JPH01256390A - 新規ｄｎａとその生産方法、それを有する新規プラスミド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤 - Google Patents
新規ｄｎａとその生産方法、それを有する新規プラスミド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤Info
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- JPH01256390A JPH01256390A JP63081683A JP8168388A JPH01256390A JP H01256390 A JPH01256390 A JP H01256390A JP 63081683 A JP63081683 A JP 63081683A JP 8168388 A JP8168388 A JP 8168388A JP H01256390 A JPH01256390 A JP H01256390A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は新規ＤＮＡ、詳細には、サイモシンβ４ ぐ以
下、ＴＭ０１と称す）とＴＮＦとをコードする新規ＤＮ
Ａとその新規生産方法、それを含有する新規プラスミド
、該ＤＮＡにより発現される新規ポリペプチドとその生
産方法及び、該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤に間
する。
下、ＴＭ０１と称す）とＴＮＦとをコードする新規ＤＮ
Ａとその新規生産方法、それを含有する新規プラスミド
、該ＤＮＡにより発現される新規ポリペプチドとその生
産方法及び、該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤に間
する。
〔従来の技術］
ＴＭ０１は、免疫能を回復させると報告されている胸腺
ホルモンであるサイモシンの１ ｆｉ （ｒ現代化学Ｊ
１９ｅ５年１２月号３４〜３８頁）なので、腫瘍細胞
等の恋性化骨髄細胞を単球細胞に分化誘導する作用を有
すると考えられており、そのアミノ酸配列も次の通りに
解明されている。
ホルモンであるサイモシンの１ ｆｉ （ｒ現代化学Ｊ
１９ｅ５年１２月号３４〜３８頁）なので、腫瘍細胞
等の恋性化骨髄細胞を単球細胞に分化誘導する作用を有
すると考えられており、そのアミノ酸配列も次の通りに
解明されている。
Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ １ｅ−Ｇｌｕ −Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−８ｅｒ −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｔｈ ｒ −Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ
−Ｌｙｓ −Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ −
Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｌａ −Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ−９ｅｒ。
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ １ｅ−Ｇｌｕ −Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−８ｅｒ −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｔｈ ｒ −Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ
−Ｌｙｓ −Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ −
Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｌａ −Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ−９ｅｒ。
しかし、従来の方法では、ウシ胸腺１ｇから、わずか４
６１μｇが分離できろ程度であり、また、精製操作も極
めて煩雑である［アナルズ ニューヨーク アカデミ−
オブ サイエンシス゛（Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ） 。
６１μｇが分離できろ程度であり、また、精製操作も極
めて煩雑である［アナルズ ニューヨーク アカデミ−
オブ サイエンシス゛（Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ） 。
ｖｏｌ ２４９，１３４頁、１９７５年］。即ち、Ｔ
Ｍ０１は、それを高純度で大量に生産する方法が発明さ
れていないために、その有用性に関する研究は未だ大き
な発展をみていない。
Ｍ０１は、それを高純度で大量に生産する方法が発明さ
れていないために、その有用性に関する研究は未だ大き
な発展をみていない。
一方、ＴＮＦは腫瘍壊死因子の総称であり、ヒト起源の
ものとしては、ザ ジャーナル オブバイオロジカル
ケミストリー ［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｒｉａ
ｌ、 Ｃｈｅｗ、、 、ｊＪ３Ｊｌ、 ２３４５〜２３
５４頁（１９８５年）コに記載されているヒ［１胞株Ｈ
Ｌ−６０ （ＡＴＣＣ２４０）より得られたＴＮＦ−α
が知られており、そのアミノ酸配列も次の通りに解明さ
れている。
ものとしては、ザ ジャーナル オブバイオロジカル
ケミストリー ［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｒｉａ
ｌ、 Ｃｈｅｗ、、 、ｊＪ３Ｊｌ、 ２３４５〜２３
５４頁（１９８５年）コに記載されているヒ［１胞株Ｈ
Ｌ−６０ （ＡＴＣＣ２４０）より得られたＴＮＦ−α
が知られており、そのアミノ酸配列も次の通りに解明さ
れている。
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−３ｅｒ −
５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ −Ａｓｐ−
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ−Ｖ
ａｔ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐ ｒ ｏ−Ｇ ｌ ｎ−Ａ
Ｉ ａ−Ｇ １ ｕ−Ｇ ｌ ｙ −Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ｇｉｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ −Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＡＩａ−Ａ
ｓｎ−Ｇ ｌ ｙ−Ｖａ ｌ−Ｇ ｌ ｕ−Ｌ ｅ ｕ
−Ａｒ ｇ −Ａｓ ｐ−Ａｓ ｎ−Ｇ ｌ ｎ−Ｌ
ｅ ｕ−Ｖａ ｌ −Ｖａｌ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｌ ｅ ＩＪ −Ｔ ｙ ｒ −Ｌ ｅ １
＋ −１１ｅ −Ｔ ｙ ｒ −５ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ −Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｃｙｓ −Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａ
ｔ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｂｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ −１
１ｅ−３ｅｒ−Ａｒｇ−１ｉｅ−Ａｌａ−Ｖａ １−５
ｅ ｒ−Ｔｙｒ−Ｇ Ｉ ｎ−Ｔｂ ｒ −Ｌｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −５ｅｒ−Ａｌａ−Ｉ
１ｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ −Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒｇ−ＧＩＩＪ −Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−
Ｇａｙ−Ａｌａ −Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｔｒｐ −Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙ
ｒ −Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ −Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ −Ａｓｐ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ −Ｇｌｕ−Ｉ ｌｅ
−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ −Ａｌａ−Ｇｌｕ−９ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ −Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉ
１ｅ −１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ 。
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ−Ｖ
ａｔ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐ ｒ ｏ−Ｇ ｌ ｎ−Ａ
Ｉ ａ−Ｇ １ ｕ−Ｇ ｌ ｙ −Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ｇｉｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ −Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＡＩａ−Ａ
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−Ｇｌｙ−Ｌ ｅ ＩＪ −Ｔ ｙ ｒ −Ｌ ｅ １
＋ −１１ｅ −Ｔ ｙ ｒ −５ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ −Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｃｙｓ −Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａ
ｔ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｂｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ −１
１ｅ−３ｅｒ−Ａｒｇ−１ｉｅ−Ａｌａ−Ｖａ １−５
ｅ ｒ−Ｔｙｒ−Ｇ Ｉ ｎ−Ｔｂ ｒ −Ｌｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −５ｅｒ−Ａｌａ−Ｉ
１ｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ −Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒｇ−ＧＩＩＪ −Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−
Ｇａｙ−Ａｌａ −Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｔｒｐ −Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙ
ｒ −Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ −Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ −Ａｓｐ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ −Ｇｌｕ−Ｉ ｌｅ
−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ −Ａｌａ−Ｇｌｕ−９ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ −Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉ
１ｅ −１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ 。
