JPH0322977A - ＭｗｏＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 - Google Patents
ＭｗｏＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法Info
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- JPH0322977A JPH0322977A JP2062454A JP6245490A JPH0322977A JP H0322977 A JPH0322977 A JP H0322977A JP 2062454 A JP2062454 A JP 2062454A JP 6245490 A JP6245490 A JP 6245490A JP H0322977 A JPH0322977 A JP H0322977A
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- mwo
- dna
- restriction endonuclease
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、Ｍｖｏｌ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メ
チラーゼ用のクローン並びにこのクローンからのこれら
酵素の製造に関する。
チラーゼ用のクローン並びにこのクローンからのこれら
酵素の製造に関する。
制限エンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在する種類
の酵素である。混在する他の細菌成分から精製して取り
出された制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を正確
な断片に分断するための実験に使用することができる。
の酵素である。混在する他の細菌成分から精製して取り
出された制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を正確
な断片に分断するための実験に使用することができる。
この性質によってＤ Ｎ Ａ分子を単一のものとして同
定し、その構或遺伝子に分画することができる。制限エ
ンドヌクレアーゼは近年の遺伝子研究に不可欠な手段で
あることが立証されている。この酵素は遺伝子工学や分
析の実施に使用する生化学的な「はさみ」である。
定し、その構或遺伝子に分画することができる。制限エ
ンドヌクレアーゼは近年の遺伝子研究に不可欠な手段で
あることが立証されている。この酵素は遺伝子工学や分
析の実施に使用する生化学的な「はさみ」である。
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿った特定の
ヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、これに結
合することにより作用する。一旦結合すると、その配列
の内部で、又はその配列の一方の側で分子を切断する。
ヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、これに結
合することにより作用する。一旦結合すると、その配列
の内部で、又はその配列の一方の側で分子を切断する。
異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列に対す
る親和性を有している。これまでに検討された数百もの
細菌種の中で １００個以上の異なる制限エンドヌクレ
アーゼが同定されている。
る親和性を有している。これまでに検討された数百もの
細菌種の中で １００個以上の異なる制限エンドヌクレ
アーゼが同定されている。
細菌は種当たり多くてもほんの少数の制限エンドヌクレ
アーゼしか持っていない傾向にある。エンドヌクレアー
ゼは、その酵素が由来する細菌に従って命名されるのが
一般的である。従って、ｈａｍｏｐｂｉｌｗｓ ＊ｅｌ
７ｐ目−１は例えば３つの異なる制限エンドヌクレアー
ゼを合成するが、これらはＨｏｅ Ｉ ， Ｈｔ＊Ｉ
Ｉ及びＨｓｅｌＩと命名されている。
アーゼしか持っていない傾向にある。エンドヌクレアー
ゼは、その酵素が由来する細菌に従って命名されるのが
一般的である。従って、ｈａｍｏｐｂｉｌｗｓ ＊ｅｌ
７ｐ目−１は例えば３つの異なる制限エンドヌクレアー
ゼを合成するが、これらはＨｏｅ Ｉ ， Ｈｔ＊Ｉ
Ｉ及びＨｓｅｌＩと命名されている。
これらの酵素は夫々（ＡＴ） ＧＧＣＣ （入Ｔ），
ＰｕＧＣＧＣＰ７及びＧＧＣＣ配列を認識し、切断する
。一方、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｉ ｃａｌｉ）
ＲＹ１３はただ１つの酵素ＥｃｏＲ Ｉのみしか合戊せ
ず、これはＧＡ＾ＴＣ配列を認識する。
ＰｕＧＣＧＣＰ７及びＧＧＣＣ配列を認識し、切断する
。一方、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｉ ｃａｌｉ）
ＲＹ１３はただ１つの酵素ＥｃｏＲ Ｉのみしか合戊せ
ず、これはＧＡ＾ＴＣ配列を認識する。
理論と結びつけることを望んでいるのではないが、実際
、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の繁栄に保護的役
割を果していると考えられている。
、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の繁栄に保護的役
割を果していると考えられている。
すなわち、細菌を破壊したり、細菌に寄生したりするウ
ィルス及びブラスミドのような外来ＤＮＡ分子による感
染に対し細菌が耐えうるようにするのである。感染する
ＤＮＡ分子の長さを精査し、認識配列が生起するたびに
該ＤＮＡ分子を切断することによって耐性を付与する。
ィルス及びブラスミドのような外来ＤＮＡ分子による感
染に対し細菌が耐えうるようにするのである。感染する
ＤＮＡ分子の長さを精査し、認識配列が生起するたびに
該ＤＮＡ分子を切断することによって耐性を付与する。
発生する分断により感染遺伝子の多くが損傷し、ＤＮＡ
はエクソｑ ヌクレアーゼで更に分解されやすくｌる。
はエクソｑ ヌクレアーゼで更に分解されやすくｌる。
細菌の防御糸の第二成分は修飾メチラーゼである。これ
らの酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であり、細
菌がそれ自身のＤＮＡを保護し、このＤＮＡと外来の感
染ＤＮＡとを区別しつるような手段を提供している。修
飾メチラーゼは対応の制限エンドヌクレアーゼと同じヌ
クレオチド認識配列を認識し、これに結合するが、ＤＮ
Ａを破壊する代わりにメチル基を付加することによって
一ゼと結合したり、制限エンドヌクレアーゼで切断され
ることはない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼ
の活性により常に完全に修飾されており、従って、存在
する内因性の制限エンドヌクレアー・ゼには全く感受性
を示さない。修飾されていない、従って外来のものであ
ると同定されるＤＮＡのみが制限エンドヌクレアーゼに
よる認識及び攻撃に対し感受性を示す。
らの酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であり、細
菌がそれ自身のＤＮＡを保護し、このＤＮＡと外来の感
染ＤＮＡとを区別しつるような手段を提供している。修
飾メチラーゼは対応の制限エンドヌクレアーゼと同じヌ
クレオチド認識配列を認識し、これに結合するが、ＤＮ
Ａを破壊する代わりにメチル基を付加することによって
一ゼと結合したり、制限エンドヌクレアーゼで切断され
ることはない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼ
の活性により常に完全に修飾されており、従って、存在
する内因性の制限エンドヌクレアー・ゼには全く感受性
を示さない。修飾されていない、従って外来のものであ
ると同定されるＤＮＡのみが制限エンドヌクレアーゼに
よる認識及び攻撃に対し感受性を示す。
遺伝子工学技術の出現により、現在では、遺伝子をクロ
ーニングし、その遺伝子がコードする蛋白質や酵素を従
来の精製法で得られたものより大量に製造することが可
能となった。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子クローンを
単離する際のキーポイントは、このようなクローンが１
１３〜１Ｇ−４という低い頻度で生ずるときに、複雑な
「ライブラリー」すなわち「ショットガン」法で得られ
たクローン集団内で該クローンを同定する単純で信頼性
のある方法を開発することである。その方法は、所望の
少数のクローンが生き残り、不必要な多数のクローンが
