JPH04504064A - 新規血小板由来成長因子ｂ鎖類似体及びその均質製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規血小板由来成長因子Ｂ鎖類似体及びその均質製造方法発明の詳細な説明 本出願は、１９８９年１２月１９日提出の米国特許出願第４５４．７９４号の一 部継続出願である。 ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、結合組繊細胞に関する血清中の主なマ イトジェン成長因子であると考えられている。ＰＤＧＦのマイトジェン活性は、 多数の研究で実証されており、それらの研究により、動脈平滑筋細胞、繊維芽細 胞系、及びダリア細胞における分裂誘発にＰＤＧＦが明確に作用することが示さ れている（Ｄｅｕｅｌ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、、２５６　（１７）、８８９６−８８９９　−（１９８１））、例え ば、Ｈｅ１ｄｉｎ他、Ｊ、Ｃｅ１ｌＰｈｙｓｉｏ１．．１０５．２３５　（１９ ８０）（脳グリア細胞）；Ｒａ１ｎｅｓ及びＲｏｓｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、。 ２５７．５１５４　（１９８２）（サル動脈平滑筋細胞）も参照するとよい。Ｐ ＤＧＦはさらに、繊維芽細胞、平滑筋細胞、単核球、及び顆粒球に対する化学誘 引剤であると考えられている。 結合組織創傷の部位に分裂を誘発し、このような創傷の部位に繊維芽細胞を引き つけるその明らかな能力のために、ＰＤＧＦは損傷又は外傷を受けた結合組織の 修復に治療的に用いるのに特別な潜在力を有すると考えられる。 ＰＤＧＦは、培養における繊維芽細胞の成長を支持し得る全血血清（しかし血小 板が不十分な血清ではない）中に見出される因子として、Ｒｏｓｓ他（Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７１．１２０７−１２１０　（１９７ ４））によって最初に記載された。ＰＤＧＦは、その後、血小板及び血清から単 離され、天然非還元型ＰＤＧＦは２７〜３５ｋｄｍｗダイマータンパク質として 同定された。ＰＤＧＦの還元で、１０〜１８ｋｄの分子量範囲に、ゲル上に２つ 以上の小バンドを生じることが判明した。これらの小バンドは、それぞれ“Ａ” 及び“Ｂ”サブユニットと、あるいはＰＤＧＦ　Ａ鎖及びＰＤＧＦ　Ｂ鎖と呼ば れる約１８ｋｄと１６ｋｄの分子量の２つの小さい、異なるモノマーサブユニッ トを表わすと考えられた。ＰＤＧＦの２つのサブユニットのアミノ酸配列は、以 後、同定され、ＰＤＧＦ　Ｂ鎖のアミノ酸配列は、悪性サル肉腫ウィルス（ＳＳ Ｖ）内に含有される腫瘍遺伝子であるｖ−ｓｉｓの予測されるタンパク質物質と ９０％以上相同であると確認されている（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ他、５ｃｉｅｎｃ ｅ、２２１゜２７５−２７６　（１９８３）　、及びＷａｔｅｒｆｉｅｌｄ他。 Ｎａ　ｔｕｒｅ、３０４．　２８１０−２８１４　（１９８３））　。 Ａ鎖はＢ鎮と約６０％相同であることが判明している。 のアミノ酸の前駆体ポリペプチドの１０９個のアミノ酸の開裂Ｊｏｈｎｓｓｏｎ 他のシーケンシングデータはさらに、Ｖ−ｓｉｓ遺伝子度物ｐ２　Ｂ　ｌｆｇの 予測アミノ酸配列の、ＰＤＧＦのＢ鎖の実際のアミノ酸配列との高度の相同性を 確証した。 ＰＤＧＦ　Ｂ鎖のｖ−ｓｉｓ遺伝子産物との相同性は、ｐ２８″ｉｓのアミノ酸 ６７、即ちセリン残基で開始し、アミノ酸１７５のトレオニン残基まで１０９個 のアミノ酸の間続く（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ他　前出）、この１０９個のアミノ酸の 相同配列はさらに、ヒトのＰＤＧＦの成熟形態であると考えられとの相同は、２ ４１個のアミノ酸の前駆体タンパク質のアミノ酸８２で開始し、１０９個のアミ ノ酸の間続く。 ＰＤＧＦは、ダイマー形態でのみ生物学的に活性であると考えられる。これらの 生物学的に活性なＰＤＧＦダイマーは、ＰＤＧＦ−ＡＢへテロダイマー、ＰＤＧ Ｆ−ＢＢホモダイマー、又はＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーの形態を取り得る（Ｈ ａｎｎｉｎｋ他、Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、、６゜１３０４−１３１４　 （１９８６））。生物学的に活性なダイマーの各モノマーサブユニットは、それ がＡ鎖モノマーであるか又はＢ鎖モノマーであるかとは無関係に、８個のシステ ィン残基を含有する。これらのシスティン残基のいくつかは、ダイマーをともに 保持する鎖間ジスルフィド結合を形成する。 Ｊｏｈｎｓｓｏｎ他によってＰＤＧＦの成熟形態であると確認された１０９個の アミノ酸のｖ−ｓｉｓ相同配列（ＰＤＧＦＢｌｏｇ）は、活性組換えＰＤＧＦ　 （ｒＰＤＧＦ）を得るために、酵母及びその他の真核生物宿主細胞系を用いる組 換え技術に用いられてきた（米国特許第４，７６６．０７３号（“Ｍｕｒｒａｙ 他！“）酵母宿主細胞）、ＰＤＧＦ　８１０９列の使用を上回る２つの利点が提 供される。即ち、（１）長いｃ−ｓｉｓコード配列よりも取り扱い易いために、 １０９個のアミノ酸のコード配列は、ＰＤＧＦ　Ｈのようなタンパク質の組換え 体生成を容易にし；そして（２）１０９個のアミノ酸のコード配列はＰＤＧＦ　 Ｈの成熟形態に近い構造をした組換え産物を生じ、したがりて、ｒＰＤＧＦ　Ｂ を含有する治療化合物で治療中のヒト被験者によるプロセッシングの必要がほと んどないであろう。さらに小型の、潜在的に生物学的に活性なＰＤＧＦ　Ｂ類似 体を生じるカルボキシ及び／又はアミノ末端アミノ酸の欠失は、実に広範な治療 有用性ｌを冑し得ると示唆されているが（米国特許第４．８４５．０７５号（″ Ｍｕｒｒａｙ他Ｉ！”））、シかしこれらの切端形態の治療効力は立証されてい ない。 Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　」、、は、必要なコード配列を得るための多数の開始物質 の任意の一つを用いる組換え技術によって調製し得る。 結コドンを挿入後に望ましい宿主細胞を形質転換し得る。あ個のアミノ酸のコー ド配列を合成し得る。さらに、例えばＭｕｒｒａｙ他■に記載されているような これらの方法の組み合わせを用い得る。任意の場合に、終結コドンは、コドン配 列上のアミノ酸位置１１０に配置されねばならない。そうでなければ、宿主細胞 の複製系は、１０９個のアミノ酸のコドンを通り過ぎて天然終結コドンに達する まで翻訳し、残りのＣ−５ｉｓコード化タンパク質（ｃ−ｓｉｓ遺伝子を組み入 れているベクターを用いる場合）、又はベクターコード化タンパク質ンパク質を 生成する。 ＰＤＧＦ　Ｂの組換え体生成のためにさらに高度に進化した真核生物宿主細胞系 又は酵母細胞系を用いると、一般に、相対的に低レベルの生物学的活性ｒＰＤＧ Ｆ　Ｈの分泌を生じる。 しかしながら、これらのより高度に進化した宿主細胞内のプロセッシング系では 、宿主細胞の天然の生物学的プロセスによる、例えばグリコジル化及び／又はタ ンパク質分解開裂による、任意の数の経路で加工された組換え体ｒＰＤＧＦ　Ｂ ホモダイマー物質を生じる。これは、哺乳類宿主細胞の場合に特にその通りであ る。その結果、組換え産物の正確な組成は、正確に予測されないか、又は、多く の場合、正確に制御されない。 他方、原核生物宿主細胞系、例えば大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉは、これらの宿主細胞が 占める低度の進化スケールに存在する生物学的プロセッシング経路が相対的に欠 けているために、より容易に制御され、限定された産物を生じる。原核生物宿主 細胞系はさらに、より多量の所望の組換え体産物を生じる。より高度の発現系で は、組換え体産物を高収率で得る代わりに、組換え体タンパク質を封入体から単 離しなければならない、これは、一般に、生物学的活性産物を生成するために、 変性タンパク質の再生を要する。しかしながら、近年開発された再生法は、高発 現宿主細胞系におけるｒＰＤＧＦ　Ｂ生成の望ましさを増大した。例えば、同時 係属中の米国特許出願第４５１．４８５号及び　、　号（その記載内容は参照に より本明細書中に含めるものとする）は、封鎖形モノマー中間物質を生成するた めに封鎖剤を用いる変性ｒ　ＰＤＧＦの再生方法を開示する。他方、国際特許出 願第９０１０４０３５号は、再生をもたらす融合タンパク質中間産物を導入する 。 にもかかわらず、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉにおけるＰＤＧＦＢ１０９の産生は、少な くともいくつかの場合において、意外にも、終結コドン”　リードスルー（ｒｅ ａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）”の問題を示すことが判明した。言い換えれば、宿主細 胞発現系は、いくつかの場合には１１０位置の終結コドンをリードスルーし、し たがって所望のＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　ｌｏ、最終産物より長い産システィンは“ リードスルー”の際にこの位置に挿入されることが判明した。その他のいくつか のタンパク質における天然ＵＧＡコドンの２　リードスルー”の際のセレノシス 　ティン挿１２２１−１２２７　（１９８６）；Ｓｕｋｅｎａｇａ他。 伝子の１１０位置に置かれる場合も、部分的“リードスルー“が、程度は少ない が観察されている。“リードスルー”問題は、長型ＰＤＧＦ　Ｂと組み合わさっ たＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　ｔ　０９の異質混き続いて、均質産物を得るために実施 すべき付加的分離工程を要する。 治療及び商業的目的のためには、かなりの量の、信頼性のある生物学的に活性な 均質形態のＰＤＧＦ　Ｂを経済的に生成するのが望ましい。