JPS5871885A - 樹立されたヒト成長ホルモン産生細胞株 - Google Patents
樹立されたヒト成長ホルモン産生細胞株Info
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- JPS5871885A JPS5871885A JP57138442A JP13844282A JPS5871885A JP S5871885 A JPS5871885 A JP S5871885A JP 57138442 A JP57138442 A JP 57138442A JP 13844282 A JP13844282 A JP 13844282A JP S5871885 A JPS5871885 A JP S5871885A
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- Japan
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- growth hormone
- human growth
- serum
- cell line
- human
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
１０発明の背景
技術分野
本発明は樹立されたヒト成長ホルモン産生細胞株に関す
るものである。
るものである。
さらに詳しくは、本発明は人体から摘出したヒト下垂体
組織を特定の培地で培養し、得られた上皮性細胞群を免
疫能が低下した動物体内に移植し、該動物体内で増殖し
た移植細胞を摘出して再び特定の培地で培養することに
より得られる新規な樹立されたヒト成長ホルモン産生細
胞株に関するものである。
組織を特定の培地で培養し、得られた上皮性細胞群を免
疫能が低下した動物体内に移植し、該動物体内で増殖し
た移植細胞を摘出して再び特定の培地で培養することに
より得られる新規な樹立されたヒト成長ホルモン産生細
胞株に関するものである。
先行技術
従来、ヒト成長ホルモンは、ヒト屍体から摘出した下垂
体を溶媒で抽出処理することによって得られていた。し
かし、この方法では入手しうる下垂体の量に限シがある
ため、医療上必要とされるヒト成長ホルモンを十分供給
することができなかった。
体を溶媒で抽出処理することによって得られていた。し
かし、この方法では入手しうる下垂体の量に限シがある
ため、医療上必要とされるヒト成長ホルモンを十分供給
することができなかった。
そこで、ヒト成長ホルモンを大量に得る方法が種々研究
され、遺伝子操作技術を用いる方法が開発されつつある
が、現在までのところ、収量が低くコストも高いためま
だ実用化されていない。また、ヒト下垂体細胞を培養し
てヒト成長ホルモンを得る試みも多数なされぞいるがい
ずれの場合も該ホルモンの分泌能が培養早期に失われ、
該ホルモンを安定して産生する樹立された細胞株を得る
ことに成功した例は報告されていない。
され、遺伝子操作技術を用いる方法が開発されつつある
が、現在までのところ、収量が低くコストも高いためま
だ実用化されていない。また、ヒト下垂体細胞を培養し
てヒト成長ホルモンを得る試みも多数なされぞいるがい
ずれの場合も該ホルモンの分泌能が培養早期に失われ、
該ホルモンを安定して産生する樹立された細胞株を得る
ことに成功した例は報告されていない。
■９発明の目的
本発明の目的は、長期にわた多安定してヒト成長ホルモ
ンを産生ずる樹立されたヒト成長ホルモン細胞株を提供
することにある。
ンを産生ずる樹立されたヒト成長ホルモン細胞株を提供
することにある。
■１発明の詳細な説明
本発明は、下記各項にそれぞれ記載のヒト成長ホルモン
細胞株からなる。
細胞株からなる。
（１） ヒト下垂体組織由来の樹立されたヒト成長ホ
ルモン産生細胞株。
ルモン産生細胞株。
（２） 人体から摘出したヒト下垂体組織を蛋白分解
酵素溶液で分散し、得られた分散細胞、を血清およびハ
ムＦ−１０培地を含む培養液に加えて該細胞を培養し、
増殖した上皮性細胞群を免疫能の低下した動物体内に移
植し、該動物体内で増殖した移植細胞を摘出し、摘出し
た移植細胞を蛋自分解酵素溶液および上記の培養液を用
いて再び分散し培養することにより樹立された上記第１
項記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。
酵素溶液で分散し、得られた分散細胞、を血清およびハ
ムＦ−１０培地を含む培養液に加えて該細胞を培養し、
増殖した上皮性細胞群を免疫能の低下した動物体内に移
植し、該動物体内で増殖した移植細胞を摘出し、摘出し
た移植細胞を蛋自分解酵素溶液および上記の培養液を用
いて再び分散し培養することにより樹立された上記第１
項記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。
（３）培養液中の血清の比率が１′〜２５ノや一セント
（容量）である上記第２項記載のヒト成長ホルモン産生
細胞株。
（容量）である上記第２項記載のヒト成長ホルモン産生