破壊されるような選択的なものであるのが好ましい。
ーニングし、その遺伝子がコードする蛋白質や酵素を従
来の精製法で得られたものより大量に製造することが可
能となった。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子クローンを
単離する際のキーポイントは、このようなクローンが１
１３〜１Ｇ−４という低い頻度で生ずるときに、複雑な
「ライブラリー」すなわち「ショットガン」法で得られ
たクローン集団内で該クローンを同定する単純で信頼性
のある方法を開発することである。その方法は、所望の
少数のクローンが生き残り、不必要な多数のクローンが
破壊されるような選択的なものであるのが好ましい。
東
■型制限一修飾解のクローニングが増加しっ釆
つある。第１のクローニングｆでは、制限エンドヌクレ
アーゼクローンを同定し又は選択する手段としてバクテ
リオファージ感染が使用された［ＥｃｏＲＩＩ ： ［
ｏＢｋｈら、Ｍｏｌａｃ．１ｅｎ．Ｇｅａｅ＋ １７
８？ｌ？〜７１９， （１９８０） ； ｔ｛ｈｇＩ
Ｉ ： Ｍｇａｎら、Ｇｅｎｅ ３，！７〜ＩＩ２（１
９７ｇ） ； Ｐｓｌｌ ：Ｗｉｌｄｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．ＮｔｔＡｃｘｄ． Ｓｃｉ，７８． １５０３
〜＋５０７ （１９８１１ ］ 。細菌内の制喋 限一修飾ｌの存在により細菌はバクテリオファージ感染
に耐えうろことから、クローン化された制限一修飾遺伝
子を保有する細胞は、主として、ファージに晒されたラ
イブラリーから生存細胞として選択的に単離される。し
かし、この方法は限定的な価値しかないことが判明して
いる。特に、クローン化された制限一修飾遺伝子は、選
択的に生存させるのに十分なファージ耐性を必らずしも
示さないことが分かった。
アーゼクローンを同定し又は選択する手段としてバクテ
リオファージ感染が使用された［ＥｃｏＲＩＩ ： ［
ｏＢｋｈら、Ｍｏｌａｃ．１ｅｎ．Ｇｅａｅ＋ １７
８？ｌ？〜７１９， （１９８０） ； ｔ｛ｈｇＩ
Ｉ ： Ｍｇａｎら、Ｇｅｎｅ ３，！７〜ＩＩ２（１
９７ｇ） ； Ｐｓｌｌ ：Ｗｉｌｄｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．ＮｔｔＡｃｘｄ． Ｓｃｉ，７８． １５０３
〜＋５０７ （１９８１１ ］ 。細菌内の制喋 限一修飾ｌの存在により細菌はバクテリオファージ感染
に耐えうろことから、クローン化された制限一修飾遺伝
子を保有する細胞は、主として、ファージに晒されたラ
イブラリーから生存細胞として選択的に単離される。し
かし、この方法は限定的な価値しかないことが判明して
いる。特に、クローン化された制限一修飾遺伝子は、選
択的に生存させるのに十分なファージ耐性を必らずしも
示さないことが分かった。
もう１つのクローニングによる方法は、プラスミドーボ
ーン（ｐ１１目ｉｄ−ｂｏｒｎｅ）として最初に特性化
された、大腸菌へのクローニングブラスミ玉 ドの移入糸を含む（ＥｅｏＲＶ ： Ｂｏａｇｕｅｌｅ
＋ｅｔ らＮ＊ｃｌ．＾ｃｉｄ．Ｒｅ＋．！２．４６５
９−３６７６，（１９Ｎ）； ｐｘｅｔ１ ：Ｇｉｖ
ｅｒ０と８ｒｏｏｋｓ， Ｐｒｏｘ．Ｎｓｔｌ．Ａｃ
＊ｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０４［１２−４０６，
（１９８３） ； 丁ｈｅｔｉｉａｌｌ とＲ
ＯＦ， Ｇｅａｃ １９，３５５−３５９，
（１９ｇ２） ； Ｐｙｓｌｌ ： Ｂｌｕ
ｍｅｎＩｈ１ら．．めに使用されている方法は、本出願
人のＥＰＯ特許第１９３４１３号明細書に開示されてい
る活性メチラーゼ遺伝子の選択を含む［Ｂｓ＊ＲＩ ：
Ｋｉｓｓら， Ｎｓｃｌ．＾ｃｉｄ Ｒｅｓ且６４０
３ 〜ｌｉ４Ｎ（１９８５）］ 。制限遺伝子と修飾遺
伝子は近接して結合している傾向にあるため、一方の遺
伝子のみを選択することにより両方の遺伝子を含むクロ
ーンをしばしば単離することができる。しかし、メチル
化活性の選択により釆 常に完全な制限一修飾ｌが得られるわけではなく、時に
は、その代わりにメチラーゼ遺伝子のみが得られる（Ｂ
ｓｐＲＩ ： Ｓｘｏｍｏｌ＊ｓＦｉら，，Ｇｅｎｅ
１０，２１’Ｊ４２５． （１９１１０） ；
ＢｃｍＩ ： Ｊ＊＊＊ｌ＊ｉｔｉｓら＋ Ｇｅ＋＋
ｅ２０． ｔ９７−２０４． （１９ｇ２） ；
ｌｌｓｗＲＩ ： ｌ［ｉｔ＊及びＩ龜１ｄｔｗ＋，
Ｇｃａｓ Ｈ， ｉｌｌ−１１１１． （１９８
３） ；及び旧ｐＩ ： Ｗ＊ｌｄｅｔら．Ｊ．８ｉ
ｏ１．ＣｈｅＩｌ． ２５８＋１２３５−１２４１．
（１９８３）ｌ。
ーン（ｐ１１目ｉｄ−ｂｏｒｎｅ）として最初に特性化
された、大腸菌へのクローニングブラスミ玉 ドの移入糸を含む（ＥｅｏＲＶ ： Ｂｏａｇｕｅｌｅ
＋ｅｔ らＮ＊ｃｌ．＾ｃｉｄ．Ｒｅ＋．！２．４６５
９−３６７６，（１９Ｎ）； ｐｘｅｔ１ ：Ｇｉｖ
ｅｒ０と８ｒｏｏｋｓ， Ｐｒｏｘ．Ｎｓｔｌ．Ａｃ
＊ｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０４［１２−４０６，
（１９８３） ； 丁ｈｅｔｉｉａｌｌ とＲ
ＯＦ， Ｇｅａｃ １９，３５５−３５９，
（１９ｇ２） ； Ｐｙｓｌｌ ： Ｂｌｕ
ｍｅｎＩｈ１ら．．めに使用されている方法は、本出願
人のＥＰＯ特許第１９３４１３号明細書に開示されてい
る活性メチラーゼ遺伝子の選択を含む［Ｂｓ＊ＲＩ ：
Ｋｉｓｓら， Ｎｓｃｌ．＾ｃｉｄ Ｒｅｓ且６４０
３ 〜ｌｉ４Ｎ（１９８５）］ 。制限遺伝子と修飾遺
伝子は近接して結合している傾向にあるため、一方の遺
伝子のみを選択することにより両方の遺伝子を含むクロ
ーンをしばしば単離することができる。しかし、メチル
化活性の選択により釆 常に完全な制限一修飾ｌが得られるわけではなく、時に
は、その代わりにメチラーゼ遺伝子のみが得られる（Ｂ
ｓｐＲＩ ： Ｓｘｏｍｏｌ＊ｓＦｉら，，Ｇｅｎｅ
１０，２１’Ｊ４２５． （１９１１０） ；
ＢｃｍＩ ： Ｊ＊＊＊ｌ＊ｉｔｉｓら＋ Ｇｅ＋＋
ｅ２０． ｔ９７−２０４． （１９ｇ２） ；
ｌｌｓｗＲＩ ： ｌ［ｉｔ＊及びＩ龜１ｄｔｗ＋，
Ｇｃａｓ Ｈ， ｉｌｌ−１１１１． （１９８
３） ；及び旧ｐＩ ： Ｗ＊ｌｄｅｔら．Ｊ．８ｉ
ｏ１．ＣｈｅＩｌ． ２５８＋１２３５−１２４１．
（１９８３）ｌ。
制限一修飾遺伝子のクローニングに対する潜在的な障害
は、修飾によって常に防御されているわけではない宿主
にエンドヌクレアーゼを導入しようとするときに存在す
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを
単一のクローンとして一緒に導入するときには、エンド
ヌクレアーゼが宿主ＤＮＡを切断する機会を得る前にメ
チラーゼがこれを保護的に修飾する必要がある。従って
、先ずメチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼと順次遺伝
子をクローニングすることが唯一可能なものであろう。
は、修飾によって常に防御されているわけではない宿主
にエンドヌクレアーゼを導入しようとするときに存在す
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを
単一のクローンとして一緒に導入するときには、エンド
ヌクレアーゼが宿主ＤＮＡを切断する機会を得る前にメ
チラーゼがこれを保護的に修飾する必要がある。従って
、先ずメチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼと順次遺伝
子をクローニングすることが唯一可能なものであろう。
東
大腸菌での浦のクローニングに対する別の障害は多様な
メチラーゼ遺伝子をクローニングする過程で発見された
。（クローニングに通常使用されるものも含む）多くの
大腸菌株は、メチル化されたシトシンを含むＤＮＡの導
入を阻止する浦を有している（Ｒ＊ＩｅｉｌｂとＷＩＩ
ＢＩｌ， Ｐｒｏｃ，Ｍｉｌｌ．＾ｃｏｄＳｃｉ．
， ＵＳＡ Ｍ３． ９０７０−９０７４， Ｈ８
６） 。このような大腸菌株にシトシン特異性のメチラ
ーゼ遺伝子をクローン化することは、単独であっても、
又は対応発明の概要 本発明によると、Ｍｅｌｈ＊ｏｏｂ＊ｃｔｅｒｉｕｓ
ｗｏｌｌｅｉ（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｓ７ｓ（．Ａｐｐｌ．
旧ｃｔｏｂｉｏｌ． ５：４５７〜４６６１９８４）
由来のＭｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝常に困難
である。従って、これらの遺伝子をクロ晃 一ニングするためには、これらの〆を欠く大腸菌の変異
株を使用する必要がある。
メチラーゼ遺伝子をクローニングする過程で発見された
。（クローニングに通常使用されるものも含む）多くの
大腸菌株は、メチル化されたシトシンを含むＤＮＡの導
入を阻止する浦を有している（Ｒ＊ＩｅｉｌｂとＷＩＩ
