JPH10262668A - 血管形成誘導因子をコードするタンパク質コード配列を包含するｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血管形成誘導因子の製造 【解決手段】 血管形成誘導因子をコードするタンパク
質コード配列を含むＤＮＡ配列を含むベクターおよび同
ベクターで形質転換した微生物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本出願はＭｏｓｃａｔｅｌｌ
ｉらの毛管内皮細胞プロテアーゼ、ＤＮＡ合成および遊
走を促進することの出来るヒト胎盤血管形成誘導因子と
いう表題の、１９８５年１２月１７日出願の米国特許出
願番号Ｎｏ．８０９，８７３の継続出願である。

【０００２】

【従来の技術】発明の背景 血管形成誘導因子は種々の性質、即ち、（１）内皮細胞
増殖；（２）内皮細胞プロテアーゼ合成増加；（３）蛋
白質の位置方向への内皮細胞遊走の促進；および（４）
生体内毛管増殖の誘起の能力を有する蛋白質として定義
されている。特に血管形成誘導因子として分類される物
質は内皮細胞のＤＮＡ合成に影響することで有糸分裂促
進能を有し、従って内皮細胞増殖の速度および血管形成
の速度を高めることが観察されている。この性質と関連
して血管形成誘導因子は内皮細胞によるプロテアーゼ合
成を増加する能力がある。これらプロテアーゼとしては
プラズミノーゲン活性化因子（ＰＡ）およびコラゲナー
ゼがある。具体的には血管形成誘導因子はＰＡおよび潜
伏性コラゲナーゼの合成を促進し、ＰＡはプラスミン前
酵素を特異性の広いプロテアーゼである活性型プラスミ
ンに変換し、これが潜伏性コラゲナーゼを活性型コラゲ
ナーゼに変換する。活性型プラスミンおよび活性型コラ
ゲナーゼの２つの酵素は周囲の組織中のほとんどの蛋白
質を分解することができ、従って毛管内皮細胞等の種々
組織の侵蝕を高める。さらに血管形成誘導因子は特に毛
管内皮細胞のようなある種の細胞では化学走性を示し、
即ち、血管形成誘導因子はそのような細胞がそれら因子
の方向へ遊走するよう誘導する。

【０００３】これらの特性を念頭に、血管形成誘導因子
を単離することによって器官への血液供給を増加させる
ことの出来る治療剤を創製することができると考えられ
た。例えばある種の心筋梗塞後梗塞の結果中断した心臓
への血液供給の再成を促進すること、或いは慢性閉鎖症
で血管の再生長を促進することが望ましい。さらに、血
管形成誘導因子の使用により褥瘡、外科切開および特に
老人および糖尿病患者の遅延治癒性創傷の回復を促進で
きる。さらに本物質をやけどに応用すれば治癒の速度や
程度を高めることができる。従ってヒトに対する治療応
用に適した精製血管形成誘導因子を検索した。さらに血
管形成を促進する物質を研究することによりガン細胞へ
の血液供給を阻害し、ガンを飢死させる方法が見つかる
と考えている科学者もいる。

【０００４】既に「血管形成誘導因子」と称する蛋白質
のクラスが同定されているが、これらの蛋白質はヒト以
外の動物から単離されている。ヒト以外の動物から単離
される血管形成誘導因子は異種蛋白質に対する免疫反応
副作用の可能性のためにヒトへの治療剤としての使用に
適当でないと考えられる。その上、これらの個々の非ヒ
ト蛋白質が上述の血管形成誘導因子としての４つの特質
を有するかどうか、また観察される性状が蛋白質の組合
せの間での相互反応に起因するのかどうか確認されてい
ない。

【０００５】事実、内皮細胞有糸分裂促進作用を有する
とされる各種蛋白質は２つのクラスに分類される：ヘパ
リン−セファロースより１ＭのＮａＣｌで溶出され、酸
性ｐＩを有する外皮細胞生育因子様分子；およびヘパリ
ン−セファロースにより強度に結合し、塩基性ｐＩを有
する線維芽細胞生育因子様分子である。さらに本発明者
らは最近ハーバード医学部のＶａｌｌｅｅらによりＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４巻、５４８０−５４９９頁
（１９８５年）に出版された論文で「アンジオジエニン
（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）」と記載されている第三の血
管形成誘導因子が存在すると信じている。アンジオジエ
ニンは真の血管形成誘導因子の性状を有しているが有糸
分裂促進作用のみ持たぬ点で区別される。

【０００６】これらのいろいろな研究を基に本発明者ら
は検討を重ね、ＦＧＦ塩基性 と分類され得るヒト胎盤
組織から単離されるものと実質的に同質であって単一分
子の、上述の性状、即ち、有糸分裂促進性、化学走性で
生体内で毛管の増殖を起させると共にプロテアーゼ合成
を促進する性質を有するヒト血管形成誘導因子を発見し
た。さらに本発明者らは本血管形成誘導因子をヒト胎盤
組織より実質的に精製した状態で単離することを試み
た。この単離した血管形成誘導因子のアミノ酸配列が決
定された。このアミノ酸配列の決定により本血管形成誘
導因子の合成のための組換えＤＮＡ法に有用な染色体ま
たはｃＤＮＡ配列を得るのに利用するＤＮＡプローブの
入手が可能となる。

【０００７】発明の要約 本発明は血管形成誘導因子一般、さらに詳しくはＦＧＦ
塩基性 と分類される血管形成誘導因子に関するもので
ある。特に本発明はヒト胎盤組織から単離され得るもの
と実質的に同等であり、有糸分裂促進および化学走性能
を有し、プロテアーゼ合成を誘導して生体内で毛管増殖
を起させることが出来るＦＧＦ塩基性血管形成誘導因子
に関する。

【０００８】本発明の目的はこれらの性質を有する血管
形成誘導因子を精製した状態で提供することである。さ
らに本発明の目的はこのような血管形成誘導因子のアミ
ノ酸配列を決定することである。さらに本発明の目的と
してはプロテアーゼ合成を促進する能力と共に有糸分裂
促進および化学走性能の性質を示す医薬品調製物として
価値のあるＦＧＦ塩基性 を精製した形で提供すること
がある。本発明のその他の目的および利点は以下の記載
に示され、また記載より明かであるか、或いは本発明の
実施から習得される。これらの目的および利点は特に添
付の請求の範囲に指摘するような方法および手段で実現
し、達成できる。

【０００９】目的の達成のため、また本発明の目的に沿
って、有糸分裂促進活性、化学走性活性、プロテアーゼ
合成促進能およびそれらの組合せより成るグループから
選ばれる活性を有する少なくとも１つの活性部位を有す
る血管形成誘導因子が明かにされる。ヒト由来または合
成のその血管形成誘導因子はＦＧＦ塩基性 と分類さ
れ、ヒト胎盤組織から単離され得る天然の血管形成誘導
因子と実質的均質性を呈する。

【００１０】血管形成誘導因子自体がプロテアーゼ合成
を促進できるのが好ましいのであるが、ここで使用する
「プロテアーゼ」という語は活性型と前駆体とを含む。
そのような前駆体としては潜伏性またはプロ−コラゲナ
ーゼがある。さらに本発明の範囲内に含まれるがプロテ
アーゼ合成を直接促進はしないような血管形成誘導因子
を単離することも可能である。しかしそれらの血管形成
誘導因子は生物応答を起し、その結果プロテアーゼ合成
を促進する。従って、本発明の血管形成誘導因子は直接
または間接にプロテアーゼ合成を促進する。

【００１１】本発明による特に好ましい血管形成誘導因
子は以下の中核アミノ酸配列を有す：

【化６】

【００１２】さらに次の配列を有するペプチドが中核配
列外のポリペプチド内に存在する。

【化７】 およびここに示す配列中カッコは完全に同定されていな
い一つのアミノ酸残基の存在を示す。もう一つの特に好
ましい血管形成誘導因子は以下の配列を有す。

【化８】 上述の略号で表わされるアミノ酸は以下の「好ましい実
施態様の説明」の中に記載されている。

【００１３】さらに、目的を達成するためそして本発明
によってヒト胎盤組織から単離できる天然の血管形成誘
導因子の実質的に精製されたものが開示される。またさ
らに、目的を達成するため、また本発明の目的によって
少なくとも１つの活性成分、本発明により記載される血
管形成誘導因子を含有する医薬品組成物が開示される。

【００１４】上記の一般記述および以下の詳細な記載は
例示および説明のためのみのものであって、請求の範囲
にある本発明を制限するものではないのは言うまでもな
い。

【００１５】好ましい実施態様の説明 本発明の現状で好ましい実施態様を記載するが、この記
載と続く例と合わせて本発明の基本を説明するものであ
る。上述のように、本発明は精製された形で単離された
血管形成誘導因子に関する。好ましくは本発明の血管形
成誘導因子はヒト胎盤組織から単離され得る天然の血管
形成誘導因子と実質的に同質で、免疫的に同等であって
特に好ましくは生物学的に同等である単一ポリペプチド
鎖蛋白質である。本明細書および請求の範囲で用いてい
る「生物学的に同等」というのは、本発明の組成物が天
然の血管形成誘導因子と同じように、しかし必ずしも同
じ程度ではなく有糸分裂促進活性および化学走性能を有
し、プロテアーゼ合成を誘導することが出来るという事
を意味する。