細胞株。
（４）血清がウシ新生児血清、ウシ胎児血清およびウマ
血清の混合血清である上記第２項または第３項記載のヒ
ト成長ホルモン産生細胞株。
血清の混合血清である上記第２項または第３項記載のヒ
ト成長ホルモン産生細胞株。
（５） ウシ新生児血清、ウシ胎児血清およびウマ血
清の混合比（容量）が４：２：１である上記第４項記載
のヒト成長ホルモン産生細胞株。
清の混合比（容量）が４：２：１である上記第４項記載
のヒト成長ホルモン産生細胞株。
（６）培養液が抗生物質を含有する上記第２項記載のヒ
ト成長ホルモン産生細胞株。
ト成長ホルモン産生細胞株。
（７）培養液が次の組成を有する上記第６項記載のヒト
成長ホルモン産生細胞株。
成長ホルモン産生細胞株。
ハムＦ−１０８２５部（容量）
ウシ新生児血清 １００〃
ウシ胎児血清 ５０〃
ウマ血清 ２５〃
ペニシリン ５０ユニット／−ストレプ
トマイシン ５０μＰ／ｍＪ 。
トマイシン ５０μＰ／ｍＪ 。
（８） 蛋白分解酵素溶液が５０〜１２００プロテア
ーゼユニツト／−のデ４スＩ？−ゼ溶液である上記第２
項記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。
ーゼユニツト／−のデ４スＩ？−ゼ溶液である上記第２
項記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。
（９）蛋白分解酵素溶液が３００７’ロチアーゼユニッ
ト／−のナイスパーゼ溶液である゛上記第８項記載のヒ
ト成長ホルモン産生細胞株。
ト／−のナイスパーゼ溶液である゛上記第８項記載のヒ
ト成長ホルモン産生細胞株。
（ＩＱ 、免疫能の低下した動物がヌードマウスまたは
ヌードラ゛ットである上記第２項記載のヒト成長ホルモ
ン産生細胞株。
ヌードラ゛ットである上記第２項記載のヒト成長ホルモ
ン産生細胞株。
θつ 摘出した移植細胞の培養が該移植動物の肺臓抗体
および補体を用いた免疫学的選択培養である上記第２項
記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。
および補体を用いた免疫学的選択培養である上記第２項
記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。
αリ ヒト下垂体組織が末端肥大症患者から手術時に摘
出した下垂体腺腫組織である上記第１項ないし第１１項
のいずれかに記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。
出した下垂体腺腫組織である上記第１項ないし第１１項
のいずれかに記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。
α場 下記の特徴をもつ上記第１項ないし第１２項のい
ずれかに記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。
ずれかに記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。
ａ）血清およびハムＦ−１０培地を含む培養液中で継代
培養される； ｂ）上皮様の形態を有しているが、接着性が弱く、細胞
シートを形成する前に浮遊状態になる細胞が出現する； Ｃ）染色体数の分布は３９にモードをもつ低倍数体であ
る； ｄ）上記培養液にインシュリンを添加することによ多細
胞増殖が促進される； ｅ）上記培養液中での培養ではヒト成長ホルモンを産生
ぜず、刺激剤としてインシュリン、ハイドロコーチシン
、ヒト視床下部正中隆起抽出物（ｒｎｅｄｉａ ｅｍｉ
ｎｅｎｃｅ ｅｘｔｒａｃｔ （ＭＥＥ） ）またはカ
ルシウムイオノフオアを該培養液中に添加するとヒト成
長ホルモンを産生ずる；ｆ）ヌードマウス皮下に移植す
ると腫瘤を形成し、ヌードマウス血清中に約１０〜２０
ｎｔ／ｌｄのヒト成長ホルモンを放出する。
培養される； ｂ）上皮様の形態を有しているが、接着性が弱く、細胞
シートを形成する前に浮遊状態になる細胞が出現する； Ｃ）染色体数の分布は３９にモードをもつ低倍数体であ
る； ｄ）上記培養液にインシュリンを添加することによ多細
胞増殖が促進される； ｅ）上記培養液中での培養ではヒト成長ホルモンを産生
ぜず、刺激剤としてインシュリン、ハイドロコーチシン
、ヒト視床下部正中隆起抽出物（ｒｎｅｄｉａ ｅｍｉ
ｎｅｎｃｅ ｅｘｔｒａｃｔ （ＭＥＥ） ）またはカ
ルシウムイオノフオアを該培養液中に添加するとヒト成
長ホルモンを産生ずる；ｆ）ヌードマウス皮下に移植す
ると腫瘤を形成し、ヌードマウス血清中に約１０〜２０
ｎｔ／ｌｄのヒト成長ホルモンを放出する。
本発明のヒト成長ホルモン産生細胞を得るには、先ず、
人体から摘、出したヒト下垂体組織を必要に応じて細切
して蛋白分解酵素溶液に入れ、同溶液中に下垂体組繊細
胞を分散させる。
人体から摘、出したヒト下垂体組織を必要に応じて細切
して蛋白分解酵素溶液に入れ、同溶液中に下垂体組繊細
胞を分散させる。
ヒト下垂体組織としては、巨人症または末端肥大症等の