高度発現原核細胞系 が均質形態のｒＰＤＧＦを生成できないことは、必要な分離工程に余分の費用が 掛るために均質産物の生成の経費をかなり増大させる。 生物学的に活性で、天然ＰＤＧＦ　Ｂに非常に似ている高度発現均質ｒＰＤＧＦ 　Ｂ産物を提供することが、本発明の目的本発明によれば、新規のｒＰＤＧＦ　 Ｂ類似体が提供される。さらに、有意量のこれらの新規の類似体の均質（ｈｏｍ ｏｇｅｎｅｏｕｓ）生成方法が提供される。、本発明の方法は、終結コドンが、 はぼアミノ酸１１１〜はぼアミノ酸１６０の位置に対応する位置で、ｃ−ｓｉｓ 遺伝子上、あるいはＰＤＧＦ　Ｂの前駆体タンパク質又はその類似体に関するそ の他のコード配列上に置かれる。本発明の方法は、高度発現宿主細胞、例えば大 腸菌から、相対的に均質大量のｒＰＤＧＦＢ類似体を生成させる。本発明の方法 により生成されるｒＰＤＧＦ　Ｂ類似体は、天然ＰＤＧＦ　Ｂに匹敵する生物学 的活性を示す。 図面の簡単な説明 図１は、哺乳類ｒＰＤＧＦ　Ｂの分析から得られたアミノ酸配列データの図であ る。 図２は、大腸菌Ｅ　、ｃ　ｏ　Ｉ　ｓ　ｒ　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　１０９及びｒ ＰＤＧＦ　Ｂ、１．と比較した哺乳類ｒＰＤＧＦ　Ｂの相対的移動度を示すクー マシーブリリアントブルー染色電気泳動ゲルＢ１１９を発現するのに用いられる コード配列の図である。 図４は、本発明に従って生成された種々のロットからの大腸菌Ｅ、ｃ　ｏ　ｌ　 ｒ　ｒ　Ｐ　ＤＧＦ　Ｂ１１９の移動を示すクーマシーブリリアントブルー染色 電気泳動ゲルである。 図５は、本発明の教示に従って再生された大腸菌見ｌＣｏ１１−産生ｒＰＤＧＦ 　Ｂ１１９の分裂誘発活性を示すグラフである。 図６は、本発明の教示に従って再生された大腸菌Ｅ。 ｃｏｌｉ−産生ｒＰＤＧＦ　Ｂｌ、、の線維芽細胞に対する走化性活性を示すグ ラフである。 図７は、本発明の教示に従って再生された大腸菌Ｅ。 ｃｏｌｉ−産生ｒ　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　ｌ、９の単球に対する走化性活性を示 すグラフである。 図８は、Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　ｔ　１９ホモダイマーと比較した場合のＰ　Ｄ　 Ｇ　Ｆ　Ｂ　、、９モノマーの活性を示す。 本発明の詳細な説明 本発明は、新規のｒＰＤＧＦ　Ｂ類似体を提供する。これらの類似体は長さ１１ ０〜１５９アミノ酸であって、ＰＤＧＦＢ　前駆体タンパク質又はＰ　Ｄ　Ｇ　 Ｆ　Ｂ　ＩＧ９前駆体タンパク質類似体の部分と同じアミノ酸配列を有する。本 類似体はモノマー及び／又はダイマーの形態である。 Ｂ類似体の均質生成方法を提供する。本発明の方法は、選択された宿主細胞を新 規のコード配列でトランスフェクト又は形質ｓｉｓ遺伝子、あるいはＰ　Ｄ　Ｇ 　Ｆ　８１０９前駆体タンパク質又はその類似体に関するその他のコード配列を 用いる。この配列では、終結コドンは、はぼアミノ酸１１１〜はぼアミノ酸１６ ０に対応する位置に置かれる。 本発明の理解を助けるために、以下の用語は、本明細書中で用いる場合、以下の ように定義される。 特記しない限り、ＰＤＧＦ　Ｂは、その類似体、還元型又は非還元型の、生物学 的に活性又は不活性の組換え体やなにかを含めた、ＰＤＧＦ　Ｂモノマー及び／ 又はダイマーの任意の組み合わせである。ｒＰＤＧＦ　ＢＪという用語は、天然 Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　１ｏ、のアミノ酸配列の数及び／又は単位に１つ又はそれ 以上の修飾を有するＰＤＧＦ　Ｂ類似体を含有することを特に意図する。ＰＤＧ Ｆ　Ｂ類似体は、生物学的に活性であるか、あるいは再生技法又はその他の同様 の機械的操作によって生物学的に活性にされ得る。 ｒＰＤＧＦモノマー」及び「モノマーＰＤＧＦＪという用語は、任意のその他の ＰＤＧＦ分子にジスルフィド結合していない単一モノマーＰＤＧＦ分子を意味す る。「還元型ＰＤＧＦＪは必然的にモノマーＰＤＧＦであると認識されよう。　 ｒＰＤＧＦダイマー」又は「ダイマーＰＩ）ＧＦＪという用語は、互いにジスル フィド結合する２つのモノマーＰＤＧＦサブユニットを含有するＰＤＧＦ分子を 意味する。 「生物学的活性ＰＤＧＦダイマー」という用語は、天然ＰＤＧＦと実質的に同一 の分裂誘発（マイトジェン）活性及び／又は走化性活性を有するダイマーＰＤＧ Ｆを意味する。 「生物学的活性ＰＤＧＦモノマー」という用語は、天然ダイマーＰＤＧＦのマイ トジェン比活性の少なくとも約１０００分の１のマイトジェン比活性を有するモ ノマーＰＤＧＦを意味する。 「生物学的活性コンホメーシ蓼ン」という用語は１、本明細書中で用いる場合、 生物学的に活性なＰＤＧＦダイマー又は生物学的に活性なＰＤＧＦモノマーのフ ンホメーシ１ンを示す。 「前駆体タンパク質」は、Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　ｌｏｇの２４１個のアミノ酸の ｃ−ｓｉｓコード化前駆体タンパク質を示す。 「前駆体タンパク質類似体」という用語は、ｃ−ｓｉｓ遺伝子にコードされる２ ４１個のアミノ酸のアミノ酸配列の数及び／又は単位に１つ又はそれ以上の修飾 を有する前駆体タンパク質を示す。前駆体タンパク質類似体は、前駆体タンパク 質同様、前駆体タンパク質コード配列によりコードされる。 本明細書中で用いる場合、「前駆体タンパク質コード配列」という用語は、ｃ− ｓｉｓ遺伝子、あるいは２４１個のアミノ酸のｃ−ｓｉｓコード化ＰＤＧＦ　Ｂ １ｏ９前駆体タンパク質又はその類似体をコードする任意のコード配列を意味す る。前駆体タンパク質コード配列は天然ｃ−ｓｉｓ遺伝子におけるコドンの数及 び／又は単位に１つ又はそれ以上の修飾を有しうるけれども、前駆体タンパク質 コード配列は：（１）ｃ−ｓｉｓ遺伝子とハイブリダイズし得るか、あるいは（ ２）遺伝子コードの縮重を除けば、ｃ−ｓｉｓ遺伝子及び／又は上記（１）と／ ％イブリダイズする。最も一般的には、前駆体タンパク質コード配列は、選択宿 主細胞系における発現のために好ましいコドンを含有する。 本明細書中で用いるナンバリング系において、アミノ酸番号１はＪｏｈｎｓｓｏ ｎ他（前出）が確定したように成熟血小板ＰＤＧＦ　Ｂのアミノ末端セリンを示 す。この位置は、２４１個のアミノ酸の前駆体タンパク質の残基８２に対応する 。Ｃ二ｓｉｓコード化前駆体タンパク質中の１番目のセリンの前のアミノ酸は、 マイナス番号で示される。１番目のセリンの後のアミノ酸は、前駆体タンパク質 の２４１番目のアミノ酸がアミノ酸１６０と指定されるように引き続いて番号を つける。 天然の哺乳類ＰＤＧＦ　Ｂに最もよく似た高度発現原核生物宿主細胞由来の、本 発明の均質（ホモジニアス）ＰＤＧＦ　Ｂ物質を生成するのが好ましい。原液生 物宿主細胞中への挿入に関して前駆体タンパク質コード配列上に終結コドンを配 置するための好ましいと考えられるほかの部位を確認するために、全２４１アミ ノ酸ｃ−ｓｉｓ遺伝子を先ず発現ベクターに挿入して、哺乳類のチャイニーズハ ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクトするために用いた。その結果生 じた分泌タンパク質物質を次に、クロマトグラフィーによって精製及び分離して 、ＣＨｏ細胞によりプロセッシングした場合のタンパク質のカルボキシ末端部位 を確定した。以下の実施例でさらに詳細に説明されるように、ＣＨｏ細胞により 分泌された２つの主なＰＤＧＦ　Ｂタンパク質産物は、アミノ酸１０９の後、及 びアミノ酸１１９の後で終結することが判明した。さらに、少なくとも２つのそ の他のＰＤＧＦ　Ｂ類似体が、はぼアミノ酸１２６後〜はぼアミノ酸１３６後の 範囲でタンパク質分解開裂によりプロセッシングされた。考えられるタンパク質 分解開裂部位に基づいて、これら２つの別のＰＤＧＦ類似体のカルボキシ末端は 、アルギニン残基で、即ちほぼアミノ酸１２６．１３０．１３３．１３５、又は １３６で終結すると判断された。 好ましくは、本発明の方法は、終結コドンがほぼアミノ酸１１１〜はぼアミノ酸 １３７の前駆体タンパク質コード配列に配置された前駆体タンパク質コード配列 で宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換することによって実施する。さらに 好ましくは、終結コドンは、はぼアミノ酸１２０〜はぼアミノ酸１３７の位置に 配置する。さらに好ましくは、終結コドンは、アミノ酸１２０、アミノ酸１２７ 、アミノ酸１３１、アミノ酸１３４、アミノ酸１３６、及びアミノ酸１３７から なる群から構成される装置に配置する。最も好ましくは、アミノ酸１２０位に終 結コドンを用いるコード配列を使用して本発明の方法を実施する。本発明の方法 により、約１１０〜約１５９のアミノ酸長を有するＰＤＧＦ　Ｂの新規の類似体 の生成を生じる。 終結コドンでの終結の最も好ましい配置により、ＰＤＧＦＢ１１９が生成する。 本発明の方法は、一般に、当業者に公知のＰＤＧＦ　Ｂの組換え体生成に関する 多数の方法のうちのいずれかを修正して実施することができる。例えば、先ずｖ −ｓｉｓ遺伝子を修飾しｃ−ｓｉｓを用いて、次にアミノ酸１１１〜１６０の位 置のいずれかに終結コドンを配置後、所望の宿主細胞をトランスフェクトし得る 。終結コドンは、好ましくは、既存コドンの部位特異的突然変異誘発によりｃ− ｓｉｓ又は修飾ｖ−ｓｉｓ前駆体タンパク質コード配列中に配置する。 あるいは、前駆体タンパク質コード配列を合成するか、又は先ずカルボキシ末端 付近の適切な制限部位でｃ−ｓｉｓ遺伝子又は修飾ｖ−ｓｉｓ遺伝子を切り詰め て、次に使用する特定のベクター及び宿主細胞系に関しで好ましいコドンを用い て、所望の末端位置（約１１１〜約１６０）に前駆体タンパク質コ一部位で短＜ シ、選択されたベクター及び宿主細胞系に関して好ましいコドンを再び用いて、 所望の開始位置（好ましくはアミノ酸１）の後方にアミノ酸末端を構築すること ができる。使用するのが天然開始材料か又は合成開始材料か、あるいはその組合 せであるか否かにかかわらず、終結コドンは、前駆体タンパク質コード配列の所 望のカルボキシ末端アミノ酸の後に、即ち約１１１〜約１６０のアミノ酸位置の 何れかに配置しなければと同時に、本発明の教示に従って、終結コドンを修飾遺 伝子の所望の位置に配置する。