【００１６】以下の明細書および請求の範囲を通して用
いている「実質的に同質」というのは、今までに報告さ
れ、精製されている実質的に同質な血管形成誘導因子が
示すよりもより高い天然血管形成誘導因子とのホモロジ
ーを意味する。好ましくはホモロジーの程度は５０％以
上、好ましくは６０％、さらに好ましくは７５％以上高
く、特に好ましい蛋白質は天然の蛋白質と８５％或いは
９０％のホモロジーである。上記ホモロジーの程度は、
特に参考文献として採用するＡｔｌａｓ ｏｆＰｒｏｔ
ｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ、第５巻、１２４頁（１９７２年）、Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、中でＭ．
Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆにより記載されるように、配列に加
えるために１００個のアミノ酸の長さに４ギャップを導
入し、比較する配列で同一アミノ酸を並べて二本の配列
の短い方の配列で見られるアミノ酸残基のパーセントと
して計算する。

【００１７】ここに記載する本発明の血管形成誘導因子
はヒトより単離されるか、または合成のポリペプチドで
ある。「合成」ポリペプチドという用語は今まで天然か
ら実質的に精製した形で単離されていないアミノ酸配列
のことを言う。この定義を用いると、「合成」という中
には他の物と共に組換えＤＮＡ法により創造されるポリ
ペプチドまたは全体または一部分を試験管内で合成した
ものを含む。特に以下に記載される好ましい配列と１個
または２個のアミノ酸が異なる合成ポリペプチドが企画
される。本発明による好ましい血管形成誘導因子はヒト
胎盤組織抽出物より発見され、初めて精製した形で単離
された。本出願の目的において、ここに開示する血管形
成誘導因子に関して使用する「純粋の形」または「精製
した形」というのは血管形成誘導因子以外の他の蛋白質
を実質的に含有していない事をいう。好ましくは本発明
の血管形成誘導因子は少なくとも５０％の純度、好まし
くは７０％の純度であり、もっと好ましくは８０％また
は９０％の純度である。

【００１８】さらに、本発明の血管形成誘導因子は種々
の腫瘍および正常細胞から単離された。その例としてＳ
Ｋ−Ｈｅｐｌ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｋ５６２細胞および
ヒト胎児肺線維芽細胞などがある。本発明の血管形成誘
導因子は次のステップより成る方法によりヒト胎盤組織
から純粋に単離できる：（ａ）ヒト胎盤組織の採取；
（ｂ）組織中の蛋白性物質の分画によるヒト胎盤組織か
らの血管形成誘導物質の単離；（ｃ）血管形成誘導因子
活性を有する画分の同定；および（ｄ）血管形成誘導因
子活性を示す画分の濃縮。

【００１９】好ましい実施態様では、ヒト胎盤組織に存
在する蛋白性物質はヘパリンアフィニティクロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび任意にゲ
ル濾過クロマトグラフィーの組合せにより分画する。こ
こで述べる血管形成誘導因子は胎盤蛋白質特異性のモノ
クローナル抗体を使用しても単離できる。この具体例で
は抗原を胎盤蛋白質に対するモノクローナル抗体を含有
するマトリックス（樹脂）に結合し、樹脂を緩衝液で洗
滌することにより非抗原性蛋白質を除去する。次に高い
ｐＨまたは低いｐＨの緩衝液、高イオン強度の緩衝液或
いはカオトロピック剤を単独または組合せで温度を変化
させることにより抗原を抗体から除去する。

【００２０】このようにして得られた画分につき血管形
成誘導因子活性の存在を検索する。好ましくは適当な内
皮細胞培養、好ましくは哺乳動物毛管内皮細胞を血管形
成誘導因子の存在下でインキュベートし、培地中の潜伏
性コラゲナーゼおよび細胞内のＰＡを測定することによ
りＰＡおよびコラゲナーゼ合成への影響を評価すること
により行なった。血管形成誘導因子により誘発された細
胞が生成するプロテアーゼの量はＥＬＩＳＡまたはＲＩ
Ａアッセイ或いは免疫沈降法のような免疫学的方法によ
り測定する。

【００２１】血管形成誘導因子の有糸分裂促進活性は好
ましくは適当な内皮細胞、好ましくは哺乳動物の毛管内
皮細胞を血管形成誘導因子および放射標識ヌクレオチ
ド、好ましくは ¹²⁵Ｉ−沃化デオキシウリジン（ ¹²⁵Ｉ
−ｄＵ）の存在下でインキュベートすることにより測定
する。トリクロール酸不溶性画分に取り込まれる ¹²⁵Ｉ
−ｄＵの量をＤＮＡ合成の程度の指標として測定する。
血管形成誘導因子の化学走性能は、適当な内皮細胞培
養、好ましくは哺乳動物毛管内皮細胞を血管形成誘導因
子の存在下でインキュベートし、適当な槽中、好ましく
は改良型Ｂｏｙｄｅｎチャンバー中で細胞の移動性を測
定することにより判定する。

【００２２】上述のように本発明者らは血管形成誘導因
子をヒト胎盤組織から今まで得られていない精製した形
で単離することに成功した。本蛋白質を精製した形で単
離することは、本蛋白質の正しい配列決定並びに血管形
成誘導因子を含む医薬組成物の開発に必須である。

【００２３】本発明の好ましい血管形成誘導因子は以下
の中核アミノ酸配列を有する：

【化９】 なる配列を有するペプチドが中核配列外に存在する。

【００２４】もう一つの特に好ましい血管形成誘導因子
は次の配列を有する：

【化１０】

【００２５】上記略号は例えばＡ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇ
ｅｒによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｏｒ
ｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク
（１９７５年）、７２頁に記載される標準のアミノ酸配
列略号に対応する。請求されている血管形成誘導因子の
活性は本来のポリペプチドから１５，１６，１７または
１８個のＮ末端アミノ酸残基を除去しても影響されるこ
とはないと考えられている。従って、これらの省略配列
の全てが本発明に含まれる。その上、本来のポリペプチ
ドのＮ−末端アミノ酸に１１０個のアミノ酸までを延長
することも企画される。

【００２６】また本発明の血管形成誘導因子のＣ−また
はＮ−末端にポリペプチド鎖を付加することも考えられ
る。特に、ポリペプチド鎖はいずれかの末端に蛋白質融
合技術により結合される。これらの添加ポリペプチドは
本発明の血管形成誘導因子の薬効を高める役割を任う。
例えば他のポリペプチドとの融合により本ポリペプチド
が低ｐＨまたは高温下で活性を保持できるようになる
か、或いは得られるポリペプチドが長い循環寿命、分解
に対するより高い抵抗性を有するようになるかまたは小
腸上皮を通しての透過性が増加する。

【００２７】しかし、これらの変化でアミノ酸配列の変
異は本血管形成誘導因子を投与する生物での免疫応答副
作用を起すようであってはいけなく、そのような副作用
は血管形成誘導因子に由来する利点が保証されないほど
の損害となり得る。生物活性分子がそのような免疫応答
副作用を起すかどうかの判定方法は通常の技術の熟練者
に周知である。

【００２８】本発明の血管形成誘導因子および本明細書
で開示されるアナログは有糸分裂促進或いは化学走性能
を有し、またプロテアーゼ合成を促進する能力を持つ医
薬製品の形でヒトおよび動物に応用される。少なくとも
一つの活性成分として本発明の血管形成誘導因子の一つ
を含有する医薬品組成物は目的の剤形によりまた適当な
医薬的に許容される担体、希釈剤、充填剤、結合剤、お
よび他の賦形剤を含有する。経口投与用には活性蛋白質
の消化管中の分解を防ぐ手段をとらねばならない。従っ
て腸溶皮剤形が経口投与に適当な一つの形として考えら
れる。非経口投与を採用する場合には、調製物は水また
は塩溶液或いは他の医薬的に許容される溶液剤を含有す
る。一般に非経口投与のための調製物は最終的に全体で
体液と同じ浸透圧となる十分濃度の塩化ナトリウムを含
むのが好ましい。本発明の血管形成誘導因子を含む医薬
品調製物で傷、外科切開または皮膚潰瘍の治療のため注
射または局部投与のように局所投与用も考えられる。さ
らに心筋梗塞後の心臓への血液供給を再開するための投
与用に徐放性挿入剤も考えられる。

【００２９】上述の各疾病の治療に適当な投与量および
前述のデリバリー法に使用する適量を決定するのに必要
な計算は普通の技術の熟練者により常法で行なわれ、特
に標準アッセイや本明細書に開示するアッセイを考慮
に、不必要な実験をしないで通常できる範囲のものであ
る。計算した投与量は適当な投与量応答データー合わせ
て有効投与量を決定する確立したアッセイを用いること
により確認される。

【００３０】本発明の教えの具体的な個々の問題や状況
に応じた応用は本明細書に含まれる教えを考慮して通常
の技術熟練者の能力範囲内のものである。本発明の生成
物の例およびその単離および製造の代表的な方法は以下
の例に示す。

【００３１】

【実施例】例１ 胎盤組成からのヒト血管形成誘導因子の精製

【００３２】Ａ．蛋白質の精製 出産後の満期ヒト胎盤を−２０℃で凍結する。凍結胎盤
を小片に切り、電気食品チョッパー（Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｓｌｉｃｉｎｇ，ニューヨーク州、バルデン）でひき、
食品用加工機でホモジナイズする。ホモジナイズ後の操
作は全て−４℃で行なう。ホモジナイズした胎盤を冷２
０ｍＭトリス、、ｐＨ７．５、３ｍＭＥＤＴＡで希釈
し、５０Ｗ（モデル１８５ソニケーター、Ｂｒａｎｓｏ
ｎ Ｓｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏ．、ニューヨーク
州、プレーンビュー）で１０分間ソニックにかける。通
常１ｋｇの凍結胎盤から２リットルの処理物を得る。