ＢＩｌ， Ｐｒｏｃ，Ｍｉｌｌ．＾ｃｏｄＳｃｉ．
， ＵＳＡ Ｍ３． ９０７０−９０７４， Ｈ８
６） 。このような大腸菌株にシトシン特異性のメチラ
ーゼ遺伝子をクローン化することは、単独であっても、
又は対応発明の概要 本発明によると、Ｍｅｌｈ＊ｏｏｂ＊ｃｔｅｒｉｕｓ
ｗｏｌｌｅｉ（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｓ７ｓ（．Ａｐｐｌ．
旧ｃｔｏｂｉｏｌ． ５：４５７〜４６６１９８４）
由来のＭｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝常に困難
である。従って、これらの遺伝子をクロ晃 一ニングするためには、これらの〆を欠く大腸菌の変異
株を使用する必要がある。
精製制限エンドヌクレアーゼ及び程度は低いものの修飾
メチラーゼは実験室内でＤＮＡを特性化し再配列させる
有用な道具であるために、組換えＤＮＡ技術を用いて、
これらの酵素を豊富に合成する細菌株を得ることは商業
的に利益と−なる。このような菌株は商業的に有用な量
の生産を行う手段を提供すると同時に精製を聞略化する
ために有用であろう。
メチラーゼは実験室内でＤＮＡを特性化し再配列させる
有用な道具であるために、組換えＤＮＡ技術を用いて、
これらの酵素を豊富に合成する細菌株を得ることは商業
的に利益と−なる。このような菌株は商業的に有用な量
の生産を行う手段を提供すると同時に精製を聞略化する
ために有用であろう。
くは、本発明は、ＤＮＡ配列ＧＣ （Ｎ７）ＧＣを認識
し、Ｎ５とＮ６の間で切断する酵素である制限エンドヌ
クレアーゼＭｖｏ Ｉを発現するクローンに関する。本
発明により製造されるＭｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアー
ゼは実質的に純粋であり、従来法によるＭｖｏ Ｉ調製
物に通常認められた汚染物質を含んでいない。
し、Ｎ５とＮ６の間で切断する酵素である制限エンドヌ
クレアーゼＭｖｏ Ｉを発現するクローンに関する。本
発明により製造されるＭｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアー
ゼは実質的に純粋であり、従来法によるＭｖｏ Ｉ調製
物に通常認められた汚染物質を含んでいない。
Ｍｖｏ Ｉ酵素の遺伝子をクローニングする好ましい方
法は、Ｍ４ｏｌ＋ｅ＋由来のＤＮＡを含むライブラリー
を形成すること、Ｍｖｏｌ修飾メチラーゼをコードする
ＤＮＡを含むクローンを単離すること、及びこれらのク
ローン中からスクリーニングしてＭｖｏ Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子も含むものを同定することからなる
。
法は、Ｍ４ｏｌ＋ｅ＋由来のＤＮＡを含むライブラリー
を形成すること、Ｍｖｏｌ修飾メチラーゼをコードする
ＤＮＡを含むクローンを単離すること、及びこれらのク
ローン中からスクリーニングしてＭｖｏ Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子も含むものを同定することからなる
。
詳細な説明
本発明は、ｌＪｖｏ Ｉ制限及び修飾遺伝子のクローン
並びにこのようなクローンが産生ずる制限エンドヌクレ
アーゼ−ｖｏｌに関する。Ｍｖｏ Ｉ修飾メチラーゼ遺
伝子を含有し、発現することに基づいて選択されるある
種のクローンはＭｖｏ １制限遺伝子も含有していると
いう事実を利用する方法によりＭｖｏ Ｉ遺伝子をクロ
ーニングする。このようなクローンのＤ Ｎ Ａは、ｉ
ｎ ｙｉｊｔｏでＭｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼに
よる消化に対して抵抗性がある。
並びにこのようなクローンが産生ずる制限エンドヌクレ
アーゼ−ｖｏｌに関する。Ｍｖｏ Ｉ修飾メチラーゼ遺
伝子を含有し、発現することに基づいて選択されるある
種のクローンはＭｖｏ １制限遺伝子も含有していると
いう事実を利用する方法によりＭｖｏ Ｉ遺伝子をクロ
ーニングする。このようなクローンのＤ Ｎ Ａは、ｉ
ｎ ｙｉｊｔｏでＭｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼに
よる消化に対して抵抗性がある。
この消化に対する抵抗性により、Ｍｖｏ Ｉメチラーゼ
及び制限エンドヌクレアーゼをコードするクローンを選
択的に単離する方法が得られる。
及び制限エンドヌクレアーゼをコードするクローンを選
択的に単離する方法が得られる。
Ｍｖｏｌ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子とメチラ−ゼ遺
伝子をクローニングし、発現させるのに好適な、本明細
書中に記載の方法を第１図に示す。
伝子をクローニングし、発現させるのに好適な、本明細
書中に記載の方法を第１図に示す。
この方法は下記の工程を含む：
１ １Ｊｅｔｈｒｎｏｂｉｃｊｅ＋ｉｗａ ｖｏｌｌｅ
ｉの増殖と溶菌。
ｉの増殖と溶菌。
Ｍ，ｖｏｌ＋ｅｉ はｗｉｎｔｅｒら、Ｓ７ｓｔ．＾
ｐｐｌ、１１ｉｃ＋ｏｂｉｏｌ５：４５７〜４６６ （
１９８４）中に記載されている。
ｐｐｌ、１１ｉｃ＋ｏｂｉｏｌ５：４５７〜４６６ （
１９８４）中に記載されている。
Ｌ ｖｏｌｌｅｉ （ＤＳｋｌ ２９７Ｇ）の培養物は
西独のＤｅｕｔｓｃｈｅＳ＞ｍｍｌｍ＋＋ｙ ｔｏｎ
Ｍｉｋｏｏｒｌｔｎｉｓａｅｎ（Ｇｒｉｓｅｂｓｃｂｌ
＋ｓｓｓｅ１． Ｄ−３４００ Ｇｏｔｌｉａ家ｌ）に
寄託されている。この細菌のサンプルはＪｏｈｎ Ｎ，
Ｒｅｅ▼Ｃ博士［オハイオ州立大学、微生物学部、４８
４ｖ．Ｉ２１ｈ ＳｊｒｅＮＣｏｌｉｓｂｗｔ， ＯＨ
４３２１０（ＵＳＡ）］からも入手できる。
西独のＤｅｕｔｓｃｈｅＳ＞ｍｍｌｍ＋＋ｙ ｔｏｎ
Ｍｉｋｏｏｒｌｔｎｉｓａｅｎ（Ｇｒｉｓｅｂｓｃｂｌ
＋ｓｓｓｅ１． Ｄ−３４００ Ｇｏｔｌｉａ家ｌ）に
寄託されている。この細菌のサンプルはＪｏｈｎ Ｎ，
Ｒｅｅ▼Ｃ博士［オハイオ州立大学、微生物学部、４８
４ｖ．Ｉ２１ｈ ＳｊｒｅＮＣｏｌｉｓｂｗｔ， ＯＨ
４３２１０（ＵＳＡ）］からも入手できる。
２． Ｍ．ｖ＋＋ｌＩ＊ｉのＤＮＡを精製する。
３．制限エンドヌクレアーゼＢ＊ｍｌ｛Ｉ ， ｝ｌｉ
ａｄｎ［及びＰｓｔ ＩでＤＮＡを部分的に消化する。
ａｄｎ［及びＰｓｔ ＩでＤＮＡを部分的に消化する。
４． ８ｓ＋ｓＨ Ｉ ， Ｈｉａｄｍ又はＰｓｌＩ部
位を含むｐｕｌｌ３２２１１ｉ導体のようなクローニン
グベクターに、消化したＤＮＡを連結する。得られた混
合物を使用して大腸菌株ＲＲｉ（＾ＴＣＣ ３１３４３
）のような適切な宿主を形質転換する。
位を含むｐｕｌｌ３２２１１ｉ導体のようなクローニン
グベクターに、消化したＤＮＡを連結する。得られた混
合物を使用して大腸菌株ＲＲｉ（＾ＴＣＣ ３１３４３
）のような適切な宿主を形質転換する。
５．形質転換細胞用に選択した、アンビシリン鳩
のような抗生物質の遭地上にＤＮＡ／細胞混合物をプレ
ーティングする。インキユベーションした後、形質転換
細胞のコロニーを集め、これを単一培養物即ち一次細胞
ライブラリーとする。
ーティングする。インキユベーションした後、形質転換
細胞のコロニーを集め、これを単一培養物即ち一次細胞
ライブラリーとする。
６．一次細胞ライブラリーから組換えプラスミドを完全
に精製して一次ｌプラスミドライブラリーを作製する。
に精製して一次ｌプラスミドライブラリーを作製する。
７．次に、Ｍｖｏｌ制限エンドヌクレアーゼを用いてプ
ラスミドライブラリーをｉ口▼ｉｌｒｏで完全に消化す
る。該Ｍｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼは自己消化し
たＭ４ｏｌ！ｅｉ細胞（［ｏａｉＨら、１９８５ ；
Ｗｉｓｆｌｅｒマトｌラフィー及びイオン交換クロマト
グラフィ一のような標準的な蛋白質精製技術により ｌ
ｌｖｏ １制限エンドヌクレアーゼ活性を精製する。Ｍ
ｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ消化により、メチラー
ゼを含有しない非修飾クローンが選択的に破壊され、そ
の結果、ｌｌｖｏ Ｉメチラーゼを保有するクローンの
相対的な頻度が増加する。
ラスミドライブラリーをｉ口▼ｉｌｒｏで完全に消化す
る。該Ｍｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼは自己消化し
たＭ４ｏｌ！ｅｉ細胞（［ｏａｉＨら、１９８５ ；
Ｗｉｓｆｌｅｒマトｌラフィー及びイオン交換クロマト
グラフィ一のような標準的な蛋白質精製技術により ｌ
ｌｖｏ １制限エンドヌクレアーゼ活性を精製する。Ｍ
ｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ消化により、メチラー
ゼを含有しない非修飾クローンが選択的に破壊され、そ
の結果、ｌｌｖｏ Ｉメチラーゼを保有するクローンの
相対的な頻度が増加する。