下垂体腺腫患者から手術時に摘出したもの、流産死し庭
ヒト胎児又はヒト屍体から摘出したものであシ活性を有
するものが用いられる。
下垂体腺腫患者から手術時に摘出したもの、流産死し庭
ヒト胎児又はヒト屍体から摘出したものであシ活性を有
するものが用いられる。
細胞の分散剤として使用される蛋白分解酵素の例として
はディス４−ゼ等が挙げられる。該酵素溶液の濃度は、
５０〜１２００ゾロテアーゼユニツト／−１好適には約
３００グロテアーゼユニット／−である。
はディス４−ゼ等が挙げられる。該酵素溶液の濃度は、
５０〜１２００ゾロテアーゼユニツト／−１好適には約
３００グロテアーゼユニット／−である。
かくして得られた分散細胞を血清およびノ・ムＦ−゛１
０培地を含む培養液に加えて該細胞を培養する。
０培地を含む培養液に加えて該細胞を培養する。
培地としてはこのほかノ１ムＦ−１２、ＤＭ１６０、Ｒ
ＰＭＩ １６４０等も使用可能ではあるが、ノ１ムＦ−
１０が最も好ましい。
ＰＭＩ １６４０等も使用可能ではあるが、ノ１ムＦ−
１０が最も好ましい。
本工程で使用される培養液は血清およびノ・ムＦ−１０
培地を含み、文献未載の新規な培地である。
培地を含み、文献未載の新規な培地である。
培養液中の血清の比率は特に限定はないがｌ〜２５パー
セント（容量）が好適である。血清としては、ウシ新生
児血清、ウシ胎児血清およびウマ血清等が用いられ、特
にこれらの混合血清が望ましい。混合比はウシ新生児血
清：ウシ胎児血清：ウマ血清＝４：２：１が好ましい。
セント（容量）が好適である。血清としては、ウシ新生
児血清、ウシ胎児血清およびウマ血清等が用いられ、特
にこれらの混合血清が望ましい。混合比はウシ新生児血
清：ウシ胎児血清：ウマ血清＝４：２：１が好ましい。
培養液は血清およびハムＦ−１０培地のほか、ペニシリ
ンおよびストレプトマイシンのような抗生物質を含有す
るのが望ましい。
ンおよびストレプトマイシンのような抗生物質を含有す
るのが望ましい。
本発明にいうハムＦ−１０培地の組成は次の通りである
。
。
ハムＦ−１０培地組成（ｒｖ／１０００−）ＮａＣ１７
４００ ＫＣ１２８５ ＣａＣ４２−２Ｈ２０４４ Ｎｇｓｏ４−７Ｈ２ｏ １５３Ｎａ２Ｈ
ＰＯ４−７Ｈ２０２９０ ＫＨ２ＰＯ４８３ Ｎ ａＩ（ＣＯｓ １２００Ｆ ｅ
Ｓ Ｏ４０−８３４ Ｃｕ Ｓ Ｏ４０−００２５ ｚｎＳＯ４０，０２８８ グルコース １１００ Ｌ−アラニン ８９ Ｌ−アルギニン塩酸 ２１１ Ｌ−アスノぐラーギンーＨ２０１５，ＯＬ−アスノぐラ
ギン酸 １３，３Ｌ−システィン塩酸
３１．５Ｌ−グルタミン酸 １４．７Ｌ
−グルタミン １４６．２グリシン
７・５ Ｌ−ヒスチジン ２１．ＯＬ−インロイシ
ン ２．６Ｌ−ロイシン
１３．ＩＬ−リジン塩酸 ２９．３Ｌ−
メチオニン ４．４８Ｌ−フェニルアラ
ニン ４．９６Ｌ−プロリン
１１．５Ｌ−セリン １０・５ Ｌ−スレオニン ３．５７Ｌ−トリプト
ファン ０．６０Ｌ−チロシン
１．８１Ｌ−バリン ３．５ ビオチン ０．０２４／？ントテ
ン酸カルシウム ０．７１５コリン塩酸
０．６９８葉酸 １．３２ ヒポキサンチン ４．０８ミオイノシト
ール ０．５４１ナイアシンアミド
０．６１５ピリドキシン塩酸 ０
．２０６リデフラビン ０．３７６チ
アミン塩酸 １．０１２チミジン
０．７２７ビタミンＢ、２１．３６ リポ酸 ０．２ ピルビン酸ソーグ １１０ フエノールレツド １．２本工程の培養は
、上記培養液を使用する以外は、通常の組織培養と同様
にして行なわれる。即ち、好気的条件下、ＰＨ約７．０
〜７．５、好適にはｐＨ７，３〜７．４、温度３７″Ｃ
，で培養する。空気９５〜９７％、ＣＯ２３〜５％の環
境で培養するのが最もｉましい。
４００ ＫＣ１２８５ ＣａＣ４２−２Ｈ２０４４ Ｎｇｓｏ４−７Ｈ２ｏ １５３Ｎａ２Ｈ
ＰＯ４−７Ｈ２０２９０ ＫＨ２ＰＯ４８３ Ｎ ａＩ（ＣＯｓ １２００Ｆ ｅ
Ｓ Ｏ４０−８３４ Ｃｕ Ｓ Ｏ４０−００２５ ｚｎＳＯ４０，０２８８ グルコース １１００ Ｌ−アラニン ８９ Ｌ−アルギニン塩酸 ２１１ Ｌ−アスノぐラーギンーＨ２０１５，ＯＬ−アスノぐラ
ギン酸 １３，３Ｌ−システィン塩酸
３１．５Ｌ−グルタミン酸 １４．７Ｌ
−グルタミン １４６．２グリシン
７・５ Ｌ−ヒスチジン ２１．ＯＬ−インロイシ
ン ２．６Ｌ−ロイシン
１３．ＩＬ−リジン塩酸 ２９．３Ｌ−
メチオニン ４．４８Ｌ−フェニルアラ
ニン ４．９６Ｌ−プロリン
１１．５Ｌ−セリン １０・５ Ｌ−スレオニン ３．５７Ｌ−トリプト
ファン ０．６０Ｌ−チロシン
１．８１Ｌ−バリン ３．５ ビオチン ０．０２４／？ントテ
ン酸カルシウム ０．７１５コリン塩酸
０．６９８葉酸 １．３２ ヒポキサンチン ４．０８ミオイノシト
ール ０．５４１ナイアシンアミド
０．６１５ピリドキシン塩酸 ０
．２０６リデフラビン ０．３７６チ
アミン塩酸 １．０１２チミジン
０．７２７ビタミンＢ、２１．３６ リポ酸 ０．２ ピルビン酸ソーグ １１０ フエノールレツド １．２本工程の培養は
、上記培養液を使用する以外は、通常の組織培養と同様