【００３３】音波処理物を塩酸でｐＨ４とし、２分間こ
のｐＨにインキュベートした後ＮａＯＨで中和する。Ｎ
ａＣｌを終濃度０．５Ｍとなるように添加してから１
０，０００×ｇで６０分間遠心分離する。上澄液を０．
５Ｍ ＮａＣｌ／３ｍＭ ＥＤＴＡ １２０ｍＭトリ
ス、ｐＨ７．５で平衡化したヘパリン−セファロース
（ファルマシア、ニュージャージー州、ピスカタウエ
イ）のカラム、８５×１５３ｍｍ、にのせる。カラムを
同じ緩衝液で洗い、２Ｍ ＮａＣｌ／３ｍＭ ＥＤＴＡ
／２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５で溶出する。溶出液を３
ｍＭ ＥＤＴＡ／２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５で希釈し
て電導度を２４ｍｍｈｏとし、二回目のヘパリン−セフ
ァロースカラム（１６×１９０ｍｍ）にのせる。カラム
を３ｍＭ ＥＤＴＡ／２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、中
０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液で洗い、同じ緩衝液中ＮａＣｌ
の０．７から２Ｍの勾配で溶出する。

【００３４】各画分につきプロテアーゼ誘導活性を測定
し、活性画分を三回目のヘパリン−セファロースカラム
（１２×７５ｍｍ）で濃縮する。カラムを先ず３ｍＭ
ＥＤＴＡ／２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、中０．８Ｍ
ＮａＣｌ溶液で、次に０．１Ｍりん酸ナトリウム、ｐＨ
６．０、中０．２Ｍ ＮａＣｌ溶液で洗滌し、０．１Ｍ
りん酸ナトリウム、ｐＨ６．０中０．２Ｍ ＮａＣｌ溶
液で溶出する。三回目のヘパリン−セファロースカラム
からの活性画分を２０倍量の０．１Ｍりん酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０で希釈する。希釈液を１０，０００×ｇ
で３０分間遠心分離してから同じ緩衝液で平衡化した９
×７２ｍｍのＣＭ−セファデックスＣ−５０カラム（フ
ァルマシア）にのせる。カラムを０．１Ｍりん酸ナトリ
ウム中０．１５Ｍ、０．５Ｍおよび２ＭのＮａＣｌ溶液
で順次溶出し、各画分のプロテアーゼ誘導活性を測定す
る。

【００３５】プロテアーゼ誘導活性を含むＣＭ−セファ
デックスカラムからの０．５Ｍ ＮａＣｌ溶出液を０．
５ｍｌのヘパリン−セファロースカラムで濃縮する。こ
のカラムは６０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ６．０、中
２Ｍ ＮａＣｌ溶液の０．５ｍｌずつで順次洗う。活性
は全て最初の１ｍｌに溶出された。この溶出液につき、
２Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ６．
０を用い、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでＦＰＬＣスペロー
ス−１２のカラム（ファルマシア）にかける。本発明の
請求の範囲にある血管形成誘導因子はこの溶出液から単
離される。この血管形成誘導因子は本例中で「蛋白質」
とも呼ぶ。

【００３６】Ｂ．蛋白質の性状および血管形成誘導因子
活性の確認 １．ＮａＤｏｄ ＳＯ₄ −ＰＡＧＥ ＮａＤｏｄ ＳＯ₄ ポリアクリルアミドゲルを用い、３
％の上層ゲルおよび１０−１８％勾配の分解ゲルを調製
し、特にここに参考文献として採用するＮａｔｕｒｅ２
７７巻、６８０−６８５頁（１９７０年）に記載される
Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って泳動する。カラムからの
活性画分はＮａＤｏｄ ＳＯ₄ −ＰＡＧＥで分子量１
８，７００の単一バンドであった。

【００３７】２．蛋白測定 蛋白濃度はウシ血清アルブミンを標準として用いたＢｉ
ｏ−Ｒｅｄ蛋白アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州、リッチモンド）に
より測定する。本蛋白質の配列に関する情報は例４に記
載する。

【００３８】３．有糸分裂促進活性− ¹²⁵Ｉ−沃化デオ
キシウリジンの取り込み 屠殺したばかりの一才牛の副腎皮質よりウシ毛管内皮
（ＢＣＥ）細胞を、ここに参考文献として採用するＰｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６巻、
５２１７−５２２１頁（１９７９年）に報告されている
Ｆｏｌｋｍａｎらの方法により単離する。特にここに参
考文献として採用するＪ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９５
巻、９７４−９８１頁（１９８２年）中でＧｒｏｓｓら
により記載されるようにマウス肉腫１８０細胞で条件づ
けした培地で補足した１０％（ｖ／ｖ）仔ウシ血清加ア
ルファ最少必須培地（ＭＥＭ）中で細胞をコンフルエン
トになるまで生育させる。コンフルエントに到達したら
培地を５％仔ウシ血清加の条件因子を含まぬＭＥＭ培地
と交換する。

【００３９】ＢＣＥ細胞のコンフルエント培養物を５％
仔ウシ血清加ＭＥＭ培地中で７日間維持する。その後培
地を各種濃度の精製胎盤血管形成誘導因子を含む５％仔
ウシ血清加ＭＥＭ培地に変える。２０時間後に培地を５
％仔ウシ血清および０．３μＣｉ／ｍｌの ¹²⁵Ｉ−沃化
デオキシウリジン（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、マサチュセッツ州
ボストン）を含有するダルベッコ改良イーグル培地に置
換する。標識培地中で１６時間インキュベート後、細胞
を冷りん酸緩衝塩液で洗滌して標識を停止する。細胞を
冷５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）と３０分間インキュベ
ートし、５％ＴＣＡおよび蒸留水で二回洗滌して酸不溶
物に取り込まれる。¹²⁵Ｉ−沃化デオキシウリジンを測
定する。

【００４０】４．遊走性測定 遊走性測定は、ここに参考文献として採用されるＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９巻：５
５９７−５６０１頁に記載されるＣａｓｔｅｌｌｏｔの
方法に従い、ゼラチンおよびフィブロネクチンで被覆し
たＰＶＰ非含有のポアサイズ５μｍのポリカーボネート
製フィルターを用いて２００μｌのブラインドウエル
（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ、カリフォルニア州、プレサン
トン）中で行なう。０．５％のウシ胎児血清含有のＭＥ
Ｍ培地で１０段階希釈した精製プロテアーゼ誘導因子を
ウエルの下層に入れる。次にフィルターを挿入し、２０
０μｌの０．５％ウシ胎児血清加ＭＥＭ培地に入った５
×１０⁴ 個のＢＣＥ細胞をウエル上層に添加する。３７
℃で４時間インキュベート後ウエル上層の培地を除去
し、フィルターの上部表面の細胞を静かに綿棒で取り除
く。次にフィルターを取り外して室温で乾燥し、ライト
−ギムザ色素（Ｂａｋｅｒ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、
ニュージャージー州、フィラデルフィア）で染色する。
フィルターの下部表面の全細胞数を光学顕微鏡（４００
倍の倍率）で数える。

【００４１】５．ＰＡおよびコラゲナーゼの誘導測定 少なくとも２日間５％仔ウシ血清含有のＭＥＭで維持し
たＢＣＥ細胞のコンフルエント培養物を５％仔ウシ血清
および試験する物質を含む新しいＭＥＭ培地と交換す
る。３７℃で２４時間インキュベート後培地を集め、参
考文献に採用するＣｅｌｌ．２０巻；３４３−３５１頁
（１９８０年）中にＭｏｓｃａｔｅｌｌｉらにより記載
されるようにしてコラゲナーゼを測定する。コラゲナー
ゼは全て潜伏性であるので活性を検出するためトリプシ
ンで活性化する。この同じ培養物からの細胞単層を冷り
ん酸緩衝塩液で２回洗滌し、０．１Ｍりん酸ナトリウ
ム、ｐＨ８．１、中の０．５％（ｖ／ｖ）トウイトンＸ
−１００溶液で抽出してからＧｒｏｓｓら（前述）によ
り記載されるようにＰＡ活性を測定する。実験の結果、
細胞抽出物中のＰＡ量は条件づけした培地中で見られた
量に比例していることがわかった。プロテアーゼ誘導活
性の１単位はＰＡおよびコラゲナーゼ合成の最大誘導の
半分まで誘導するのに必要な量と定義する。

【００４２】例２ ヒト胎盤組織からの血管形成促進因子の精製 例１の方法に従って二回目のヘパリン−セファロースカ
ラムにかける溶出液を得る。カラムを３ｍＭ ＥＤＴＡ
／２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、中０．９５ＭＮａＣｌ
溶液で洗い、同じ緩衝液中の２Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出
する。２Ｍ溶出液を０．２Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｍ
ＥＳ、ｐＨ６．０、に対して透析する。透析物を１０
０，０００×ｇで６０分間遠心分離して不溶物を除き、
Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＦＰＬＣ）システムを用いてＭｏ
ｎｏ−Ｓカラムにかける。カラムを０．２Ｍ ＮａＣｌ
／２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、で洗滌後２０ｍＭ
ＭＥＳ、ｐＨ６．０中の０．２−２Ｍ ＮａＣｌ勾配で
溶出する。各画分につきプロテアーゼ誘導活性を測定す
る。プロテアーゼ誘導活性は０．４５−０．６Ｍ Ｎａ
Ｃｌで溶出した。