ｇ．消化したプラスミドライブラリーＤＮＡを大腸菌株
ＲＲＩのような適当な宿主内に形質転換適 させて戻し、抗生物質平板〆地上にプレーティングする
ことにより、再度、形質転換クローンを得る。コロニー
を取り出し、次の方法に従って、それらのＤＮＡを分析
しＭｗｏ Ｉ修飾遺伝子の存在を調べる：コロニーが保
有するプラスミドＤＮＡを精製し、ＩＩｌ▼ＨｒｏでＭ
ｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼと共にインキユベート
して、ＭｖｏＩの消化に対して耐性であるかどうかを判
定する。クローンの細胞）ｆｌＤＮＡ全て（染色体ＤＮ
Ａ及びプラスミドＤＮＡ）も精製し、Ｍｖｏｌ制限エン
ドヌクレアーゼと共にインキユベートする。Ｍｖｏ Ｉ
メチラーゼ遺伝子を保有するクローンのＤＮＡが修飾さ
れるべきであり、プラスミドＤＮＡ及び全ＤＮＡの両者
は実質的に、又は完全に消化に対して耐性であることが
見出されるべきである。
ＲＲＩのような適当な宿主内に形質転換適 させて戻し、抗生物質平板〆地上にプレーティングする
ことにより、再度、形質転換クローンを得る。コロニー
を取り出し、次の方法に従って、それらのＤＮＡを分析
しＭｗｏ Ｉ修飾遺伝子の存在を調べる：コロニーが保
有するプラスミドＤＮＡを精製し、ＩＩｌ▼ＨｒｏでＭ
ｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼと共にインキユベート
して、ＭｖｏＩの消化に対して耐性であるかどうかを判
定する。クローンの細胞）ｆｌＤＮＡ全て（染色体ＤＮ
Ａ及びプラスミドＤＮＡ）も精製し、Ｍｖｏｌ制限エン
ドヌクレアーゼと共にインキユベートする。Ｍｖｏ Ｉ
メチラーゼ遺伝子を保有するクローンのＤＮＡが修飾さ
れるべきであり、プラスミドＤＮＡ及び全ＤＮＡの両者
は実質的に、又は完全に消化に対して耐性であることが
見出されるべきである。
９．工程８でＭｖｏ Ｉメチラーゼ遺伝子を保有すると
同定されたクローンの粗抽出物を調製し、この抽出物を
Ｍｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活性についてアッセ
イすることにより、Ｍｖｏｌ制限エンドヌクレアーゼを
保有するクローンを同定する。
同定されたクローンの粗抽出物を調製し、この抽出物を
Ｍｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活性についてアッセ
イすることにより、Ｍｖｏｌ制限エンドヌクレアーゼを
保有するクローンを同定する。
遥
１０．発酵槽中、アンピシリン含有豊裕ｌ地内で増殖さ
せることにより、Ｍｖａｌ制限及び修飾遺伝子を保有す
るクローンからＩｉｖａ Ｉ ＠限エンドヌクレアーゼ
を製造できる。その後、細胞を遠心分離により採取し、
超音波処理して破壊することにより、ＭｖｏＩ制限エン
ドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を得る。
せることにより、Ｍｖａｌ制限及び修飾遺伝子を保有す
るクローンからＩｉｖａ Ｉ ＠限エンドヌクレアーゼ
を製造できる。その後、細胞を遠心分離により採取し、
超音波処理して破壊することにより、ＭｖｏＩ制限エン
ドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を得る。
１１． アフィニティーク口マトグラフィー及びイオ
ン交換クロマトグラフィーのような標準の蛋白質精製技
術により、Ｍｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活性を含
む粗細胞抽出物を精製する。
ン交換クロマトグラフィーのような標準の蛋白質精製技
術により、Ｍｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活性を含
む粗細胞抽出物を精製する。
上記に概説した工程は本発明を実施する好ましい態様を
代表するものであるが、上記方法は当業界で公知の技術
に従って変化させうるちのであることは当業者には明ら
かであろう。
代表するものであるが、上記方法は当業界で公知の技術
に従って変化させうるちのであることは当業者には明ら
かであろう。
次の実施例は現在のところ、実施するのに好ましいもの
であり、本発明の実施態様を説明するために示している
。本実施例は例証的なものであり、本発明は、添付の特
許請求の範囲に示されるものを除き、本実施例で限定さ
れるものではないことは理解されよう。
であり、本発明の実施態様を説明するために示している
。本実施例は例証的なものであり、本発明は、添付の特
許請求の範囲に示されるものを除き、本実施例で限定さ
れるものではないことは理解されよう。
実施例
Ｍｗｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニン
グ と １， Ｍ４ｏｌ１ｅｉの増殖矛溶解（ｆｒｕｉｔ）
： ２４Ｌ ＮｅｗＢｒｕ＋＋ｓｖｉｃｋ嫌気性発酵槽
中６２℃で、Ｓｃｈｏｍｈｅｉら，＾ｒｃｂＪｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ． １２７ ： ５９〜６Ｓ（１９８Ｇ）
に記載の最少培地２０１中でＭ，ｖｏｌｌｅｉ培養物を
増殖させた。
グ と １， Ｍ４ｏｌ１ｅｉの増殖矛溶解（ｆｒｕｉｔ）
： ２４Ｌ ＮｅｗＢｒｕ＋＋ｓｖｉｃｋ嫌気性発酵槽
中６２℃で、Ｓｃｈｏｍｈｅｉら，＾ｒｃｂＪｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ． １２７ ： ５９〜６Ｓ（１９８Ｇ）
に記載の最少培地２０１中でＭ，ｖｏｌｌｅｉ培養物を
増殖させた。
Ｎ ａ Ｓ ●９ Ｈ ２ ０ ０− ５ ｇ ／
Ａ’及びＬ−システイ２ ン・Ｈ（４０．５ｇ／ｊ２を添加して培地を還元した。
Ａ’及びＬ−システイ２ ン・Ｈ（４０．５ｇ／ｊ２を添加して培地を還元した。
Ｍ ｖｏｌｌｃ＋の増殖にはタングステンが必要である
（Ｗ…ｅｒら，１９川ため、Ｎ ａ Ｗ Ｏ ”
２ Ｈ ２ ０２４ ２６４■／ｌを含む微量元素溶液を補充した。発酵の間
には、８０％Ｈ：２０％ＣＯ２混合物をバプリ２ ングさせて培地を散らした。Ｈ ：ＣＯ２ガス混２ 合物で３００１ｐｓの圧力としたｌｏａｄのストッパー
付き血清フラスコ中でより少量の培養物（２０ｊＩｅ）
を増殖させた。自己消化［Ｋｏａｉｌら、Ａｒｃｈ．旧
ｃｒｏｂｉｏｌ，１４１： １？Ｔ 〜ｌロ（１９８５
） ； Ｋｉｅａｅ＋ら、Ｉ． Ｂｘｅｌｅｒｉｏ
ｌ，１６９：１０１０−１０１６ ＋１８８７） ］に
よりＭ．ｖｏ目ｅｉの溶解物を得た。指数増殖の間に湿
潤重量７０ｇの細胞を採取し、６（１Ｇ−の最少培地に
再懸濁させ、次に、８０％Ｎ２ ：２Ｇ％ＣＯ２雰囲気
下の血清フラスコ内で、振とうすることな＜、６２℃で
インキユベートした。
（Ｗ…ｅｒら，１９川ため、Ｎ ａ Ｗ Ｏ ”
２ Ｈ ２ ０２４ ２６４■／ｌを含む微量元素溶液を補充した。発酵の間
には、８０％Ｈ：２０％ＣＯ２混合物をバプリ２ ングさせて培地を散らした。Ｈ ：ＣＯ２ガス混２ 合物で３００１ｐｓの圧力としたｌｏａｄのストッパー
付き血清フラスコ中でより少量の培養物（２０ｊＩｅ）
を増殖させた。自己消化［Ｋｏａｉｌら、Ａｒｃｈ．旧
ｃｒｏｂｉｏｌ，１４１： １？Ｔ 〜ｌロ（１９８５
） ； Ｋｉｅａｅ＋ら、Ｉ． Ｂｘｅｌｅｒｉｏ
ｌ，１６９：１０１０−１０１６ ＋１８８７） ］に
よりＭ．ｖｏ目ｅｉの溶解物を得た。指数増殖の間に湿
潤重量７０ｇの細胞を採取し、６（１Ｇ−の最少培地に
再懸濁させ、次に、８０％Ｎ２ ：２Ｇ％ＣＯ２雰囲気
下の血清フラスコ内で、振とうすることな＜、６２℃で
インキユベートした。
Ｈ２が涸渇すると約４８時間後には完全に溶解した。
この自己消化物を−７０℃で保存した。
２．ＤＮＡの精製：解凍した自己消化物５一を、ｌＯｍ
Ｍ Ｔｔｉ＊ − Ｈ ＣＪ （ｐＨ ７、４）．
１０ｉＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ，１）．２５Ｍ蔗糖．ブロテ
ィナーゼＫ２０埒／一、５ｄと混合した。ドデシル硫酸
ナトリウムを１％ｗ／Ｙまで加え、溶液を６０℃で３０
分間インキユベートした。
Ｍ Ｔｔｉ＊ − Ｈ ＣＪ （ｐＨ ７、４）．
１０ｉＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ，１）．２５Ｍ蔗糖．ブロテ
ィナーゼＫ２０埒／一、５ｄと混合した。ドデシル硫酸
ナトリウムを１％ｗ／Ｙまで加え、溶液を６０℃で３０
分間インキユベートした。
５ＭＮ ａ ＣＪ Ｏ． ５ｍを加え、試験管を２時間
氷上に置いた。１７． ０００ ｇで１５分間遠心分離
して溶液を清澄させ、次に、等量のイソブロパノールを
加えて核酸を沈澱させた。その沈澱物をＴＥバッフ７［
ＩＱｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），