（上記アミノ酸配列において、初めから１８番目のアミ
ノ酸であるＡｌａから最後のＬｅｕまでのアミノ酸配列
は、ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグア
ニン（Ｇ）を連結した形の塩基配列に対応する。従って
、明細書の他の部分における記載においては、上記Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ部分はｒＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配
列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応する
アミノ酸配列」と表現する） しかし、このＴ Ｎ Ｆ−αが抗腫瘍活性を示す細胞は
極めて限定されており［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
Ｊ −２」Ｌ山−、９４３〜９４５頁（１９８５年）
］、又、脂肪細胞の異１ヒを光道させるいわゆるカケク
チン活性を有することも報告されている［セラビューテ
ィック リサーチ （Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） 、−
ヱー、第２号、１８４〜１９０頁、１９８７年］。その
ため、このＴＮＦ−αの欠陥を補うべく、いくつかの組
換えＴＮＦ（以下、ｒＴＮＦと称す）が発明されている
。
ノ酸であるＡｌａから最後のＬｅｕまでのアミノ酸配列
は、ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグア
ニン（Ｇ）を連結した形の塩基配列に対応する。従って
、明細書の他の部分における記載においては、上記Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ部分はｒＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配
列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応する
アミノ酸配列」と表現する） しかし、このＴ Ｎ Ｆ−αが抗腫瘍活性を示す細胞は
極めて限定されており［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
Ｊ −２」Ｌ山−、９４３〜９４５頁（１９８５年）
］、又、脂肪細胞の異１ヒを光道させるいわゆるカケク
チン活性を有することも報告されている［セラビューテ
ィック リサーチ （Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） 、−
ヱー、第２号、１８４〜１９０頁、１９８７年］。その
ため、このＴＮＦ−αの欠陥を補うべく、いくつかの組
換えＴＮＦ（以下、ｒＴＮＦと称す）が発明されている
。
［発明が解決しようとする課題］
このような状況下において、本発明の目的は、ＴＨβ４
とＴＮＦとをコードし、ＴＨβ４を高純度で大量生産す
ることを初めて可能にした新規ＤＮＡとその生産方法、
それを含有する新規プラスミド、該ＤＮＡにより発現さ
れる新規ポリペプチドとその生産方法及び、該ポリペプ
チドからなる新規抗腫瘍剤を提供することにある。
とＴＮＦとをコードし、ＴＨβ４を高純度で大量生産す
ることを初めて可能にした新規ＤＮＡとその生産方法、
それを含有する新規プラスミド、該ＤＮＡにより発現さ
れる新規ポリペプチドとその生産方法及び、該ポリペプ
チドからなる新規抗腫瘍剤を提供することにある。
［課題を解決するための手段］
本発明により、次のアミノ酸配列をコードする新規ＤＮ
Ａが提供される。
Ａが提供される。
（ＴＨβ４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−−Ｐ ｒ ｏ−
ｘ −（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列）（式中、Ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のい
ずれかを表す。
ｘ −（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列）（式中、Ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のい
ずれかを表す。
１）Ｖａｌ−５ｅｒ−９ｅｒ−５ｅｒ −Ａ、 ｒ ｇ
−Ｔ ｂ ｒ −Ｐ ｒ ｏ −Ｓ ｅ ｒ −Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ − Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ ； ２）Ｖａ １−Ａｒ ｇ−３ｅ ｒ−Ｓｅ ｒ −Ｓｅ
ｔ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ − ５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｖａｌ−Ａｌａ−）Ｔｉｓ−Ｖａｔ −Ｖａじ ３）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ −Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ− Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｖａ １−Ａｌ ａ−Ｈｉ ５−Ｖａ １ −
Ｖａｌ： ４）Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−３ｅｒ −Ｔｈｒ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ −９ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ −Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ −Ｖ
ａ １ ： ５）Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ −Ｔｈｒ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ − ９ｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ − Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ −Ｖ ａ ｌ
ｍ ） 本発明の新規ＤＮＡは、ＴＨβ４のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡと、Ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩
基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応
するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとを、Ａｓｐ−
Ｐｒｏを連結部として連結させることにより生産される
。
−Ｔ ｂ ｒ −Ｐ ｒ ｏ −Ｓ ｅ ｒ −Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ − Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ ； ２）Ｖａ １−Ａｒ ｇ−３ｅ ｒ−Ｓｅ ｒ −Ｓｅ
ｔ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ − ５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｖａｌ−Ａｌａ−）Ｔｉｓ−Ｖａｔ −Ｖａじ ３）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ −Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ− Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｖａ １−Ａｌ ａ−Ｈｉ ５−Ｖａ １ −
Ｖａｌ： ４）Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−３ｅｒ −Ｔｈｒ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ −９ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ −Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ −Ｖ
ａ １ ： ５）Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ −Ｔｈｒ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ − ９ｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ − Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ −Ｖ ａ ｌ
ｍ ） 本発明の新規ＤＮＡは、ＴＨβ４のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡと、Ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩
基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応
するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとを、Ａｓｐ−
Ｐｒｏを連結部として連結させることにより生産される
。
得られたＤＮＡを発現させるには、それを適当なベクタ
ーＤＮＡに発現されるように組み込み、得られたｒＤＮ
Ａを用いで、動物細胞、酵母、枯草菌、大腸菌等の微生
物等の宿主を形質転換し、発現を誘導すればよい。
ーＤＮＡに発現されるように組み込み、得られたｒＤＮ
Ａを用いで、動物細胞、酵母、枯草菌、大腸菌等の微生
物等の宿主を形質転換し、発現を誘導すればよい。
又、その発現により得られたポリペプチドを終濃度０．
５〜２ ｍ ｇ ／ ｍ Ｑで、例えばギ酸または酢酸
等の適当な酸中て２４〜４８時間、３７℃で反応させる
と分解し、ＴＨβ４とｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソン
の塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に
対応するアミノ酸配列）（式中、Ｘは前記定義通りであ
る）とが得られる。
５〜２ ｍ ｇ ／ ｍ Ｑで、例えばギ酸または酢酸
等の適当な酸中て２４〜４８時間、３７℃で反応させる
と分解し、ＴＨβ４とｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソン
の塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に
対応するアミノ酸配列）（式中、Ｘは前記定義通りであ
る）とが得られる。
工
生産の方法としては、次の３つの形態が考えられるが、
そのいずれによってもよい。
そのいずれによってもよい。
１）（ＴＨβ４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏをコ
ードするＤＮＡと、ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４エクソンの
塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対
応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡを連結する。
ードするＤＮＡと、ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４エクソンの
塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対
応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡを連結する。
２）（ＴＨβ４のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡと
、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４エクソンの
塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対
応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡを連結する。
、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４エクソンの
塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対