【００４３】例３ 肝癌細胞からの血管形成誘導因子の精製 ＦＰＬＣ以外の全ての精製ステップは４℃で行なう。Ｓ
Ｋ−Ｈｅｐ−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］寄託
番号Ｎｏ．ＨＴＢ５２）のコンフルエント単層より細胞
を冷ＰＢＳにかり取り、４００×ｇで１０分間遠心分離
して集める。細胞ペレットを１０倍容量のＰＢＳ／０．
５Ｍ ＮａＣｌにけん濁し、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉ
ｃａｔｏｒ（ニューヨーク州、プレインビュー）を用い
て５ワットで３分間音波処理を行なう。抽出物を遠心分
離にかけ（１０，０００×ｇ、１時間）、上澄液を集め
る。ペレットは等容量のＰＢＳ／０．５Ｍ ＮａＣｌに
再けん濁して音波処理を行ない、遠心分離する。上澄液
を合わせて２８×７５ｍｍのＰＢＳ／０．５Ｍ ＮａＣ
ｌで平衡化したヘパリン−セファロースカラム（ファル
マシア、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）を通
す。カラムを０．５Ｍ ＮａＣｌ／３ｍＭ ＥＤＴＡ／
１００ｍＭトリス、ｐＨ７．５で洗滌後、同じ緩衝液中
の０．５−２ＭＮａＣｌ勾配で溶出する。各画分につい
てＰＡ誘導活性を測定し、活性画分を集めて伝導率が２
０ｍｍｈｏとなるまで３ｍＭ ＥＤＴＡ／２０ｍＭトリ
ス、ｐＨ７．５で希釈する。

【００４４】次に活性物質を３ｍＭ ＥＤＴＡ／２０ｍ
Ｍトリス、ｐＨ７．５中０．５ＭＮａＣｌ溶液で平衡化
した二回目のヘパリン−セファロースカラム（１０×７
５ｍｍ）にかける。カラムを先ず０．５Ｍ ＮａＣｌ
で、次に３ｍＭ ＥＤＴＡ／２０ｍＭトリス、ｐＨ７．
５、で洗い、同じ緩衝液中の０．９−２Ｍ ＮａＣｌ勾
配で溶出する。活性画分を三回目のヘパリン−セファロ
ースカラム（７×８５ｍｍ）にのせて２０ｍＭ ＭＥ
Ｓ、ｐＨ６．０中の０．５Ｍ ＮａＣｌで洗滌後、Ｎａ
Ｃｌを２Ｍとして溶出する。三回目のヘパリン−セファ
ロースカラムからの活性画分を２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ
６．０、で１：１０に希釈して１００，０００×ｇ、／
時間の遠心分離で不溶性物質を除く。これを０．２Ｍ
ＮａＣｌ／２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０で平衡化した
Ｍｏｎｏ−Ｓ ＦＰＬＣカラム（ファルマシア）にのせ
る。カラムを０．２Ｍ ＮａＣｌで洗ってから溶出をＮ
ａＣｌの勾配（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、中０．
２から２Ｍ）で溶出する。各画分につきＰＡ誘導活性を
測定し、活性画分を集めて純度をＮａＤｏｄ ＳＯ₄ −
ＰＡＧＥで検定する。

【００４５】例４ ヒト胎盤より単離した胎盤血管形成誘導因子（ＰＡＦ）
のアミノ酸配列の決定Ａ．Ｌｙｓ−Ｃペプチド 上述の例２の方法により２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．
０、０．５Ｍ ＮａＣｌに溶解した精製ＰＡＦを得る。
天然蛋白質を以下のようにエンド型プロテナーゼＬｙｓ
−Ｃを用いて消化する：２ｎｍｏｌｅの天然蛋白質を３
５０μｌの２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、０．５Ｍ
ＮａＣｌに溶解して含有する反応液を２ＭＮＨ₄ ＨＣＯ
₃ １５μｌを添加してｐＨ８．７に調整する。１．１７
単位のエンド型プロテナーゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガ
ー）を添加し、３７℃で７時間３０分消化を行なう。次
に２−メルカプトエタノールを最終濃度が１％（ｖ／
ｖ）となるように添加し、３７℃でさらに１５分間イン
キュベートする。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を最終濃
度０．１％（ｖ／ｖ）となるように添加し、消化物をＳ
ｙｎｃｈｒｏｍ ＲＰ８カラムを用いた逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分画する。ペプチドは
０．１％ＴＦＡ水溶液および次に０．１％ＴＦＡ中のア
セトニトリル勾配（６０分間で０−６０％のアセトニト
リル）でカラムから溶出する。カラムからのペプチド溶
出はＡ₂₁₅ およびＡ₂₈₀ で追跡し、適当な画分を手動で
集める。

【００４６】１９％のアセトニトリルで溶出したペプチ
ドを自動エドマン分解により配列決定した結果、次の配
列を示した：

【化１１】 (K)-N-G-G-F-F-L-R-I-H-P-D-G-R-V-D-G-V-R-E-K この配列および以下の配列中カッコ内に示すアミノ酸残
基ははっきりと同定されていない残基である。

【００４７】１９．８％のアセトニトリルで溶出したペ
プチドを配列決定した結果次の配列であった：

【化１２】(K)-G-V-( )-A-N-( )-Y-L-(A)-M-K-(E)-D-G-

【００４８】同じ消化物から１７．５％アセトニトリル
で溶出した他のペプチドは次のアミノ酸配列を示した：

【化１３】(K)-L-Q-L-Q-A-E-E-R-G-V-V-S-I-K

【００４９】２６％のアセトニトリルで溶出したペプチ
ドを自動エドマン分解にかけて次のアミノ酸配列を示し
た：

【化１４】(K)-(C)-V-T-(D)-E-(C)-F-F-F-E-( )-L-E-S-
N-N-Y-N-(T)-

【００５０】１６％のアセトニトリルで溶出したもう二
個のペプチドは混合物として得られ、配列決定前に再精
製した。得られたペプチド混合物を真空下で乾燥し、１
００μｌの５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．５、８Ｍ尿
素に再けん濁する。２０ｎｍｏｌｅのジチトトライトー
ル（ＤＴＴ）を添加して３７℃１５分で存在するＳ−Ｓ
結合を還元する。次に６０ｎｍｏｌｅの ³Ｈ−沃度酢酸
を添加してペプチドをカルボキシメチル化し、室温で暗
所下２０分インキュベートする。さらに６０ｎｍｏｌｅ
のＤＴＴを添加して室温で３０分間インキュベートした
後、反応液をＴＦＡ０．１％に調整し、Ａｌｔｅｘ Ｃ
−３逆相カラムを用いたＨＰＬＣで再分画する。ペプチ
ドはカラムより０．１％ＴＦＡ水溶液および続くアセト
ニトリル勾配（１２０分間で０−６０％アセトニトリ
ル）で溶出する（流速１ｍｌ／ｍｉｎ）。

【００５１】１３％アセトニトリルで溶出したペプチド
を自動エドマン分解にかけたところ次の配列を示した：

【化１５】(K)-G-V-C-A-N-R-Y-L-A-M-K

【００５２】Ｂ．ＳＭＰ−ペプチド 天然ＰＡＦ蛋白質をマウス下顎腺プロテアーゼで消化し
てさらにペプチドを得る。３５０μｌの２０ｍＭ ＭＥ
Ｓ、ｐＨ６．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ中に２ｎｍｏｌｅ
の蛋白質を含む溶液に２５μｌの１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 、
ｐＨ９．０、を添加してｐＨ８．０に調整する。下顎腺
プロテアーゼ（３．６μｇ）を添加して消化を３７℃で
２４時間行なう。９０ｎｍｏｌｅのＤＴＴを添加して３
７℃のインキュベーションを３０分間続ける。３６０ｎ
ｍｏｌｅの ³Ｈ−ヨード酢酸を添加してペプチドのカル
ボキシメチル化を行ない、室温暗所で２０分間インキュ
ベーションをする。さらに３６０ｎｍｏｌｅのＤＴＴを
添加してから反応液をＴＦＡ中０．１％（ｖ／ｖ）に調
整し、上述のようにペプチド混合物をＲＰ−８ＨＰＬＣ
で分画する。

【００５３】１２％アセトニトリルで溶出するペプチド
混合物を一つの画分に集め、乾燥して１００μｌの５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、８Ｍ尿素に再けん濁
してＡｌｔｅｘ Ｃ−３カラムを用いたＨＰＬＣで再分
画してＬｙｓ−Ｃペプチドの精製で記載した溶出スケジ
ュールと同じように溶出した。

【００５４】１４．８％アセトニトリル（ａ）および１
５．３％アセトニトリル（ｂ）で溶出した二つのペプチ
ドを自動エドマン分解にかけて次のようなアミノ酸配列
を得た：

【化１６】a) (R)-G-V-V-( )-I-K-G-V-C-A-N- b) (R)-L-V-C-K-N-G-G-F-F-

【００５５】天然ＰＡＦをＳ．ａｕｒｅｕｓプロテアー
ゼ（Ｖ８）で消化していくつかのペプチドを得た。５０
０μｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２Ｍ
ＮａＣｌに溶解した１ｍｏｌｅの蛋白質をＲＰ−８逆相
カラムを用いてＨＰＬＣで脱塩する。蛋白含有の脱塩画
分を乾燥し、５０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．０の５０μｌに再
けん濁し、１μｇのＶ８プロテアーゼを加える。３７℃
１８時間消化を行なう。ペプチドを上述のようにＲＰ−
８逆相カラムを用いたＨＰＬＣで分画する。

【００５６】１７％アセトニトリルで溶出したペプチド
を自動エドマン分解にかけ次のアミノ酸配列を得た：

【化１７】(E)-K-S-( )-P-H-I-K-L-Q-L-( )-A-E

【００５７】Ｖ８消化物からの２０％アセトニトリル溶
出のペプチドも配列決定し、次の結果を得た：

【化１８】(E)-( )-(G)-( )-L-L-A-( )-K-

【００５８】２１％アセトニトリルで溶出したＶ８ペプ
チドを配列決定して次の結果を得た：

【化１９】(E)-S-N-N-Y-N-T-Y-R-(S)-

【００５９】上記アミノ酸配列を整理すると以下に示す
ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の中核配列が得られる：