ｌｍ劃 ＥＤＴＡ］ ２ｍに溶解し、次にフェノー
ル及びクロロホルムで抽出した。７．５Ｍ酢酸アンモニ
ウム２００ｎ及び９５％エタノール２．５容を加えて核
酸を再び沈澱させた。
氷上に置いた。１７． ０００ ｇで１５分間遠心分離
して溶液を清澄させ、次に、等量のイソブロパノールを
加えて核酸を沈澱させた。その沈澱物をＴＥバッフ７［
ＩＱｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），
ｌｍ劃 ＥＤＴＡ］ ２ｍに溶解し、次にフェノー
ル及びクロロホルムで抽出した。７．５Ｍ酢酸アンモニ
ウム２００ｎ及び９５％エタノール２．５容を加えて核
酸を再び沈澱させた。
沈澱物を７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、次にＲＮ
＊ｔｅ １埒／ａｔを含有するＴＥバッファに再び溶解
した。
＊ｔｅ １埒／ａｔを含有するＴＥバッファに再び溶解
した。
３，ＤＮＡの消化：精製したＤＮＡをｈｍ｝ＩＩで部分
的に切断した。５０ｍＭ Ｔｒｉｇ（ｐＨ ７．５）
． ｌｏＯｍＭＮ ａ ＣＪ， ｌｅｄ Ｍ ｇ（
Ｊ２． １０ｍｌｉ ２−メルカブトエタノール中１
Ｈ１当り１０（Ｕ９の濃度となるようＤＮＡを希釈し、
ＤＮＡＩ埒当り ０．５単位（１）のＢＩＩＨ Ｉを第
一試験管に加え、次に第二試験管に移して８１ｄ ｌ
０． ２５単位／埒とするようにして、各試験管が前の
試験管の半量のＢｓｍＨ Ｉを有するようにした。ＤＮ
Ａを３７℃で１時間消化した後、１０分間７２℃に加熱
して消化を完結させた。クローニング用の部分的消化断
片源として、中等度の不完全な消化を示す試験管を選択
した。（これらは０．５ｕ／ ｎ． （１． ２５ ｕ
／ ）ｔ９，及び０．１ｕ／埒の試験管であった。３
つの溶液を一緒に混合し、下記のように使用した。） ４，連結二次のようにして、消化したＤＮＡを９８Ｒ３
２２に連結した：ＢａｍＨＩで消化したＩＪ．ｖｏｌｌ
ｅｉＤ Ｎ Ａ ２． Ｏ＃ （４０Ｉ１１）を、ｈｍ
Ｈ Ｉで切断し、脱リン酸化したｐＢ１３２２ １．０
増（ １０ｌ１１）と混合した。
的に切断した。５０ｍＭ Ｔｒｉｇ（ｐＨ ７．５）
． ｌｏＯｍＭＮ ａ ＣＪ， ｌｅｄ Ｍ ｇ（
Ｊ２． １０ｍｌｉ ２−メルカブトエタノール中１
Ｈ１当り１０（Ｕ９の濃度となるようＤＮＡを希釈し、
ＤＮＡＩ埒当り ０．５単位（１）のＢＩＩＨ Ｉを第
一試験管に加え、次に第二試験管に移して８１ｄ ｌ
０． ２５単位／埒とするようにして、各試験管が前の
試験管の半量のＢｓｍＨ Ｉを有するようにした。ＤＮ
Ａを３７℃で１時間消化した後、１０分間７２℃に加熱
して消化を完結させた。クローニング用の部分的消化断
片源として、中等度の不完全な消化を示す試験管を選択
した。（これらは０．５ｕ／ ｎ． （１． ２５ ｕ
／ ）ｔ９，及び０．１ｕ／埒の試験管であった。３
つの溶液を一緒に混合し、下記のように使用した。） ４，連結二次のようにして、消化したＤＮＡを９８Ｒ３
２２に連結した：ＢａｍＨＩで消化したＩＪ．ｖｏｌｌ
ｅｉＤ Ｎ Ａ ２． Ｏ＃ （４０Ｉ１１）を、ｈｍ
Ｈ Ｉで切断し、脱リン酸化したｐＢ１３２２ １．０
増（ １０ｌ１１）と混合した。
１０倍の連結混合物［５Ｑｌｌ＋ａＭ Ｔｈｉｓ（ｐＨ
７．５）， ｌ００ｍＭＭｇＣｉ！２．ｌｏＯ＋＋Ｍ
ＤＴＴ，５ｄ ＡＴＰ］ ２０ｍと滅菌蒸留水１３０ｍ
を加えて最終容量２００ハとした。
７．５）， ｌ００ｍＭＭｇＣｉ！２．ｌｏＯ＋＋Ｍ
ＤＴＴ，５ｄ ＡＴＰ］ ２０ｍと滅菌蒸留水１３０ｍ
を加えて最終容量２００ハとした。
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ７． ５ｔ１！を加え、混合物を
ｌ７℃で４時間インキユベートし、次に、クロロホルム
１０４を加えて滅菌した。約１２５Ｉｉｌの連結ＤＮＡ
を使用して、次のように大腸菌株ＲＲＩを形質転換した
：氷上でＤＮＡを１．０−のＳ Ｓ Ｃ ／ Ｃ ａ
Ｕ ２（５０＋ｅＭ Ｎ ａ （Ｊ， ５ｍＭクエン酸
三ナトリウム， ６７ｍＭＣａα２）とを混合し、水冷
したコンビテント大腸菌Ｒ Ｒ． １ （ｈｓｄＲ
Ｍ ＡＣ丁Ｔ胤３１３４３）細胞２．０一を加えた
。４２℃で５分間インキユベートした後、Ｌｕ＋ｉｘ−
プロス（Ｌ−プロス）８ｔｄを加えて細胞を希釈し、３
７℃で４時間インキユベートした。
ｌ７℃で４時間インキユベートし、次に、クロロホルム
１０４を加えて滅菌した。約１２５Ｉｉｌの連結ＤＮＡ
を使用して、次のように大腸菌株ＲＲＩを形質転換した
：氷上でＤＮＡを１．０−のＳ Ｓ Ｃ ／ Ｃ ａ
Ｕ ２（５０＋ｅＭ Ｎ ａ （Ｊ， ５ｍＭクエン酸
三ナトリウム， ６７ｍＭＣａα２）とを混合し、水冷
したコンビテント大腸菌Ｒ Ｒ． １ （ｈｓｄＲ
Ｍ ＡＣ丁Ｔ胤３１３４３）細胞２．０一を加えた
。４２℃で５分間インキユベートした後、Ｌｕ＋ｉｘ−
プロス（Ｌ−プロス）８ｔｄを加えて細胞を希釈し、３
７℃で４時間インキユベートした。
５．一次細胞ライブラリー二形質転換し，た細胞培養物
を軽く遠心分離し、上清を捨て、細抱をＬ一ブＯスｌ．
Ｏｄ１ｍ再懸濁させた． １００４／ＩＩＩｌ（７）
７ンビシリンを含有する各ＬＩｌｔ目一アガー（Ｌ−ア
ガー）平板培地上に２００Ｉｉｉずつブレーティングし
た。
を軽く遠心分離し、上清を捨て、細抱をＬ一ブＯスｌ．
Ｏｄ１ｍ再懸濁させた． １００４／ＩＩＩｌ（７）
７ンビシリンを含有する各ＬＩｌｔ目一アガー（Ｌ−ア
ガー）平板培地上に２００Ｉｉｉずつブレーティングし
た。
３７℃で一晩インキユベートした後、ｌＯｍｌＪ Ｔｒ
目ｆｐＨ一次細胞ライブラリーを形成した。
目ｆｐＨ一次細胞ライブラリーを形成した。
６，一次プラスミドライブラリー二次のようにして一次
プラスミドライブラリーを調製した：アンビシリンｌ０
０ｌ１９／一を含有する Ｌ−ブロス５００ｄ中に一次
細胞ライブラリー ２．５ｄを接種した。
プラスミドライブラリーを調製した：アンビシリンｌ０
０ｌ１９／一を含有する Ｌ−ブロス５００ｄ中に一次
細胞ライブラリー ２．５ｄを接種した。
培養物を３７℃で一晩振盪した後，． ４０００ｔｐＩ
１で５分間遠心分離した。上清を捨て、２５％蔗糖、５
ｈＭ丁ｒｉｇ ｆｐ｝Ｉ ８． Ｏ） ＩＯｄ中に細胞
ベレットを室温で再懸濁させた。０．２５Ｍ Ｅ ＤＴ
Ａ （ｐ｝Ｉ ８．０） ５−を加えた後、［ｌ．ｌ’
５ＭＴｒ目（ｐ｝１１１．１１）中のｌ（１■／葺づゾ
チーム３Ｍｌを加えた。この溶液を１時間氷上に放置し
、溶解用混合物（工％Ｔｒｉｌｏａ Ｉ−ＬＯＧ． ５
０ａ＋Ｍ Ｔｔｉｓ（ｐＨ８．０）， ６７一Ｍ Ｅ
ＤＴＡ）１２ｍを強力にピペットで入れ、細胞懸濁液を
穏かに回転させて溶解させた。
１で５分間遠心分離した。上清を捨て、２５％蔗糖、５
ｈＭ丁ｒｉｇ ｆｐ｝Ｉ ８． Ｏ） ＩＯｄ中に細胞
ベレットを室温で再懸濁させた。０．２５Ｍ Ｅ ＤＴ
Ａ （ｐ｝Ｉ ８．０） ５−を加えた後、［ｌ．ｌ’
５ＭＴｒ目（ｐ｝１１１．１１）中のｌ（１■／葺づゾ
チーム３Ｍｌを加えた。この溶液を１時間氷上に放置し
、溶解用混合物（工％Ｔｒｉｌｏａ Ｉ−ＬＯＧ． ５
０ａ＋Ｍ Ｔｔｉｓ（ｐＨ８．０）， ６７一Ｍ Ｅ
ＤＴＡ）１２ｍを強力にピペットで入れ、細胞懸濁液を
穏かに回転させて溶解させた。
溶解後、この混合物を５０６ｄのプラスチック製遠沈管
に移し、 ４℃、１７０００ｒｐ園で４５分間遠心した
。上清をピペットで取り除いた。固体Ｃｓ（Ｊ２０．［
ｌｇを計量し、５０ｄのプラスチック製ねじ蓋式試験管
に入れ、さらに上清２２． Ｏ．をピペットで入れて混
合した。臭化エチジウム溶液［１０ｍＭ Ｔ＋ｉｓ（ｐ
ｌ１ ８．０） ，１ｓＭ ＥＤＴＡ，１０ｈＭ Ｎａ
Ｑ！中の臭化エチジウム５■／ｄ）ｌ．Ｏｄを混合物に
加えた。溶液を２本の５／８インチ×３インチのポリア
ロマー製遠沈管に移し、密封した。次に、これらの遠心
管を８ｅｃｋｍｓｎ Ｔｙ７０ｃｙ−ターを使用し、１
７℃、４４０（ｔｏｏｐｍで４２時間回転させた。ブラ
スミドを採集するために、遠心管に紫外線を照射し、上
部に外科用メスを突き刺し、２つの蛍光性ＤＮＡバンド
の低い方をシリンジで採集した。各遠心管からの低い方
のバンドをねじ蓋式ガラス管内で合一にし、等量の水一
飽和氷冷曽一プタノールで４回抽出して臭化エチジウム
を除去した。
に移し、 ４℃、１７０００ｒｐ園で４５分間遠心した
。上清をピペットで取り除いた。固体Ｃｓ（Ｊ２０．［
ｌｇを計量し、５０ｄのプラスチック製ねじ蓋式試験管
に入れ、さらに上清２２． Ｏ．をピペットで入れて混
合した。臭化エチジウム溶液［１０ｍＭ Ｔ＋ｉｓ（ｐ
ｌ１ ８．０） ，１ｓＭ ＥＤＴＡ，１０ｈＭ Ｎａ
Ｑ！中の臭化エチジウム５■／ｄ）ｌ．Ｏｄを混合物に
加えた。溶液を２本の５／８インチ×３インチのポリア
ロマー製遠沈管に移し、密封した。次に、これらの遠心
管を８ｅｃｋｍｓｎ Ｔｙ７０ｃｙ−ターを使用し、１
７℃、４４０（ｔｏｏｐｍで４２時間回転させた。ブラ
スミドを採集するために、遠心管に紫外線を照射し、上