にして行なわれる。即ち、好気的条件下、ＰＨ約７．０
〜７．５、好適にはｐＨ７，３〜７．４、温度３７″Ｃ
，で培養する。空気９５〜９７％、ＣＯ２３〜５％の環
境で培養するのが最もｉましい。
本工程の培養によシ、上皮性細胞と線維芽細胞がそれぞ
れを層をなして増殖するので、ホルモン産生細胞であ名
上皮性細胞を分離し、免疫能を低下せしめた動物体内に
移植し、該動物体内で増殖させる。移植の際に、線維芽
細胞が混入していても１．この細胞は移植動物体内で増
殖せず死滅するので特に障害とはならない。免疫能を低
下せしめた動物の例としては、ヌードマウスまたはヌー
ドラットがあげられる。移植は通常背部皮下または腹腔
内に行なわれる。増殖した細胞をさらに新しい動物に移
植継代することもできる。かくして得られた増殖細胞を
摘出し、蛋白分解酵素溶液および前述した培養液を用い
て再び分散し培養し、樹立したヒト下垂体組織由来細胞
を得る。
れを層をなして増殖するので、ホルモン産生細胞であ名
上皮性細胞を分離し、免疫能を低下せしめた動物体内に
移植し、該動物体内で増殖させる。移植の際に、線維芽
細胞が混入していても１．この細胞は移植動物体内で増
殖せず死滅するので特に障害とはならない。免疫能を低
下せしめた動物の例としては、ヌードマウスまたはヌー
ドラットがあげられる。移植は通常背部皮下または腹腔
内に行なわれる。増殖した細胞をさらに新しい動物に移
植継代することもできる。かくして得られた増殖細胞を
摘出し、蛋白分解酵素溶液および前述した培養液を用い
て再び分散し培養し、樹立したヒト下垂体組織由来細胞
を得る。
樹立した細胞に移植動物由来の細胞が混入している場合
には、該移植動物の肺臓抗体と補体を用いた免疫学的選
択培養によりその細胞を除く。例えばウサギを用いて調
製した抗牌臓血清と補体を細胞培養中の培養液に加え、
数時間培養し、その後常法に従って継代する。移植動物
由来の細胞は、抗血清中の抗体および補体によって破壊
され、ヒト由来細胞のみが増殖する。
には、該移植動物の肺臓抗体と補体を用いた免疫学的選
択培養によりその細胞を除く。例えばウサギを用いて調
製した抗牌臓血清と補体を細胞培養中の培養液に加え、
数時間培養し、その後常法に従って継代する。移植動物
由来の細胞は、抗血清中の抗体および補体によって破壊
され、ヒト由来細胞のみが増殖する。
かくして得られた樹立ヒト成長ホルモン産生細胞株は下
記の特徴を有する。
記の特徴を有する。
ａ）血清およびハムＦ−１０培地を含む培養液中で継代
培養される； ｂ）上皮様の形態を有しているが、接着性が弱く、細胞
シートを形成する前に浮遊状態になる細胞が出現する； Ｃ）第１図に示すように、染色体分布は、３９にモード
をもつ低倍数体である； ｄ）前記培養液中へ、０．０１〜１００μＰ／ｄのイン
シュリンを添加することによって細胞増殖が促進され、
その効果は、１０μに−の添加量で最大となる。
培養される； ｂ）上皮様の形態を有しているが、接着性が弱く、細胞
シートを形成する前に浮遊状態になる細胞が出現する； Ｃ）第１図に示すように、染色体分布は、３９にモード
をもつ低倍数体である； ｄ）前記培養液中へ、０．０１〜１００μＰ／ｄのイン
シュリンを添加することによって細胞増殖が促進され、
その効果は、１０μに−の添加量で最大となる。
ｅ）前記培養液中での培養ではヒト成長ホルモンを産生
せず、刺激剤としてインシュリン（第２図）、ハイドロ
コーチシン（第３図）およびヒト視床下部正中隆起抽出
物（第４図）を該培養液中に添加するとヒト成長ホルモ
ンを産生ずる。
せず、刺激剤としてインシュリン（第２図）、ハイドロ
コーチシン（第３図）およびヒト視床下部正中隆起抽出
物（第４図）を該培養液中に添加するとヒト成長ホルモ
ンを産生ずる。
ｆ）ヌードマウス皮下に移植すると腫瘤を形成し、ヌー
ドマウス血清中に約１０〜２０ ｎ％／ｍｇのヒト成長
ホルモンを放出する。
ドマウス血清中に約１０〜２０ ｎ％／ｍｇのヒト成長
ホルモンを放出する。
ｇ）凍結保存は、１３チジメチルスルホキサイド添加培
養液を用い、液体窒素中で行う。
養液を用い、液体窒素中で行う。
カくシて得られた樹立ヒト成長ホルモン産生細胞株を前
記刺激剤を添加した前記培養液中で培養することによシ
ヒト成長ホルモンを産生させることができ、該ホルモン
それ自体公知の方法によって培養液中から採取される。
記刺激剤を添加した前記培養液中で培養することによシ
ヒト成長ホルモンを産生させることができ、該ホルモン
それ自体公知の方法によって培養液中から採取される。
次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。
実施例
末端肥大症患者から手術時に摘出した下垂体腺腫組織を
すみやかに抗生物質添加のハンクス塩類溶液で洗浄し、
カミソリの刃を使ってこまかく切りきざむ。その細切片
を第１表に示す組成の培養液に３００ｆロチアーゼユニ
ット／−のディスノ＜？−ゼ（合同酒精社製）を加えた
酵素液に入れ、３７℃で３０分間インキュベートしたあ
と軽くピペッティングをして細胞分散を行う。得られた
