JPH022370A - ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 - Google Patents
ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法Info
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- JPH022370A JPH022370A JP63319327A JP31932788A JPH022370A JP H022370 A JPH022370 A JP H022370A JP 63319327 A JP63319327 A JP 63319327A JP 31932788 A JP31932788 A JP 31932788A JP H022370 A JPH022370 A JP H022370A
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- gene
- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明のバックグラウンド
本発明は、制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩおよびその
修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。
修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。
制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中にみられる酵素
の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する伯
の細菌成分から精製すると、実験室でＤＮＡ分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、ＤＮＡ分子はひとつずつ
独自に同定することができ、またその構成遺伝子別に分
画することができる。制限エンドヌクレアーゼは現代の
遺伝子研究における不可欠の手段であることが立証され
ている。これらの酵素は、遺伝子の工学および解析を達
成するのに使用される生化学的な「ハサミ」である。
の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する伯
の細菌成分から精製すると、実験室でＤＮＡ分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、ＤＮＡ分子はひとつずつ
独自に同定することができ、またその構成遺伝子別に分
画することができる。制限エンドヌクレアーゼは現代の
遺伝子研究における不可欠の手段であることが立証され
ている。これらの酵素は、遺伝子の工学および解析を達
成するのに使用される生化学的な「ハサミ」である。
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用で−る。
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用で−る。
これらの酵素はＤＮＡ分子に結合すると、認識配列の内
部または一端でその分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼはそれぞれ異なる認識配列に対して親和力
をもっている。今日までに調べられた幾百種もの細菌で
百を越える数の異なる制限エンドヌクレアーゼが同定さ
れている。
部または一端でその分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼはそれぞれ異なる認識配列に対して親和力
をもっている。今日までに調べられた幾百種もの細菌で
百を越える数の異なる制限エンドヌクレアーゼが同定さ
れている。
通常細菌は、その種石に、小数の制限エンドヌフレアー
ゼをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼはそ
れの由来となった細菌に因んで命名される。たとえば、
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔ＋ｕｓは１−
１ａｅＩ、Ｈａｅ■およびＨａｃ［ｌとよばれる３つの
異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵
素（ま、それぞれ（八Ｔ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、ＰｕＧＣ
ＧＣＰｙおよびＧＧＣＣという配列を認識して開裂する
。一方、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒ
Ｙ１３は唯１種類の酵素Ｅ（１０）ＲＩを合成するだけ
であり、このＰ？！素はＧＡＡＴＴＣという配列を認識
する。
ゼをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼはそ
れの由来となった細菌に因んで命名される。たとえば、
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔ＋ｕｓは１−
１ａｅＩ、Ｈａｅ■およびＨａｃ［ｌとよばれる３つの
異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵
素（ま、それぞれ（八Ｔ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、ＰｕＧＣ
ＧＣＰｙおよびＧＧＣＣという配列を認識して開裂する
。一方、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒ
Ｙ１３は唯１種類の酵素Ｅ（１０）ＲＩを合成するだけ
であり、このＰ？！素はＧＡＡＴＴＣという配列を認識
する。
理論にとられれるつもりはないが、制限エンドヌクレア
ーゼは自然界で細菌細胞の繁殖に関して防衛的な役割を
果たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、
細菌は、もしこれらの酵素がなければこれらの細菌を殺
したりまたはこれらに寄生したりするウィルスやプラス
ミドのような外来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗す
ることが可能になる。制限エンドヌクレアーゼは、侵入
して来るＤＮＡ分子に結合し、それぞれの認識配列に出
会う度毎にそれらのＤＮＡ分子を開裂することによって
、細菌に抵抗性を付与する。こうして生起する破壊作用
の結果、侵入する感染性の遺伝子の多くは不活化され、
そのＤＮＡはエキソヌクレアーゼによってさらに細かく
分解されることになる。
ーゼは自然界で細菌細胞の繁殖に関して防衛的な役割を
果たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、
細菌は、もしこれらの酵素がなければこれらの細菌を殺
したりまたはこれらに寄生したりするウィルスやプラス
ミドのような外来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗す
ることが可能になる。制限エンドヌクレアーゼは、侵入
して来るＤＮＡ分子に結合し、それぞれの認識配列に出
会う度毎にそれらのＤＮＡ分子を開裂することによって
、細菌に抵抗性を付与する。こうして生起する破壊作用
の結果、侵入する感染性の遺伝子の多くは不活化され、
そのＤＮＡはエキソヌクレアーゼによってさらに細かく
分解されることになる。
細菌の防御系の第二の要素は修飾メチラーゼである。こ
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、
これらが提供する手段によって、細菌は外来の感染性Ｄ
ＮＡから自身のＤＮＡを区別し防御できるようになる。
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、
これらが提供する手段によって、細菌は外来の感染性Ｄ
ＮＡから自身のＤＮＡを区別し防御できるようになる。
修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーぜと同
じヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、
このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加するこ
とによってその認識配列内のヌクレオチドのいずれかを
化学的に修飾する。このメチル化が起こると、制限エン
ドヌクレアーゼがその認識配列に結合することはなくな
り、また、その配列が制限エンドヌクレアーゼに開裂さ
れることもなくなる。
じヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、
このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加するこ
とによってその認識配列内のヌクレオチドのいずれかを
化学的に修飾する。このメチル化が起こると、制限エン
ドヌクレアーゼがその認識配列に結合することはなくな
り、また、その配列が制限エンドヌクレアーゼに開裂さ
れることもなくなる。
細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼの活性のおかげ
でいつも充分に修飾されており、したがって内因性の制
限エンドヌクレアーゼの存在に対して全く感受性をもた
ない。制限エンドヌクレアーゼの認識と攻撃に対して感
受性のあるのは未修飾のＤ Ｉ’Ｊ Ａ、したがって外
来のものであることが確認できるＤＮＡだけである。
でいつも充分に修飾されており、したがって内因性の制
限エンドヌクレアーゼの存在に対して全く感受性をもた
ない。制限エンドヌクレアーゼの認識と攻撃に対して感
受性のあるのは未修飾のＤ Ｉ’Ｊ Ａ、したがって外
来のものであることが確認できるＤＮＡだけである。
遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をクロ
ーニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質や
酵素を従来の精製技術で取得可能な量より大量に生産す
ることが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローンを単離する際の鍵は、そのようなりローンの出
現頻度が１０−３〜１０−４程度に低い場合、複雑な「
ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られ
るクローンの集団の中で目的とするクローンを同定する
ための簡単で信頼のおける方法を開発することである。
ーニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質や