部に外科用メスを突き刺し、２つの蛍光性ＤＮＡバンド
の低い方をシリンジで採集した。各遠心管からの低い方
のバンドをねじ蓋式ガラス管内で合一にし、等量の水一
飽和氷冷曽一プタノールで４回抽出して臭化エチジウム
を除去した。
抽出した溶液を透析チューブに移し、ＤＮＡバッファ（
ＬＯ＠Ｍτｔｉｔ（ｐｔｌ７。Ｓ）， ｌｍＭ ＥＤ
ＴＡ）を４回交換して２４時間透析した。次に、透析し
たＤＮＡ溶液を予め計量してあるＳｏｄの滅菌遠沈管に
移し、その容量を測定した。５１Ｎａ（Ｊを最終濃度０
，４Ｍとなるように加え、次に２容量のインブロパノー
ルを加えて混合した。溶液を−２０℃に一晩置き、ＤＮ
Ａを沈澱させた。沈澱後、溶液を０℃、１５０ｆｌＯｒ
ｐｍ＋でｌ５分間遠心し、上清を捨てた。
ＬＯ＠Ｍτｔｉｔ（ｐｔｌ７。Ｓ）， ｌｍＭ ＥＤ
ＴＡ）を４回交換して２４時間透析した。次に、透析し
たＤＮＡ溶液を予め計量してあるＳｏｄの滅菌遠沈管に
移し、その容量を測定した。５１Ｎａ（Ｊを最終濃度０
，４Ｍとなるように加え、次に２容量のインブロパノー
ルを加えて混合した。溶液を−２０℃に一晩置き、ＤＮ
Ａを沈澱させた。沈澱後、溶液を０℃、１５０ｆｌＯｒ
ｐｍ＋でｌ５分間遠心し、上清を捨てた。
この遠心管をベンチ上に放置して１５分間空気乾燥し、
次に、ＤＮＡペレットをＤＮＡバッファ ５Ｇｔｌパに
溶解して−２０℃で保存した。この方法で調製したプラ
スミドライブラリーのＤＮＡ濃度は１１１０〜２００
＃／＃１であることが分かった。
次に、ＤＮＡペレットをＤＮＡバッファ ５Ｇｔｌパに
溶解して−２０℃で保存した。この方法で調製したプラ
スミドライブラリーのＤＮＡ濃度は１１１０〜２００
＃／＃１であることが分かった。
７．プラスミドプールの消化二次のようにして、一次プ
ラスミドブールを消化し、非Ｍｖｏ Ｉメチラーゼクロ
ーン（ａｏａ−Ｍｔｏ Ｉ ｍｃＬｌ＋４１ｓ＠ｅ
ｃｌｏｉｅｓ）を破壊した： Ｍｖｏｌ一消化用バッ
フ７ ［１０１Ｍ Ｔｒｈ− Ｈ ＣＪ （ｐＨ １．
５）． １０ｍＭ Ｍ ｇα２ ，ｌＱｍＭ ２−
メルカブトエタノーノレ， １５ｈＭ Ｎ ａ （Ｊ
ｌ ９０ｍ中のプラスミドライブラリー２ＩＩＩＩを、
部分精製したｌＪｖｏ Ｉ制限酵素２（１単位（３ｄ）
と共に６５℃で１時間インキユベートした。消化したＤ
ＮＡをククロロホルムで抽出し、ミクロ遠心した。
ラスミドブールを消化し、非Ｍｖｏ Ｉメチラーゼクロ
ーン（ａｏａ−Ｍｔｏ Ｉ ｍｃＬｌ＋４１ｓ＠ｅ
ｃｌｏｉｅｓ）を破壊した： Ｍｖｏｌ一消化用バッ
フ７ ［１０１Ｍ Ｔｒｈ− Ｈ ＣＪ （ｐＨ １．
５）． １０ｍＭ Ｍ ｇα２ ，ｌＱｍＭ ２−
メルカブトエタノーノレ， １５ｈＭ Ｎ ａ （Ｊ
ｌ ９０ｍ中のプラスミドライブラリー２ＩＩＩＩを、
部分精製したｌＪｖｏ Ｉ制限酵素２（１単位（３ｄ）
と共に６５℃で１時間インキユベートした。消化したＤ
ＮＡをククロロホルムで抽出し、ミクロ遠心した。
８．形質転換：遠心管からの１２． ｓｇのサンプルを
使用してコンビテント大腸菌ＲＲ１２００ｄを形質転換
した。細胞／ＤＮＡ混合物を、アンピシリンＩＯＯＩ１
９／一を含有する Ｌ−アがー平板培地上にプレーティ
ングした。３７℃で一晩インキユベートした後、プレー
トを調べた。Ｍｖｏ Ｉでプラスミドライブラリーを消
化すると、形質転換体の数が１０４以上の率で減少した
ことが分かった。個々のコロニーをプレートから取り出
し、各々をアンビシリン含有Ｌ−ブロスｌｌｌｄに接種
してミニ培養物を調製し、またアンピシリン含有Ｌ−ア
ガー平板培地上で平板塗抹培養してマスターストック（
ｉｎ目ｅｔ ｘ’ｌｏｃｋｌを調製した。
使用してコンビテント大腸菌ＲＲ１２００ｄを形質転換
した。細胞／ＤＮＡ混合物を、アンピシリンＩＯＯＩ１
９／一を含有する Ｌ−アがー平板培地上にプレーティ
ングした。３７℃で一晩インキユベートした後、プレー
トを調べた。Ｍｖｏ Ｉでプラスミドライブラリーを消
化すると、形質転換体の数が１０４以上の率で減少した
ことが分かった。個々のコロニーをプレートから取り出
し、各々をアンビシリン含有Ｌ−ブロスｌｌｌｄに接種
してミニ培養物を調製し、またアンピシリン含有Ｌ−ア
ガー平板培地上で平板塗抹培養してマスターストック（
ｉｎ目ｅｔ ｘ’ｌｏｃｋｌを調製した。
Ｌ生き残った個体の分析：第８節で得られた生き残った
コロニーの２つをｌｏｄの培養物（第８節）中で増殖さ
せ、コロニーが保有するブラスミドを、ｌｉｒｅｈｏｉ
ａとＤｏｌ７の方法（Ｎｏｃｌｅｉｅ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．７ ： １５Ｎ（１９７９）］から採用した次の
ミニブリーブ（ｍｉａｉｐｒｅｐ）精製法で調製した。
コロニーの２つをｌｏｄの培養物（第８節）中で増殖さ
せ、コロニーが保有するブラスミドを、ｌｉｒｅｈｏｉ
ａとＤｏｌ７の方法（Ｎｏｃｌｅｉｅ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．７ ： １５Ｎ（１９７９）］から採用した次の
ミニブリーブ（ｍｉａｉｐｒｅｐ）精製法で調製した。
ミニブリーブ法：各培養物を８０００ｔｐｍで５分間遠
心分離した；上清を捨て、リゾチーム１■／一を含有す
る ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ， １０ｍＭ ＥＤＴＡ，
５ｈＭグルコース（ｐＨ ８．０） １．１ｄに細胞ベ
レットを再懸濁した。室温で１０分間後、各遠心管に０
．２ＭＮａＯＨ，ｌ％ＳＤＳを２．０ｄ加え、遠心管を
振盪して細胞を溶解させ、次に氷上に置いた。溶液が澄
明になったら、各遠心管番こ３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．８） １．５−を加えて振盪した。４℃． １５
０１１０ｒｐｍで１０分間遠心して、沈澱を形成させた
。イソプロパノール３ｄを含有する遠沈管に各上清を注
ぎ入れて混合した。室温で１０分間後、１５０ＧＯｒｐ
ｍでｌＯ分間、遠心管を回転させて、沈澱した核酸をべ
レット化した。上清を捨て、ベレットを室温で３０分間
空気乾燥した。乾燥後、１０ａ＋Ｍ Ｔｒｉ３ １０ｍ
ｌｌＥＤＴＡ， ｐＨｇ．ｏ ８５０ｌ１１にペレット
を再懸濁した。
心分離した；上清を捨て、リゾチーム１■／一を含有す
る ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ， １０ｍＭ ＥＤＴＡ，
５ｈＭグルコース（ｐＨ ８．０） １．１ｄに細胞ベ
レットを再懸濁した。室温で１０分間後、各遠心管に０
．２ＭＮａＯＨ，ｌ％ＳＤＳを２．０ｄ加え、遠心管を
振盪して細胞を溶解させ、次に氷上に置いた。溶液が澄
明になったら、各遠心管番こ３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．８） １．５−を加えて振盪した。４℃． １５
０１１０ｒｐｍで１０分間遠心して、沈澱を形成させた
。イソプロパノール３ｄを含有する遠沈管に各上清を注
ぎ入れて混合した。室温で１０分間後、１５０ＧＯｒｐ
ｍでｌＯ分間、遠心管を回転させて、沈澱した核酸をべ
レット化した。上清を捨て、ベレットを室温で３０分間
空気乾燥した。乾燥後、１０ａ＋Ｍ Ｔｒｉ３ １０ｍ
ｌｌＥＤＴＡ， ｐＨｇ．ｏ ８５０ｌ１１にペレット
を再懸濁した。
５Ｍ Ｎ ａ ｃＪ１５１１１を各々に加え、この溶液
をイソブロパノール５７５Ｉ１！含有するＥｐｐｅ＋＋
ｄｆＢｌ管に移し、再度、室温で１０分間沈澱させた。
をイソブロパノール５７５Ｉ１！含有するＥｐｐｅ＋＋
ｄｆＢｌ管に移し、再度、室温で１０分間沈澱させた。
次に、遠心管をミクロ遠心機内で４５秒間回転させ、上
溝を捨て、ベレットを空気乾燥した。次に、ＲＮｓｓｅ
１００４／ｄを含有する ＬｈＭ Ｔｈｉｓ， ｌ
ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ Ｉｌ．Ｇ５ｆｌＯｔ１１に
ベレットを溶解し、３７℃で１時間インキユベートして
ＲＮＡを消化した。ＳＭＮａＣｊ！５０バ、次にイソブ
ロパノール３５０Ｉｉ１を加えてＤＮＡを再度沈澱させ
た。室温で１０分間後、４５秒間遠心分離してＤＮＡを
沈澱させ、上溝を捨て、１ｈＭ丁ｒｉｓ， ＬｍＭ Ｅ
ＤＴＡ． ｐｌ１ ８．０ １５０バの最終溶液にペレ
ットを再懸濁した。次に、ＭｖｏＩで消化することによ
りプラスミドミニブリーブを分析した。
溝を捨て、ベレットを空気乾燥した。次に、ＲＮｓｓｅ
１００４／ｄを含有する ＬｈＭ Ｔｈｉｓ， ｌ
ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ Ｉｌ．Ｇ５ｆｌＯｔ１１に
ベレットを溶解し、３７℃で１時間インキユベートして
ＲＮＡを消化した。ＳＭＮａＣｊ！５０バ、次にイソブ
ロパノール３５０Ｉｉ１を加えてＤＮＡを再度沈澱させ
た。室温で１０分間後、４５秒間遠心分離してＤＮＡを
沈澱させ、上溝を捨て、１ｈＭ丁ｒｉｓ， ＬｍＭ Ｅ