終結コドンを含有するｃ−ｓｉｓ前駆前駆体タン パク−コード配列にベクターに挿入し、これを用いて所望の原核生物宿主細胞を トランスフェクトする。 さらに好ましくは、本発明の方法に用いる前駆体タンパク質コード配列は、ｃ− ｓｉｓ遺伝子の類似体である。ｃ−ｓｉｓ類似類似体前駆体タンパク−コード配 列大腸菌宿主細胞における発現のための好ましいコドンを含有するよう構築し得 る。 ｃ−ｓｉｓ遺伝子の類似体は、部位特異的突然変異誘発、並びに適切なタンパク 質分解開裂部位での既存の末端のタンパク質分解開裂後の合成カルボキシ及びア ミン末端とのｃ−ｓｉｓ遺伝子の結合によって得られる。 ｖ−ｓｉｓ遺伝子は、本発明に用いるための前駆体タンパク質コード配列を生成 するのに優れた開始材料を提供する。例えば、アミノ酸１〜１１９をコードする 領域では、ｖ−ｓｉｓ遺Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　１ｏ、前駆体タンパク質との間に は、５アミノ酸のせ、２つのアミノ酸がＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　ｌｏ９前駆体タン パク質中の対応する残基と同一であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を生成 することができる。コドン１０１及び↓０７に所望の変化を導入するために、Ｄ ＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発のための多数の方法が用いられる。このよ うな方法は、当業者には十分公知である。例えば、Ａｍｅ−ｒｓｈａｍ（Ａｒｌ ｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ ｔｉｄｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ＩｎＶｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙ ｓｔｅｍ”キットに関する使用説明用小冊子に記載されているような（１９８５ ）；Ｎａｋａｍａｙｅ　ａｎｄ　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ。 （１９８８））は、アミノ酸１０１のイソロイシン残基をトレオニン残基に変換 し、アミノ酸１０７のアラニン残基をプロリン残基に変換するのに特に有用であ る。 る位置で切断する制限酵素ｌエユＩ　Ｉを用いてアミノ末端で切り詰める。最初 の２４アミノ酸を含めたその遺伝子の上流部分は、下流のｌエユＩＩ−切断突然 変異ｖ−ｓｉｓＤＮＡと、（１）ＡＴＧ翻訳開始コドン；　（２）アミノ酸１の セリン残基、により復元することができる。この方法では、その他の３つの異な るアミノ酸のうちの２つ、即ちアミノ酸６のセリン残基とアミノ酸７のバリン残 基は、ヒトＰＤＧＦ　Ｂ形態（それぞれトレオニン及びインロイシン）に変換し 、ｖ−ｓｉｓによりコードされる上流前駆体アミノ酸が除去される。 同様の方法でカルボキシ末端から切り詰めると、同時にアミノ酸１１４を変え、 アミノ酸１２０を終結コドンと置換する合成フラグメントによるカルボキシ末端 の置換が可能になる。好ましくは、突然変異ｖ−ｓｉｓＤＮＡを、アミノ酸１１ ２に対応する位置で切断する制限酵素Ｓｍａ　Ｉで切断する。ＰＤＧＦＢ１０９ 前駆体タンパク質のアミノ酸１１２〜１１９及び１２０位置での翻訳終結コドン をコードする合成りＮＡフラグメントを、次にＳｍａ　Ｉ−切断突然変異ｖ−ｓ ｉｓＤＮＡに結合する。 この合成りＮＡはさらに、アミノ酸１１４でトレオニン残基の代わりにグリシン 残基をコードし、第５変異アミノ酸を、Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　ｌｏ、前駆体タン パク質の対応するアミノ酸に変換させる。 本前駆体タンパク質コード配列の最終ＤＮＡ構築物は、ＰＤＧＦＨのアミノ酸１ 〜１１９、それに加えてＮ−末端の付加的メチオニン残基をコードする。このＰ ＤＧＦ　Ｂ、ｌ、遺伝子を、次に適切な発現ベクター、例えばｐｃＦＭ１１５６ に結合し、次いで適切な宿主細胞系、好ましくは大腸菌宿主細胞のような原核生 物中に形質転換又はトランスフェクトし、宿主細去できず、それによってアミノ 末端に別のアミノ酸残基を含有する組換え体物質を生成する可能性がある）。 本発明のｒＰＤＧＦ　Ｂ類似体の均質生成のための好ましその他の系が本発明に よって意図され、例えばプロテアーゼ開裂のための部位の修正、及び／又は本発 明のｒＰＤＧＦ類似体の宿主細胞からの産生レベルを増大するための別のリーダ ー配列の使用が挙げられるが、しかし、それらに限定されない。 本発明の新規のｒＰＤＧＦ　Ｂ類似体は、当業者に公知の多単離、再生、及び精 製し得る。再生のための好ましい方法は、前記米国特許出願第４５１．４８５号 及び　号に記載されている。その記載内容は、参照により本明細書中に含めるも のとする。 好ましい再生方法によれば、ジスルフィド封鎖剤を用いて、還元型変性モノマー ｒＰＤＧＦの遊離スルフヒドリルが封鎖されるように、モノマー混合ジスルフィ ド中間物質を生成する。 これは、還元型ｒＰＤＧＦのスルフヒドリル基が、単離及び精製中にジスルフィ ド結合を早期形成しないようにする。同時に、この修飾はさらに、ｒＰＤＧＦ中 間物質を水溶液中で可溶性にする。この可溶性の結果として、選択された水性環 境中に存在する力を用いて、封鎖形モノマー中間物質をその生物学的に活性なコ ンホメーシ優ンにし、その後、封鎖解除し得る。一般に、封鎖解除により、ダイ マー形態のＰＤＧＦの生成が生じるが、この場合、ダイマー構造は、所望の鎖内 及び鏡開ジスルフィド結合の形成により適切にその時、“固定“される。 意外にも、本発明の封鎖形モノマーｒＰＤＧＦ　Ｂ類似体は、対応するＰＤＧＦ ダイマーに関して観察される最大活性を達成するためには有意に大量のモノマー が必要である（即ちモノマーの比活性がダイマーの比活性より低い）けれども、 生物学的活性を示すことが判明した。ＰＤＧＦは、モノマー形態で天然に存在す るとは考えられておらず、したがって、天然から単離されていない。ダイマー形 態のＰＤＧＦは、ＰＤＧＦがＰＤＧＦ細胞表面受容体との相互作用によりシグナ ルを伝達すると考えられる機序の最新モデルに基づいて、生物学的活性に必要で あると仮定されている。 細胞表面受容体との必要な相互作用の一般的モデルは、シグナルを伝達するため には２つのＰＤＧＦ受容体が互いに相互作用しなければ成らないことを示唆して いる。この結果として、クロス燐酸化と呼ばれる相互反応を生じる。即ち、各受 容体は、−の各モノマーサブユニットは、一つの受容体分子と結合し、したがっ て、２つの受容体を一緒にし、時としては受容体ダイマー化と呼ばれるクロス燐 酸化を可能にすると考えられる２４８９−２４９５　（１９８９））。さらにモ ノマー形態のＰＤＧＦは、い（つかの場合に、生物学的活性を示すことが示唆さ れているけれども（国際特許出願第８９１０４４６０号）、ＰＤＧＦモノマー中 のこのような活性の存在は、今まで証明されていない。さらに、モノマーが必要 な受容体ダイマー化を如何に誘発するかの説明は示されていない。 実質的に大量の本発明のモノマーｒＰＤＧＦ　Ｂ類似体が、対応するダイマー形 態によって達成可能な観察される最大生物学的活性を示すのに必要であることが 観察されているけれども、これらのモノマーは、事実、“超活性”、即ち任意の 量のダイマーによって達成可能な活性より少なくとも約３〜３．５倍高い活性の レベルを達成し得ることも判明している。 本発明の治療ｌ用の生物学的活性ダイマーｒＰＤＧＦ　Ｂ類似体及び／又は生物 学的活性モノマーｒＰＤＧＦ　Ｂ類似体は、医師及び／又は獣医による哺乳類種 の多種類の創傷の治療に用い得る。このような治療に用いる生物学的活性ＰＤＧ Ｆの量は、勿論、治療すべき創傷の重症度、選択される投与経路、及びＰＤＧＦ の比活性又は純度によっており、担当の医師又は獣医により決定されるであろう 。”ＰＤＧＦの治療有効量”という用語は、その他の外的に使用される生長因子 が存在しない場ＰＤＧＦの量を示す。このような治療有効量は、当業者によって 容易に確認され得る。全厚及び一部属の皮膚創傷を治療するためのｒＰＤＧＦ　 Ｂ類似体の治療的有効量は、同時係属中の米国特許出願第３６２，６２２号に開 示されている（その記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）。 本発明により生成されるＰＤＧＦは、治療すべき創傷又は症状に適した任意の経 路により、投与し得る。ＰＤＧＦの治療的適用により有益に治療され得る症状と しては、前述の開放性皮膚創傷、皮膚切開性創傷、及び胃腸切開性創傷が挙げら れる。 ＰＤＧＦはさらに、骨、軟骨、朧、靭帯、及び上皮（例えば小腸内層、胃内層） の治癒に、並びにダリア修復に用い得る。 好ましくは、ＰＤＧＦは、創傷に外用する。外用は、１回塗布又は投与、あるい は指定間隔毎の複数の反復投与でよい。本発明のＰＤＧＦの外用のための組成物 は、当業者が容易に確認し得る。好ましい経路が治療すべき創傷又は症状に依っ て変わることは、当業者には容易に分かるであろう。ＰＤＧＦが純粋物又は実質 的に純粋な化合物として投与され得るが、それは医薬調剤又は製剤として提供す るのが好ましい。 本発明の調剤は、獣医学的使用及びヒトでの使用のために、上記のように治療的 に有効量のＰＤＧＦを、したがって一つ又はそれ以上の医薬的に許容可能な担体 、及び任意にその他の治療的成分とともに含有する。担体は、調剤のその他の成 分に適合性であり、その受体に対して有害でないという意味で“許容可能２でな ければならない。望ましくは、本調剤は、酸化剤又は還元剤、及びペプチドが配 合禁忌であることが公知のその他の成分を含有すべきでない。本調剤は、単位投 与形態で存在するのが便利であって、当業界で公知の任意の方法で調製し得る。 全方法が、活性成分を一つ又はそれ以上の補助成分から成る担体と会合させる工 程を含む。