応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡを連結する。
３）（ＴＨβ４のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡと
、Ａｓｐ−ＰｒｏをコードするＤＮＡと、ｘ−（ＴＮＦ
−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結
した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコードす
るＤＮＡとをその順位で同時に連結する。
、Ａｓｐ−ＰｒｏをコードするＤＮＡと、ｘ−（ＴＮＦ
−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結
した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコードす
るＤＮＡとをその順位で同時に連結する。
１）の場合の一例を説明すると、次の通りである。
悪性化骨髄細胞を生体外分化誘導物質で刺激して単球細
胞に分化する過程で合成されるｍ ＲＮ Ａの１種と相
補的なｃＤＮＡであるｐＨＨ５８［バイオケミカル ア
ンド バイオフィジカル リサーチコミュニケーション
ス（ＢｌｏｃＨＥＭｌｃＡＬＡＮＤＢＩＯＰＨＹＳＩＣ
ＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨＣＯＭＭｔＪＮＩＣＡＴＩＯＮ
Ｓ） 、 ｖ ｏ ｌ 。
胞に分化する過程で合成されるｍ ＲＮ Ａの１種と相
補的なｃＤＮＡであるｐＨＨ５８［バイオケミカル ア
ンド バイオフィジカル リサーチコミュニケーション
ス（ＢｌｏｃＨＥＭｌｃＡＬＡＮＤＢＩＯＰＨＹＳＩＣ
ＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨＣＯＭＭｔＪＮＩＣＡＴＩＯＮ
Ｓ） 、 ｖ ｏ ｌ 。
１３２、Ｎｏ、１．１００〜１０９頁（１９８５年）］
をＰｓｔｌで処理し、得られた約５３０ｂｐのＤＮＡ断
片を回収する。ついで、Ｈｉｎｆｌで処理し、約２２０
ｂｐのＰｓ ｔ Ｉ／）１ｉｎｆｌ断片と約３１０ｂｐ
の１（ｉｎｆｌ／ＰｓｔＩ断片とを回収する。前者のＰ
ｓ ｔ Ｉ／Ｈｉｎｆｌ断片をＭｎ１ｌ（米国ニューイ
ングランドバイラボス社製）で切断して１２７ｂｐのＭ
ｎｉ！Ｉ／ＨｉｎｆＩ断片を得、これをさきほどのＨｉ
ｎ ｆ Ｉ ／ Ｐ ｓ ｔ Ｉ断片と連結させて、
ＴＨβ４のアミノ酸配列をコードするＭｎｆｆ１ｌ／Ｐ
ｓｔｌ断片を得る。この断片を、プラスミドベクターｐ
Ｕｃ５４０のＭｎ１Ｉ／ＰｓｔＩ断片に連結させて、プ
ラスミドｐＵｃ５４０ＴＨβ４（約３．５ｋｂ）を生産
する。
をＰｓｔｌで処理し、得られた約５３０ｂｐのＤＮＡ断
片を回収する。ついで、Ｈｉｎｆｌで処理し、約２２０
ｂｐのＰｓ ｔ Ｉ／）１ｉｎｆｌ断片と約３１０ｂｐ
の１（ｉｎｆｌ／ＰｓｔＩ断片とを回収する。前者のＰ
ｓ ｔ Ｉ／Ｈｉｎｆｌ断片をＭｎ１ｌ（米国ニューイ
ングランドバイラボス社製）で切断して１２７ｂｐのＭ
ｎｉ！Ｉ／ＨｉｎｆＩ断片を得、これをさきほどのＨｉ
ｎ ｆ Ｉ ／ Ｐ ｓ ｔ Ｉ断片と連結させて、
ＴＨβ４のアミノ酸配列をコードするＭｎｆｆ１ｌ／Ｐ
ｓｔｌ断片を得る。この断片を、プラスミドベクターｐ
Ｕｃ５４０のＭｎ１Ｉ／ＰｓｔＩ断片に連結させて、プ
ラスミドｐＵｃ５４０ＴＨβ４（約３．５ｋｂ）を生産
する。
ｐＵｃ５４０は、ファルマシア社より市販されているプ
ラスミドベクターｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ／ Ｂ ａ ｍ
Ｈ１部位に、同じく同社より市販されている、ｔａｃ
プロモーターを有するプラスミドｐＤＲ５４０のＥｃｏ
Ｒ１／ＢａｍＨＩ断片をクローニングしたものである。
ラスミドベクターｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ／ Ｂ ａ ｍ
Ｈ１部位に、同じく同社より市販されている、ｔａｃ
プロモーターを有するプラスミドｐＤＲ５４０のＥｃｏ
Ｒ１／ＢａｍＨＩ断片をクローニングしたものである。
ついでｐＵｃ５４０ＴＨβ４から、ＢａｍＨＩリンカ−
との結合を含む処理により、ＴＨβ４のアミノ酸配列と
、ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列）との連結部となるアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｐｒｏとを
コードするＤＮＡを生産する。
との結合を含む処理により、ＴＨβ４のアミノ酸配列と
、ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列）との連結部となるアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｐｒｏとを
コードするＤＮＡを生産する。
ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグ
アニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列
）をコードするＤＮＡは、ヌクレイツク アシッズ リ
サーチ［（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、） 、
１０．７４３９〜７４４Ｂ頁（１９８１年）］、バイオ
ケミストリー［（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙコ１７．１
２５７〜１２６７頁（１９７８年）］等に記載されてい
る方法に準拠して、化学的に合成できる。
アニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列
）をコードするＤＮＡは、ヌクレイツク アシッズ リ
サーチ［（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、） 、
１０．７４３９〜７４４Ｂ頁（１９８１年）］、バイオ
ケミストリー［（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙコ１７．１
２５７〜１２６７頁（１９７８年）］等に記載されてい
る方法に準拠して、化学的に合成できる。
例えば、特閘昭６２−２８２５８７号公報（特願昭６ｌ
−１（３９５２２号出願）の実施例２に開示されている
ｐＵｃ５４０ＴＮＦ２１／２２［Ｘが存在しない場合に
対応する］、ｐＵＣ５４０丁ＮＦ６９／７０［ｘが前記
１）に対応する］、ｐＵｃ５４０ＴＮＦ？２／７３ Ｃ
ｘが前記２）に対応する］、実施例３に開示されている
ｐＵＣ５４０ＡＭＣＴ−１［Ｘが前記３）に対応するコ
、或いは、後記実施例で開示するｐＵｃ５４０ＡＭ１［
Ｘが前記４）に対応する］或いはＡＭ２ ［Ｘが前記５
）に対応する］は、Ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの
塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対
応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ部分がＴａｃ
プロモーターのＢａｍＨ１下流に連結され、ＢａｍＨＩ
切断点直後に開始コドンとしてのＡＴＧを有し、これに
続くアミノ酸の第１コドンがＧなので、それらをＮｃｏ
Ｉ［日本ジーン（株）１１］、ムング ビーン（Ｍｕｎ
ｇＢｅａｎ ）ヌクレアーゼ、Ｐｓｔｌで処理すること
により目的とするｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの先
頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ
酸配列）をコードするＤＮＡを得ることができる。−例
として、ｐ Ｕ Ｃ５４０Ａ Ｍ １を使用した場合の
例を実施例で詳しく述べる。
−１（３９５２２号出願）の実施例２に開示されている
ｐＵｃ５４０ＴＮＦ２１／２２［Ｘが存在しない場合に
対応する］、ｐＵＣ５４０丁ＮＦ６９／７０［ｘが前記
１）に対応する］、ｐＵｃ５４０ＴＮＦ？２／７３ Ｃ
ｘが前記２）に対応する］、実施例３に開示されている
ｐＵＣ５４０ＡＭＣＴ−１［Ｘが前記３）に対応するコ
、或いは、後記実施例で開示するｐＵｃ５４０ＡＭ１［
Ｘが前記４）に対応する］或いはＡＭ２ ［Ｘが前記５
）に対応する］は、Ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの
塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対
応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ部分がＴａｃ
プロモーターのＢａｍＨ１下流に連結され、ＢａｍＨＩ
切断点直後に開始コドンとしてのＡＴＧを有し、これに
続くアミノ酸の第１コドンがＧなので、それらをＮｃｏ
Ｉ［日本ジーン（株）１１］、ムング ビーン（Ｍｕｎ
ｇＢｅａｎ ）ヌクレアーゼ、Ｐｓｔｌで処理すること
により目的とするｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの先
頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ
酸配列）をコードするＤＮＡを得ることができる。−例
として、ｐ Ｕ Ｃ５４０Ａ Ｍ １を使用した場合の
例を実施例で詳しく述べる。
本発明のＤＮＡをベクターＤＮＡに発現可能なように絹
み込むには、よく知られているように、プロモーター配
列（通常オペレータ配列の下流に存在している）とその
下流にシャイン・ダルガルノ配列（以下、ＳＤ配列と記
す）を有するベクターＤＮＡのＳＤ配列の下流に本発明
のＤＮＡを組み込むか、ベクターＤＮＡに本発明のＤＮ
Ａを組み込んだ後に、その上流にプロモータ配列（通常
オペレータ配列も）及びＳＤ配列を挿入すればよい。
み込むには、よく知られているように、プロモーター配
列（通常オペレータ配列の下流に存在している）とその
下流にシャイン・ダルガルノ配列（以下、ＳＤ配列と記
す）を有するベクターＤＮＡのＳＤ配列の下流に本発明
のＤＮＡを組み込むか、ベクターＤＮＡに本発明のＤＮ
Ａを組み込んだ後に、その上流にプロモータ配列（通常
オペレータ配列も）及びＳＤ配列を挿入すればよい。
ｒＤＮＡ技術により外来遺伝子の遺伝情報を微生物細胞
内で発現させる方法は、ｒ遺伝子組換え実用化技術（４
）Ｊ （１９８３年）（サイエンスフォーラム社）、
「モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ） Ｊ （１９８２年）［コールドス
プリング ハーバ−ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ） ］、ｒ組換え遺伝子の細
胞への導入と発現Ｊ （１９８３年）（共立出版株式
会社）等に記載されている。
内で発現させる方法は、ｒ遺伝子組換え実用化技術（４
）Ｊ （１９８３年）（サイエンスフォーラム社）、
「モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ） Ｊ （１９８２年）［コールドス
プリング ハーバ−ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ） ］、ｒ組換え遺伝子の細
胞への導入と発現Ｊ （１９８３年）（共立出版株式
会社）等に記載されている。
大腸菌を宿主として用いた場合の例を実施例に示す。
又、酵母を宿主として用いる時は、以下のようにする。
アルコール脱水素酵素（ＡＤＨＩ）のプロモーターを挿
入したプラスミドベクターｐＭＡ５６［ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ） −２」ＬＪ−１３４７〜３５０頁
（１９８２年）］は、プロモーター下流にＥｃｏＲ１部
位を有しているため、本発明のＤＮＡを、例えば、実施
例に記載しである組換え体よりＢａｍＨｒ−Ｐｓ ｔ
Ｉ断片として回収し、ｐＭＡ５６のＡＤＨＩプロモータ
ー下流のＥｃ。
入したプラスミドベクターｐＭＡ５６［ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ） −２」ＬＪ−１３４７〜３５０頁
（１９８２年）］は、プロモーター下流にＥｃｏＲ１部
位を有しているため、本発明のＤＮＡを、例えば、実施
例に記載しである組換え体よりＢａｍＨｒ−Ｐｓ ｔ
Ｉ断片として回収し、ｐＭＡ５６のＡＤＨＩプロモータ
ー下流のＥｃ。
Ｒ１部位にＥｃｏＲｒ／ＢａｍＨＩリンカ−１Ｐｓ ｔ
ｒ／Ｅｃ ｏＲＩリンカ−を用いて挿入すればＡＤＨ
Ｉプロモーターの支配になり、本発明のＤＮＡの遺伝情
報は発現可能となる。
ｒ／Ｅｃ ｏＲＩリンカ−を用いて挿入すればＡＤＨ
Ｉプロモーターの支配になり、本発明のＤＮＡの遺伝情
報は発現可能となる。
又、抑制酸性フォスファターゼ（ＰＨ０５）プロモータ
ーを有するｐＡＭ８２［プロシーディング オブ ナシ
ョナル アカデミ−サイエンスオブ ニーニスｘ −（
Ｐｒｏｃｉ Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ。
ーを有するｐＡＭ８２［プロシーディング オブ ナシ