ＤＴＡ． ｐｌ１ ８．０ １５０バの最終溶液にペレ
ットを再懸濁した。次に、ＭｖｏＩで消化することによ
りプラスミドミニブリーブを分析した。
ｌｆｌ， ＭＷＩＩ Ｉメチラーゼ遺伝子クローン二
分析されたプラスミドの２つは、Ｍｖｏｌ制限酵素によ
る消化に対し、実質的に、しかし完全にではなく耐性で
あることが分かった。これらクローンは約ｋ ９ｋｂ及び３Ｊｂの長さの２つのＢｓｉＨ Ｉ断片を保
有していた（第２図参照）。これらのブラスミドは同一
であるようであり、従って、ＭｖｏＩ修飾メチラーゼ遺
伝子だけでな（ ＭｖｏＩ制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子を有することが示された。
分析されたプラスミドの２つは、Ｍｖｏｌ制限酵素によ
る消化に対し、実質的に、しかし完全にではなく耐性で
あることが分かった。これらクローンは約ｋ ９ｋｂ及び３Ｊｂの長さの２つのＢｓｉＨ Ｉ断片を保
有していた（第２図参照）。これらのブラスミドは同一
であるようであり、従って、ＭｖｏＩ修飾メチラーゼ遺
伝子だけでな（ ＭｖｏＩ制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子を有することが示された。
目． ＭロＩ制限遺伝子クローン ｌｌｖｏ Ｉ修飾メ
チラーゼ遺伝子を保有することが（第９節で）同定され
たｐＫＬ Ｍｖｏｌ ＲＭ ３−１は、Ｍｖｅ Ｉ制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子を保有していることも分かっ
た。このことは、形質転換によりブラスミドを移入した
大腸菌株Ｅ Ｒ １３９ｇから調製した抽出物のｉ▼ｉ
ｔｒｏでの制限エンドヌクレアーゼアッセイによって証
明された。
チラーゼ遺伝子を保有することが（第９節で）同定され
たｐＫＬ Ｍｖｏｌ ＲＭ ３−１は、Ｍｖｅ Ｉ制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子を保有していることも分かっ
た。このことは、形質転換によりブラスミドを移入した
大腸菌株Ｅ Ｒ １３９ｇから調製した抽出物のｉ▼ｉ
ｔｒｏでの制限エンドヌクレアーゼアッセイによって証
明された。
エンドヌクレアーゼアッセイ：エンドヌクレア一ゼ活性
をアッセイするために２つの溶液を調製した： （ｉ） ＩＯＸ制限エンドヌクレアーゼバッファ：１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）． １６０ｍ
Ｍ Ｍｇ（Ｊ２ ． ｌＨｍＭ２−メノレカブトエ
タノーノレ， １５００鵬ＭＮａＣＪ；及び（ｉｉ）
消化反応用混合物： ＢｉｎｄＩＩ［で消化した９［Ｉ
Ｃ１９（３９５４／Ｍｌ） ４５ｍ． １０Ｘ制１１１
工：／ Ｆ ヌクＬ／７ −ゼバッファ３５。５鱈，蒸
留水２７４．５パでＤ Ｎ Ａ ５０即／ｄとした。
をアッセイするために２つの溶液を調製した： （ｉ） ＩＯＸ制限エンドヌクレアーゼバッファ：１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）． １６０ｍ
Ｍ Ｍｇ（Ｊ２ ． ｌＨｍＭ２−メノレカブトエ
タノーノレ， １５００鵬ＭＮａＣＪ；及び（ｉｉ）
消化反応用混合物： ＢｉｎｄＩＩ［で消化した９［Ｉ
Ｃ１９（３９５４／Ｍｌ） ４５ｍ． １０Ｘ制１１１
工：／ Ｆ ヌクＬ／７ −ゼバッファ３５。５鱈，蒸
留水２７４．５パでＤ Ｎ Ａ ５０即／ｄとした。
細胞抽出物を次のように調製した： ｌＯＧ埒／一の
アンビシリンを加えたＬ−ブロス中、３７℃でクローン
の培養物５０−を一晩増殖させ、４０（ｌｏｒｐｍで５
分間遠心分離することにより細胞をベレット化した。上
溝を捨て、超音波処理バッファ［５０ｍＭ ＫＰＯ４（
ｐＨ ７．５）． ｌｏｉＭ ＢＭＥ， Ｏ．ＩｍＭ
ＥＤＴＡ］ ３ｄにペレットを再懸濁した。リゾチ一
ム１０■／ｄを含む超音波処理バッファ ０．３−を加
え、懸濁液を遠心し、氷上に１時間放置した。
アンビシリンを加えたＬ−ブロス中、３７℃でクローン
の培養物５０−を一晩増殖させ、４０（ｌｏｒｐｍで５
分間遠心分離することにより細胞をベレット化した。上
溝を捨て、超音波処理バッファ［５０ｍＭ ＫＰＯ４（
ｐＨ ７．５）． ｌｏｉＭ ＢＭＥ， Ｏ．ＩｍＭ
ＥＤＴＡ］ ３ｄにペレットを再懸濁した。リゾチ一
ム１０■／ｄを含む超音波処理バッファ ０．３−を加
え、懸濁液を遠心し、氷上に１時間放置した。
サンプル Ｉｄを Ｅｐｐｅｏｄｏ＋Ｉチューブに移し
、１０秒間ずつ３回穏やかに超音波処理して細胞を破壊
した。ミクロ遠心機内でチューブを５分間回転させ、得
られた上清を細胞抽出物として使用した。抽出物をアッ
セイするために、消化反応用混合物を３つのチューブに
分配し、第１チューブに１５０／ｌ１、残りの２本のチ
ューブの各々に ｌＱＱｌ１１入れた。第１チューブに
抽出物？． ｓｌＪ１を加えて混合した。第ｌチューブ
から４７． ５Ｉ１１を取り出して第２チューブに移し
、混合し、同様の操作を繰り返した。従って、第１チュ
ーブはＤＮＡ１埒当り １．０４の抽出物を受容し、第
２チューブは０．３１Ｊ！／Ｉｌｌ、第３チューブはＯ
．ｌｔｌｌ／Ｒ等々を受容した。各々 ｉｏｏＩＩＩｌ
を含有するチューブを６５℃で工時間インキユベートし
た後、各チューブの２０４のサンプルをゲル電気泳動で
分析した。抽出物の力価はｌａｉ！当り約５Ｇ単位であ
ることが分かったが、これは細胞１グラム当り約１０Ｇ
Ｏ単位のＭｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼに相当する
（第３図参照）。
、１０秒間ずつ３回穏やかに超音波処理して細胞を破壊
した。ミクロ遠心機内でチューブを５分間回転させ、得
られた上清を細胞抽出物として使用した。抽出物をアッ
セイするために、消化反応用混合物を３つのチューブに
分配し、第１チューブに１５０／ｌ１、残りの２本のチ
ューブの各々に ｌＱＱｌ１１入れた。第１チューブに
抽出物？． ｓｌＪ１を加えて混合した。第ｌチューブ
から４７． ５Ｉ１１を取り出して第２チューブに移し
、混合し、同様の操作を繰り返した。従って、第１チュ
ーブはＤＮＡ１埒当り １．０４の抽出物を受容し、第
２チューブは０．３１Ｊ！／Ｉｌｌ、第３チューブはＯ
．ｌｔｌｌ／Ｒ等々を受容した。各々 ｉｏｏＩＩＩｌ
を含有するチューブを６５℃で工時間インキユベートし
た後、各チューブの２０４のサンプルをゲル電気泳動で
分析した。抽出物の力価はｌａｉ！当り約５Ｇ単位であ
ることが分かったが、これは細胞１グラム当り約１０Ｇ
Ｏ単位のＭｖｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼに相当する
（第３図参照）。
第１図は、Ｍｖｏｌ制限エンドヌクレアーゼをクローニ
ングし、製造するための概略図を示している。 第２図は、Ｍｔｏｌ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メ
チラーゼをコードする１２ １ｂ ｈｍＨＩ多断片挿入
物の制限地図である。 第３図は、ｐＫＬ ｌｉｖｏ Ｉ ＲＭ ３−１の粗抽
出物から得られたＭｖｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活
性を示すアガロースゲルの写真である。
ングし、製造するための概略図を示している。 第２図は、Ｍｔｏｌ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メ
チラーゼをコードする１２ １ｂ ｈｍＨＩ多断片挿入
物の制限地図である。 第３図は、ｐＫＬ ｌｉｖｏ Ｉ ＲＭ ３−１の粗抽
出物から得られたＭｖｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活
性を示すアガロースゲルの写真である。
Claims (13)
- （１）Ｍｗｏ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有
するクローニングベクター。 - （２）請求項１記載のクローニングベクターを含む形質
転換宿主。 - （３）Ｍｗｏ I 遺伝子をＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｗｏｌｆｅｉ（ＤＳＭ２９７０）から切り出す
請求項１記載のクローニングベクター。 - （４）Ｍｗｏ I 修飾遺伝子を含有するクローニングベ
クター。 - （５）請求項４記載のクローニングベクターを含む形質
転換宿主。 - （６）（ａ）Ｍ．ｗｏｌｆｅｉ由来のＤＮＡからライブ
ラリーを形成すること；（ｂ）Ｍｗｏ I 修飾遺伝子を
含むクローンを単離すること；並びに（ｃ）修飾遺伝子
を含むクローンをスクリーニングし、及びＭｗｏ I 制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むクローンを単離する