概して、本調剤は、ＰＤＧＦを液体担体又は微細に分割された固体担 体、又はその両方と均一に及び密に会合させることにより、調製する。 以下の実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、本発明の範囲は添付 の請求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱しない限り、前述の手順を 改変し得ると理解されよ叉ＪＬＩＬ↓ ＣＨＯ−ｒＰＤＧＦ　Ｂの Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐ　−ＩＬｃａｔｉｏｎ　Ｎ ｏ、ＰＣＴ／ＵＳ８８１００７０に詳細に記載された手順で、アミノ酸１６１に 天然産生終結コドンを含むｃ−ｓｉｓ遺伝子を、ＣＨＯｍｌｌ中でクローニング 及び発現させ、得られたｒＰＤＧＦ　Ｂを以下のごとく精製及び分離した。 哺乳類ＣＨＯ−ｐＤＳＶＥ／ｃ−ｓ　ｉ　ｓ細胞のならし培地に由来のｒＰＤＧ Ｆ　Ｂを４段階で精製し、次いで濃縮して透析−過した。第１段階では、−過し たならし培地に、強力なカチオン交換樹脂、Ｂｉｏｃｒｙｌ　ＢＰＡ−２１００ を０．１２５％（ｖ　／　ｖ、１０“％懸濁液／培地）のレベルで添加した。ｒ ＰＤＧＦ　Ｂタンパク質産生物が樹脂に結合するように攪拌した後で、産生物− 樹脂複合体を連続フロー遠心によって回収した０次いでベレットを、１０％エタ ノール／１０ｍＭ）リスＨＣ１ｐＨ７，７を含む約８倍容（ベレットの湿潤重量 に対する割合）のバッファで洗浄し、遠心によって回収した。ベレットを２倍容 の同じバッファに再懸濁させた後、等容の９５％エタノールを添加した。更に処 理するためにこの懸濁液を−２０”Ｃ±１０℃で保存した。 樹脂懸濁液を遠心し、ベレットをコントロールされた室温で０．１ＭのＮａＣ１ ／２０ｍＭのトリスＨ（１！　ＰＨ７゜７に再懸濁させた。懸濁液が得られた後 、１０％（ｗ　／　ｖ　）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムを最終濃度１ ％（ｗ　／　ｖ　）まで添加した０次いで懸濁液を少なくとも３０分間攪拌し、 遠心して樹脂（ベレット）を産生物（上清中）から分離した。１！３倍容のＮ− ラウロイルサルコシンナトリウム抽出側を用いて樹脂を前記同様に再抽出し、第 １樹脂抽出段階からプールした上清のｐＨを塩酸（ＨＣ１）で２．７±０．１に 調整し、次いで１．０５５倍容９５％エタノールを添加し、少量の沈降物を遠心 によって除去した。 先行段階の上清を、５０％エタノール／　５　ｍ　ＭのＨＣＩで予め平衡させた スルホキシエチル（ＳＥ）−セルロースカラムで処理した。酸性ＰＨで、Ｎ−ラ ウロイルサルコシンは電荷を喪失し、従ってカラムを通過したが、産生物ｒＰＤ ＧＦ　Ｂはカチオン性なのでカラムマトリックスに結合した。カラムを５０％エ タノール／　５　ｍ　ＭのＨＣＩで洗浄して残留Ｎ−ラウロイルサルコシンを除 去し、次いで２０ｍＭのＮ　ａ　Ｐ　Ｏ＜　Ｐ　Ｈ７、５で中性ｐＨにし、最後 に１０ｍＭのトリスＨＣ１ｐＨ７，７で洗浄した。ｒＰＧＤＦ産生物を０．５Ｍ のＮａＣ１／１０ｍＭ）リスＨＣｌＰＨ７，７で溶出させた。 ２．５倍容の注射用水をｒＰＤＧＦ　Ｂ溶液に添加し、次いで２．５倍容の３． ０Ｍの（ＮＨ４）ｉｓＯｎを添加した。 産生物を、５％エタノール／１．２５Ｍの（ＮＨ４）ｚｓｏ４／　５０　ｍ　Ｍ のＮ　ａ　Ｐ　Ｏ４Ｐ　Ｈ７、５で予め平衡したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏ ｓｅ　（登録商標＞（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）カ ラムで処理した。産生物をロードした後、カラムを後者のバッファで洗浄した。 硫酸アンモニウムが漸減しエタノールが漸増する直線勾配を用いてｒＰＤＧＦ　 Ｂ産生物をカラムから溶出させた。出発バッファは洗浄バッファと同じであり、 極限バッファは３０％エタノール／　５０　ｍ　ＭのＮａＰＯ４ｐＨ７，５であ った。このカラムから得られた分画を非還元性条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥによっ て分析した。夾雑タンパク質を含まない産生物を含む分画をプールした。 先行段階でプールした分画をＩＮのＨＣＩでｐＨ４，０±０、】、に調整し、次 いでＡｍ１ｃｏｎ　ＹＭ（登録商標）１０（Ａｍｉｃｏｎ　Ｉｎｃ、、Ｄａｎｖ ｅｒｓ。 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）限外Ｐ過膜で２８０ｎｍ（１ｃｍ光路）の吸光度 が約０．６になるまで濃縮した。 次いで、産生物を少なくとも４倍容の１０ｍＭ酢酸アンモニウム１０．１５Ｍの ＮａＣ１ｐＨ４，０で透析枦遇した。 産生物の溶液をこの溶液で、２８０ｎｍ（１ｃｍ光路）の吸光度が、ｒ　Ｐ　Ｄ 　１１；Ｆ：”　！ｌの濃度０．５ｍ＠／ｍｆにマ価の０．２４±０．０４にな るまで希釈した。 Ｋ凰■ユ ＣＨＯこ　っ　゛　れたｒＰＤＧＦ　Ｂの−゛α班Ｉ ２４１個のアミノ酸から成るｃ−ｓｉｓコードされた前駆体タンパク質をＰＤＧ Ｆ　Ｂ＋ｏｓに哺乳類細胞が加工し得る位置を決定するために、分泌され加工さ れた組換えタンパク質産生物の構造を、分析的ゲル電気泳動及びタンパク質配列 決定によって分析した。 ≧ ＣＨＯ−ｐＤＳＶＥ／ｃ−ｓ　ｉ　ｓ細胞のならし培地から精製したｒＰＤＧＦ 　Ｈのアミノ酸配列を、完全（ｉｎ−ｔａｃｔ）ｒＰＤＧＦ　Ｂの配列解析と、 ４−ビニルピリジンとの誘導体にした還元形ｒＰＤＧＦ　Ｂの消化によって得ら れたトリプシンペプチド及びＳｖ８プロテアーゼペプチドの配列解析とを併用す ることによって決定した。 ４７０Ａ及び４７７Ａシーケンサ（ＡＰＰｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎ ｃ、、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いて配列決定を行な った。結果を以下にまとめ図１に示す。 完全ｒＰＤＧＦ　Ｂを２６サイクルで配列決定した。この分析で同定された主要 配列は、ｒＰＤＧＦ　Ｂアミノ酸１から始まり、図１の「完全ＰＤＧＦＪと記し た上線によって示される。この配列は−ＤＮＡ配列に基づ（ｒＰＤＧＦた調製物 はアルキル化されていないので、１６サイクルでシスティンは検出できながった 。非アルキル化システィンは配列解析によって容易に同定されない、ｒＰＤＧＦ 　Ｂ配列のアミノ酸３３及び８０がら始まるフラグメントに対応するマイナー配 列が観察された。これらのマイナーアミノ末端は、ヒト血小板がら観察されるア ミノ末端と同様であり（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ他、１団）、タンパク質の処理中に生 じた内部開裂に起因する。 還元して４−ビニルピリジンでアルキル化しておいたｒＰＤＧＦ　Ｂを、トリプ シン及び５Ｖ−８Ｑプロテアーゼで別々に消化した後で、ペプチドフラグメント を単離した。 非還元形ｒＰＤＧＦ　Ｂはトリプシンまたは５Ｖ−Ｓプロテアーゼによって消化 されないので還元が必要であった。 ４−ビニルピリジンによってアルキル化するとシーケンサによってシスティンを 検出できた。 完全ｒＰＤＧＦ　Ｂのアミノ末端配列解析とトリプシンペプチド及び５Ｖ−Ｓペ プチドのアミノ末端配列解析とを併用すること（こよって、１１８個の残基にわ たるタンパク質配列を確認した。カルボキシペプチダーゼＰによるカルボキシ末 端配列解析を使用して残基１１７がら１１９までを確認した。データは、哺乳類 ＣＨＯＩＩＩＩに由来のｒＰＤＧＦ　Ｂタンパク質調製物の主要形態が図１に示 す１１９個のアミノ酸残基と一致することを示す。 ゲル　゛ 実施例１に記載したように、哺乳１１　ＣＨＯ−ｐ　Ｄ　Ｓ　Ｖ　Ｅ／ｃ−ｓｉ ｓ細胞のならし培地から精製したｒＰＤＧＦＢ産生物を、１２％５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲル電気泳動にかけた。この方法では、未知のサイズのポリペプチ ドの長さを、既知のサイズの適当なタンパク質標準に比較することによって算定 し得る。ＣＨＯ−ｐＤＳＶＥ／ｃ−ｓｉｓ細胞によって産生されたｒＰＤ、ＧＦ 　Ｂタンパク（１０μｇ）を還元の前後に電気泳動させ、ゲルをクーマシーブリ リアントブルーで染色した０図２のレーン１及び２から明らかなように、このタ ンパク質は還元後にかなり速く泳動した。還元サンプルの分析はまた、４つの主 要バンドの存在を示した。パターンは、異なる長さの４つのｒＰＤＧＦ　Ｂモノ マーが対をなしてジスルフィドダイマーを形成している非還元形ｒＰＤＧＦ　Ｂ の構造と一致する。 ＣＨＯ−ｐＤＳＶＥ／ｃ−ｓ　ｉ　ｓ細胞によって分泌される４つのｒＰＤＧＦ 　Ｂモノマーのサイズを正確に決定するために、これらのポリペプチドの電気泳 動移動度を既知のサイズの２つのｒＰＤＧＦ　Ｂタンパク質、即ち、細菌発現系 を用いて産生させたｒＰＤＧＦ　Ｂ、。、及びｒＰＤＧＦ　Ｂ＋、ｓと比較した 。これらの細菌産生ｒＰＤＧＦＢタンパク質は実施例３に記載の手順で得られた 。違いは、１つの場合にはアミノ酸１１０位に終結コドンを使用するコード配列 を使用して細菌宿主細胞をトランスフェクトしたことである。後者の場合には終 結コドンの「リードスルー」の問題があるので、得られた組換えタンパク質（Ｐ ＤＧＦ　Ｂ、。、及びＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋　ａ。）をならし培地から分離す る必要があった。哺乳類組換え産生物に対する標準として使用すべく選択された ２つの細菌産生ｒＰＤＧＦ　Ｂタンパク質は、ヒト血小板由来のＰＤＧＦ　Ｂ（ Ｊｏｈｎ−ｓｏｎ他、ＭＪ：ｚ＞及びＣＨＯ−ｐＤＳＶＥ／ｃ−ｓ　ｉ　ｓ細胞 （上記）由来のｒＰＤＧＦ　Ｂの配列解析に基づいて、カルボキシ末端がアミノ 酸１０９及び１１９で終結するように特別に操作された。 実施例２と同様の手順でアミノ酸配列解析を実行し、これらの２つの細菌産生タ ンパク質が夫々、Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋。。 