酵素を従来の精製技術で取得可能な量より大量に生産す
ることが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローンを単離する際の鍵は、そのようなりローンの出
現頻度が１０−３〜１０−４程度に低い場合、複雑な「
ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られ
るクローンの集団の中で目的とするクローンを同定する
ための簡単で信頼のおける方法を開発することである。
この方法は、目的としない大多数のクローンは死滅する
が珍にある望ましいクローンは生き残れるように選択的
なものであると好ましい。
が珍にある望ましいクローンは生き残れるように選択的
なものであると好ましい。
■型の制限−隆飾系はクローニングされつつあり、その
数は次第に増加している。最初にクローニングされた系
では、制限エンドヌクレアーぜクローンを同定または選
択する手段としてバクチリオフ？−ジによる感染が使用
された［ＨｈａＩＩ：Ｈａｎｎ ａｔ ａｌ、、Ｇｅｎ
ｅ、 ３：９７−１１２（１９７８）： ＥｃｏＲＩＩ
：にｏｓｙｋｈ ｅｔ ａｌ、、Ｈｏ１ｅｃ、 ｌ１
ｌｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、 １７８ ： ７１７−７
１９（１９８０）； ＰｓｔＩ ： Ｗａｌｄｃｒ
ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、 ＮａｔＡｃａｄ、 Ｓｃｉ
、 ＵＳＡ ７８ １５（１２）−１５０７ （１９
８１）］ 。
数は次第に増加している。最初にクローニングされた系
では、制限エンドヌクレアーぜクローンを同定または選
択する手段としてバクチリオフ？−ジによる感染が使用
された［ＨｈａＩＩ：Ｈａｎｎ ａｔ ａｌ、、Ｇｅｎ
ｅ、 ３：９７−１１２（１９７８）： ＥｃｏＲＩＩ
：にｏｓｙｋｈ ｅｔ ａｌ、、Ｈｏ１ｅｃ、 ｌ１
ｌｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、 １７８ ： ７１７−７
１９（１９８０）； ＰｓｔＩ ： Ｗａｌｄｃｒ
ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、 ＮａｔＡｃａｄ、 Ｓｃｉ
、 ＵＳＡ ７８ １５（１２）−１５０７ （１９
８１）］ 。
細菌中に制限−修飾系が存在すると細菌はバクテリオフ
ァージによる感染に対して抵抗できるので、クローニン
グされた制限−修飾遺伝子を担持する細胞は、原則とし
て、ファージに暴露されたライブラリーから生えて来る
（生き残る）株として選択的に単離することができる。
ァージによる感染に対して抵抗できるので、クローニン
グされた制限−修飾遺伝子を担持する細胞は、原則とし
て、ファージに暴露されたライブラリーから生えて来る
（生き残る）株として選択的に単離することができる。
しかしこの方法は限られた価値しかないことが判明した
。すなわち、クローニングされた制限−修飾遺伝子は、
選択的な生き残りを可能にする程に充分なファージ耐性
を常に発現するとは限らないことが判明したのである。
。すなわち、クローニングされた制限−修飾遺伝子は、
選択的な生き残りを可能にする程に充分なファージ耐性
を常に発現するとは限らないことが判明したのである。
もうひとつ別のクローニング法では、最初プラスミド由
来とされていた系をＥ、ｃｏｌｉクローニングプラスミ
ド中に組み込んでいる［Ｅ（１０）ＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅ
ｌｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、 １２゜３６５９−３６７６（１９８
４）＋ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｑｅｒａｓ ａｎｄ Ｂｒｏ
ｏｋｓ。
来とされていた系をＥ、ｃｏｌｉクローニングプラスミ
ド中に組み込んでいる［Ｅ（１０）ＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅ
ｌｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、 １２゜３６５９−３６７６（１９８
４）＋ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｑｅｒａｓ ａｎｄ Ｂｒｏ
ｏｋｓ。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ
Ａ、 ８０：４０２−４０６（１９８３） ：Ｔｈｅｒ
＋ａｕ１℃ ａｎｄ Ｒｏｙ、Ｇｅｎｅ、１９：３５
５−３５９ （１９８２）ｐｖｕ［： Ｂｌｕｍｅｎ
ｔｈａｌ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、。
Ａ、 ８０：４０２−４０６（１９８３） ：Ｔｈｅｒ
＋ａｕ１℃ ａｎｄ Ｒｏｙ、Ｇｅｎｅ、１９：３５
５−３５９ （１９８２）ｐｖｕ［： Ｂｌｕｍｅｎ
ｔｈａｌ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、。
１６４： ５０１−５０９ （１９８５）］。
第三の方法としてますます多くの系のクローニングに使
用されている方法では、本発明者らの特許出願第７０７
０７９号に関連する活性なメチラーゼ遺伝子について選
択する［ＢｓｕＲＩ ： Ｋ１５ｓ ｅｔ ａＮｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １３： ６４（１