ことからなるＭｗｏ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローニング方法。 - （７）（ａ）Ｍ．ｗｏｌｆｅｉ由来のＤＮＡを精製する
工程；（ｂ）精製ＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成す
る工程； （ｃ）該断片をクローニングベクター中に連結する工程
； （ｄ）工程（ｃ）のクローニングベクターで宿主細胞を
形質転換して細胞ライブラリーを形成する工程；及び （ｅ）該細胞ライブラリーから組換えベクターを精製し
てプラスミドライブラリーを形成する工程によってライ
ブラリーを形成する請求項６記載の方法。 - （８）クローニングベクターがｐＢＲ３２２である請求
項７記載の方法。 - （９）宿主細胞が大鵬菌ｈｓｄＲ＾−株である請求項７
記載の方法。 - （１０）Ｍｗｏ I で該プラスミドライブラリーを消化
して消化プールを形成すること、該消化プールを宿主細
胞内に形質転換すること、及びＭｗｏ I 修飾遺伝子を
含むクローンを選択することにより、Ｍｗｏ I 修飾遺
伝子を含むクローンを単離する請求項７記載の方法。 - （１１）（ａ）Ｍ．ｗｏｌｆｅｉ由来のＤＮＡを精製す
ること；（ｂ）適切な制限エンドヌクレアーゼで精製Ｄ
ＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成すること；（ｃ）該断
片をクローニングベクターに連結してＤＮＡ混合物を形
成すること； （ｄ）工程（ｃ）のＤＮＡ混合物で宿主細胞を形質転換
すること； （ｅ）Ｍｗｏ I 修飾メチラーゼ遺伝子を含むクローン
を単離すること； （ｆ）該Ｍｗｏ I 修飾メチラーゼ遺伝子を含むクロー
ンをスクリーニングして、Ｍｗｏ I 制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子を含むクローンを単離すること； （ｇ）工程（ｆ）のクローンを含む宿主細胞を培養する
こと；及び （ｈ）培養物からＭｗｏ I 制限エンドヌクレアーゼを
取り出すこと からなるＭｗｏ I 制限エンドヌクレアーゼの製造方法
。 - （１２）クローニングベクターがプラスミド又はウィル
スＤＮＡ分子である請求項１１記載の方法。 - （１３）プラスミドがｐＢＲ３２２である請求項１２記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US322,685 | 1989-03-13 | ||
| US07/322,685 US5053330A (en) | 1989-03-13 | 1989-03-13 | Method for producing the mwoi restriction endonuclease and methylase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0322977A true JPH0322977A (ja) | 1991-01-31 |
Family
ID=23255977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2062454A Pending JPH0322977A (ja) | 1989-03-13 | 1990-03-13 | ＭｗｏＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5053330A (ja) |
| EP (1) | EP0388136B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0322977A (ja) |
| CA (1) | CA2011975A1 (ja) |
| DE (2) | DE69023681T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8355441B2 (en) | 2004-12-09 | 2013-01-15 | Thomson Licensing | Method and apparatus for generating motion compensated pictures |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5278060A (en) * | 1990-08-30 | 1994-01-11 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Nla III restriction endonuclease and methylase |
| US5288696A (en) * | 1990-09-07 | 1994-02-22 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing and cloning SacII restriction endonuclease and methylase |
| US5192676A (en) * | 1991-02-05 | 1993-03-09 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same |
| US5200337A (en) * | 1991-10-25 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, apo i, obtainable from arthrobacter protophormiae and a process for producing the same |
| CA2159081C (en) * | 1993-03-24 | 2000-11-21 | David Mead | Dinucleotide restriction endonuclease preparations and methods of use |
| EP2565267A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-03-06 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| WO2013074977A1 (en) * | 2011-11-18 | 2013-05-23 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Selective amplification and detection of mutant gene alleles |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc |
-
1989
- 1989-03-13 US US07/322,685 patent/US5053330A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-03-12 CA CA002011975A patent/CA2011975A1/en not_active Abandoned
- 1990-03-13 DE DE69023681T patent/DE69023681T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-13 EP EP90302641A patent/EP0388136B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-13 DE DE90302641T patent/DE388136T1/de active Pending
- 1990-03-13 JP JP2062454A patent/JPH0322977A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8355441B2 (en) | 2004-12-09 | 2013-01-15 | Thomson Licensing | Method and apparatus for generating motion compensated pictures |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0388136A1 (en) | 1990-09-19 |
| US5053330A (en) | 1991-10-01 |
| DE69023681D1 (de) | 1996-01-04 |
| EP0388136B1 (en) | 1995-11-22 |
| DE69023681T2 (de) | 1996-08-14 |
| DE388136T1 (de) | 1994-02-03 |
| CA2011975A1 (en) | 1990-09-13 |
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