細胞は遠心分離後、上記の培養液に再浮遊させ、６０％
シャーレ（テルモ株式会社製）に植え込み初代培養を行
う。植え込んだ細胞が分裂増殖を始め上皮性細胞と線維
芽細胞が混在した細胞シートを形成したところで、０．
２５％トリプシン溶液を浸み込１せた滅菌ｒ紙片を使っ
て上皮性細胞のみをつシ上げて、分離培養をする。継代
培養後、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ−ｎｕ／ＪＣＬ
■日本クレア社日本２丁７ 移植直前の下垂体腺腫由来上皮性細胞の，培養上清中の
ヒト成長ホルモン分泌量は２４時間で１ｍｌあたり８０
０から２４００ｎ％であった。移植後１ケ月でヌードマ
ウス皮下に腫瘤が形成され、移植継代可能な細胞系が得
られる。この時のヌードマウス血清中にヒト成長ホルモ
ンが１−あたシ１０〜２０ｎｆ！ー測定された。腫瘤を
摘出し、上記の初代培養法と同様の手順で酵素処理を行
い、再び培養系へ戻す。この腫瘤の中にはヒト下垂体腺
腫由来細胞だけでなく、血管内皮細胞、血球、間質細胞
などヌードマウス由来細胞が混在した状態になっている
ため、免疫学的選択培養を行いヒト下垂体腺腫由来細胞
を分離する。免疫学的選択培養は家兎からとった抗ヌー
ドマウス牌臓抗体と補体を用いて、ヌードマウス由来細
胞を選択的に破壊することによって行う。分離した細胞
をクローニングし、ＪＨ８Ａ − ２株を樹立した。
すみやかに抗生物質添加のハンクス塩類溶液で洗浄し、
カミソリの刃を使ってこまかく切りきざむ。その細切片
を第１表に示す組成の培養液に３００ｆロチアーゼユニ
ット／−のディスノ＜？−ゼ（合同酒精社製）を加えた
酵素液に入れ、３７℃で３０分間インキュベートしたあ
と軽くピペッティングをして細胞分散を行う。得られた
細胞は遠心分離後、上記の培養液に再浮遊させ、６０％
シャーレ（テルモ株式会社製）に植え込み初代培養を行
う。植え込んだ細胞が分裂増殖を始め上皮性細胞と線維
芽細胞が混在した細胞シートを形成したところで、０．
２５％トリプシン溶液を浸み込１せた滅菌ｒ紙片を使っ
て上皮性細胞のみをつシ上げて、分離培養をする。継代
培養後、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ−ｎｕ／ＪＣＬ
■日本クレア社日本２丁７ 移植直前の下垂体腺腫由来上皮性細胞の，培養上清中の
ヒト成長ホルモン分泌量は２４時間で１ｍｌあたり８０
０から２４００ｎ％であった。移植後１ケ月でヌードマ
ウス皮下に腫瘤が形成され、移植継代可能な細胞系が得
られる。この時のヌードマウス血清中にヒト成長ホルモ
ンが１−あたシ１０〜２０ｎｆ！ー測定された。腫瘤を
摘出し、上記の初代培養法と同様の手順で酵素処理を行
い、再び培養系へ戻す。この腫瘤の中にはヒト下垂体腺
腫由来細胞だけでなく、血管内皮細胞、血球、間質細胞
などヌードマウス由来細胞が混在した状態になっている
ため、免疫学的選択培養を行いヒト下垂体腺腫由来細胞
を分離する。免疫学的選択培養は家兎からとった抗ヌー
ドマウス牌臓抗体と補体を用いて、ヌードマウス由来細
胞を選択的に破壊することによって行う。分離した細胞
をクローニングし、ＪＨ８Ａ − ２株を樹立した。
ＪＨ８Ａ − ２株は上皮様の形態を持っているが、接
着性が弱く細胞シートを形成する前に浮遊状態になる細
胞が出現する。細胞分裂の倍化時間は約３５時間であり
、培養液中へのインシュリンの添加によって増殖促進の
効果がある。０．０１μＶ−から１００μが−の濃度の
インシュリンを添加した場合にはいずれの濃度でも増殖
の促進がみられ、１０μｆ％／−で最も大きな効果があ
る。染色体数の分布は、３９にモードを持つ低倍数体で
、約９０１の細胞が３４から４１の範囲に分布する。次
にホルモン分泌能の面では、この細胞株は上記の培養液
中では２０時間培養で培養上清１−あた、９Ｉｎ７以下
とヒト成長ホルモンを分泌せずまた細胞内コンテントも
測定されない。ところが培養液中にヒト視床下部正中隆
起抽出物を加えると同じ条件下で５０ Ｏｎ５Ｌ以上と
いう著しいヒト成長ホルモンの分泌が見られる。この様
なＪＨ８Ａ −２株に対するヒト成長ホルモン分泌促進
効果はヒト視床下部正中隆起抽出物の他にもインシュリ
ン、ハイドロコーチシン、カルシウムイオノフオアによ
っても引きおこされる。インシュリンにおいては培養液
中に１０μｍ７ろ艷を添加することにょシ上記条件（２
０時間培養、培養上清１−当シ）で約３００ ｎｆ、ハ
イドロコーチシンにおいては培養液中に１００ ｎＭを
添加することによシ上記条件でそれぞれ約２００ｎｉ、
約５０ｏｆＩｇ−、カルシウムイオノフオアにおいては
培養液中に１μ５１’−／ｌｄを添加することにより１
時間培養で培養上清１−あたシ約５００ｎｊｉＬのヒト
成長ホルモンが測定される。ヒト成長ホルモン以外の下
垂体性ホルモンである甲状腺刺激ホルモン、黄体化ホル
モン、卵胞刺激ホルモン、副腎ｆｆｌ質刺激ホルモン、
プロラクチンについては培養液中にヒト視床下部正中隆
起抽出物１μｍ／−添加時の２０時間培養の培養上清中