２）−６４２１ （１９８５）］。
用されている方法では、本発明者らの特許出願第７０７
０７９号に関連する活性なメチラーゼ遺伝子について選
択する［ＢｓｕＲＩ ： Ｋ１５ｓ ｅｔ ａＮｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １３： ６４（１
２）−６４２１ （１９８５）］。
制限遺伝子と修飾遺伝子とは近接して存在する傾向があ
るので、両者の遺伝子を含有するクローンは一方の遺伝
子について選択するだけで単離できることが多い。しか
し、メチル化活性による選択では常に完全な制限−修飾
系が得られるわけではなく、逆に、メチラーゼ遺伝子の
みが得られることもある［ Ｂ ＳＤＲＩ ： Ｓｚｏ
ｍｏｌａｎｙｉ ａｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅｌｏ：２１９
−２２５ （１９８０）；Ｂｃｒ＋Ｉ ： Ｊａｎｕｌ
ａｉｔｉｓ ｅｔ ａＧｅｎｅ、 ２０：１９７−２０
４ （１９８２） ： ＢｓｕＲＩ ：にｉｓｓ ａ
ｎｄＢａｌｄａｕｆ、Ｇｅｎｅ、 ２１＋１１１−１１
９ （１９８３）；およびＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒｅｔ
ａｔ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、
２５８：１２３５−１２４１（１９８３）］ 。
るので、両者の遺伝子を含有するクローンは一方の遺伝
子について選択するだけで単離できることが多い。しか
し、メチル化活性による選択では常に完全な制限−修飾
系が得られるわけではなく、逆に、メチラーゼ遺伝子の
みが得られることもある［ Ｂ ＳＤＲＩ ： Ｓｚｏ
ｍｏｌａｎｙｉ ａｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅｌｏ：２１９
−２２５ （１９８０）；Ｂｃｒ＋Ｉ ： Ｊａｎｕｌ
ａｉｔｉｓ ｅｔ ａＧｅｎｅ、 ２０：１９７−２０
４ （１９８２） ： ＢｓｕＲＩ ：にｉｓｓ ａ
ｎｄＢａｌｄａｕｆ、Ｇｅｎｅ、 ２１＋１１１−１１
９ （１９８３）；およびＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒｅｔ
ａｔ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、
２５８：１２３５−１２４１（１９８３）］ 。
制限−修飾遺伝子のクローニングに対する基本的な障害
は、ＩＩＩｆｓによって保護されていない宿主中にエン
ドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。
は、ＩＩＩｆｓによって保護されていない宿主中にエン
ドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。
メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒
に単一のクローンとして導入すると、エンドヌクレアー
ゼが宿主ＤＮＡを開裂する機会を得る前にメチラーゼが
そのＤＮＡを修飾して保護するはずである。したがって
、場合によっては、これらの遺伝子は順番（すなわち、
最初にメチラーゼ、次にエンドヌクレアーぜの順）にの
みクローニングが可能となるかもしれない。
に単一のクローンとして導入すると、エンドヌクレアー
ゼが宿主ＤＮＡを開裂する機会を得る前にメチラーゼが
そのＤＮＡを修飾して保護するはずである。したがって
、場合によっては、これらの遺伝子は順番（すなわち、
最初にメチラーゼ、次にエンドヌクレアーぜの順）にの
みクローニングが可能となるかもしれない。
制限−修飾系のクローニングに対する別の障害は、旦３
匹月の株の中にはシトシンの修飾に対して逆の反応を示
すものがあるという発見にある。すなわら、そのような
株は、メチル化シトシンを含有しているＤＮＡを破壊す
る系をもっているのである［Ｒａｌｅｉｇｈ ａｎｄ
Ｗｉｌｓｏｎ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＡｃａｄＳ
ｃ＋、 ＵＳＡ、 ８３・９０７０−９０７４ （１
９８６） ］。シトシンに特異的なメチラーゼ遺伝子は
、それ単独でも、あるいはそれに対応するエンドヌクレ
アーゼ遺伝子と一緒にでも、これらの株中で容易にクロ
ーニングすることができない。この問題を避けるために
は、これらの系を欠損しているＥ、ｃｏｌｉ変異株（Ｍ
ＣｒＡ およびＭｃｒＢ ）を使用する必要があ
る。
匹月の株の中にはシトシンの修飾に対して逆の反応を示
すものがあるという発見にある。すなわら、そのような
株は、メチル化シトシンを含有しているＤＮＡを破壊す
る系をもっているのである［Ｒａｌｅｉｇｈ ａｎｄ
Ｗｉｌｓｏｎ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＡｃａｄＳ
ｃ＋、 ＵＳＡ、 ８３・９０７０−９０７４ （１
９８６） ］。シトシンに特異的なメチラーゼ遺伝子は
、それ単独でも、あるいはそれに対応するエンドヌクレ
アーゼ遺伝子と一緒にでも、これらの株中で容易にクロ
ーニングすることができない。この問題を避けるために
は、これらの系を欠損しているＥ、ｃｏｌｉ変異株（Ｍ
ＣｒＡ およびＭｃｒＢ ）を使用する必要があ
る。
精製した制限エンドヌクレアーゼ、および重要性はそれ