前駆体タンパク質のアミノ酸配列の残基１〜１０９及び１〜１１９から構成され ることを確認した０図２のレーン２〜４から明らかなように、還元層哺乳類（Ｃ ＨＯ−ＰＤＳＶＥ／ｃ−ｓｉｓ）ｒＰＧＤＦ　Ｂサンプル中の最も速く泳動する ポリペプチドは大腸菌ｒ　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋。、標準と同等に泳動（ｃｏ −ｍｉｇｒａｔｅ）Ｌ、哺乳類サンプル中のその次に速く泳動するポリペプチド は大腸菌ｒＰＤＧＦ　Ｂｌｌ’！標準と同等に泳動した。＋１１乳顛サンプル中 の最も遅く泳動する２つのポリペプチドは、１１９（１１のアミノ酸を含む形態 よりもアミノ酸５〜２０個だけ長いアミノ酸と一致する場所に泳動した。塩基性 アミノ酸残基はしばしばタンパク質分解開裂部位である。２４１個のアミノ酸を 含むＰＤＧＦ　Ｂｌ。、前駆体タンパク質のアミノ酸配列の分析によって、１２ ６′位、１３０位、１３３位、１３５位及び１３６位の塩基性アミノ酸が判明し た。これらの位置のいずれか１つを開裂すると、１１９個のアミノ酸を含む形態 よりもアミノ酸７〜１７個だけ長いＰＤＧＦ　Ｂ類似体が生じるであろう。 アミノ酸配列決定及びゲル電気泳動分析を総合すると、哺乳類（ＣＨＯ−ｐＤＳ ＶＥ／ｃ−ｓ　ｉ　ｓ）宿主紺胞によって分泌されるｒＰＤＧＦ　、Ｂは、各々 がＰＤＧＦ　Ｂ１ｎ５タンパク質配列のセリン１から成るアミノ末端を有する４ つのモノマーに由来するダイマー混合物であることが判明する。４つのポリペプ チドのうちで最も多量に存在するポリペプチドはアルギニン１１９で終わるカル ボキシ末端を有する。残りのポリペプチドの１つは、トレオニン１０９から成る カルボキシ末端を有する。残りの２つのポリペプチドにおいては、夫々のカルボ キシ末端が、１１９個のアミノ酸を含む形態より−もアミノ酸５〜２０個だけ長 いアミノ酸、特にアルギニン１２６、アルギニン１３０、アルギニン１３３、ア ルギニン１３５またはアルギニン１３６で終結する。 罠ｌ■ユ ｒＰＤＧＦ　Ｈの 図３に示すようなＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　、、、をコードする前駆体タンパク質コ ード配列を、ｖ−ｓｉｓ遺伝子を出発材料として構築した。 ≧ノ　１０１　び１０７の サル肉腫ウィルスレトロウィルスゲノム（Ｗｏｎ、ｇ−Ｓｔａａｌ他、５ｃｉｅ ｎｃｅ、２１３，２２６〜２２８　（１９８１＞のクローンである１゛μ２のプ ラスミドＰＣ６０を制限エンドヌクレアーゼ５ａｌｉ及びＸ　ｂ　ａ　、Ｉで消 化し、得られた１１８３塩基対のフラグメント・を、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏ−ｎ１ｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　ＭａｎｕａｌＣ ｏｌｄ　Ｓ　ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−Ｌ土工ｌ（１９８２）によ って記載された手順に従って、低融点アガロースゲル中の電気泳動分離によって 精製した。 精製フラグメントを次にゲルから切出した。同時に、０．２μｙのＭ１３ｍｐ１ ９　ＤＮＡを５ａｌＩ及び■ａｌで消化し、７２４５塩基対の大バンドを同様に 低融点ゲルから単離した。切出した両方のゲルスライスを６５℃で溶融させ、次 いで３７℃に冷却した。７２４５塩基対のＭ１３ｍｐ１９フラグメントをもつゲ ル全部と、１１８３塩基対のｖ−ｓｉｓフラグメントをもつゲルの１／４とを混 合し、５ｔｒｕｈｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ。 旦、　４５２〜４５３　（１９８５）に従って結合した。結合したＤＮＡで大腸 菌に１２株ＴＧＩを形質転換させ、透明なプラークを選択し、液体培地中で増殖 させた１Ｍ１３ｍｐ１９ベクター中の１１８３塩基対のｖ−ｓｉｓフラグメント の存在を、ファージＤＮＡのＲＦ形態の調製及び制限地図分析によって確認した 。Ｍｅｓｓｉｎｇ他。 このようにして得られたＭ　１３ｍｐ　１９／ｖ−ｓ　ｉ　ｓファージを液体培 地中で増殖させ、−重鎖ＤＮＡを単離した。 Ｍｅｓｓｉｎｇ他、１逼。残基１０１及び１０７のアミノ酸をＰＤＧＦ　Ｈの対 応するアミノ酸に変換するために、特定オリゴヌクレオチドのｉｎ　ｖｉｔｒｏ 突然変異誘発用テンプレートとして使用した。即ち、インロイシン１０１をコー ドするＡＴＡコドンを、（トレオニンをコードする）ＡＣＡに変換し、アラニン １．０７をコードするＧＣＴコドンを、（プロリンをコードする）ＣＣＴに変換 した。 １０μ２のＭ１３ｍｐ１９／ｖ　二５ｉｓ−重鎖ＤＮＡを、配列： ５°ＣＧＴＣＡＣＡＧｔ、ＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＣＴ（、ＴＣＴＣＡＣ ＡＣ３“を有するｓｐｍｏ＆のリン酸化オリゴヌクレオチドとアニーリングした 。 この配列は、ｖ−ｓｉｓ遺伝子のヌクレオチド４２８３〜４３１６に相同である （Ｄｅｖａｒｅ他、１裏によるナンバリング系）。オリゴヌクレオチドの下線を 付けた塩基は、ｖ−ｓｉｓからヒトＰＤＧＦ　Ｂ配列への変化を示す。 突然変異オリゴヌクレオチドでＤＮＡ合成を開始し、完全突然変異原を三リン酸 チオヌクレオチドを用いた大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメ ントで合成し、次いで、Ｔ４　、ＤＮＡリガーゼで結合した。残留する一重鎮テ ンプレートＭ１３ｍｐ１８／ｖ−ｓｉｓ　ＤＮＡを、ニトロセルロースフィルタ ーでｒ過して完全に除去した。 非突然変異鎖を、制限エンドヌクレアーゼ■と共にインキュベーションすること によってニックした０次に、突然変異鎖をテンプレートとして用い、ニックした 非突然変異鎖を三リン酸デオキシヌクレオチドと共に再重合させた。その結果、 最終産生物中の両方のＤＮＡ鎖が所望の突然変異を含んでいた。ＤＮＡで・大腸 菌に１２株ＴＧＩを形質転換した。プラークを選択し、液体培養で増殖させ、− 重ＭＤＮＡを単離した。所望の突然変異体が得られたことを確認するために、Ｓ ａｎｇｅ　ｒ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４．　５４６３〜５４６７（１９７７）の方法で ＤＮＡを配列決定した。 ミノ　６　７の 次の段階では、突然変異ｖ−ｓｉｓ遺伝子の５′部分を、アミノ酸６及び７がｖ −ｓｉｓ形からヒトＰＤＧＦ　Ｂ形に変化した合成りＮＡフラグメントで置換し た。この合成フラグメントはまた、ヒトＰＤＧＦ　Ｂのセリン１のコドンの直前 の翻訳開始ＡＴＧコドンを有し、また、大腸菌リポソームに結合する配列と所望 の大腸菌発現ベクター（後述）に結合する制限部位とを有していた０合成りＮＡ フラグメントをｖ−ｓｉｓ遺伝子のヌクレオチド４０６１（Ｄｅｖａｒｅ他、肛 」によるナンバリング系）に位置する旦−【」１■部位に結合した。Ｍ１３ｍｐ １９ベクターに存在するＬＬユ■部位は上記の結合段階を複雑にして妨害するで あろうから、突然変異ｖ−ｓＬｓ遺伝子を、ｌエユ■部位を含まない市販のプラ スミドベクターｐＵｃ１８にまず移した。Ｍ１３ｍｐ１９／ｖ−ｓｒｓ突然変異 ＲＦＤＮＡを５ａｉｌ及びＢａｍＨＩで制限し、得られた１１９３塩基対のフラ グメントを低融点アガロースゲルを用いた電気泳動によって単離した。このフラ グメントを、同じ（Ｓａｉｌ及びＢａｍＨＩによって制限したプラスミドｐＵｃ １８に結合した。結合ＤＮＡで市販の大腸菌に１２株ＤＨ５を形質転換させ、形 質転換体をアンピシリン存在下の増殖によって選択した。コロニーを選択し、液 体培養で増殖させ、プラスミドＤＮＡを単離し、制限地図作成によってｖ−ｓｉ ｓインサートの存在を分析した。 ｐＵｃ１８／ｖ−ｓｉｓ突然変異ＤＮＡを、突然変異ｖ−ｓｉｓインサートの直 ぐ上流のｐＵｃ１８のポリリンカーを切断するＨｉｎｄｌ［［、及び、成熟タン パク質産生物のアミノ酸番号２４に対応するヌクレオチド４ｏ６１（Ｄｅｖａｒ ｅ他、前出によるナンバリング系）でム二ｓｉｓ　ＤＮＡを内部切断する旦−４ 」、■で制限した。この反応によって得られた３５６５塩基対の大フラグメント を低融点アガロースゲル中の電気泳動によって単離した。このフラグメントを以 下の配列： ５°＾ＧＣＴＴＣＴＡＧ＾＾ににＡにＧ＾＾Ｔ＾＾ＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＧ ＧＴＴＣＧＴＴ＾＾ＣＣＡＴＴＧＣにＧ３°　ＡＧ　ＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴ ＡＴＴにＴＡ　ＴＡＣＡＣ；ＡＧＡＣＣＣＡ　ＡＧＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＧＣ Ｃ−＾＾ＣＣＧＧＣＴＡＴｔｌ：ＡＴＴにＣＣＧＡＧＴＧＣ＾＾ＧＡＣＡＣに＾ ＾ＣＣＣＡＧＧＴにＴＴＣに＾　３′−ＴＴ（ｔｌ：ＣＣＧＡＴＡＣＴＡＡＣＧ ｔｌ：ＣＴＣＡＣＧＴＴＣＴｆ；ＴＧ　ＣＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＣＴ ＡＧ５’を有する合成二重類ＤＮＡフラグメントに結合した。 この合成りＮＡフラグメントは、その上流（左）端に旦１ｎｄｌ［ｒ付着」端を 含み、その下流（右）端にｌエユ■「付着」端を含む、更に、Ｈｉｎｄｌｌｒ付 着」端の直ぐ下流の合成りＮＡ内部にＸｂａｉ部位（ＴＣＴＡＧＡ）が存在し、 従って、引き続きＸｂａｉで制限すると後述する発現ベクターのＸｂａ１部位に 結合し得る。結合したＤＮＡで大腸菌に１２株ＤＨ５を形質転換させ、アンピシ リン含有培地で増殖させることによって形質転換体を選択する。 得られたコロニーからの１ラスミドＤＮＡの制限地図作成によって合成りＮＡフ ラグメントの存在を分析した。ここで、ｐＵＣｌ　８／ｖ−ｓ　ｉ　ｓ構築物は 、アミノ酸番号６゜７．１０１及び１０７がヒトＰＤＧＦ　Ｂ形に変化し、５° 末端がセリン１の直前のＡＴＧコドンで翻訳が始まるように変化した突然変異ｖ −ｓｔｓ遺伝子を含んでいた。 ミノ　１１４の　アミノ　１２０の　コ゛ンの■ 次の段階では、アミノ酸番号１１４のコドンをＡＣＴがらＧＧＴに変化させ、最 終タンパク質産生物中のトシオニンをグリシンで置換する。