【化２０】

【００６０】さらに他のペプチドを単離して自動エドマ
ン分解にかけた。それらのアミノ酸配列は上記中核配列
外にあった。下顎腺消化物（上記参照）の分画で１３％
のアセトニトリルで溶出したペプチドは次のアミノ酸配
列を示した：

【化２１】 K-L-G-S-K-T-G-P-G-Q-K-A-I-L-F-L-P-M-S-A-K

【００６１】２０％アセトニトリルで溶出したＬｙｓ−
Ｃペプチドは次のアミノ酸配列であった：

【化２２】Y-( )-S-W-Y-V-( )-L-( )

【００６２】例５ 治療剤として臨床応用に適した血管形成誘導因子性状の
同定 例１および例２の方法により単離した胎盤由来の因子お
よび肝癌細胞から単離した因子が血管形成誘導因子に予
想される試験管内の三つの全ての性質を示すことを明ら
かにした。先ず、０．１から１０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃
度でこれらの分子はＢＣＥ細胞のＰＡおよび潜伏性コラ
ゲナーゼの合成を促進する。ＰＡは前酵素プラズミノー
ゲンを特異性の広いプロテアーゼであるプラズミンに変
換することができる。プラズミンは潜伏性コラゲナーゼ
を活性コラゲナーゼに変換できる。従って低濃度の本因
子の影響で毛管内皮細胞は周囲組織のほとんどの蛋白質
を分解できる少なくとも２つのプロテアーゼを生成し、
その結果細胞が組織に浸入する。

【００６３】精製分子はＢＣＥ細胞のＰＡおよびコラゲ
ナーゼを濃度依存的に促進する。コラゲナーゼは全て活
性型である。トリプシン処理の後コラーゼ分解活性が検
出された。ＰＡおよび潜伏性コラゲナーゼの両者が相関
して促進される。１／２最大促進は１ｎｇ／ｍｌのプロ
テアーゼ誘導因子の濃度で観察される。未処理細胞で生
成するＰＡおよびコラゲナーゼの量は実験により差があ
り、従って促進の割合も変化する。プロテアーゼ誘導因
子の濃度を非常に高くすると、化学走性および有糸分裂
促進と同様にＰＡ合成の促進も低下する。ＢＣＥ細胞を
ＰＡおよびコラゲナーゼを誘導する濃度のプロテアーゼ
誘導因子と２４時間インキュベートすると、細胞の形態
が典型的な玉石型から伸長した紡錐型に変化する。

【００６４】第二番目として本因子はＢＣＥ細胞に対し
て化学走性能を示す。そこで試験管内で毛管内皮細胞は
本因子の方向に移動する。本因子を０．００１および
０．１ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加するとＢＣＥ細胞
の化学走性がブラインドウエル槽内で促進される。これ
より高い濃度では化学走性は見られない。上槽から下槽
への細胞移動の増加は下槽に上槽より高濃度の因子が存
在する場合のみ観察され、このことは真の化学走性が起
きていることを示す。化学走性は観察される運動性増加
の２５％以上を占めることはなかった。

【００６５】第三番目に、本因子はＢＣＥ細胞に対して
有糸分裂促進を示す。ＢＣＥ細胞培養にプロテアーゼ誘
導因子を添加した時、その添加量に依存した ¹²⁵Ｉ−ヨ
ードデオキシウリジンのＤＮＡへの取り込み促進を示
す。プロテアーゼ誘導因子の濃度を高めるとこの誘導活
性は低下する。 ¹²⁵Ｉ−ヨードデオキシウリジン取り込
みの促進はＰＡおよびコラゲナーゼ誘導ができると同じ
濃度で観察される。胎盤由来の粗音波処理物による ¹²⁵
Ｉ−ヨードデオキシウリジンのＤＮＡへの取り込み促進
は他の有糸分裂促進活性と相関していることを本発明者
は既に確認している。従って本因子は真に有糸分裂促進
的に作用している。精製した単一分子がＢＣＥ細胞でＰ
Ａおよびコラゲナーゼを誘導し、細胞複製を促進し、そ
の運動性を促進する能力があると考えられる。

【００６６】例６ 血管形成活性 血管形成の測定のためにＡｕａｔ．Ｒｅｃ．１９９巻、
３３−４２頁（１９８１年）に報告されているようにＤ
ｕｎｎらの方法を用いた実験で、例２の血管形成誘導因
子はトリ繊毛尿膜上で６５ｎｇの投与量で９１％の卵で
血管形成を促進した。

【００６７】例７ ａ）ＰＡＦのＮ−末端アミノ酸配列 上述のようにして（例１および例２参照）ヒト胎盤血管
形成因子を精製する。２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ
６．０、および５００ｍＭ ＮａＣｌに溶解した精製蛋
白質をＲＰ−８逆相カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーで脱塩する。２５０から５００ｐｍｏｌｅの脱
塩蛋白質を自動エドマン分解するためＡＢＩ４７０Ａ気
相蛋白質シークエンサーにかける。得られるＰＴＨアミ
ノ酸をシアン逆相カラムを用いた高速液クロで同定す
る。

【００６８】これらの実験結果よりＰＡＦのＮ末端アミ
ノ酸配列は以下のように決定された：

【化２３】G-T-M-A-A-G-S-I-T-T-L-P-A-L-P -E さらに、上述のＰＡＦのＮ末端アミノ酸配列は例４、Ａ
に記載するクロマトグラフィー系で２３％アセトニトリ
ルで溶出したＬｙｓ−Ｃペプチドの自動エドマン分解に
よっても確認された。

【００６９】ｂ）ＰＡＦのＣ末端アミノ酸配列 ＰＡＦのＬｙｓ−Ｃ消化物より例４に記載のようにＣ−
末端ＰＡＦペプチドを単離した。本ペプチドは２２％ア
セトニトリルで溶出する。このペプチドを自動エドマン
分解にかけて次のアミノ酸配列を示した：

【化２４】A-I-L-F-L-P-M-S-A-K-S

【００７０】（ｉ）例４；（ii）ＰＡＦのＮ末端アミノ
酸配列；（iii ）ＰＡＦのＣ末端アミノ酸配列；および
（iv）ｃＤＮＡのデータを総合してＰＡＦの全アミノ酸
配列は以下のとおりである： １．ＰＡＦ １型

【化２５】

【００７１】２．ＰＡＦ ２型： Ｎ末端ブロックＰＡ
Ｆ 精製ＰＡＦおよび天然ＰＡＦを自動エドマン分解にかけ
た多くの実験で、チャージした蛋白質のある部分（５０
−８０％）がエドマン処理で分解しないことがわかっ
た。ＰＡＦ蛋白質分子の一部分はＮ末端がブロックされ
て存在するものと考えられた。ブロックしている基の性
状は精製アミノ末端ペプチドの研究により明白になっ
た。ＰＡＦの酵素分解（例４参照）から得られるアミノ
末端ペプチドはアミノ酸分析で同定する。また濾紙電気
泳動または薄層クロマトグラフィーと参照文献として採
用するＣｈｅｍ．Ｂｅｒ．８７巻、１１０３−１１０７
頁（１９５４年）中にＦ．ＲｅｉｎｄｅｌおよびＷ．Ｈ
ｏｐｐｅにより記載される塩素／Ｏ−トリジン試薬によ
る染色で同定される。（ブロックされているペプチドは
側鎖のリジン残基による弱い呈色以外には、先ず加水分
解しない限りニンヒドリンで検出されない。）

【００７２】さらに、小さいＮ−末端ブロックＰＡＦペ
プチドは酸性サーモリシンまたはペプシンによるＰＡＦ
消化物をＮａｒｉｔａら（１９７５年）によりＰｒｏｔ
ｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ、３０−１０３頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ、ベルリン、ハイデルベルグ、ニューヨーク、中に記
載されるようにＤｏｗｅｘ ５０、ｘ２（Ｈ⁺ 型）のク
ロマトグラフィーで単離するか、Ｉ．ＫｌｕｎによりＣ
ｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．（英語版）
４４巻、１４５−１４７頁（１９７９年）に記載される
ようにスルホエチル−セファデックスのクロマトグラフ
ィーにより単離できる。これらの文献は参考文献として
とり上げている。ブロックされた短かいペプチドの構造
は多くの標準手法および方法により決定される。例え
ば、Ｇ．ＡｌｌｅｎのＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｎｏｒｔ
ｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ、アムステルダム、ニューヨーク、オックスフォ
ード（１９８１年）またはそこに記載されている文献
で、これらは本出願の参考文献として採用している。こ
れらの手順および方法はＮ末端のブロックしたペプチド
のカルボキシペプチダーゼ、プログルタミン酸アミノペ
プチダーゼによる消化、ヒドラジン分解、質量分析、核
磁器共鳴、ガスクロマトグラフィーおよびＢｏｉｓｓｅ
ｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２巻、８４４８−８４５２（１９８５年）により記
載されるＦＡＢ質量分析などがある。

【００７３】３．ＰＡＦ ３型：短縮および伸長ＰＡＦ ウシ腎線維芽細胞生育因子（ＦＧＦ）はＮ末端からのア
ミノ酸の多くを欠損していることがわかっている（Ａ．
Ｂａｉｒｄら、Ｒｅｑｕｌ．Ｐｅｐｔ、印刷中：１９８
５年）（Ｄ．Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚｙｍｏｌ印刷中：１９８６年）。Ｇ．Ｎｅｕｆｅ
ｌｄおよびＤ．Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０巻、１３８６０−１３８６８頁
（１９８５年）により示されているように短縮した線維
芽細胞生育因子はＦＧＦレセプターの結合能力を保持し
ており、このことは本蛋白質のＮ末端はＦＧＦの細胞表
層レセプターとの相互作用に重要な役割を持たないこと
を示している。従って、ＰＡＦの短縮型および伸長型の
両者ともレセプター結合能を保持すると予想される。Ｐ
ＡＦの生物活性を保持したままのＮ末端最大欠損および
伸長はまだ決定されていない。