にはいずれのホルモンも分泌が認められない。
着性が弱く細胞シートを形成する前に浮遊状態になる細
胞が出現する。細胞分裂の倍化時間は約３５時間であり
、培養液中へのインシュリンの添加によって増殖促進の
効果がある。０．０１μＶ−から１００μが−の濃度の
インシュリンを添加した場合にはいずれの濃度でも増殖
の促進がみられ、１０μｆ％／−で最も大きな効果があ
る。染色体数の分布は、３９にモードを持つ低倍数体で
、約９０１の細胞が３４から４１の範囲に分布する。次
にホルモン分泌能の面では、この細胞株は上記の培養液
中では２０時間培養で培養上清１−あた、９Ｉｎ７以下
とヒト成長ホルモンを分泌せずまた細胞内コンテントも
測定されない。ところが培養液中にヒト視床下部正中隆
起抽出物を加えると同じ条件下で５０ Ｏｎ５Ｌ以上と
いう著しいヒト成長ホルモンの分泌が見られる。この様
なＪＨ８Ａ −２株に対するヒト成長ホルモン分泌促進
効果はヒト視床下部正中隆起抽出物の他にもインシュリ
ン、ハイドロコーチシン、カルシウムイオノフオアによ
っても引きおこされる。インシュリンにおいては培養液
中に１０μｍ７ろ艷を添加することにょシ上記条件（２
０時間培養、培養上清１−当シ）で約３００ ｎｆ、ハ
イドロコーチシンにおいては培養液中に１００ ｎＭを
添加することによシ上記条件でそれぞれ約２００ｎｉ、
約５０ｏｆＩｇ−、カルシウムイオノフオアにおいては
培養液中に１μ５１’−／ｌｄを添加することにより１
時間培養で培養上清１−あたシ約５００ｎｊｉＬのヒト
成長ホルモンが測定される。ヒト成長ホルモン以外の下
垂体性ホルモンである甲状腺刺激ホルモン、黄体化ホル
モン、卵胞刺激ホルモン、副腎ｆｆｌ質刺激ホルモン、
プロラクチンについては培養液中にヒト視床下部正中隆
起抽出物１μｍ／−添加時の２０時間培養の培養上清中
にはいずれのホルモンも分泌が認められない。
第１表
培養液組成（ＩＡ中）
ハムＦ−１０８２５ｄ
□
ウシ新生児血清 １００−
ウシ胎児血清 ５０艷
ウマ血清 ２５ｄ
ペニシリン ５０ユニット／−ストレノ
トマイシン ５０μ？廁■１発明の作用効果 本発明によれば、上述した如く、ヒト下垂体組織由来の
樹立されたヒト成長ホルモン産生細胞株が提供され、こ
の細胞株は特に、下記の特徴を有する。
トマイシン ５０μ？廁■１発明の作用効果 本発明によれば、上述した如く、ヒト下垂体組織由来の
樹立されたヒト成長ホルモン産生細胞株が提供され、こ
の細胞株は特に、下記の特徴を有する。
＆）血清およびノ・ムＦ−１０培地を含む培養液中で継
代培養される； ｂ）上皮様の形態を有しているが、接着性が弱く、細胞
シートを形成する前に浮遊状態になる細胞が出現する； Ｃ）染色体数の分布は３９にモードをもつ低倍数体であ
る； ｄ）上記培養液にインシュリンを添加することにより細
胞増殖が促進される； ｅ）上記培養液中での培養ではヒト成長ホルモンを産生
ぜず、刺激剤としてインシュリン、・・イドロコーチゾ
ン、ヒト視床下部正中隆起抽出物またはカルシウムイオ
ノフオアを該培養液中に添加するとヒト成長ホルモンを
産生ずる。
代培養される； ｂ）上皮様の形態を有しているが、接着性が弱く、細胞
シートを形成する前に浮遊状態になる細胞が出現する； Ｃ）染色体数の分布は３９にモードをもつ低倍数体であ
る； ｄ）上記培養液にインシュリンを添加することにより細
胞増殖が促進される； ｅ）上記培養液中での培養ではヒト成長ホルモンを産生
ぜず、刺激剤としてインシュリン、・・イドロコーチゾ
ン、ヒト視床下部正中隆起抽出物またはカルシウムイオ
ノフオアを該培養液中に添加するとヒト成長ホルモンを
産生ずる。
ｆ）ヌードマウス皮下に移植すると腫瘤を形成し、ヌー
ドマウス血清中に約１０〜２０ｎｐ／ｄのヒト成長ホル
モンを放出する。
ドマウス血清中に約１０〜２０ｎｐ／ｄのヒト成長ホル
モンを放出する。
本発明のヒト成長ホルモン産生細胞株は、長期に亘る安
定したヒト成長ホルモン産生能を維持している。従って
この細胞株を培養することに↓シヒト成長ホルモンを安
価にかつ大量に得ることができ、上記ホルモンを必要と
する患者に十分な量を供給することができる。また、本
発明の細胞株は、ヒト由来の細胞であるからヒト成長ホ
ルモン製剤中に異種蛋白質等の混入がなく、精製が容易
であり、安全に人体に投与することができる。さらに、
本発明の細胞株は、ヌードマウス皮下において安定した
゛ヒト成長ホルモン産生能ヲモツコトから、人工下垂体
として人体に該細胞株を移植して治療に用いることがで
きる可能性もある。
定したヒト成長ホルモン産生能を維持している。従って
この細胞株を培養することに↓シヒト成長ホルモンを安
価にかつ大量に得ることができ、上記ホルモンを必要と
する患者に十分な量を供給することができる。また、本
発明の細胞株は、ヒト由来の細胞であるからヒト成長ホ
ルモン製剤中に異種蛋白質等の混入がなく、精製が容易
であり、安全に人体に投与することができる。さらに、
本発明の細胞株は、ヌードマウス皮下において安定した
゛ヒト成長ホルモン産生能ヲモツコトから、人工下垂体
