記と同様の方法で、この両分中
の融合ペプチドの量を測定し、回収率を求めた。この結
果、画分中の融合ペプチドの濃度を４２％まで高めると
、回収率は３６％しかならず、また逆に、回収率を８３
％まで上げると、融合ペプチドの濃度は２５％しかなら
ないことが分かった。
［発明の効果］
本発明は、アデニレートキナーゼ融合ペプチドが塩酸グ
アニジン又は尿素水溶液に一度溶解し、この溶液中の塩
酸グアニジン又は尿素の濃度を低減させると析出せず溶
液状を保つことができるのに対し、他のペプチドはこれ
らの濃度の低下により析出し、この点の両ペプチドの性
質の差を利用して両者を分離しようとするものである。
アニジン又は尿素水溶液に一度溶解し、この溶液中の塩
酸グアニジン又は尿素の濃度を低減させると析出せず溶
液状を保つことができるのに対し、他のペプチドはこれ
らの濃度の低下により析出し、この点の両ペプチドの性
質の差を利用して両者を分離しようとするものである。
本発明では、この両者の性質の差を利用して分離するこ
とによって、アデニレートキナーゼ融合ペプチドを高純
度で収率よく精製し、採取することができる。本発明の
方法は、遺伝子組換え手段により、大腸菌等にヒルジン
等のような異種ペプチドを発現させた場合、該ペプチド
が大腸菌等のフロテア−ゼにより分解させるのを防止し
、該ペプチドを効率よく精製採取することができるとい
う効果を奏する。
とによって、アデニレートキナーゼ融合ペプチドを高純
度で収率よく精製し、採取することができる。本発明の
方法は、遺伝子組換え手段により、大腸菌等にヒルジン
等のような異種ペプチドを発現させた場合、該ペプチド
が大腸菌等のフロテア−ゼにより分解させるのを防止し
、該ペプチドを効率よく精製採取することができるとい
う効果を奏する。
Claims (3)
- （１）アデニレートキナーゼ融合ペプチドを含有する粗
製物を、塩酸グアニジン又は尿素水溶液に溶解し、この
溶液中の塩酸グアニジン又は尿素の濃度を低減し、析出
する固形分を分離除去し、溶液を採取することを特徴と
するアデニレートキナーゼ融合ペプチドの精製方法。 - （２）アデニレートキナーゼ融合ペプチドを含有する粗
製物が、アデニレートキナーゼ若しくはその類縁体のア
ミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする塩基配列か
らなるＤＮＡに被融合ペプチドのアミノ酸配列からなる
ＤＮＡを結合させた発現ベクターを微生物又は細胞に導
入し、アデニレートキナーゼ融合ペプチドを発現させ、
得られた微生物又は細胞を破砕し、固液分離して固形分
を回収したものである請求項（１）に記載のアデニレー
トキナーゼ融合ペプチドの精製法。 - （３）アデニレートキナーゼ融合ペプチドがアデニレー
トキナーゼとヒルジンもしくはその類縁体とが融合した
ペプチドである請求項（１）または（２）記載のアデニ
レートキナーゼ融合ペプチドの精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015286A JPH03219890A (ja) | 1990-01-25 | 1990-01-25 | アデニレートキナーゼ融合ペプチドの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015286A JPH03219890A (ja) | 1990-01-25 | 1990-01-25 | アデニレートキナーゼ融合ペプチドの精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03219890A true JPH03219890A (ja) | 1991-09-27 |
Family
ID=11884607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015286A Pending JPH03219890A (ja) | 1990-01-25 | 1990-01-25 | アデニレートキナーゼ融合ペプチドの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03219890A (ja) |
-
1990
- 1990-01-25 JP JP2015286A patent/JPH03219890A/ja active Pending
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