【００７４】例８：ＰＡＦのｃＤＮＡクローン ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を１０％ウシ胎児血清、非必須ア
ミノ酸およびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ添加の最少必須イーグ
ル培地で培養する。ＲＮＡはここに参考文献として採用
するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、１９８２年、１９１−１９３頁）中にＭａｎｉ
ａｔｉｓらにより記載されるＮＰ−４０溶解法を用いて
単離した。Ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ｍＲＮＡを文献として採用
したＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６
９巻、１４０８頁（１９７２年）に記載されるＨ．Ａｖ
ｉｖおよびＰ．Ｌｅｄｅｒの手法を用いたオリゴｄＴク
ロマトグラフィー（ＢＲＬ）により選択した。ここに文
献として採用したＧｅｎｅ、２５巻、２６３−２６９頁
（１９８３年）にＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎが
記載するように、オリゴｄＴによる第一鎖合成およびＲ
Ｎａｓｅ Ｈ−ＤＮＡポリメラーゼ関与の第二鎖合成を
用い、５μｇのｍＲＮＡから８μｇの二重鎖ｃＤＮＡを
得た。この操作にはＡｍｅｒｓｈａｍの試薬を使用し
た。以下の反応は特に記載しない限り製造元の指示通り
行なった。このｃＤＮＡを１０単位のＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて平滑末端化した。
ＥｃｏＲＩ部位は４００単位のＥｃｏＲＩメチラーゼ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および１
００ｍＭのＳ−アデノシルメチオニンで保護した。同量
のＥｃｏＲＩリンカー（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ
ｌａｂｓ、８塩基対）を１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ）で結合した。過剰のリ
ンカーは２００単位のＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化して除去し、１００ｎｇ
のこのｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化のアルカリフォスファ
ターゼ処理ラムダｇｔ−１０ ＤＮＡ（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１μｇと連結する。
ＤＮＡをインビトロでパケッジングし（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ
６００ＨＦＬａにプレーティングして８．２×１０ ⁵ 個
の形質転換株を得た。

【００７５】オリゴヌクレオチドプローブのデザイン ＳＫ−ＨＥＰ−１ ｃＤＮＡクローンの単離のため２種
の混合配列オリゴヌクレオチドプローブを使用した。プ
ローブは決めたアミノ酸配列に対応する全ゆるＤＮＡ配
列をプールしたものより成る。プローブは本明細書に記
載されるＰＡＦの中核アミノ酸配列中の配列を選択し
た。プローブ＃５はアミノ酸配列

【化２６】 Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｌａ をコードするＤＮＡとハイブリダイズするように作成
し、１９２配列から成る１７マーである：

【化２７】 ♯５ Ile Lys Gly Val Cys Ala 5′ ATZ AAN GGX GTX TGY GC 3′ １９２倍低下、１７マー、 Ｘ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ Ｎ＝ＡまたはＧ Ｙ＝ＴまたはＣ Ｚ＝Ｔ、ＣまたはＡ

【００７６】プローブ＃８はアミノ酸配列

【化２８】Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe, をコードするＤＮＡとハイブリダイズするように作成
し、２５６種の配列より成る２０マーである。

【化２９】 ♯８ Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe 5′ TAY TGY AAN AAY GGX GGX TT 3′ ２５６倍低下、２０マー 両プローブともＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
ＤＮＡ合成機で合成した。いずれもゲルにより精製し
てＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア）を用
い［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で４−６×
１０⁶ ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性に放射標識した。

【００７７】ハイブリダイゼーション温度は文献に特に
採用しているＳ．Ｖ．Ｓｕｇｇｓら、（Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉ
ｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ：Ｄ．Ｄ．ＢｒｏｗｎおよびＣ．
Ｆ．Ｆｏｘ編集、６８３−６９３頁：１９８２年、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）により記載
されているように、ＡＴの多いもののほとんどで計算し
たＴｍ値よりも２℃低い温度とした。最後の洗絛につい
ては計算値どおりのＴｍで行なった（即ちハイブリダイ
ゼーション温度より２℃高い温度）。ｃＤＮＡのライブ
ラリーを１５０ｍｍルリアーベルトニ寒天平板につき５
０，０００個のプラーク濃度となるように、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｃ６００ＨＦＬａ株とＮＺＣＹＭ上層寒天（０．７
％）を用いてプレートした。ファージＤＮＡは二枚のニ
トロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａ
ｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、ＢＡ８５）にトライスファー
し、文献に採用しているＳｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１
８０−１８２頁（１９７９年）のＢｅｎｔｏｎおよびＤ
ａｖｉｓにより記載されているようにハイブリダイゼー
ション用に調製した。フィルターは６×ＳＳＣ（２０×
ＳＳＣは３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．５）、２×デンハルツ溶液（１００×デン
ハルツ溶液は２％ファイコール、２％ポリビニルピロリ
ドンおよび２％ＢＳＡ）、０．１％ＳＤＳ、０．０５％
ピロリン酸ナトリウムおよび１００ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲ
ＮＡを含む溶液中４８℃で２時間プレハイブリダイゼー
ションを行なう。プローブ＃８を０．２ｐｍｏｌ／ｍｌ
で添加し、１６時間ハイブリダイゼーションを行なう。
ハイブリダイゼーション後、フィルターを以下のように
洗絛した：６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中室温で１
５分間ずつ３回と最後の１回は５０℃で８分間。次にフ
ィルターを乾燥し、コダックＸＡＲ５フィルムおよび
「ライトニング・プラス」増幅スクリーンを用いて−７
０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行なう。二枚
のフィルターで陽性であるプラークを精製のため吊る。
それらのプラークをプローブ＃５および＃８を用いて二
次選択を行ない、両プローブとハイブリダイズしたプラ
ークを血管形成誘導因子をコードする候補として選ん
だ。

【００７８】文献として特に採用したＡｄｖａｎｃｅｄ
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ ｍａｎ
ｕａｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｐｒｉｎｇ Ｈｏｂａｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，ニューヨーク：１９８０年）中でＲ．Ｗ．
Ｄａｖｉｓ、Ｄ．ＢｏｓｔｅｉｎおよびＪ．Ｒ．Ｒｏｔ
ｈにより記載されている方法に従い、このファージより
プレート溶解法およびホルムアミド抽出によりＤＮＡを
調製した。このＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化により１％アガ
ロースゲルで１．１ｋｂの挿入断片を放出した。この挿
入断片をＭａｎｉａｔｉｓら、上述、１７３−１７８頁
により記載されるようにサブクローニングのため５％ア
クリルアミドゲルから精製した。挿入断片をバクテリオ
ファージＭ１３ｍｐ１９ＲＦ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化
物に連結し、参考文献のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４
巻、４４１頁（１９７５年）に記載されるＳａｎｇｅｒ
のジデオキシヌクレオチド法を用いて配列決定した。得
られた配列の解析の結果、ＰＡＦの一時構造をコードす
る読みワクが得られた。

【００７９】蛋白質の配列データ（例７参照）および報
告されているＦＧＦの情報（Ｅｓｃｈら；Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２巻、６５０７−
６５１１：１９８５年）から、ＰＡＦのいくつかの活性
型が精製されているものと思われる。ＰＡＦ １型（例
７参照）はこのＤＮＡよりＡＧＴＭＡＡの５′側のどこ
かから翻訳が開始し、まだ解明されていないプロセスに
よるＡＧ結合の翻訳後の切断により生成される。さらに
ＰＡＦ３型はコンセンサス開始部位（Ｍ．Ｋｏｚａｋ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４７巻、１−４５頁：１
９８３年）であるＭＡＡ配列から翻訳が開始し、任意に
メチオニンの分解除去により精製する。ＰＡＦ３型はま
た他の機能的開始部位からの翻訳開始によっても精製さ
れる。そのような部位は技術に熟練した者に容易に理解
されるもので、特に本明細書の記載より明かである。さ
らに、翻訳一次生成物の翻訳後のプロセシングも起る
が、これは必須ではない。ＰＡＦ２型は１型または３型
からまだわかっていないプロセスによりＮ末端のアミノ
酸の遊離アミノ基のブロックが起ることにより生じる。

【００８０】例９：ＰＡＦの発現 ＰＡＦ発現の原理は以下のとおりである。ラムダｇｔ１
０グローンから単離した１．１ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を
プラスミドｐＵＣ９にサブクローンする。この断片はＰ
ＡＦの全コード配列を含む。サブクローンの小さい２つ
の断片が発現システムの構築に有用である。１つは３６
７ｂｐのＡｖａＩからＢａｍＨＩまでの断片で、これは
胎盤由来の１型蛋白質のＧＴＭＡＡ残基を１から５と数
えて１７から１３７までのアミノ酸残基のＰＡＦをコー
ドする配列を含む。もう一つは４０５ｂｐのＮｃｏＩか
らＢａｍＨＩまでの断片で、これはＰＡＦの４から１３
７までのアミノ酸残基をコードする配列を含む。これら
の制限断片の両端に合成アダプターをつけてコード配列
を完全し、翻訳開始、終了またはカプリング配列などを
調製して適当な発現ベクターとの連結に必要な配列も加
える。