として人体に該細胞株を移植して治療に用いることがで
きる可能性もある。
第１図は、ＪＨ８Ａ−２株の染色体数の分布を示し、第
２図ないし第４図は、ＪＨ８Ａ−２株の培養液中に、そ
れぞれインシュリン、ハイドロコーチシンまたはヒト視
床下部正中隆起抽出物（ＭＥＥ）を添加したときのヒト
成長ホルモン（ＧＨ）産生量を示す。 第１図 う岬デ 色 イ本、４１ζ。 第２図 ｒｇ／ｍｌ ＧＨ Ｉｎｓｕｉｉｎ ）ｕｇ／ｍｌ 第３図 ｎｇ／ｍｌ ＧＨ Ｈ７ｄｒＯＣＯｒｔｌＳＯｎｅ ｎＭ 第４因 ｎｇ／ｍｔ ａＨ ＭＥＥ ）ｉｇ／ｍｌ ４０１
２図ないし第４図は、ＪＨ８Ａ−２株の培養液中に、そ
れぞれインシュリン、ハイドロコーチシンまたはヒト視
床下部正中隆起抽出物（ＭＥＥ）を添加したときのヒト
成長ホルモン（ＧＨ）産生量を示す。 第１図 う岬デ 色 イ本、４１ζ。 第２図 ｒｇ／ｍｌ ＧＨ Ｉｎｓｕｉｉｎ ）ｕｇ／ｍｌ 第３図 ｎｇ／ｍｌ ＧＨ Ｈ７ｄｒＯＣＯｒｔｌＳＯｎｅ ｎＭ 第４因 ｎｇ／ｍｔ ａＨ ＭＥＥ ）ｉｇ／ｍｌ ４０１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） ヒト下垂体組織由来の樹立されたヒト成長ホ
ルモン産生細胞株。 （２）人体から摘出したヒト下垂体組織を蛋白分解酵素
溶液で分散し、得られた分散細胞を血清およびハムＦ−
１０培地を含む培養液に加えて該細胞を培養し、増殖し
た上皮性細胞群を免疫能の低下した動物体内に移殖し、
該動物体内で増殖した移植細胞を摘出し、摘出した移植
細胞を蛋白分解酵素溶液および上記の培養液を用いて再
び分散し培養することにより樹立された特許請求の範囲
第１項記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。 （３）培養液中の血清の比率が１〜２５ノぐ−セント（
容量）である特許請求の範囲第２項記載のヒト成長ホル
モン産生細胞株。 （４） 血清がウシ新生児血清、ウシ胎児血清およ□
びウマ血清の混合血清である特許請求の範囲第２項また
は第３項記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。 （５） ウシ新生児血清、ウシ胎児血清およびウマ血
清の混合比（容量）が４：２：１である特許請求の範囲
第４項記載のヒト成長ホルモン産生細胞株＝ （６）、培養液が抗生物質を含有する特許請求の範囲第
２項記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。 （７）培養液が次の組成を有する特許請求の範囲第６項
記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。 ハムＦ−１０８２５部（容量） ウシ新生児血清 １００〃 ウシ胎児血清 ５０〃 ウマ血清 ２５〃 （ニジリン ５０ ユニット／１ｎ
ｌストレツトマイシン ５０ μり／−（８）
蛋白分解酵素溶液が５０〜１２００プロテアーゼユニ
ツト／−のディスパーゼ溶液である特許請求の範囲第２
項記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。 （９）蛋白分解酵素溶液が３００プロテアーゼユニツト
／７のディスパーゼ溶液である特許請求の範囲第８項記
載のヒト成長ホルモン産生細胞株。 はヌードラットである特許請求の範囲第２項記載のヒト
成長ホルモン産生細胞株。 （１１） 摘出した移植細胞の培養が該移植動物の膵
臓抗体および補体を用いた免疫学的選択培養である特許
請求の範囲第２項記載のヒト成長ホルモン産生細胞株。 ０リ ヒト下垂体組織が末端肥大症患者から手術時に摘
出した下垂体腺腫組織である特許請求の範囲第１項ない
し第１１項のいずれかに記載のヒト成長ホルモン産生細
胞株。 ０３ 下記の特徴をもつ特許請求の範囲第１項ないし
第１２項のいずれかに記載のヒト成長ホルモン産生細胞
株。 ａ）血清およびハムＦ−１０培地を含む培養液中で継大
培養される； ｂ）上皮様の形態を有しているが、接着性が弱く、細胞
シートを形成する前に浮遊状態になる細胞が出現する； Ｃ）染色体数の分布は３９にモードをもつ低倍数体であ
る； ｄ）上記培養液にインシュリンを添加することによシ細
胞増殖が促進される； ｅ）上記培養液中での培養ではヒト成長ホルモンを産生
ぜず、刺激剤としてインシュリン、ハイドロコーチシン
、ヒト視床下部正中隆起抽出物またはカルシウムイオノ
フオアを該培養液中に添加するとヒト成長ホルモンを産
生ずる一′ ｆ）ヌードマウス皮下に移植すると腫瘤を形成し、ヌー
ドマウス血清中に約１０〜２０ｎｆ／ｄのヒト成長ホル