ョナル アカデミ−サイエンスオブ ニーニスｘ −（
Ｐｒｏｃｉ Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ。
Ｓ、Ａ、）ｌｉ、１〜５頁（１９８３年）］は、ＰＨ０
５プロモーター下流にＸｈｏ Ｉ部位を有するため、本
発明のＤＮＡを、例えば、実施例に記載しである組換え
体よりＢａｍＨＩ−Ｐｓｔｌ断片として回収し、ｐＡＭ
８２のＰＨ０５プロモーター下流のＸｈｏ Ｉ部位にＢ
ａｍＨＴ／Ｘｈｏｌリンカ−１Ｐｓ ｔ Ｉ／Ｘｈｏ
Ｉリンカ−を用いて挿入すればＰＨ０５プロモーターの
支配になり、その遺伝情報は酵母で発現可能となる。
５プロモーター下流にＸｈｏ Ｉ部位を有するため、本
発明のＤＮＡを、例えば、実施例に記載しである組換え
体よりＢａｍＨＩ−Ｐｓｔｌ断片として回収し、ｐＡＭ
８２のＰＨ０５プロモーター下流のＸｈｏ Ｉ部位にＢ
ａｍＨＴ／Ｘｈｏｌリンカ−１Ｐｓ ｔ Ｉ／Ｘｈｏ
Ｉリンカ−を用いて挿入すればＰＨ０５プロモーターの
支配になり、その遺伝情報は酵母で発現可能となる。
又、枯草菌を宿主として用いても、以下のようにして本
発明のＤＮＡの遺伝情報を発現させることができる。
発明のＤＮＡの遺伝情報を発現させることができる。
バチルス サブチリス マーパース（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｓ）株の有するα−ア
ミラーゼプロモーターを有するｐＴＵ８２８５ ［ジー
ン（Ｇｅｎｅ） 、ユ土、１４８頁（１９８５年）］は
、プロモーター、及びシグナルペプチドの下流に１（ｉ
ｎｃｌＩ部位を有しているため、例えば、本発明のＤＮ
Ａを、実施例に記載されている組換え体よりＢａｍＨＩ
−Ｐｓｔｌ断片として回収し、ｐＴＵＢ２８５の１（ｉ
ｎｃＩＴ部にシグナルペプチドのアミノ酸フレームと合
うようなＨｉｎｃ１１／ＢａｍＨＩリンカ−１Ｈｉｎｃ
ｌｌ／Ｐｓｔｌリンカ−を用いて挿入してやれば、α−
アミラーゼプロモーターの支配をうけ、枯草菌でも発現
可能となる。
ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｓ）株の有するα−ア
ミラーゼプロモーターを有するｐＴＵ８２８５ ［ジー
ン（Ｇｅｎｅ） 、ユ土、１４８頁（１９８５年）］は
、プロモーター、及びシグナルペプチドの下流に１（ｉ
ｎｃｌＩ部位を有しているため、例えば、本発明のＤＮ
Ａを、実施例に記載されている組換え体よりＢａｍＨＩ
−Ｐｓｔｌ断片として回収し、ｐＴＵＢ２８５の１（ｉ
ｎｃＩＴ部にシグナルペプチドのアミノ酸フレームと合
うようなＨｉｎｃ１１／ＢａｍＨＩリンカ−１Ｈｉｎｃ
ｌｌ／Ｐｓｔｌリンカ−を用いて挿入してやれば、α−
アミラーゼプロモーターの支配をうけ、枯草菌でも発現
可能となる。
（３）１．１ぺ ゛
形質転換された宿主細胞を遠心分離などによって集め、
超音波或いはリゾチームなとて破砕する。
超音波或いはリゾチームなとて破砕する。
このとき低張ｔαを用いるが、ＳＤＳなとの界面活性剤
や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を共存させたほうが
良い結果が得られる場合もある。
や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を共存させたほうが
良い結果が得られる場合もある。
細胞破砕ｉ夜を遠心分離に付して上清液を得る。
このようにして得られる抗腫瘍性ポリペプチドを含む破
砕上清液を通常の蛋白質精製法に準じて精製する。
砕上清液を通常の蛋白質精製法に準じて精製する。
即ち、塩基性陰イオン交換体によるイオン交換クロマト
グラフィー、塩析法、透析法、ゲル濾過法、ｍ水りロマ
トグラフィー、高速分子篩クロマトグラフィー、電気泳
動法等を順次又は適宜組み合わせることによって精製で
きる。
グラフィー、塩析法、透析法、ゲル濾過法、ｍ水りロマ
トグラフィー、高速分子篩クロマトグラフィー、電気泳
動法等を順次又は適宜組み合わせることによって精製で
きる。
例えば、塩基性陰イオン交換体としてはＤＥＡＥ−セフ
ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ａ −２５、八−
５０、ＤＥＡＥ−セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ
）ＣＬ−６８，ＤＥＡＥ−セファミル（５ｅｐｌ＋ａｍ
ｉ Ｉ ）（以上、ファルマシア社！りが好ましく、
その池、ジエチルアミノ基、アミノエチル基又は四級化
アミノエチル基含有陰イオン交換体も使用できろ。
ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ａ −２５、八−
５０、ＤＥＡＥ−セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ
）ＣＬ−６８，ＤＥＡＥ−セファミル（５ｅｐｌ＋ａｍ
ｉ Ｉ ）（以上、ファルマシア社！りが好ましく、
その池、ジエチルアミノ基、アミノエチル基又は四級化
アミノエチル基含有陰イオン交換体も使用できろ。
使用される緩衝液としては、ｐＨ６，０〜９．０のトリ
ス−ＨＣｌ又はリン酸緩衝液が望ましく、これらの０．
０５Ｍ程度の希薄な緩衝液て抗腫瘍性ポリペプチドの培
養液を希釈し、塩濃度０．１Ｍ以下の溶ｉ夜として陰イ
オン交換体と接触させて抗腫瘍性ポリペプチドを吸着さ
せる。
ス−ＨＣｌ又はリン酸緩衝液が望ましく、これらの０．
０５Ｍ程度の希薄な緩衝液て抗腫瘍性ポリペプチドの培
養液を希釈し、塩濃度０．１Ｍ以下の溶ｉ夜として陰イ
オン交換体と接触させて抗腫瘍性ポリペプチドを吸着さ
せる。
抗１１瘍性ポリペプチドの溶出は０．１〜０．２Ｎ１の
ＮａＣ１又はＫ ＣＩ！等の塩類溶液で行う。抗腫瘍性
ポリペプチドは０．２Ｍ付近の塩濃度で溶出される。陰
イオン交換体との接触はカラム法が望ましいが、大量の
場合はバッチ法も採用できる。
ＮａＣ１又はＫ ＣＩ！等の塩類溶液で行う。抗腫瘍性
ポリペプチドは０．２Ｍ付近の塩濃度で溶出される。陰
イオン交換体との接触はカラム法が望ましいが、大量の
場合はバッチ法も採用できる。
陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、前処理と
して限外濾過膜で低分子物質を除去することが望ましく
、精製効果を上げることが出来る。
して限外濾過膜で低分子物質を除去することが望ましく
、精製効果を上げることが出来る。
陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた溶液は透析
後、濃縮してゲル濾過に付す。ゲル濾適用の坦体として
は、セファデックスＧ−７５、Ｇ−１００（ファルマシ
ア社！り、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ） Ｓ
−２００（ファルマシア社製）、バイオゲル（Ｂｉｏ
ｇｅｌ） Ｐ −１００（バイオラッド社製）及びトー
ヨーパールＨＷ−５０、ＨＷ−５５（東洋曹達工業社製
）等を使用する。
後、濃縮してゲル濾過に付す。ゲル濾適用の坦体として
は、セファデックスＧ−７５、Ｇ−１００（ファルマシ
ア社！り、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ） Ｓ
−２００（ファルマシア社製）、バイオゲル（Ｂｉｏ
ｇｅｌ） Ｐ −１００（バイオラッド社製）及びトー
ヨーパールＨＷ−５０、ＨＷ−５５（東洋曹達工業社製
）等を使用する。
ゲル濾過に使用する緩衝液はｐＨｅ、Ｏ〜９．０のトリ
ス−ＨＩ３またはリン酸緩衝液である。吸着防止のため
、０．２〜０．５ＭのＮａＣｌ等の塩類を添加して使用
することが望ましい。
ス−ＨＩ３またはリン酸緩衝液である。吸着防止のため
、０．２〜０．５ＭのＮａＣｌ等の塩類を添加して使用
することが望ましい。
又、陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた抗腫瘍
性ポリペプチド活性溶ｉαは、疏水クロマトグラフィー
で精製することもできる。この場合はブチルート−ヨー
パール６５０（東洋曹達工業社製）等を坦体とし、硫安
、ＮａＣ２等の塩類を用いて抗腫瘍性ポリペプチドを溶
出させろ。
性ポリペプチド活性溶ｉαは、疏水クロマトグラフィー
で精製することもできる。この場合はブチルート−ヨー
パール６５０（東洋曹達工業社製）等を坦体とし、硫安
、ＮａＣ２等の塩類を用いて抗腫瘍性ポリペプチドを溶
出させろ。
ゲル濾過或いは疏水クロマトグラフィーで精製した抗Ｉ
Ｉ瘍性ポリペプチド含有液は、次いでモノ（Ｍｏｎｏ）
Ｑ ＨＲ５１５カラム（ファルマシア社製の高性能
陰イオン交換体カラム）を使用するファルマシアＦ Ｐ
Ｔ、、 Ｃ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、 Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ。
Ｉ瘍性ポリペプチド含有液は、次いでモノ（Ｍｏｎｏ）
Ｑ ＨＲ５１５カラム（ファルマシア社製の高性能
陰イオン交換体カラム）を使用するファルマシアＦ Ｐ
Ｔ、、 Ｃ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、 Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ。
Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、 Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）システムによる高性能陰イ
オン交換体クロマトグラフィーにＩｔ Ｌ、て、精製標
品を得る。この高性能陰イオン交換体クロマトグラフィ
ーの条件は最初のＤＥＡＥ−セファローズ等の坦体を使
用する陰イオン交換クロマトグラフィーの場合と同じで
ある。
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）システムによる高性能陰イ
オン交換体クロマトグラフィーにＩｔ Ｌ、て、精製標
品を得る。この高性能陰イオン交換体クロマトグラフィ
ーの条件は最初のＤＥＡＥ−セファローズ等の坦体を使
用する陰イオン交換クロマトグラフィーの場合と同じで
ある。
本発明の新規なりＮＡは、大別すると３つの有用性を持
つ。
つ。
第１の有用性は、それ自体が、新規な抗腫瘍性ポリペプ
チドをコードしている点にある。この抗腫瘍性は、Ｌ−
９２９細胞［プロシーデイングオブ ナショナル アカ
デミ−サイエンス オブ ニーニスニー １１．３６６
６〜３６７０頁］及び繊維芽肉腫メス（Ｍｅｔｈ）
Ａ細胞［サイエンス（Ｓｃ ｉ ｅｎｃｅ ） −２
」ＬＪ−１９４４頁（１９８５年）］に対する細胞毒性
より確認されている。
チドをコードしている点にある。この抗腫瘍性は、Ｌ−
９２９細胞［プロシーデイングオブ ナショナル アカ
デミ−サイエンス オブ ニーニスニー １１．３６６
６〜３６７０頁］及び繊維芽肉腫メス（Ｍｅｔｈ）
Ａ細胞［サイエンス（Ｓｃ ｉ ｅｎｃｅ ） −２
」ＬＪ−１９４４頁（１９８５年）］に対する細胞毒性
より確認されている。
更に、この新規ポリペプチドは、高い内因性ＴＮＦ産生
誘導活性を持っている。
誘導活性を持っている。
第２の有用性は、その発現により得られるポリペプチド
をギ酸や酢酸などの適当な酸で処理すると、連結部であ
るＡｓｐ−Ｐｒｏの間で切断され、Ｔ’Ｈβ４と抗腫瘍
性ポリペプチドであるｘ −（ＴＮＦ−αの第４エクソ
ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
に対応するアミノ酸配列）とを得られる点にある。前述
の如く、本発明のＤＮＡは大腸菌等に組み込むことによ
り大量生産できるので、従来、大量生産が不可能であっ
たＴＨβ４の大量生産が初めて可能になった。
をギ酸や酢酸などの適当な酸で処理すると、連結部であ
るＡｓｐ−Ｐｒｏの間で切断され、Ｔ’Ｈβ４と抗腫瘍
性ポリペプチドであるｘ −（ＴＮＦ−αの第４エクソ
ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
に対応するアミノ酸配列）とを得られる点にある。前述
の如く、本発明のＤＮＡは大腸菌等に組み込むことによ
り大量生産できるので、従来、大量生産が不可能であっ
たＴＨβ４の大量生産が初めて可能になった。
第３の有用性は、本発明のＤＮＡがコードするアミノ酸
配列において、（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列
の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するア
ミノ酸配列）の先頭のアミノ酸であるアラニン（Ａｌａ
）の塩基配列がＧＣＧである場合には、制限酵素Ｎｒｕ
ｌ （ＴＣＧＣＧＡ）の作用により、ＴＮＦ−αの第４
エクソン部分の塩基配列と同一の塩基配列の前で塩基配
列を切断し、任意の塩基配列を導入できるという点にあ
る。
配列において、（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列
の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するア
ミノ酸配列）の先頭のアミノ酸であるアラニン（Ａｌａ
）の塩基配列がＧＣＧである場合には、制限酵素Ｎｒｕ