【００８１】ヒト胎盤から単離したＰＡＦはＧＴＭＡＡ
で開始する配列を有する。ＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞から単
離したｃＤＮＡクローンからＧＴＭＡＡ配列より少なく
とも１００アミノ酸上流から、またはＭＡＡで開始する
ＰＡＦの他の型が存在することが示唆される。胎盤型を
用いて酵母（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ）および細菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現した。他のＳＫ−Ｈｅｐ−１型
およびアミノ末端の短縮型は下に記述する方法の改良で
発現させることが出来、その方法は技術に熟練する者に
は明白である。その方法はｃＤＮＡ断片のアミノ末端
（ＮｃｏＩ部位またはＡｖａＩ部位）を発現ベクターに
連結するのに用いる合成アダプターを変化させることよ
り成る。また別の方法としては、以下に示すＧＴＭＡＡ
型からヌクレオチド−支持欠損変位処理（文献として採
用する“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｔｕ
ｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”、Ｋ．Ｍｉｚｏｂｕｃ
ｈｉ、Ｉ．ＷａｔａｎａｂｅおよびＪ．Ｄ．Ｗａｔｓｏ
ｎ編集、Ａｃａｃｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨー
ク、４１９−４３６頁：１９８３年にＭ．Ｉｎｏｕｙ
ｅ、Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｓ．Ｉｎｏｕｙｅおよび
Ｙ．Ｍａｓｕｉにより記載）によって短縮型の発現プラ
スミドを構築できる。以下のアダプターをＡｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡ合成機で合成し、ゲ
ル精製をする。５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（ファルマシア）でりん酸化する。対の相補オリゴヌ
クレオチドを以下のようにしてアニールし、二重鎖アダ
プターを精製する。等量の核オリゴヌクレオチドを５０
ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５および１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡに添加する。この溶液を沸とう湯浴中で加
熱する。続いて湯浴を火から外し、２時間で室温まで冷
やす。以下が使用したアダプターのリストおよびその説
明である。

【００８２】

【表１】

【００８３】

【表２】

【００８４】

【表３】

【００８５】

【化３０】

【００８６】例９：酵母発現プラスミドの構築 ｐＵＣ８をＨｉｎｄ IIIで消化してｐＵＣ８由来でポリ
リンカーのＨｉｎｄ III部位からＳｍａＩ部位までの制
限酵素部位を欠いているプラスミドｐＧＳ１８５を構築
し、それをＨｉｎｄ III部位を再生しないＨｉｎｄ III
／ＳｍａＩアダプター（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番
号ＤＡ１００６）とＳｍａＩ消化および希薄溶液（１ｎ
ｇ／ｍｌ）中でライゲーションして連結し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＪＭ８３を形質転換する。形質転換株から単離した
プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩまたはＨｉｎ
ｄ IIIで消化して正しいプラスミドを同定する。このよ
うにしてＥｃｏＲＩ部位およびＳｍａＩ部位を有するが
Ｈｉｎｄ III部位を欠いているプラスミドを保有する形
質転換株を同定した。酵母ＭＦ１遺伝子を含むＥｃｏＲ
Ｉ断片をＪ．ＫｕｒｇａｎおよびＩ．Ｈｅｒｓｋｏｗｉ
ｔｚによりＣｅｌｌ、３０巻：９３３頁（１９８２年）
中に記載されるようにプラスミドｐＣＹ１７からゲル電
気泳動により精製し、ＥｃｏＲＩで切断したｐＧＳ１８
５に連結する。このライゲーション反応液を用いてＥ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリン耐性
の形質転換株を選択する。形質転換株よりプラスミドＤ
ＮＡを単離し、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して正しい挿
入の存在を確認する。これがプラスミドｐＧＳ２８５で
ある。

【００８７】プラスミドｐＧＳ２８５をＨｉｎｄ IIIで
完全消化し、希薄状態（１ｎｇ／ｍｌ）で連結して上述
のＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚにより記載
されるＭＦ１遺伝子中の４個のＨｉｎｄ III部位の３個
を除去する。上に記載のようにして正しい構成を選択す
る。これがプラスミドｐＧＳ３８５である。部位特異変
異のため、ＥｃｏＲＩ消化によりｐＧＳ３８５からＭＦ
１遺伝子を除き、ゲルで精製後（１．５ｋｂ）ＥｃｏＲ
Ｉで消化したＭ１３ｍｐ１８ＲＦと連結する。ライゲー
ション反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ７１−１８を形質
転換し、ＭＦ１遺伝子が正しい方向性で挿入されている
クローンを［³²Ｐ］標識ＭＦ１遺伝子はハイブリダイズ
により同定する。ＭＦ１の配列をＺｏｌｌｅｒおよびＳ
ｍｉｔｈ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、１００巻、１９８３年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ Ｉｎｃ．，４６８頁）が記載する部位特異インビ
トロ変異の標準法を用いてＧＴＡ ＴＣＴ ＴＴＧ Ｇ
ＡＴ ＡＡＡＡＧＡからＧＴＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＡ
Ｔ ＡＡＡ ＡＧＡに変える。−ファクター遺伝子変
異、ＭＦ −Ｈをジデオキシ法配列決定により確認す
る。

【００８８】Ｍ１３ｍｐ１８クローンのＲＦ型をＥｃｏ
ＲＩで消化してＭＦ −Ｈ遺伝子を除去し、１．５Ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片をアクリルアミドゲル電気泳動により
精製し、ＥｃｏＲＩ切断のｐＧＳ１８５と連結する。得
られるライゲーション反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂ１０１を形質転換し、ＭＦ−遺伝子を有するプラスミ
ドを保有するコロニーをＭＦ −Ｈ遺伝子を含む³²Ｐ標
識の１．５Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズして
同定する。そのようなプラスミドをｐＧＳ２８６と命名
する。ＰＡＦ遺伝子を以下のとおりｐＧＳ２８６に挿入
する。アダプター＃１および＃２をＰＡＦ ＮｃｏＩ／
ＢａｍＨＩ断片と連結する。反応液をポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動し、アダプターを付加したＰＡＦ Ｄ
ＮＡをＭＷの増加により同定する。この正しく連結した
ＤＮＡ断片をゲルより溶出し、Ｈｉｎｄ III／ＳａｌＩ
消化のｐＧＳ２８６と連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１をこのライゲーション反応液で形質転換し、アンピ
シリン耐性のコロニーを選択する。正しい挿入を有する
プラスミドを保有する形質転換株を［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ
およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとインキュベート
して放射標識したアダプター１Ａおよび２Ａとハイブリ
ダイズして同定する。このようにして構築し、単離した
プラスミドをｐＧＳ２８６−ＰＡＦと命名している。こ
のプラスミドはＭＦ Ｈ遺伝子がＭＦ Ｈ遺伝子の“プ
レ−プロ”領域のＨｉｎｄ III部位でＰＡＦ遺伝子と融
合している。このような構築物は酵母に導入されると、
Ａ．Ｊ．Ｂｒａｋｅら、１９８１年（ＰＮＡＳ：ＵＳＡ
８１巻、４６４２頁）により示されるように異種蛋白質
の合成、プロセシングおよび分泌を指示することが知ら
れている。

【００８９】ＭＦ Ｈ遺伝子およびＰＡＦの融合物を含
むＥｃｏＲＩ断片はｐＧＳ２８６−ＰＡＦである。この
断片はＥｃｏＲＩによる消化およびポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により単離する。Ｔ４ ＤＮＡポリメラー
ゼにより平滑末端とした後Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い
てＰｓｔＩアダプター（ファルマシア）を連結する。こ
の断片を次にベクターｐＣ１／１（Ａ．Ｊ．Ｂｒａｋｅ
ら、１９８１年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８１巻：４０４２
頁）のＰｓｔＩ消化物に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０
１をこの反応液で形質転換してＴＥＴ^r のコロニーを選
択する。ＰＡＦ遺伝子とのハイブリダイゼーションによ
り正しい構築を同定する。このプラスミドをＳ．ｃｅｒ
ｖｉｓｉａｅＤＢＹ７４６（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、カリホルニア州、バー
クレイ）にＴｏｈ−ＥおよびＷｉｃｋｎｅｒ（Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１４５巻、１９８１年、１４２
１−１４２４頁）により記載されるように欠損させた２
ミクロンＤＮＡプラスミドを用い、標準の形質転換プロ
トコールにより導入する。ＰＡＦを発現する形質転換株
は精製抗ＰＡＦ ＩｇＧとのアフィニティーの反応性に
より選択する。

【００９０】例１０：Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズマ分泌 ＰＡＦ発現をＥ．ｃｏｌｉペリプラズマへの輸送に適し
た型に制御するため、以下のような制御因子を使用し
た：転写開始を高レベルで行なうためのプラスミドｐＣ
Ｊ−１上のｔａｃプロモーター；転写調節のためのプラ
スミドｐＣＪ−１上のｌａｃオペレーター；Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＪＭ１０７株の染色体上に存在するｌａｃレプレッ
サー（ｌａｃＩ）。ＰＡＦのペリプラズマへの輸送を行
なうためＯｍｐ ＡリーダーペプチドをＰＡＦをコード
するＤＮＡに、前者ペプチドのＣ−末端ＡｌａとＰＡＦ
１型のＮ−末端Ｇｌｙとが融合し、一次産物中のＡｌａ
−Ｇｌｙ結合がＥ．ｃｏｌｉのリーダーペプチダーゼに
より切断されて成熟ＰＡＦが生成するように連結する。
Ｅ．ｃｏｌｉの分泌ベクターは以下の通り構築する。ア
ダプター＃５および＃４をＰＡＦのＡｖａＩ／ＢａｍＨ
Ｉ断片に連結する。正しい大きさのＤＮＡをポリアクリ
ルアミドゲルより溶出し、Ｏｍｐ ＡリーダーＤＮＡと
および、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦ
と連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ−１０７をライゲーシ
ョン反応液で形質転換する。ＰＡＦ遺伝子を含む形質転
換株を制限酵素マッピングにより検出し、ジデオキシ法
配列決定により構築物の配列を確認する。ＰＡＦ遺伝子
を含有するＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片をＥｃｏＲＩおよ
びＰｓｔＩによる消化およびポリアクリルアミドゲルか
らの溶出によりＲＦ ＤＮＡから単離する。これをＥｃ
ｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化のｐＣＪ−１に連結し、反応液で
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０７を形質転換する。ＰＡＦを生
成するコロニーをＴｅｔ平板に生育させアフィニティー
で精製した抗ＰＡＦ ＩｇＧで免疫スクリーニングして
選択する。