また、ｖ−ｓｉｓ中 のコドン番号１２０のアラニンをコードしているＧＣＣを翻訳終了コドンＴＡＡ に変化させた。この構築で得られたタンパク質産生物は残基１１９のアルギニン で終結する。コドン番号１１２以内にＳｍａ　Ｉ部位を配置した後で合成りＮＡ フラグメントを挿入することによって両方の変化を１段階で生じさせた。 上記のごとく生成したｐＵｃ１８／ｖ−ｓｉｓ突然変異ＤＮＡを、ｖ−ｓｉｓ配 列のヌクレオチド４３２４（Ｄｅｖａｒｅ他、前出によるナンバリング系）で切 断するＳｍａ　ｌ及びｖ−ｓｉｓインサートの直ぐ下流のｐｔｒｃ１８のポリリ ンカーを切断するＥｃｏＲｌで制限した。ヱ−５ｉｓタンパク質のＣ−末端部分 と、３′非非翻訳列とをコードするＳｍａ１部位とＥｃｏＲ１部位との間の小フ ラグメント（５１０塩基対）を低融点アガロースゲル電気泳動によって除去した 。大フラグメント（約３５３０塩基対）を、以下の配列： ５　’　（：にＧにＧＧＴＴＣＣＣＡＧにＡ（：ＣＡｆ；Ｃ０ＡＴ＾＾Ｇ　３’ ３　’　ＣＣＣＣ四ＭＣＧにＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴＡＴＴＣＴＴ＾＾５′を有 する合成りＮＡフラグメントに結合した。 １１４位の新しいグリシン残基をコードするＧＣＴコドン及び１２０位に導入さ れたＴＡＡ終結コドンに下線を付けである０図１に示すこの合成りＮＡフラグメ ントは、ｙ−ｓｉｓ突然変異配列をＳｍａ　ｌで制限して生じた平滑端に結合す る平滑端を上流（左）端に有し、ｐＵｃ１８ポリリンカーをＥｃｏＲＩで制限し て生じたＥｃ　ｏＲｌ端に結合するＥｃｏＲＩ　ｒ付着」端をその下流（右）端 に有する。 結合したＤＮＡで大腸菌に１２株Ｄ）（５を形質転換させ、アンピシリン含有培 地で増殖させることによって形質転換体を選択した。得られたコロニーのプラス ミドＤＮＡの制限地図作成によって合成りＮＡフラグメントの存在を分析した。 Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　ｌ　！の 最終段階では、完全形の突然変異ｖ−ｓｉｓ遺伝子をｐＵｃ１８から取り出し、 大腸菌発現ベクターｐＣＦＭ１１５６に結合した。プラスミドｐｃＦＭ１１５６ ＰＬは公知のプラスミドｐＣＦＭ８３６から調製する。プラスミドｐＣＦＭ８３ ６の調製は、米国特許第４，７１０，４７３号の明細書の該当する部分、特に実 施例１がら７に記載されている。該特許の記載内容は本発明に含まれるものとす る。ｐＣＦＭ８３６からｐｃＦＭ１１５６を調製するために、２つの内在Ｎｄｅ Ｉ制限部位を切断し、露出端をＴ４ポリメラーゼで埋め戻し、埋め戻した末端を 平滑端結合する。 得られたプラスミドを次に、Ｃ１ａｌ及びｍＩで消化し、切出したＤＮＡフラグ メントを、以下の配列二Ｃ１ａ　ｌ　晒■ ５°ＣＣＡＴＴＴにＡＴＴＣＴＡＧ＾＾ＧＧＡＧＧ＾＾Ｔ＾＾ＣＡＴＡＴＧＧＴ Ｔ＾＾ＣＧＣＧＴＴにに＾＾ＴＴＣＧＧＴＡＣ３゜３’　Ｔ＾＾＾ＣＴ＾＾ＧＡ ＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＡＴＡＣＣ＾＾ＴＴＧＣ［；Ｃ＾＾ＣＣＴＴ ＾＾にＣ５’のＤＮＡオリゴヌクレオチドで置換する。 ｐｃＦＭ１１５６ベクターは、上流Ｘｂａ１部位と下流の多数の制限部位の１つ との間に外来遺伝子の挿入領域を含む。この実施例では、下流のＥｃｏＲ１部位 を使用した。 上記のごとく生成したｐＵｃ１８／ｖ−ｓｉｓ突然変異ＤＮＡを、ＸｂａＩ及び ＥｃｏＲＩで制限し、３８３塩基対の小フラグメントを低融点アガロースゲル電 気泳動によって単離した。このフラグメントを、同じ（ＸｂａＩ及び旦旦至Ｒ１ で制限したｐｃＦＭ１１５６　ＤＮＡに結合した。結合したＤＮＡで大腸菌に１ ２株ＦＭ５　（ＡＴＣＣ＃６７５４５）を形質転換させ、カナマイシン含有培地 で増殖させることによって形質転換体を選択した。得られたコロニーからのプラ スミドＤＮＡの制限地図作成によって挿入ＤＮＡフラグメントの存在を分析した 。 最終発現プラスミドは、開始メチオニンに始まり、その下流にヒトＰＤＧＦ　Ｂ 鎖配列のアミノ酸１〜１１９を含むタンパク質をコードする挿入ＤＮＡ配列を含 んでいた。 原核大腸菌宿主細胞では、合成後にＮ末端メチオニンが除去され、従って、産生 された最終タンパク質はヒトＰＤＧＦＢのアミノ酸１〜１１９に対応する。 １１９個のアミノ酸から成るＰＤＧＦ　Ｂタンパク質の発現を確認するために、 発現プラスミドを含む細菌細胞を２８〜３０℃で培養物が所望の光学密度に達す るまで増殖させ、次いで培養物を４２℃にシフトして数時間増殖させた。４２℃ にシフトする前とその後のいくつかの時点で培養細胞を採取した。細菌タンパク 質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析すると、見掛は分子量１４ ゜６ｋｄの主要バンドが、温度誘導した細菌細胞中に存在したが誘導前の細菌細 胞中には存在しなかった。このタンパク質は、６００ｎｍの光学密度が１．０に なるまで増殖させた細菌培養物１１あたり約３０〜４０ｍｆＩのレベルで存在し た。 Ｋ１勇Ａ ｒＰＤＧＦ　Ｂ　の−゛　１の 大腸菌産生ＰＤＧＦ　Ｂ、□の予想アミノ酸配列及びその均質性（ｈｏｍｏｇｅ ｎｅ　ｉ　ｔｙ）を確認するために、実施例５に十分に説明した公知技術を用い 、異なる３つのロットに由来の組換え産生物を封入体から精製し、次いで分析的 ゲル電気泳動及びタンパク質配列決定によって分析した。 ア≧ノ 実施例２の手順でアミノ酸配列解析を行なった。この分析によって、大腸菌宿主 細胞に由来のｒＰＤＧＦ　Ｂｚ。 産生物が図１に示す予想配列を示すことが確認された。 ル　゛ 実施例３で得られた精製大腸菌ｒ　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋　＋　ｓを、還元条 件（５％の２−メルカプトエタノールを加えて加熱）及び非還元条件（加熱せず ）下に５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析処理した。Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）がら得られた分子量標準と共 に３〜２７％ポリアクリルアミドゲルにサンプルを流す以外は、はぼ実施例２の 手順で電気泳動分析を実施した。 図４は、クーマシーブリリアントプルーで染色後のロット１．２及び３の結果を 示す、サンプルのロード量３〜２４μｇのとき、検出された唯一っのバンドは大 腸菌ｒＰＤ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋　＋　＊に由来するバンドであった。非還元性条件 下では、分子量約３０　、ＯＯＯにバンドが観察された。還元すると見掛は分子 量約１５．０００にバンドが観察された。 叉ｍ ル　ン　た　に のｒＰＤＧＦ　Ｂ　ホモ　マーの 実施例３で得られたｒＰＤＧＦ　Ｂｚｓを含有する約１．５〜１．６　ｋｇの採 取（即ち濃縮）大腸菌ペーストを再生のために取り出した。大腸菌ペーストを９ 倍容（ｖ／ｗ）の２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム に懸濁させ、温度を４℃に維持した。懸濁した細胞ペーストをＭｅｎｔｏｎ−Ｇ ａｕ　ｌ　ｉｎホモジナイザーを使用し圧力１４．０００ｐｓｉ及び温度１２℃ で溶菌させた。溶菌液を直ちに３．６００ＸＧで４℃で６０分間遠心し、上清を 廃棄し、封入体ｒＰＤＧＦ含有ペレットを取り出した。 ベレットを１４４倍容　ｖ　／　ｗ　）の８．５Ｍ尿素、０．１Ｍグリシン　ｐ Ｈ３，０に懸濁させ、３０分間攪拌した。その間に、ＳＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ （登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）クロマトグラフィー樹脂を脱水した。 市販樹脂を焼結ガラス漏斗に入れ、樹脂を重力によって脱水し、樹脂を脱イオン 水で洗い、樹脂を再度脱水した。再懸濁ベレットの攪拌を継続しながら、脱水し た２、４ｋｙの樹脂をベレット懸濁液に添加した。３０分後に攪拌を停止した。 樹脂を沈降させ、上清を廃棄した。沈降した樹脂に、５１の８．５Ｍ尿素、０． １ＭグリシンｐＨ３，５を添加した。 混合物を更に５分間攪拌し、樹脂を再度沈降させ、上清を廃棄した。 次いで沈降した樹脂に、５１の８．５Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ｐＨ３，０を添加 した。得られた混合物を再度５分間攪拌し、樹脂を再度沈降させ、上清を廃棄し た。第２の容量５１の８．５Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ｐ　Ｈ３，０を沈降した樹 脂に添加した。この混合物を攪拌しながら、２５インチ水銀に等しい真空に３０ 分間維持した０次いで真空を破壊し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の５ｍＭ混 合物とし、１０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でＰＨを７．７に調整した。真 空を回復し、混合物を３０分間攪拌した。真空下に維持しながら攪拌を停止して 樹脂を沈降させ、上清の９０％を廃棄した。残りの液体によって樹脂を直ちにス ラリー化し、２５ｃｍ径のカラム（バッチカラム）に注ぎ、フローアダプターを 取付け、Ｎ２ガスで掃気（ｓｐａｒｇｅ）したかまたは掃気されている８、５Ｍ 尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム（Ｎａ、ＨＰＯ４）ｐＨ７，７（バッファＡ） で樹脂を１００ｃｍ／時で１０分間充填した。フローアダプターを樹脂の表面ま で下げ、追加のバッファＡを流速２５ｃｍ／時で用いて流出液の２８０ｎｍの吸 光度が一定になるまでカラムを洗浄した。 