ｌ （ＴＣＧＣＧＡ）の作用により、ＴＮＦ−αの第４
エクソン部分の塩基配列と同一の塩基配列の前で塩基配
列を切断し、任意の塩基配列を導入できるという点にあ
る。
なお、本発明の新規ＤＮＡがコードする新規ポリペプチ
ドのＬ９２９細胞に対する細胞毒性は、次のようにして
分析できる。
ドのＬ９２９細胞に対する細胞毒性は、次のようにして
分析できる。
、＋。
Ａ９２９細胞を、５％仔牛脂児血清（以下ＦＣ５と記す
）を加えたイーグルミニマムエッセンシャル培地（以下
ＭＥＭと記す）で育成し、８Ｘ１０’個の細胞が１００
μｔの同上培地に含まれる様にし、９６大の平底プレー
トで育種する。
）を加えたイーグルミニマムエッセンシャル培地（以下
ＭＥＭと記す）で育成し、８Ｘ１０’個の細胞が１００
μｔの同上培地に含まれる様にし、９６大の平底プレー
トで育種する。
育種条件は３７℃、２時間、５％ＣＯ２，１００％Ｈ，
Ｏであり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。そ
の後、アクチノマイシンＤを培地中に終濃度ｌμｇ ／
ｍ ９．どなるように加え、培養液の液量を１５０μ
ｔとする。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈した
ものを５０μを加える（この際稀釈率を適宜調製し、Ｅ
Ｄ、。を求める事ができる）。更に、最終液量２００μ
ｔとなったＬ９２９細胞を上記条件で１８時間培養する
。
Ｏであり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。そ
の後、アクチノマイシンＤを培地中に終濃度ｌμｇ ／
ｍ ９．どなるように加え、培養液の液量を１５０μ
ｔとする。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈した
ものを５０μを加える（この際稀釈率を適宜調製し、Ｅ
Ｄ、。を求める事ができる）。更に、最終液量２００μ
ｔとなったＬ９２９細胞を上記条件で１８時間培養する
。
細胞壊死活性を測定するには、まず全培地を除去し、つ
いで０．２％クリスタルバイオレットを含む２％メチル
アルコール溶液を加えて固定染色する。クリスタルバイ
オレットは全有核細胞を染色し、細胞壊死を生じた結果
プレート底面より遊離した細胞は染色しないので、細胞
壊死活性を直接測定できる。この染色度をＯＤ５ＱＯｎ
ｍでの吸収で測定し、対照群に対する染色度と比較する
事で細胞壊死活性を測定する。活性の定義は次の様に行
う。
いで０．２％クリスタルバイオレットを含む２％メチル
アルコール溶液を加えて固定染色する。クリスタルバイ
オレットは全有核細胞を染色し、細胞壊死を生じた結果
プレート底面より遊離した細胞は染色しないので、細胞
壊死活性を直接測定できる。この染色度をＯＤ５ＱＯｎ
ｍでの吸収で測定し、対照群に対する染色度と比較する
事で細胞壊死活性を測定する。活性の定義は次の様に行
う。
Ｌ９２９ｗＩｉ胞が５０％生存できる検体原液の稀釈率
（Ｎ）を求める。対照としてウサギＴＮＳをを２．４Ｘ
１０’単位／ｍｇ／ｍｌのヒトＴＮＦを用いて決定する
。このウサギＴＮＳのＥＤ５０を与える稀釈率（Ｃ）を
求める。
（Ｎ）を求める。対照としてウサギＴＮＳをを２．４Ｘ
１０’単位／ｍｇ／ｍｌのヒトＴＮＦを用いて決定する
。このウサギＴＮＳのＥＤ５０を与える稀釈率（Ｃ）を
求める。
する。
以下、実施例、実験例により本発明を更に詳細に説明す
る。
る。
１）ｐＨＨ５Ｂ （１００μｇ）を２５０単位のＰｓｔ
ｌで消化しく３７℃）、１．２％アガロースゲルで、５
３０塩基対からなるＰｓ ｔ Ｉ／Ｐｓｔｌ断片を分離
した。ゲルからこのＤＮＡを抽出し、ハイトロキシルア
パタイトカラムで精製して、２．７μｇのＤＮＡを回収
した。
ｌで消化しく３７℃）、１．２％アガロースゲルで、５
３０塩基対からなるＰｓ ｔ Ｉ／Ｐｓｔｌ断片を分離
した。ゲルからこのＤＮＡを抽出し、ハイトロキシルア
パタイトカラムで精製して、２．７μｇのＤＮＡを回収
した。
２〉ついてこのＤＮＡを１２単位のＨｉｎｆＩて消化し
、８％アクリルアミドゲルで、２２０の塩基対からなる
”Ｐ ｓ ｔ Ｉ／Ｈｉ ｎ ｆ Ｉ’°断片と、３１
０塩基対からなる”ＨｉｎｆＴ／Ｐｓｔ１３°断片とを
別々に回収した。この回収は、ゲルから両断片を抽出後
、ＤＥＡＥセルロースカラムを用いろ通常の方法により
実施した。両断片の回収量は、紫外線吸収（ＯＤ ２６
０ ｎ ｍ ）での検出が不可能と考え、回収率を１０
０％として、以下の計算式により推定した。
、８％アクリルアミドゲルで、２２０の塩基対からなる
”Ｐ ｓ ｔ Ｉ／Ｈｉ ｎ ｆ Ｉ’°断片と、３１
０塩基対からなる”ＨｉｎｆＴ／Ｐｓｔ１３°断片とを
別々に回収した。この回収は、ゲルから両断片を抽出後
、ＤＥＡＥセルロースカラムを用いろ通常の方法により
実施した。両断片の回収量は、紫外線吸収（ＯＤ ２６
０ ｎ ｍ ）での検出が不可能と考え、回収率を１０
０％として、以下の計算式により推定した。
Ｐｓ ｔ Ｉ／Ｈ４ｎｆ Ｉ断片の回収量Ｈ４ｎｆｌ／
ＰｓｔＩ断片の回収量 ３）ＰｓｔＩ／Ｈｉｎｆｌ断片を８単位のＭｎｌ！Ｉて
消化し、８％アクリルアミドゲルで、１２７塩基対から
なるＭ ｎ ｌ！ Ｉ ／ Ｈｉ ｎ ｆ Ｔ断片を分
離、回収した。（回収量は約１００〜１５０ｎｇ）φ ４）２６μｇのＭｎｌ！ Ｉ／Ｈｉｎｆ Ｉ断片と、６
５℃ｇのＨｉｎｆＩ／Ｐｓｔｌ断片を混ぜ、８７単泣の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、１６°Ｃて１時間反応させ
た。ついて、７０℃、５分の処理によって酵素を失活さ
せた後、１５単位のＰｓｔｌを加え、３７℃で２時間培
養して約９０ｎｇのＤＮＡを得た。
ＰｓｔＩ断片の回収量 ３）ＰｓｔＩ／Ｈｉｎｆｌ断片を８単位のＭｎｌ！Ｉて
消化し、８％アクリルアミドゲルで、１２７塩基対から
なるＭ ｎ ｌ！ Ｉ ／ Ｈｉ ｎ ｆ Ｔ断片を分
離、回収した。（回収量は約１００〜１５０ｎｇ）φ ４）２６μｇのＭｎｌ！ Ｉ／Ｈｉｎｆ Ｉ断片と、６
５℃ｇのＨｉｎｆＩ／Ｐｓｔｌ断片を混ぜ、８７単泣の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、１６°Ｃて１時間反応させ
た。ついて、７０℃、５分の処理によって酵素を失活さ
せた後、１５単位のＰｓｔｌを加え、３７℃で２時間培
養して約９０ｎｇのＤＮＡを得た。
５）上記４）で得られたＤＮＡを、１００ｍＭのＮａＣ
１の存在下、エタノール（終濃度７０％）中でｐＵｃ５
４０のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ断片（２６μｇ）と混じた
。沈澱物を回収し、５μｉの蒸留水に溶かし、約０．５
μりになる迄凍結乾燥して、エタノールと蒸留水を除去
した。ついて、１０Ｘリガーゼ反応緩衝液［１０ｍＭの
ＡＴＰ＋６６０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７，６）＋６
６ｍＭの塩化マグネシウム＋５０ｍＭのジチオスレイト
ール］を０．４μＩ！、Ｔ４ＤＮＡｌ／ガーゼを３５単
位加えて、４℃で一晩培養して、約３．５ｋ ｂのｐＵ
ｃ５４０ＴＨβ４を得た。
１の存在下、エタノール（終濃度７０％）中でｐＵｃ５
４０のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ断片（２６μｇ）と混じた
。沈澱物を回収し、５μｉの蒸留水に溶かし、約０．５
μりになる迄凍結乾燥して、エタノールと蒸留水を除去
した。ついて、１０Ｘリガーゼ反応緩衝液［１０ｍＭの
ＡＴＰ＋６６０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７，６）＋６
６ｍＭの塩化マグネシウム＋５０ｍＭのジチオスレイト
ール］を０．４μＩ！、Ｔ４ＤＮＡｌ／ガーゼを３５単
位加えて、４℃で一晩培養して、約３．５ｋ ｂのｐＵ
ｃ５４０ＴＨβ４を得た。
６）１００μｇのｐＵｃ５４０ＴＨβ４を１９０単位の
ＨｉｎｆＩにより、３７℃で一晩消化させ、そのうちの
５０℃ｇを、８０μＭのデオキシＡＴＰと８０μＭのデ
オキシＴＴＰの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノ
ウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（４０単位）と混じ、室温で３
０分間培養した。
ＨｉｎｆＩにより、３７℃で一晩消化させ、そのうちの
５０℃ｇを、８０μＭのデオキシＡＴＰと８０μＭのデ
オキシＴＴＰの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノ
ウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（４０単位）と混じ、室温で３
０分間培養した。
７）７０℃、５分間の加熱処理で上記フレノウ断片を失
活させた後、１２０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で
３時間培養した。
活させた後、１２０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で
３時間培養した。
７）８％アクリルゲルを使い、ＢａｍＨ■部位、Ｈｉｎ
ｆ １部位をＡ及びＴで峰復して平滑末端として、ＤＥ
ＡＥセルロースカラムを使い、約４５０ｎｇの１３５ｂ
ｐのＤＮＡを分離、回収した。
ｆ １部位をＡ及びＴで峰復して平滑末端として、ＤＥ
ＡＥセルロースカラムを使い、約４５０ｎｇの１３５ｂ
ｐのＤＮＡを分離、回収した。
８）上記７）で得られたＤＮＡの２７μｇと、１．６μ
ｇのＢａｍＨＩリンカ−とを、８７単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下で合わせて、４℃で一晩培養して、（Ｔ
Ｈβ４のアミノ酸配列）−Ａ ｓ ｐ −Ｐ ｒ ｏ
をコードするＤＮＡを生産した。
ｇのＢａｍＨＩリンカ−とを、８７単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下で合わせて、４℃で一晩培養して、（Ｔ
Ｈβ４のアミノ酸配列）−Ａ ｓ ｐ −Ｐ ｒ ｏ
をコードするＤＮＡを生産した。
９）ヒト急性単球性白血病細胞ＴＨＰ−１から精製され
た抗腫瘍性ポリペプチドのゲノム遺伝子（特開昭６２−
２８２５８７号公報）をＸｈｏ Ｉ。
た抗腫瘍性ポリペプチドのゲノム遺伝子（特開昭６２−
２８２５８７号公報）をＸｈｏ Ｉ。
ＰｓｔＩて切断し、第１図に示すＸｈｏｌ／Ｐｓｔｌ断
片を回収した。次にこの断片を、Ｔａｃプロモーター及
びＳＤ配列を有するプラスミドベクターｐＵｃ５４０の
５ａｆｆｉ Ｉ／Ｐｓ ｔ １部位に挿入して、プラス
ミドｐＵｃ５４０ＴＮＦｘ／ｐを調製した。
片を回収した。次にこの断片を、Ｔａｃプロモーター及
びＳＤ配列を有するプラスミドベクターｐＵｃ５４０の
５ａｆｆｉ Ｉ／Ｐｓ ｔ １部位に挿入して、プラス
ミドｐＵｃ５４０ＴＮＦｘ／ｐを調製した。
１０）別途、第１図に示すＸｈｏｌ／Ｐｓｔｌ断片をＨ
ｉｎｃＴＩて切断し、２９４塩基対のＸｈｏ！／Ｈｉｎ
ｃＩＩ断片と、５２１塩基対のＨｉｎｃｌＩ／Ｐｓｔｌ
断片を回収し、又、２９４塩基対の該断片をＤｄｅＩで
部分分解して、２０Ｇ塩基対のＤｄｅｌ／Ｈ４ｎｃｌｌ
断片を回収した。
ｉｎｃＴＩて切断し、２９４塩基対のＸｈｏ！／Ｈｉｎ
ｃＩＩ断片と、５２１塩基対のＨｉｎｃｌＩ／Ｐｓｔｌ
断片を回収し、又、２９４塩基対の該断片をＤｄｅＩで
部分分解して、２０Ｇ塩基対のＤｄｅｌ／Ｈ４ｎｃｌｌ
断片を回収した。
この様にして回収した５２１塩基対の
Ｈ４ｎｃｒｒ／Ｐｓｔｒ断片、２０Ｇ塩基対のＤｄｅｌ
／ＨｉｎｃＩＩ断片を、ＡＢ１社（米国）の３８０Ａ型
ＤＮＡシンセサイザーで合成した、第１表に示す７２／
７３塩基対の２本鎖ＤＮＡと結合させた後に、ｐＵｃ５
４０ＴＮ’ ｘ／ｐのＢａｍＨＩ／Ｐ ｓ ｔ １部位
に挿入してｐＵｃ５４０ＴＮ’ＡＭＩを生成した。
／ＨｉｎｃＩＩ断片を、ＡＢ１社（米国）の３８０Ａ型
ＤＮＡシンセサイザーで合成した、第１表に示す７２／
７３塩基対の２本鎖ＤＮＡと結合させた後に、ｐＵｃ５
４０ＴＮ’ ｘ／ｐのＢａｍＨＩ／Ｐ ｓ ｔ １部位
に挿入してｐＵｃ５４０ＴＮ’ＡＭＩを生成した。
第 １ 表
八 声 １
７２／７３ 塩基対
１１） ｐＵｃ５４０ＴＮ’ＡＭＩ （１００１１ｇ）
ニ１２０単位のＮ ｃ、、 ｏ Ｉを加え、３７℃で
一晩培養した。寒天ゲル電気泳動で完全消化を確認後、
フェノール抽出、クロロホルム抽出を行い、セファデッ
クス０５０カラムでＤＮＡを精製した。
ニ１２０単位のＮ ｃ、、 ｏ Ｉを加え、３７℃で
一晩培養した。寒天ゲル電気泳動で完全消化を確認後、
フェノール抽出、クロロホルム抽出を行い、セファデッ
クス０５０カラムでＤＮＡを精製した。
１２）９０単位のムング ビーン ヌクレアーゼを力σ
えて３７℃で１０分間経過させた。次いで、７０℃で５
分間の加熱処理を行って、該ヌクレアーゼを失活させた
。
えて３７℃で１０分間経過させた。次いで、７０℃で５
分間の加熱処理を行って、該ヌクレアーゼを失活させた
。
１３）１６０単位のＰｓｔｌを加えて３７℃で一晩培養
した。次いて、５％アクリルアミドゲルで、７７０塩基
対のＤＮＡ（約１μｇ）を回収した。
した。次いて、５％アクリルアミドゲルで、７７０塩基
対のＤＮＡ（約１μｇ）を回収した。
１４）上記した１）〜８）の手順で得られたＤＮＡ （