【００９１】例１１：Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質内発現 ＰＡＦの発現をＥ．ｃｏｌｉの細胞質内に留めるよう制
御するために次のような操作因子を用いた：プラスミド
ｐＣＪ−１上のｔａｃプロモーター；プラスミドｐＣＪ
−１上のｌａｃオペレーターおよびＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ
１０７株の染色体上のｌａｃレプレッサー（ｌａｃ
Ｉ^q ）；コンセンサスシャイン−ダルガーノ配列；高レ
ベルの翻訳を開始するための翻訳カプラーとして使用す
るＯｍｐ Ａリーダーペプチド断片。翻訳カプリング配
列はＯｍｐ Ａ遺伝子の翻訳開始領域をコードするＤＮ
Ａ、Ｏｍｐ Ａリーダーペプチドの最初の８アミノ酸、
上述のコンセンサスシャイン−ダルガーノ配列および翻
訳ターミネーターより成る。翻訳カプリング配列はｌａ
ｃオペレーターとＰＡＦ遺伝子の翻訳開始部位との間に
後者に重なって挿入する。（翻訳カプラーの特性はＥ．
ｃｏｌｉの分泌発現でアダプターと共に示したＤＮＡ配
列に組込まれている。） ＰＡＦ遺伝子はｐＣＪ−１プラスミドに以下のように翻
訳カプラーと共に取り込まれる。アダプター＃３および
Ｏｍｐ Ａ翻訳カプラーを例１０に記載するＭ１３ ｍ
ｐ１９構築物からのＰＡＦ ＡｖａＩ／ＰｓｔＩ断片に
結合する。この断片をポリアクリルアミドゲルから精製
する。次にこの断片をＭ１３ ｍｐ１９ＲＦのＥｃｏＲ
Ｉ／ＰｓｔＩ消化物に連結し、連結反応液を用いてＥ．
ｃｏｌｉ ＪＭ１０７細胞を形質転換する。ＰＡＦ遺伝
子融合物を含むプラークを制限酵素マッピングにより選
択する。ＰＡＦ遺伝子融合物を含むＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ
Ｉ断片をポリアクリルアミドゲルから溶出し、ｐＣＪ−
１のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化物と連結し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＪＭ１０７翻訳を反応液で形質転換する。テトラサ
イクリン耐性を示すコロニーを選択し、ＰＡＦ生産をア
フィニティー精製した抗ＰＡＦ ＩｇＧで免疫スクリー
ニングする。本発明の方法および生産物について多くの
修飾および変異があることは技術の熟練者には明白であ
る。従って、本発明はそれらが添付の請求の範囲および
それに同等なものの範囲内である限りそのような本発明
の修飾および変異を含む。

【００９２】例１２：Ｅ．ｃｏｌｉでの細胞質内発現 例１１に記載したＭ１３ ｍｐ１９分泌用構築物をＮｒ
ｕＩおよびＮｃｏＩで消化し、大きい断片をゲルから溶
出する。次にアダプター＃６をＮｒｕＩ／ＮｃｏＩ切断
ＤＮＡに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０７株を反応
液で形質転換する。ＰＡＦ遺伝子融合物を含有するプラ
ークをジデオキシ法配列決定により確認する。ＰＡＦ遺
伝子融合物を含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片をポリアク
リルアミドゲルより溶出してＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで消
化したｐＣＪ−１と連結し、反応液でＥ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０７細胞を形質転換する。テトラサイクリン耐性を
示すコロニーを選択し、ＰＡＦ生産をアフィニティー精
製した抗−ＰＡＦ ＩｇＧで免疫スクリーニングする。
アダプター＃６

【化３１】

【００９３】例１３：ｍＲＮＡの同定 以下の細胞株より全ＲＮＡを単離する：ＳＫ−ＨＥＰ−
１ヒト肝癌細胞、ヒト胎児肺（ＨＥＬ）細胞、ＲＰＭＩ
７２７２ヒト黒腫細胞および肉腫１８０細胞。次にＰ
ｏｌｙ ＡプラスマイナスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）をオリゴ（ＤＴ）セルロースクロマトグラフィー
を用いて単離する。上記各細胞からのＰｏｌｙ Ａプラ
スマイナスＲＮＡ１５μｇを１．２５パーセントアガロ
ース／ホルムアルデヒドゲルの電気誘導により分離す
る。これらのＲＮＡをゼタプローブメンブレンに移す。
ヒト肝癌細胞ＳＫ ＨＥＰ−１からのヒト塩基性ＦＧＦ
に対するｃＤＮＡプローブ（ＦＧＦ１５、ＥｃｏＲＩ挿
入）をニックトランスレーション法により比活性が８．
６４×１０⁸ ｃｐｍ／μｇとなるよう³²Ｐ−ＤＣＴＰで
標識する。³²Ｐ−ＢＦＧＦ ｃＤＮＡプローブのＲＮＡ
へのハイブリダイゼーションは５０パーセントホルムア
ミド、６×ＳＳＣ、２×デンハルト溶液、１パーセント
ＳＤＳ、０．０５パーセント ピロリン酸ナトリウムお
よび１７５μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ中で４２℃１６時間行
なう。ゼタープローブメンブレンを０．５×ＳＳＣ／１
パーセントＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ／１パーセントＳＤ
Ｓ、０．１×ＳＳＣ／１パーセントＳＤＳの各１リット
ルで６５℃１５分洗絛し、さらに０．１×ＳＳＣ／１パ
ーセントＳＤＳで７０℃１５分間洗う。次にメンブレン
を乾燥し、オートラジオグラフィーを−８０℃で１日お
よび３日間行なう。ＳＫＨＥＰ−１細胞、ＨＥＬ細胞お
よびＲＰＭＩ ７２７２細胞はそれぞれ大きさが８．０
ＫＢ、４．３ＫＢ、２．３ＫＢおよび１．０ＫＢの上記
ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズする４種のＲＮＡを
含有した。ｃＤＮＡプローブはマウス肉腫１８０細胞の
どのＲＮＡともハイブリダイズしなかった。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 35/50 ＡＢＳ Ａ６１Ｋ 35/50 ＡＢＳ 35/76 ＡＤＴ 35/76 ＡＤＴ 38/00 ＡＤＡ 37/02 ＡＤＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 リフキン，ダニエル ビー アメリカ合衆国 10021 ニューヨーク州, ニューヨーク，イー．シィクスティシィク スス ストリート 444 (72)発明者 ソマー アンドリース アメリカ合衆国 80301 コロラド州ボー ルダー，ピードラ コート 4145

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト胎盤組織（分娩後の）から単離でき
   る天然の血管形成誘導因子と実質的ホモロジーを示す精
   製したヒトまたは合成の一本鎖ポリペプチド蛋白質より
   なる血管形成誘導因子（ｂＦＧＦ）であって、該血管形
   成誘導因子が有糸分裂促進活性、化学走性活性、プロテ
   アーゼ合成促進能およびそれらの組合せより成るグルー
   プから選ばれた活性を示す少なくとも一つの活性部位を
   有し、かつ以下のアミノ酸配列 【化１】 を含有する血管形成誘導因子をコードするタンパク質コ
   ード配列を含むＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 タンパク質コード配列が、以下のアミノ
   酸配列をもとに調製したＤＮＡプローブでゲノムまたは
   ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより
   得ることができる請求項１のＤＮＡ配列。 【化２】
3. 【請求項３】 タンパク質コード配列が、 ヒト胎盤組織（分娩後の）から単離できる天然の血管形
   成誘導因子と実質的ホモロジーを示す精製したヒトまた
   は合成の一本鎖ポリペプチド蛋白質よりなる血管形成誘
   導因子（ｂＦＧＦ）であって、該血管形成誘導因子が有
   糸分裂促進活性、化学走性活性、プロテアーゼ合成促進
   能およびそれらの組合せより成るグループから選ばれた
   活性を示す少なくとも一つの活性部位を有し、かつ以下
   のアミノ酸配列 【化３】 を含有する血管形成誘導因子をコードし、同因子がヒト
   胎盤（分娩後の）から単離される、請求項１または２の
   いずれか一つのＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 タンパク質コード配列 【化４】 を包含する請求項１〜３のいずれか一つのＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 ヒト胎盤組織（分娩後の）から単離でき
   る天然の血管形成誘導因子と実質的ホモロジーを示す精
   製したヒトまたは合成の一本鎖ポリペプチド蛋白質より
   なる血管形成誘導因子（ｂＦＧＦ）であって、該血管形
   成誘導因子が有糸分裂促進活性、化学走性活性、プロテ
   アーゼ合成促進能およびそれらの組合せより成るグルー
   プから選ばれた活性を示す少なくとも一つの活性部位を
   有し、かつ以下のアミノ酸配列 【化５】 を含有する血管形成誘導因子をコードするＤＮＡ配列を
   含む組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項５のベクターで形質転換した宿主
   微生物。