次に、バッチカラムの出口を、新しいＳＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（登録商標） （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填した２５ｃｍＸ２０ｃｍの第２のカラム（分離カ ラム）の入口に接続し、バッファＡで平衡させた。バッチカラム及び分離カラム を、１００％バッファＡからＮ２ガスで掃気されたか掃気されている１００％バ ッファＢ　（８，５Ｍ尿素、２０ｍＭのＮａ、ＨＰＯ，，０，４ＭのＮａＣｊ！ 　ｐＨ’７．７）までの８０１直線勾配で流速２’５ｃｍ／時で分離処理した。 適当な分画をカラムから出た時に直ちにプールし、真空下に維持した０発酵ブイ ヨン１１あたりの収量は０．４５〜０．９Ｏｆであった。 変性モノマーｒ　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋　＋　＊含有溶液を必要に応じて、吸 光度が０．４〜０．５０．Ｄ、になるまで希釈した０次に、タンパク質溶液を酸 化形グルタチオンの０．１Ｍ溶液にし、ＩＯＭのＮａＯＨでｐｉ（を８．０に調 整した。溶液を再度真空下に維持し、１８〜２４時間攪拌した。真空を破壊し、 新しい誘導体形モノマーｒ　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ混合ジスルフィド中間体のｐＨをＨ Ｃｌで３．０に下げた。得られた溶液を初期容量の１／２に濃縮し、次にＡｍ１ ｃｏｎ　ＹＭ（登録商標）１０（Ａｍｉｃｏｎ　Ｉｎｃ、、Ｄａｎｖｅｒｓ。 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）限外−過膜を使用し、４倍容の８．５Ｍ尿素、０ ．１Ｍ酢酸、及び、４倍容の０，１Ｍ酢酸に順次透析濾過した。最終タンパク質 濃度は１．５〜２．０ｍｇ／ｍ１（ε１％／２８０ｎｍ＝０．４６）であり、ｒ ＰＤＧＦ−Ｓ−８−Ｇモノマー純度は〉８５％であり、収量は発酵ブイヨン１１ あたり０．４５〜０．９０ｙであった。 ２０ｍＭのトリスでｒＰＤＧＦ−Ｓ−３−Ｇ溶液を０．１ｍｙ／ｍ１に希釈する ことによって再生を行なった。 次いで、この溶液に０，１Ｍ酢酸中の１Ｍシスティンを最終濃度１ｍＭまで添加 し、ＮａＯＨでｐＨを８．０に調整した。溶液を１６時間攪拌し、誘導体形ｒＰ ＤＧＦ−Ｓ−３−Ｇモノマー中間体を封鎖解除し、鋼内及び鋼量ジスルフィド結 合の形成を開始させ、次いで酢酸の０．１Ｍ溶液にした０発酵ブイヨン１１あた りの収量は０．３２〜０．６３ｇであった。 ０．０５ＭグリシンｐＨ３，５（バッファＣ）または０．０５Ｍグリシン、０． ４ＭのＮａＣ４’　ｐＨ３，５（バッファＤ）で平衡させた１１．３％５ｃｍの コンドロールドボアガラスカラム（ＣＰＧ−ｐｇ−３５０−４００，９６Ｍ２／ ｇ、平均孔径３８２人、Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）に、再生したｒ　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆダイマー溶液 を流速１００ｃｍ／時でロードした。ＰＤＧＦの酸化後溶液をカラムにロードし た後、カラムを流速４０ｃｍ／時の平衡バッファで洗浄した。精製したＰＤＧＦ ダイマーを次に、バッファＣまたはＤで始まりバッファＣ中の２Ｍ塩酸グアニジ ンまたはバッファＤ中の８Ｍ尿素で終わる５１勾配を使用し再度流速４０　ｃ　 ｍ／時でカラムから溶出させた。 純粋なＰＤＧＦの適当な分画をプールした。収量は発酵ブイヨン１１あたり０． ２５〜ｏ、５ｇであった。 え五且互 １ｒＰＤＧＦ　Ｂ　ホモダ　マーのマ　トンエン２ＣＨＯ細胞に由来の哺乳類ダ イマーｒＰＤＧＦ　Ｂを標準として使用し、Ｐｉｅｒｃｅ他のＬユｍユＭｅｄ工 。 １７６、　９７４〜９８７　（１９８８）に記載の方法を修正した正常ラット腎 細胞、クローン４９Ｆ、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７０（ＮＲＫ）を使用するチミ ジン吸収アッセイで、実施例５で得られた再生ｒＰＤＧＦ　Ｂａｔｓホモダイマ ーのマイトジェン活性を検定した。ＮＲＫ細砲を、（１）１ｇ／＆のグルコース 、１％（Ｗ／Ｖ）のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（１００ｘ、１０．０ ０単位ペニシリン、１０，０００μ２ストレプトマイシン／　ｍ　ｉ　）と１％ （ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミン溶液（１００ｘ、２００ｍＭ）とを含むダルベツコ改 質イーグル培地（ＤＭＥＭ）と、（２）７．５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｗ ｈｉ　−ｔａｋｅｒ　ＭＡ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗａｌ　−ｋｅｒｓｖｉ ｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）とから成る増殖培地（ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）で増殖さ せた。 細胞を２４ウエルのマイクロタイタープレートに、ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で２Ｘ１ ０’細胞／ウエルの密度でプレートした。５日後、ＦＢＳ−ＤＭＥＭを吸引し、 ＦＢＳを含まない１ｍｌのＤＭＥＭで置換し、細胞がＰＤＧＦに接触したときに より顕著な応答を示すように、細胞を「飢餓状態」にした。この培地で細胞を２ ４時間インキュベートした後、５０μｌのＰＤＧＦ−含有サンプルを各ウェルに 添加した。更に１８時間インキュベーション後、ＰＤＧＦ−含有サンプルを吸引 し、ＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ、２μＣｉ／　ｍ　１のｔＨ−チミジンから成る１ｍ ／の標識培地で置換した。プレートを３７℃で更に１時間インキュベートした。 ショ糖／ＥＤＴＡ溶液によって３個１組のウェルから細胞を剥離し、全自動マイ クロハーベスタ−でガラス繊維フィルターマットに採取した。細胞をエタノール でマットに固定し、乾燥後、マットをシンチレーションカウンターでカウントし た。 ＰＤＧＦを与えなかった対照ウェルの平均値を、各実験サンプルの３個１組のウ ェルのカウント数の平均値から減算した。ＰＤＧＦ濃度ｎｙ／ｍｆの対数を、各 サンプルに取り込まれたｃｐｍに対してプロットした。結果を図５に示す、これ らの結果は、実施例５で得られた再生ｒＰＤＧＦＢ、、ホモダイマーが真核ＣＨ Ｏ宿主細胞に由来のダイマーｒＰＤＧＦ　Ｂと実質的に同じマイトジェン活性を 有することを示す。 Ｋ隨１ ｒＰＤＧＦ　Ｂ　ホモ　イマーノ２ Ｓｅｎｉｏｒ他、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、９６゜３８２〜３８５　（１９８ ３）；Ｄｅｕｅ　ｌ他、史工Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、６９．　１０４６Ｎ１ ０４９（１９８２）に記載の手順にほぼ基づいて、実施例５で得られた再生ｒＰ ＤＧＦ　Ｂｚｓホモダイマーの線維芽細膓及び単球に対する走化性活性を検定し た。ＣＨＯ細胞に由来の哺乳類のタイマーｒＰＤＧＦ　Ｂを標準として用い、実 施例４のｒ　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋　＋　＊ホモダイマーを上記文献に記載の ごとくボイデンチェンバーで試験した。この試験では、細胞が、走化性因子を含 まない１つの室から走化性因子を含む別の室にフィルターを通って移動する。所 与の時間後に走化性因子を含む側の顕微鏡視野の細胞数をカウントする。 健常成人皮膚の外科標本の外植片から繊維芽細胞を採取した。２ｍＭのＬ−グル タミン、非必須アミノ酸、１０％のウシ胎仔血清（ＫＣＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、 Ｉｎｃ、。 Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）を補充したダルベツコ改質イーグル培地（ＤＭＥ Ｍ）で細胞を培養した。６継代後の細胞をアッセイに使用した。ヒト血液単核細 胞（単球）をＦ　ｉ　ｃｏ　１１／Ｈｙｐａｑｕｅ勾配で採取し、２％のヒトア ルブミンを補充したＤＭＥＭに２．５Ｘ１０・細胞／ｍ１の密度で懸濁させた。 ３０ウエルを有するマルチブラインドウェル装置で走化性を測定した。０．４５ μｍのボアを有する硝酸セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ。 Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の上に８μｍのボア（繊維芽細 胞）または５μｍのボア（単球）を有するポリカーボネート展（Ｎｕｃｌｅｏｐ ｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ ）を重ねた二重農法を使用し、各ウェルを上室と下室とに分離した。検定すべき ＰＤＧＦ溶液または対照培地を下室に充填し、次いで適正順序の２つの膜で被覆 し、その後で、繊維芽細胞または単球を含む細胞浮遊液を上室に入れた。ウェル の両方の室に充填した後、走化性装置を、５％炭酸ガス／９５％空気から成る雰 囲気の３７℃の加湿インキュベータに入れて６時間維持した０次いで、装置を分 解し、多対の膜を取り出して染色した。 高倍率（Ｘ４００）に拡大して２つの膜の間の界面に移動した細胞と下腹に移動 した細胞とをカウントすることによって細胞移動を測定した。１対の膜あたり５ つのハイパワーフィールド（ｈｐｆ）をカウントした。細胞移動をｈｐｆあたり の正味移動細胞数、即ち、ｈｐｆあたりの細胞数から対照培地のｈｐｆあたりの 移動細胞数を減算した数で示す、繊維芽細胞に対する走化性アッセイの結果を図 ６に示し、単球に対する走化性アッセイの結果を図７に示す。 これらの結果は、実施例５で得られた再生ｒＰＤＧＦＢ　ＩＩＩホモダイマーが 真核ＣＨＯ宿主細胞に由来のダイマーｒＰＤＧＦ　Ｂと実質的に同じ走化性活性 を有することを示す。 