２８，６ｎｇ）と、上記した９） 〜１３）の手順で得
られたＤＮＡ （１５７ｇｇ）を、８７単位の７４ＤＮ
Ａリガーゼの存在下、４℃で一晩培養した。次いで、７
０℃で１０分間の加熱処理により該リガーゼを失活させ
た。
２８，６ｎｇ）と、上記した９） 〜１３）の手順で得
られたＤＮＡ （１５７ｇｇ）を、８７単位の７４ＤＮ
Ａリガーゼの存在下、４℃で一晩培養した。次いで、７
０℃で１０分間の加熱処理により該リガーゼを失活させ
た。
＋５）０．８単位のＰｓｔｌを加え、３７℃で１２時間
培養した後、７０℃で１０分間の加熱処理によりＰｓｔ
ｌを失活させた。次いで、プラスミドベクターｐＵｃ５
４０のＢａｍＨＩ／Ｐｓｔｌ断片（７６ｕ ｇ）と混ぜ
、９０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下、４℃で一晩
培養して、プラスミドｐＵｃ５４０ （ＴＨβ４のアミ
ノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４
エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩
基配列に対応するアミノ酸配列）（式９式％ Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｔ を表す）を生成した。
培養した後、７０℃で１０分間の加熱処理によりＰｓｔ
ｌを失活させた。次いで、プラスミドベクターｐＵｃ５
４０のＢａｍＨＩ／Ｐｓｔｌ断片（７６ｕ ｇ）と混ぜ
、９０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下、４℃で一晩
培養して、プラスミドｐＵｃ５４０ （ＴＨβ４のアミ
ノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４
エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩
基配列に対応するアミノ酸配列）（式９式％ Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｔ を表す）を生成した。
１６）上記１５）で生成したプラスミドを有する大腸菌
（ＤＨ−１）を、アンピシリン（５０ｇｇ／ｍ ’ｉ
）とカナマイシン（１０ｇｇ ／ ｍ Ｌ ）を含む１
０ｍｆｆ１のＮＺＹ培地［５ｇのＮａＣＬ、２ｇ＋７）
Ｍ ｇ Ｃｌ ２・７Ｈｅ０．１０ｇのＮＺアミンＡ（
株式会社和光純薬製）、５ｇのイーストエキスを混合し
、蒸留水で全量を１ｔとした培地］で３７℃で一晩、振
どう培養した。この培養液の１０ ｍ Ｌを、アンピシ
リン（５０ｇｇ ／ ｍ ｉ ）とカナマイシン（１０
ｇｇ／ｍｆｆ１）を含む１００ ｍ ＥのＮＺＹ培地に
加え、３７℃で６時間振どう培養した。
（ＤＨ−１）を、アンピシリン（５０ｇｇ／ｍ ’ｉ
）とカナマイシン（１０ｇｇ ／ ｍ Ｌ ）を含む１
０ｍｆｆ１のＮＺＹ培地［５ｇのＮａＣＬ、２ｇ＋７）
Ｍ ｇ Ｃｌ ２・７Ｈｅ０．１０ｇのＮＺアミンＡ（
株式会社和光純薬製）、５ｇのイーストエキスを混合し
、蒸留水で全量を１ｔとした培地］で３７℃で一晩、振
どう培養した。この培養液の１０ ｍ Ｌを、アンピシ
リン（５０ｇｇ ／ ｍ ｉ ）とカナマイシン（１０
ｇｇ／ｍｆｆ１）を含む１００ ｍ ＥのＮＺＹ培地に
加え、３７℃で６時間振どう培養した。
次いで、この培養液の全量（約１００ ｍ ｌ ）を、
０．７ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
、アンピシリン（５０ｇｇ／ｍｌり、カナマイシン（１
０μｇ ／ ｍ Ｌ ）を含む１之のＮＺＹ培地に加え
て、３７℃−晩垢とう培養した。
０．７ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
、アンピシリン（５０ｇｇ／ｍｌり、カナマイシン（１
０μｇ ／ ｍ Ｌ ）を含む１之のＮＺＹ培地に加え
て、３７℃−晩垢とう培養した。
１７）このようにして得られた大腸菌を遠心分離（５０
００ｒｐｍ、１０分）に付し、沈澱を１００ ｍ ｌ！
のＰＢＳ（−）にラスイ社製）に懸濁した。この！３濁
液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分）に付して菌体
を集め、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド（蛋白分解酵素阻害剤）に懸濁した。得られた菌体浮
遊液を１０ｍｆｆ１ずつ超音波に付して［ブランソン
ソニファイア（Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏ旧ｆｉｅｒ）の目
盛り４０で６分間を３回）、大腸菌を破壊した。
００ｒｐｍ、１０分）に付し、沈澱を１００ ｍ ｌ！
のＰＢＳ（−）にラスイ社製）に懸濁した。この！３濁
液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分）に付して菌体
を集め、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド（蛋白分解酵素阻害剤）に懸濁した。得られた菌体浮
遊液を１０ｍｆｆ１ずつ超音波に付して［ブランソン
ソニファイア（Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏ旧ｆｉｅｒ）の目
盛り４０で６分間を３回）、大腸菌を破壊した。
１８）１００００ ｒ ｐｍ、１時間の遠心操作に付し
て上清を回収した。この上清の、Ｌ９２９１１胞に対す
るＴＮＦ活性は１．８５Ｘ１０６単泣／ｍＩ！だった・ ＋９）上記上清の硫安画分く６０％飽和）を分取した。
て上清を回収した。この上清の、Ｌ９２９１１胞に対す
るＴＮＦ活性は１．８５Ｘ１０６単泣／ｍＩ！だった・ ＋９）上記上清の硫安画分く６０％飽和）を分取した。
この両分を１０００Ｏｒ ｐｍ、３０分の遠心処理に付
して沈；澱を得、この沈澱を５ｍｆｆ１のＰＢＳ（−）
に溶かし、５１の１０ｍＭ）リス−ＨＣＬ （ｐＨ７，
４）＋ １０ｍＭＮａＣｉ！に対して透析した。次いで
、１３０００ｒｐｍて一晩遠心処理に付して不溶物を除
いて、上清を回収した。
して沈；澱を得、この沈澱を５ｍｆｆ１のＰＢＳ（−）
に溶かし、５１の１０ｍＭ）リス−ＨＣＬ （ｐＨ７，
４）＋ １０ｍＭＮａＣｉ！に対して透析した。次いで
、１３０００ｒｐｍて一晩遠心処理に付して不溶物を除
いて、上清を回収した。
２０）この上清をファルマシア社製のモノＱＦＰＬＣカ
ラムクロマトグラフィーに付した。流速は２．０ｍｌ！
、／分とし、ＮａＣ１！ｉ！ｉ度を０．ＯＩＭからＩＭ
まで直線的に上げる段階的溶出法により各２０ｍ１！の
画分を集めた。溶出パターンを第２図に示す。
ラムクロマトグラフィーに付した。流速は２．０ｍｌ！
、／分とし、ＮａＣ１！ｉ！ｉ度を０．ＯＩＭからＩＭ
まで直線的に上げる段階的溶出法により各２０ｍ１！の
画分を集めた。溶出パターンを第２図に示す。
第２図において、横軸に沿った連続番号はそれぞれの画
分を表し、曲線は蛋白の溶出量を表し、柱状グラフは、
Ｌ９２９細胞に対するＴＮＦ活性（単位）を表し、直線
は溶出液の塩濃度（０，ＯＩＭ〜ＩＭ）を表している。
分を表し、曲線は蛋白の溶出量を表し、柱状グラフは、
Ｌ９２９細胞に対するＴＮＦ活性（単位）を表し、直線
は溶出液の塩濃度（０，ＯＩＭ〜ＩＭ）を表している。
２＋） （ＴＨβ４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭
にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸
配列）（式中、Ｘは Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ −Ａｒｇ−
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ −Ｖａ Ｉ−Ｖａ １ を表
す）の構造をした蛋白を多量に含む活性画分（２３〜２
７）を集め、再度モノＱカラムにかけて、はぼ単一ビー
ク（精製度〉９５％）を持つ画分（７，５ｍ２）を分取
した。
ｏ−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭
にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸
配列）（式中、Ｘは Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ −Ａｒｇ−
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ −Ｖａ Ｉ−Ｖａ １ を表
す）の構造をした蛋白を多量に含む活性画分（２３〜２
７）を集め、再度モノＱカラムにかけて、はぼ単一ビー
ク（精製度〉９５％）を持つ画分（７，５ｍ２）を分取
した。
溶出パターンを第３図に示す。
第３図において、横軸に沿った連続番号、曲線、柱状グ
ラフ、直線が表すものは第２図におけると同しである。
ラフ、直線が表すものは第２図におけると同しである。
上記画分のＬ９２９細胞に対するＴＮＦ活性は、２．５
Ｘ１０’単位／ ｍ ｌだった。又、ファルマシアスペ
ローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ５ｕｐｅｒｏｓｅ） １
２カラム（ゲル濾過）に付して分子量を調べたら、６７
０００ダルトン以上であり、３全体ないし４量体の構造
をとっているものと推定された。又、５ｐｓ＝気泳動法
によると、２２０００ダルトンであった。
Ｘ１０’単位／ ｍ ｌだった。又、ファルマシアスペ
ローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ５ｕｐｅｒｏｓｅ） １
２カラム（ゲル濾過）に付して分子量を調べたら、６７
０００ダルトン以上であり、３全体ないし４量体の構造
をとっているものと推定された。又、５ｐｓ＝気泳動法
によると、２２０００ダルトンであった。
、ニーｐ、■」一
実施例中の９）〜１３）の手順で得られたｒＤＮＡ（以
下、ｒＴＮＦ−９−ＡＭ！と称す）を有する大腸菌ＪＭ
Ｉ ０３を、アンピシリン５０μｇ ／ ｍ Ｌを含む
Ｉ ＸＹＴ培地（バクトドリブトン ０．８％、バクト
イ−ストエキス ０．５％、ＮａＣ１Ｏ，５％）で３７
℃で前培養した後、アンピシリン５０μｇ ／ ｍ Ｌ
を含むｌ ＸＹＴ培地１００ ｍ ｌを含む５００ ｍ
ｌ坂ロフラスコに１％植菌し、同様に３７℃で培養し
、０Ｄ６６゜＝０．３に達した時にイソプロピルβ−Ｄ
−チオガラクトピラノシドを最終濃度０．７ｍＭになる
ように添加し、更に２４時間培養を続けた。大腸菌を遠
心分離により集め、ＩＸＰＢＳ （ＮａＣ１００８％、
ＫＣｆｆｉ Ｏ，０２％、 Ｋ ＨａＰ Ｏａｏ、０
２％、Ｎａ２ＨＰ０． ０．１１５％）で洗浄後、再び
］、 Ｏｍ ｌのＩＸＰＢＳに懸濁し、超音波で大腸菌
を破砕した。次いで、通常の蛋白質精製法により、ｒ
Ｔ Ｎ Ｆ −Ｓ −Ａ Ｍ １により発現されたポリ
ペプチドを分離、精製した。このポリペプチド（以下、
ＡＭＩと称す）のアミノ酸配列は次の通りであり、その
分子量はｌ ７５００±５００ （ＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動法）であった。
下、ｒＴＮＦ−９−ＡＭ！と称す）を有する大腸菌ＪＭ
Ｉ ０３を、アンピシリン５０μｇ ／ ｍ Ｌを含む
Ｉ ＸＹＴ培地（バクトドリブトン ０．８％、バクト
イ−ストエキス ０．５％、ＮａＣ１Ｏ，５％）で３７
℃で前培養した後、アンピシリン５０μｇ ／ ｍ Ｌ
を含むｌ ＸＹＴ培地１００ ｍ ｌを含む５００ ｍ
ｌ坂ロフラスコに１％植菌し、同様に３７℃で培養し
、０Ｄ６６゜＝０．３に達した時にイソプロピルβ−Ｄ
−チオガラクトピラノシドを最終濃度０．７ｍＭになる
ように添加し、更に２４時間培養を続けた。大腸菌を遠
心分離により集め、ＩＸＰＢＳ （ＮａＣ１００８％、
ＫＣｆｆｉ Ｏ，０２％、 Ｋ ＨａＰ Ｏａｏ、０
２％、Ｎａ２ＨＰ０． ０．１１５％）で洗浄後、再び
］、 Ｏｍ ｌのＩＸＰＢＳに懸濁し、超音波で大腸菌
を破砕した。次いで、通常の蛋白質精製法により、ｒ
Ｔ Ｎ Ｆ −Ｓ −Ａ Ｍ １により発現されたポリ
ペプチドを分離、精製した。このポリペプチド（以下、
ＡＭＩと称す）のアミノ酸配列は次の通りであり、その
分子量はｌ ７５００±５００ （ＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動法）であった。
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ＝Ａｒｇ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ −Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ −Ｖａ Ｉ−Ｖａ Ｉ−（Ｔ
ＮＦ−ａの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを
連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列） ヱ土亘２ 実施例中の第１表に示された合成りＮＡの先頭から５番
目のアミノ酸である５ｅｒｔｉ：ＣｙＳに代え、実施例
中の９）〜１３）と同じ手順で得られたｒＤＮＡ（以下