モンを放出する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57138442A JPS5871885A (ja) | 1982-08-11 | 1982-08-11 | 樹立されたヒト成長ホルモン産生細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57138442A JPS5871885A (ja) | 1982-08-11 | 1982-08-11 | 樹立されたヒト成長ホルモン産生細胞株 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56168723A Division JPS5869818A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | ヒト下垂体ホルモン産生細胞株の樹立方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5871885A true JPS5871885A (ja) | 1983-04-28 |
| JPH0353910B2 JPH0353910B2 (ja) | 1991-08-16 |
Family
ID=15222085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57138442A Granted JPS5871885A (ja) | 1982-08-11 | 1982-08-11 | 樹立されたヒト成長ホルモン産生細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5871885A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63258593A (ja) * | 1987-04-16 | 1988-10-26 | Kowa Co | 抗血液凝固物質の製造法 |
| EP0911389A3 (en) * | 1997-08-29 | 2002-10-23 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Epithelial cell cultures for in vitro testing |
| JP2018038401A (ja) * | 2011-10-31 | 2018-03-15 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 幹細胞の培養方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS49100285A (ja) * | 1972-11-09 | 1974-09-21 | ||
| JPS54140789A (en) * | 1978-04-22 | 1979-11-01 | Jitsuken Doubutsu Chuo Kenkiyu | Culturing of colony stimulating factor producing tumor cell |
-
1982
- 1982-08-11 JP JP57138442A patent/JPS5871885A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS49100285A (ja) * | 1972-11-09 | 1974-09-21 | ||
| JPS54140789A (en) * | 1978-04-22 | 1979-11-01 | Jitsuken Doubutsu Chuo Kenkiyu | Culturing of colony stimulating factor producing tumor cell |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63258593A (ja) * | 1987-04-16 | 1988-10-26 | Kowa Co | 抗血液凝固物質の製造法 |
| EP0911389A3 (en) * | 1997-08-29 | 2002-10-23 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Epithelial cell cultures for in vitro testing |
| JP2018038401A (ja) * | 2011-10-31 | 2018-03-15 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 幹細胞の培養方法 |
| US10808224B2 (en) | 2011-10-31 | 2020-10-20 | Riken | Method for culturing stem cell |
| US11834672B2 (en) | 2011-10-31 | 2023-12-05 | Riken | Method for producing hypophysis precursor tissue |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0353910B2 (ja) | 1991-08-16 |
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