Ｋ舅■Ｉ ＰＤＧＦ　Ｂ　ホモ　イマー　ＰＤＧＦ　Ｂ　モノマー　のマイトジェンゞ　の 実施例５で得られた封鎖形モノマーＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　ｌｌ＊中間体のマイト ジェン活性を、（実施例５で得られた）ｒＰＤＧＦ　Ｂ、□ホモダイマーを標準 として使用し、実施例６に記載の手順で検定した。意外にも、本発明のモノマー 形ｒＰＤＧＦ　Ｂｚｓ類似体がマイトジェン活性を示した。 但し、Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋　＋　＊ホモダイマーと同じ最大活性を達成する ためにはダイマーよりも多量のモノマー（５００〜１．０００倍）が必要であっ た。より意外なことには、モノマー形によって達成された最大活性は、任意の量 の対応するＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋　＋　＊ホモダイマーで達成され得る活性の ３〜３．５倍であった。 特に、実施例６に示す手順を用い対照Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　目ｓホモダイマー（ ＢＢ）を標準として使用してＮＲＫＩｌｉ胞に対するｒＰＤＧＦ−３−３−Ｇモ ノマー（ｒｍＢ−ｇ」）のマイトジェン活性を検定した。結果を図８に示す、ダ イマーの達成可能な最大活性は約３００ｐｍＸ１０−’（温度約４ｎｇ／ｍｌに 到達後）のピークに観察され、同等の活性を達成するためのモノマーの必要量は ５００〜１．０００ｎ　ｙ／　ｍ　１であった。しかしながら、より高い濃度で モノマーの活性はダイマーで観察される最大値をはるかにこえている。 ＦＩＧ、２ 週九　Ｄ尋ん ＦＩＧ、４ ＬＯＧ　ｒＰＤＧＦ　Ｂ　（ＮＧ） 口ｒＰＤＧＦＢ１１９　＋　槽育、Ｊ鐵　ｒＰＤＧＦ　ＢＦＩＧ、５ 稗肩奇佃抱、Ｉｔ−也憧　＃１ ｒＰＤＧＦ　Ｂ　（ｎｇ／ｍす ＦＩＧ、６ 卑線丈Ａシ・画　緻 Δ”＜翫￥（ｒＰＤＧＦ　Ｂ 、　ＥｃｏｌｉｒＰＤＧＦＢ１１９（ｌｏｔｌ）ｏ　Ｅ　ｃｏｌｉ　ｒＰＤＧＦ 　Ｂ１１９　（ｌｏｔ　２）要約 新規な血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）類似体が本発明によって提供される。ま た、ホモジニアスな量のこれらの新規な類似体の産生方法が提供される。本発明 の新規な類似体は、再生されると、天然産生ＰＤＧＦ　Ｂ、。、と実質的に同じ 生物活性を有する。本発明方法では、はぼアミノ酸１１１からほぼアミノ酸１６ ０までの場所に対応するある位置でｃ−ｓｉｓ遺伝子、またはその他のＰＤＧＦ 　Ｂ１゜、もしくはその類似体の前駆体タンパク質のコード配列の終結コドンを 使用する。本発明の方法によって、大腸菌のごとき高発現宿主細胞から比較的多 いホモジニアスな量の組換えＰＤＧＦ　Ｂ類似体が産生される。 国際調査報告

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．ほぼアミノ酸１１１からほぼアミノ酸１６０までの前駆体タンパク質コード 配列のある位置に終結コドンが配置された前駆体タンパク質コード配列によって 宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることを特徴とする血小板由来成 長因子Ｂ類似体の産生方法。
2. ２．前記宿主細胞が原核宿主細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法 。
3. ３．前記終結コドンが、ほぼアミノ酸１１１からほぼアミノ酸１３７までのある 位置に配置されていることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. ４．前記終結コドンがほぼアミノ酸１２０からほぼアミノ酸１３７までのある位 置に配置されていることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. ５．前記終結コドンがアルギニン残基のコドンの直後の位置に配置されているこ とを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. ６．前記終結コドンが、アミノ酸１２０、アミノ酸１２７、アミノ酸１３１、ア ミノ酸１３４、アミノ酸１３６及びアミノ酸１３７から成るグループから選択さ れた位置に配置されていることを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. ７．前記終結コドンがアミノ酸１２０位に配置されていることを特徴とする請求 項６に記載の方法。
8. ８．前記前駆体タンパク質コード配列がｃ−ｓｉｓ遺伝子であることを特徴とす る請求項７に記載の方法。
9. ９．ＰＤＧＦ　Ｂ１００前躯体タンパク質のアミノ酸配列の一部分に実質的に等 しいホモジニアスなアミノ酸配列を有し、再生されると、天然産生ＰＤＧＦ　Ｂ １００と実質的に同じ生物活性を有する組換えタンパク質において、前記組換え タンパク質がほぼアミノ酸１１０からほぼアミノ酸１５９までのある位置で終結 することを特徴とする該組換えタンパク質。
10. １０．前記組換えタンパク質が、ほぼアミノ酸１１０からほぼアミノ酸１３６ま でのある位置で終結することを特徴とする請求項９に記載の組換えタンパク質。
11. １１．前記組換えタンパク質が、ほぼアミノ酸１１９からほぼアミノ酸１３６ま でのある位置で終結することを特徴とする請求項１０に記載の組換えタンパク質 。
12. １２．前記組換えタンパク質が、アミノ酸１１９、アミノ酸１２６、アミノ酸１ ３０、アミノ酸１３３、アミノ酸１３５及びアミノ酸１３６から成るグループか ら選択された位置で終結することを特徴とする請求項１３に記載の組換えタンパ ク質。
13. １３．前記組換えタンパク質がアミノ酸１１９で終結することを特徴とする請求 項１２に記載の組換えタンパク質。
14. １４．前記組換えタンパク質が図３に示すアミノ酸配列１〜１１９を有すること を特徴とする請求項１３に記載の組換えタンパク質。
15. １５．ＰＤＧＦ　Ｂ１００前駆休タンパク質のアミノ酸配列の一部分に実質的に 等しいホモジニアスなアミノ酸配列を有し、再生されると天然産生ＰＤＧＦ　Ｂ １００のマイトジェン比活性の少なくとも約１／１０００のマイトジェン比活性 を有するモノマー組換えタンパク質において、前記組換えタンパク質がほぼアミ ノ酸１１０からはぼアミノ酸１５９までのある位置で終結することを特徴とする 該モノマー組換えタンパク質。
16. １６．前記組換えタンパク質が、ほぼアミノ酸１１０からほぼアミノ酸１３６ま でのある位置で終結することを特徴とする請求項１５に記載のモノマー組換えタ ンパク質。
17. １７．前記組換えタンパク質が、ほぼアミノ酸１１９からほぼアミノ酸１３６ま でのある位置で終結することを特徴とする請求項１６に記載のモノマー組換えタ ンパク質。
18. １８．前記組換えタンパク質が、アミノ酸１１９、アミノ酸１２６、アミノ酸１ ３０、アミノ酸１３３、アミノ酸１３５及びアミノ酸１３６から成るグループか ら選択された位置で終結することを特徴とする請求項１７に記載のモノマー組換 えタンパク質。
19. １９．前記組換えタンパク質がアミノ酸１１９で終結することを特徴とする請求 項１８に記載のモノマー組換えタンパク質。
20. ２０．前記組換えタンパク質が図３に示すアミノ酸配列１〜１１９を有すること を特徴とする請求項１９に記載のモノマー組換えタンパク質。
21. ２１．組換え血小板由来成長因子Ｂ類似体の宿主細胞中での発現を確保するため に使用され、終結コドンがほぼアミノ酸１１１からはぼアミノ酸１６０までの前 駆体タンパク質コード配列のある位置に配置されていることを特徴とする前駆体 タンパク質コード配列。
22. ２２．終結コドンが、ほぼアミノ酸１１１からほぼアミノ酸１３７までの前駆体 タンパク質コード配列のある位置に配置されていることを特徴とする請求項２１ に記載の前駆体タンパク質コード配列。
23. ２３．終結コドンが、ほぼアミノ酸１２０からほぼアミノ酸１３７までの前駆体 タンパク質コード配列のある位置に配置されていることを特徴とする請求項２２ に記載の前躯体タンパク質コード配列。
24. ２４．終結コドンが、アルギニン残基のコドンの直接の前躯体タンパク質コード 配列のある位置に配置されていることを特徴とする請求項２３に記載の前駆体タ ンパク質コード配列。
25. ２５．終結コンが、アミノ酸１２０、アミノ酸１２７、アミノ酸１３１、アミノ 酸１３４、アミノ酸１３６及びアミノ酸１３７から成るグループから選択された 前記前駆体タンパク質コード配列のある位置に配置されていることを特徴とする 請求項２４に記載の前躯体タンパク質コード配列。
26. ２６．終結コドンがアミノ酸１２０位に配置されていることを特徴とする請求項 ２５に記載の前駆体タンパク質コード配列。
27. ２７．宿主細胞がホモジニアスなアミノ酸配列を有する血小板由来成長因子Ｂ類 似体を発現できるように、請求項２６に記載の前駆体タンパク質コード配列によ って形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
28. ２８．前記前駆体タンパク質コード配列が図３に示すコード配列であることを特 徴とする請求項２７に記載の宿主細胞。
29. ２９．治療有効量の請求項９に記載の血小坂由来成長因子Ｂ類似体と医薬的に許 容される担体とを含む医薬組成物。
30. ３０．前記血小板由来成長因子Ｂ類似体が請求項１３の類似体であることを特徴 とする請求項２９に記載の医薬組成物。
31. ３１．前記血小板由来成長因子Ｂ類似体が請求項１４の類似体であることを特徴 とする請求項３０に記載の医薬組成物。
32. ３２．治療有効量の請求項９に記載の血小板由来成長因子Ｂ類似体を創傷に投与 することを特徴とする創傷の治療方法。
33. ３３．前記血小板由来成長因子類似体が請求項１３の類似体であることを特徴と する請求項３２に記載の方法。
34. ３４．前記血小板由来成長因子類似体が請求項１４の類似体であることを特徴と する請求項３３に記載の方法。