、ｒＴＮＦ−５−ＡＭ２と称す）を有する大腸菌ＪＭ１
０３を、参考例１と同様に処理して、ｒＴＮＦ−５−Ａ
Ｍ２により発現されたポリペプチドを分離、精製した。
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ −Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ −Ｖａ Ｉ−Ｖａ Ｉ−（Ｔ
ＮＦ−ａの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを
連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列） ヱ土亘２ 実施例中の第１表に示された合成りＮＡの先頭から５番
目のアミノ酸である５ｅｒｔｉ：ＣｙＳに代え、実施例
中の９）〜１３）と同じ手順で得られたｒＤＮＡ（以下
、ｒＴＮＦ−５−ＡＭ２と称す）を有する大腸菌ＪＭ１
０３を、参考例１と同様に処理して、ｒＴＮＦ−５−Ａ
Ｍ２により発現されたポリペプチドを分離、精製した。
このポリペプチド（以下、ＡＭ２と称す）のアミノ酸配
列は次の通りであり、その分子量は１７５００±５００
（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）であった。
列は次の通りであり、その分子量は１７５００±５００
（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）であった。
Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ −Ａｒｇ−
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｔ−Ａｒｇ −Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ −Ｖａ １−Ｖａ ｌ −
（ＴＮＦ−ａの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニ
ンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列） １１且工 ゛・ ゛１０週齢のＢＡ
ＬＢ／ｃ雄マウスの腹部皮肉に、同系腫瘍である繊維芽
肉腫メスＡ！胞を２×１０’ｌＩｌ移植した。７日後、
平均腫瘍径が５〜６ｍｍに達したマウスに、生理的食塩
水（対照）、実施例で得られた本発明のポリペプチド（
Ｌ９２９！Ｉ胞に対する活性単位として１００００単位
）又は、参考例２で生成されたＡＭ２ （Ｌ９２！１１
１１胞に対する活性単位としてｔｏｏｏｏ単位）を尾静
脈より投与した。この投与は合計３回（腫瘍移植後７．
１０．１３３日目行った。
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｔ−Ａｒｇ −Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ −Ｖａ １−Ｖａ ｌ −
（ＴＮＦ−ａの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニ
ンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列） １１且工 ゛・ ゛１０週齢のＢＡ
ＬＢ／ｃ雄マウスの腹部皮肉に、同系腫瘍である繊維芽
肉腫メスＡ！胞を２×１０’ｌＩｌ移植した。７日後、
平均腫瘍径が５〜６ｍｍに達したマウスに、生理的食塩
水（対照）、実施例で得られた本発明のポリペプチド（
Ｌ９２９！Ｉ胞に対する活性単位として１００００単位
）又は、参考例２で生成されたＡＭ２ （Ｌ９２！１１
１１胞に対する活性単位としてｔｏｏｏｏ単位）を尾静
脈より投与した。この投与は合計３回（腫瘍移植後７．
１０．１３３日目行った。
腫瘍移植後７日目、１００日目１３３日目１７７日目２
１１日目腫瘍の短径と長径を１Ｊ１１定し、その相乗平
均を腫瘍径として記録した。結果（各群３匹の平均）を
第４図に示す。
１１日目腫瘍の短径と長径を１Ｊ１１定し、その相乗平
均を腫瘍径として記録した。結果（各群３匹の平均）を
第４図に示す。
第４図に示されるように、本発明のポリペプチドは対照
に対し、危険率５％以下で有意差があるが、ＡＭ２では
、対照に対して有意差は認められなかった。
に対し、危険率５％以下で有意差があるが、ＡＭ２では
、対照に対して有意差は認められなかった。
ヱｌ且ユ − 。
７週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウスに、ブライマーとしての
、実施例で得られた本発明のポリペプチド又は参考例１
で得られたＡＭＩをそれぞれ、Ｌ９２９ｍ胞に対する活
性単位として１単位又は１００００単位を尾静脈より投
与した。対照群には生理的食塩水を投与した。
、実施例で得られた本発明のポリペプチド又は参考例１
で得られたＡＭＩをそれぞれ、Ｌ９２９ｍ胞に対する活
性単位として１単位又は１００００単位を尾静脈より投
与した。対照群には生理的食塩水を投与した。
その３時間後に、トリガーとしてのビシバニール（登録
商標、中外製薬株式会社製）を３ＫＥ［クリニッシェ
アインハイト（ＫｌｉｎｉｓｃｈｅＥ ｉ ｎｈｅ ｉ
ｔ ）系単位であり、ＩＫＥは、０．１ｍｇの乾燥細
菌を含む製剤量に当たるコ尾静脈から投与した。その２
時間後に５！頚部動脈から採血し、血清を分離して、そ
のＴＮＦ活性を、Ｌ９２９．ｍ胞に対する活性単位とし
て測定した。結果（各群３匹、ＡＭＩ投与群は４匹の平
均）を第５図に示す。
商標、中外製薬株式会社製）を３ＫＥ［クリニッシェ
アインハイト（ＫｌｉｎｉｓｃｈｅＥ ｉ ｎｈｅ ｉ
ｔ ）系単位であり、ＩＫＥは、０．１ｍｇの乾燥細
菌を含む製剤量に当たるコ尾静脈から投与した。その２
時間後に５！頚部動脈から採血し、血清を分離して、そ
のＴＮＦ活性を、Ｌ９２９．ｍ胞に対する活性単位とし
て測定した。結果（各群３匹、ＡＭＩ投与群は４匹の平
均）を第５図に示す。
第５ｖ！！Ｊに示されるように、本発明のポリペプチド
は１単位で約２０倍の内因性ＴＮＦ産生増強効果を示し
たが、ＡＭＩにはかかる効果はほとんどなかった。１０
０００単位では、共に、７０〜１５０倍という高い増強
効果を示した。
は１単位で約２０倍の内因性ＴＮＦ産生増強効果を示し
たが、ＡＭＩにはかかる効果はほとんどなかった。１０
０００単位では、共に、７０〜１５０倍という高い増強
効果を示した。
見１亘
実施例で得られた蛋白を凍結乾燥後、終濃度０．５〜２
ｍｇ／ｍ１４．３７℃、７０％ギ酸中て２４時間反応さ
せて、下記条件のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に
より、生成された蛋白を検出した。
ｍｇ／ｍ１４．３７℃、７０％ギ酸中て２４時間反応さ
せて、下記条件のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に
より、生成された蛋白を検出した。
分離ゲル：１５％アクリルアミド＋０．４％ビスアクリ
ルアミド十０．３７５Ｍ）リス −ＨＣＲ（ｐＨ８，８）＋０．１％ ＳＤＳ＋０．０８％ＴＥＭＥＤ （Ｎ。
ルアミド十０．３７５Ｍ）リス −ＨＣＲ（ｐＨ８，８）＋０．１％ ＳＤＳ＋０．０８％ＴＥＭＥＤ （Ｎ。
Ｎ、Ｎ、Ｎ−テトラメチレンエチレン
ジアミン＋０．０８％過硫酸アンモニ
ウム
濃縮ゲル：５％アクリルアミド十０．１３％ビスアクリ
ルアミド十０．１２５Ｍ）リス −ＨＣタ （ｐＨ８，８）＋０． １ ％ＳＤＳ＋０．
２ ％Ｔ ＥＭＥ Ｄ ＋０．０７５％過硫酸
アンモニウム 泳動バッファー：０．０２５Ｍ）リス−ＨＣ１＋０．１
９２Ｍグリシン＋ ０．１％ＳＤＳ （ｐＨ約８．３） 泳動条件：２０ｍＡ定電流で約４．５〜５時間染色・脱
色：泳動終了後、ゲルを２０％トリクロロ酢酸で、室温
、３０分の条件で固 定し、コーマジー ブリリアント ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ’ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂ
ｌｕｅ）Ｒ−２５０のエタノールφ酢酸φ水 （９： ２ ： ９）混液中０．２５％溶液で蛋白のバ
ンドを染色する。
ルアミド十０．１２５Ｍ）リス −ＨＣタ （ｐＨ８，８）＋０． １ ％ＳＤＳ＋０．
２ ％Ｔ ＥＭＥ Ｄ ＋０．０７５％過硫酸
アンモニウム 泳動バッファー：０．０２５Ｍ）リス−ＨＣ１＋０．１
９２Ｍグリシン＋ ０．１％ＳＤＳ （ｐＨ約８．３） 泳動条件：２０ｍＡ定電流で約４．５〜５時間染色・脱
色：泳動終了後、ゲルを２０％トリクロロ酢酸で、室温
、３０分の条件で固 定し、コーマジー ブリリアント ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ’ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂ
ｌｕｅ）Ｒ−２５０のエタノールφ酢酸φ水 （９： ２ ： ９）混液中０．２５％溶液で蛋白のバ
ンドを染色する。
脱色は、エタノール・酢酸・水
（２５： ８ ： ６５）混液て行う。
その結果、分子量約１７０００と、分子量約５０００の
ところにバンドが検出された。
ところにバンドが検出された。
これらのバンドはそれぞれ、ＴＮＦに対する抗体、ＴＨ
Ｐ４に対する抗体と結合することが確認された。
Ｐ４に対する抗体と結合することが確認された。
［発明の効果］
本発明により、ｗＩ規な抗腫瘍性ポリペプチドをコード
する新規ＤＮＡが提供される。この抗ＩＩ！ Ｊ’Ｉ性
は、Ｌ−９２９細胞及び繊維芽肉腫メスＡｍ胞に対する
細胞毒性により確認されている。更に、この新規ポリペ
プチドは、高い内因性ＴＮＦ産生誘導活性を持っている
。
する新規ＤＮＡが提供される。この抗ＩＩ！ Ｊ’Ｉ性
は、Ｌ−９２９細胞及び繊維芽肉腫メスＡｍ胞に対する
細胞毒性により確認されている。更に、この新規ポリペ
プチドは、高い内因性ＴＮＦ産生誘導活性を持っている
。
又、本発明の新規ポリペプチドをギ酸、酢酸等の適当な
酸で処理すると、ＴＨＰ４と抗１１瘍性ポリペプチドと
を得られる。本発明のＤＮＡは大腸菌等に組み込むこと
により大量生産できるので、従来、大量生産が不可能で
あったＴＨＰ４の大１生産が初めて可能になった。
酸で処理すると、ＴＨＰ４と抗１１瘍性ポリペプチドと
を得られる。本発明のＤＮＡは大腸菌等に組み込むこと
により大量生産できるので、従来、大量生産が不可能で
あったＴＨＰ４の大１生産が初めて可能になった。
又、本発明のＤＮＡがコードするアミノ＃配列において
、（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグア
ニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）
の先頭のアミノ酸であるアラニン（Ａｌａ）の塩基配列
がＧＣＧである場合には、制限酵素Ｎｒ ｕ Ｉ （Ｔ
ＣＧＣＧＡ）の作用により、ＴＮＦ−αの第４エクソン
の塩基配列と同一の塩基配列の前で塩基配列を切断し、
任意の塩基配列を導入できるという利点がある。
、（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグア
ニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）
の先頭のアミノ酸であるアラニン（Ａｌａ）の塩基配列
がＧＣＧである場合には、制限酵素Ｎｒ ｕ Ｉ （Ｔ
ＣＧＣＧＡ）の作用により、ＴＮＦ−αの第４エクソン
の塩基配列と同一の塩基配列の前で塩基配列を切断し、
任意の塩基配列を導入できるという利点がある。
第１図は、ＴＨＰ−１細胞から精製された抗腫瘍性ポリ
ペプチドのゲノム遺伝子のＸｈｏ Ｉ／Ｐｓｔｌ断片の
塩基配列を示す。 第２図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドを含
む遠心分離の上清を第１回のファルマシア社製のモノＱ
ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーに付した際の溶出パ
ターンを示す。 第３図は、第２図に示された溶出パターンを参考にして
集められた活性画分を第２回のファルマシア社製のモノ
ＱＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーに付した際の溶出
パターンを示す。 第４図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドの、
繊維芽肉腫メスＡｌｌ１胞に対する抗腫瘍効果を示すグ
ラフである。 第５図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドの、
内因性ＴＮＦ産生増強効果を示すグラフである。 第２．３図において、横軸に沿った連続番号はそれぞれ
の両分を表し、曲線は蛋白の溶出量を表し、柱状グラフ
は、Ｌ９２９ｍ胞に対するＴＮＦ活性（単位）を表し、
直線は溶出液の塩１度（０゜０１Ｍ−ＩＭ）を表してい
る。 第４図において、Ｏは対照群の、△は本発明には含まれ
ないポリペプチドＡＭ２の、口は本発明のポリペプチド
のデータを示している。 特許出願人 抽 源一部 （ばか１名）０＋＋、ｉ
、ｅ ｔｔｉ ａアうＦ３３第 ５ 図 Ｉｎ ＸＸＬ手続補正
書（方式） 昭和６３年７月２７日 １、事件の表示 昭和６３年特許願第０８１６８３号 ２、発明の名称 新規ＤＮＡとその生産方法、それを有する新規プラスミ
ド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプ
チドからなる新規抗腫瘍剤 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 〒１５８ 東京都世田谷区東玉川１−１０−２１ 昭和６３年６月２８日 ５、補正の対象 第４１！１
ペプチドのゲノム遺伝子のＸｈｏ Ｉ／Ｐｓｔｌ断片の
塩基配列を示す。 第２図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドを含
む遠心分離の上清を第１回のファルマシア社製のモノＱ
ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーに付した際の溶出パ
ターンを示す。 第３図は、第２図に示された溶出パターンを参考にして
集められた活性画分を第２回のファルマシア社製のモノ
ＱＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーに付した際の溶出
パターンを示す。 第４図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドの、
繊維芽肉腫メスＡｌｌ１胞に対する抗腫瘍効果を示すグ
ラフである。 第５図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドの、
内因性ＴＮＦ産生増強効果を示すグラフである。 第２．３図において、横軸に沿った連続番号はそれぞれ
の両分を表し、曲線は蛋白の溶出量を表し、柱状グラフ
は、Ｌ９２９ｍ胞に対するＴＮＦ活性（単位）を表し、
直線は溶出液の塩１度（０゜０１Ｍ−ＩＭ）を表してい
る。 第４図において、Ｏは対照群の、△は本発明には含まれ
ないポリペプチドＡＭ２の、口は本発明のポリペプチド
のデータを示している。 特許出願人 抽 源一部 （ばか１名）０＋＋、ｉ
、ｅ ｔｔｉ ａアうＦ３３第 ５ 図 Ｉｎ ＸＸＬ手続補正
書（方式） 昭和６３年７月２７日 １、事件の表示 昭和６３年特許願第０８１６８３号 ２、発明の名称 新規ＤＮＡとその生産方法、それを有する新規プラスミ
ド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプ
チドからなる新規抗腫瘍剤 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 〒１５８ 東京都世田谷区東玉川１−１０−２１ 昭和６３年６月２８日 ５、補正の対象 第４１！１
Claims (6)
- （１）下記アミノ酸配列をコードするＤＮＡ。 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かを表す。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。） - （２）下記アミノ酸配列をコードするＤＮＡの生産方法
において、 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かである。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。）、 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
をコードするＤＮＡと、ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソ
ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
に対応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとを連結
させる工程； （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）をコードするＤＮ
Ａと、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソ
ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
に対応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとを連結
させる工程； （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）をコードするＤＮ
Ａと、Ａｓｐ−ＰｒｏをコードするＤＮＡと、ｘ−（Ｔ
ＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを
連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコー
ドするＤＮＡとをその順位で同時に連結させる工程；の
いずれかを含む方法。 - （３）下記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有する
プラスミド。 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かを表す。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。） - （４）下記アミノ酸配列で表されるポリペプチド。 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かを表す。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。） - （５）宿主微生物細胞内で増殖しうるプラスミドに挿入
されている、下記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを有
する宿主微生物を培養することを特徴とする、下記アミ
ノ酸配列で表されるポリペプチドの生産方法。 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かを表す。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。） - （６）下記アミノ酸配列で表されるポリペプチドからな
る抗腫瘍剤。 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かを表す。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。）
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63081683A JP2828988B2 (ja) | 1988-04-03 | 1988-04-03 | 新規ｄｎａとその生産方法、それを有する新規プラスミド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤 |
| CA000595536A CA1340244C (en) | 1988-04-03 | 1989-04-03 | Dnas and processes for their preparation, novel plasmids comprising themnovel polypeptides and processes for their preparation and novel anti-tumor agents comprising said polypeptides |
| EP89400912A EP0341100B1 (en) | 1988-04-03 | 1989-04-03 | DNA coding for thymosin and TNF |
| DE68913802T DE68913802T2 (de) | 1988-04-03 | 1989-04-03 | Thymosin und TNF-kodierende DNA. |
| AT89400912T ATE102997T1 (de) | 1988-04-03 | 1989-04-03 | Thymosin und tnf-kodierende dna. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63081683A JP2828988B2 (ja) | 1988-04-03 | 1988-04-03 | 新規ｄｎａとその生産方法、それを有する新規プラスミド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01256390A true JPH01256390A (ja) | 1989-10-12 |
| JP2828988B2 JP2828988B2 (ja) | 1998-11-25 |
Family
ID=13753155
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63081683A Expired - Fee Related JP2828988B2 (ja) | 1988-04-03 | 1988-04-03 | 新規ｄｎａとその生産方法、それを有する新規プラスミド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0341100B1 (ja) |
| JP (1) | JP2828988B2 (ja) |
| AT (1) | ATE102997T1 (ja) |
| CA (1) | CA1340244C (ja) |
| DE (1) | DE68913802T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02101019A (ja) * | 1988-10-05 | 1990-04-12 | Genichiro Soma | 抗エイズ剤 |
| WO1993001211A1 (en) * | 1991-07-05 | 1993-01-21 | Peptide Technology Limited | Peptide which abrogates tnf and/or lps toxicity |
| RU2225443C1 (ru) * | 2002-07-25 | 2004-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Фармаклон" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-ТИМОЗИН-α1 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19975063I2 (de) * | 1984-03-06 | 2005-08-18 | Dainippon Pharmaceutical Co | DNS den menschlichen Tumornekrosisfaktor kodierendund das menschliche Tumornekronisfaktor-Polypepti d. |
| CA1340998C (en) * | 1986-02-04 | 2000-05-23 | Den'ichi Mizuno | Dnas and processes for their preparation, novel plasmids possessing them, novel polypeptides and processes for their preparation and novel anti-tumor agents comprising said polypeptides |
-
1988
- 1988-04-03 JP JP63081683A patent/JP2828988B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-04-03 AT AT89400912T patent/ATE102997T1/de active
- 1989-04-03 EP EP89400912A patent/EP0341100B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-03 CA CA000595536A patent/CA1340244C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-03 DE DE68913802T patent/DE68913802T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0341100A2 (en) | 1989-11-08 |
| EP0341100B1 (en) | 1994-03-16 |
| EP0341100A3 (en) | 1990-09-12 |
| CA1340244C (en) | 1998-12-15 |
| JP2828988B2 (ja) | 1998-11-25 |
| ATE102997T1 (de) | 1994-04-15 |
| DE68913802D1 (de) | 1994-04-21 |
| DE68913802T2 (de) | 1994-10-13 |
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