より落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡの特性
決定と再配列をするのに有用な道具であるから、これら
の酵素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術によ
って得ることは商業的に魅力がある。そのような株が得
られれば、商業的に有用な樋で生産するための手段が提
供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思われ
るので、これらの株は極めて有用なものとなろう。
より落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡの特性
決定と再配列をするのに有用な道具であるから、これら
の酵素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術によ
って得ることは商業的に魅力がある。そのような株が得
られれば、商業的に有用な樋で生産するための手段が提
供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思われ
るので、これらの株は極めて有用なものとなろう。
発明の概要
本発明によって、 Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ ｏ
ｋｅａｎｏｋｏ−ｔｅｓ （ＩＦＯ１２５３６）に由来
するＦｏｋ■制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラ
ーゼの遺伝子を含有するクローン、ならびにこれらの酵
素の生産方法が提供される。より特定すると、本発明は
、ＧＧＡＴＧというＤＮＡ配列を認識してそれより９７
１３ヌクレオチド下流で開裂する酵素である制限エンド
ヌクレアーぜＦｏｋＩを発現するクローンに係る。
ｋｅａｎｏｋｏ−ｔｅｓ （ＩＦＯ１２５３６）に由来
するＦｏｋ■制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラ
ーゼの遺伝子を含有するクローン、ならびにこれらの酵
素の生産方法が提供される。より特定すると、本発明は
、ＧＧＡＴＧというＤＮＡ配列を認識してそれより９７
１３ヌクレオチド下流で開裂する酵素である制限エンド
ヌクレアーぜＦｏｋＩを発現するクローンに係る。
Ｓｕｇｉｓａｋｉ、１１． ａｎｄ Ｋａｎａｚａｗ
ａ、Ｓ、、 １９８１． Ｇｅｎｅ、１６７３−７８
参照（その開示内容は、ここで引用したことによって本
明細書中に含まれるものとする）。
ａ、Ｓ、、 １９８１． Ｇｅｎｅ、１６７３−７８
参照（その開示内容は、ここで引用したことによって本
明細書中に含まれるものとする）。
本発明に従って生産されるＦｏｋＩ制限エンドヌクレア
ーゼは実質的に純粋であって、５ｕ（ｌｉｓａｋｉ ａ
ｎｄＫａｎａＺａＷａ、 ５Ｌｌｐｒａに開示されてい
るような従来の技術によって製造されたＦｏｋＩ調製物
中に通常みられる夾雑物を含んでいない。
ーゼは実質的に純粋であって、５ｕ（ｌｉｓａｋｉ ａ
ｎｄＫａｎａＺａＷａ、 ５Ｌｌｐｒａに開示されてい
るような従来の技術によって製造されたＦｏｋＩ調製物
中に通常みられる夾雑物を含んでいない。
この酵素をクローニングする好ましい方法は、Ｆｌａｖ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ
（ＩＦＯ１２５３６）に由来するＤＮＡを含有するライ
ブラリーを形成し、ＦｏｋＩ修飾メチラーゼをコードし
ているＤＮＡを含有するクローンを単離し、これらをス
クリーニングしＵ、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子も共に含有しているクローンを同定することからな
る。
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ
（ＩＦＯ１２５３６）に由来するＤＮＡを含有するライ
ブラリーを形成し、ＦｏｋＩ修飾メチラーゼをコードし
ているＤＮＡを含有するクローンを単離し、これらをス
クリーニングしＵ、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子も共に含有しているクローンを同定することからな
る。
発明の詳細な説明
本発明は、ｌ”ｏｋ■制限および修飾遺伝子のクローン
、ならびにそのようなりローンによって生産される制限
エンドヌクレアーゼＦｏｋＩに係る。これらのＦＯｋ工
遺伝子は、ＦｏｋＩａ飾メチラーぜ遺伝子を含有し発現
することに基づいて選択したある種のクローンが同時に
ＦｏｋＩ制限遺伝子も含有しているという事実を利用す
る方法によってクローニングされる。そのようなりロー
ンのＤＮＡはＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼによるｉ
ｎ ＶｉｔｒＯ消化に対して耐性を示す。この消化に対
する耐性によって、ｌ”ｏｋ■メチラーゼおよび制限エ
ンドヌクレアーゼをコードしているクローンを選択的に
単離するための手段がＩＦＰられる。
、ならびにそのようなりローンによって生産される制限
エンドヌクレアーゼＦｏｋＩに係る。これらのＦＯｋ工
遺伝子は、ＦｏｋＩａ飾メチラーぜ遺伝子を含有し発現
することに基づいて選択したある種のクローンが同時に
ＦｏｋＩ制限遺伝子も含有しているという事実を利用す
る方法によってクローニングされる。そのようなりロー
ンのＤＮＡはＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼによるｉ
ｎ ＶｉｔｒＯ消化に対して耐性を示す。この消化に対
する耐性によって、ｌ”ｏｋ■メチラーゼおよび制限エ
ンドヌクレアーゼをコードしているクローンを選択的に
単離するための手段がＩＦＰられる。
ＦｏｋＩ制限遺伝子およびメチラーゼ遺伝子をクローニ
ングして発現させるための本発明の好ましい方法を第１
図に示すが、これには以下のステップが含まれる。
ングして発現させるための本発明の好ましい方法を第１
図に示すが、これには以下のステップが含まれる。
（１） Ｈａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａ
ｎｏｋｏｉｔｅｓのＤＮＡを精製する。Ｆｌａｖｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓはＳｕｇｉ
ｓａｋｉ ａｎｄ Ｋａｎａｚａｗａ、 ５ｕｐｒａを
始めとしていくつかの刊行物（その開示内容は、ここで
引用したことによって水明ｍ書に含まれるものとする）
に記載されており、この細菌のサンプルは大阪の８！Ｉ
Ｐ？ｆ研究所（ｔｈｅ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ
ＦｅｒｍｅｎｔａＮｏｎＯｓａｋａ）からＩＦｏ １２
５３６として入手可能である。
ｎｏｋｏｉｔｅｓのＤＮＡを精製する。Ｆｌａｖｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓはＳｕｇｉ
ｓａｋｉ ａｎｄ Ｋａｎａｚａｗａ、 ５ｕｐｒａを
始めとしていくつかの刊行物（その開示内容は、ここで
引用したことによって水明ｍ書に含まれるものとする）
に記載されており、この細菌のサンプルは大阪の８！Ｉ
Ｐ？ｆ研究所（ｔｈｅ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ
ＦｅｒｍｅｎｔａＮｏｎＯｓａｋａ）からＩＦｏ １２
５３６として入手可能である。
（２） このＤＮＡを１Ｉ１１限エンドヌクレアーゼ
）（ｈａ■で消化する。
）（ｈａ■で消化する。
（３） 消化したＤＮＡを、１個以上のＦｏｋＩ部位
を含有するｌ）Ｕ Ｃ１９（ＡＴＣＣ３γ２５４）のよ
うなりロニングベクターに連結する。連結したＤＮＡを
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＲＩ株（ＡＴ
ＣＣ３１３４３＞のような適当な宿主に形質転換する。
を含有するｌ）Ｕ Ｃ１９（ＡＴＣＣ３γ２５４）のよ
うなりロニングベクターに連結する。連結したＤＮＡを
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＲＩ株（ＡＴ
ＣＣ３１３４３＞のような適当な宿主に形質転換する。
（４） このＤＮＡ／細胞混合物を、形質転換細胞を
選択するためのアンピシリンのような抗生物質を含有す
る培地に接種する。培養後形質転換細胞コロニーをひと
つに集めてセルライブラリーとする。
選択するためのアンピシリンのような抗生物質を含有す
る培地に接種する。培養後形質転換細胞コロニーをひと
つに集めてセルライブラリーとする。
（５） このセルライブラリーから組換えプラスミド
全部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成
する。
全部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成
する。
（６） このプラスミドライブラリーを、Ｓｕｇｉｓ
ａｋａｎｄ Ｋａｎａｚａｗａ、 ５ｕｐｒａに記載さ
れている方法と類似の方法によってＦｌａＶＯｂａＣｔ
（！ｒｉ１ｍｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓから製造したＦ
ｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化する。Ｆｏ
ｋＩ消化により、メチラーゼを含有しない未修飾クロー
ンが特異的に破壊され、ＦｏｋＩメチラーゼ担持クロー
ンの相対頻度が増大する。
ａｋａｎｄ Ｋａｎａｚａｗａ、 ５ｕｐｒａに記載さ
れている方法と類似の方法によってＦｌａＶＯｂａＣｔ
（！ｒｉ１ｍｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓから製造したＦ
ｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化する。Ｆｏ
ｋＩ消化により、メチラーゼを含有しない未修飾クロー
ンが特異的に破壊され、ＦｏｋＩメチラーゼ担持クロー
ンの相対頻度が増大する。
（７） 消化したプラスミドライブラリーのＤＮＡを
旦ｃｏｌｉＲ旧株のような適当な宿主に形質転換し、抗
生物質プレートに接種して形質転換コロニーを再度取得
する。これらのコロニーを採取し、そのＤＮＡをｌ：ｏ
ｋＩＩｌｆｌ遺伝子の存在について以下のようにして分
析する。すなわち、コロニーが担持するプラスミドＤＮ
Ａを精製し、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼと共にｉ
ｎ ＶｉｔｒＯでインキュベートしてＦｏｋＩ消化に対
して低抗性か否かを決定する。また、このクローンの全
細胞ＤＮＡ （染色体およびプラスミド）も精製してＦ
ｏｋＩ制限エンドヌクレアーぜと共にインキュベ−１〜
する。
旦ｃｏｌｉＲ旧株のような適当な宿主に形質転換し、抗
生物質プレートに接種して形質転換コロニーを再度取得
する。これらのコロニーを採取し、そのＤＮＡをｌ：ｏ
ｋＩＩｌｆｌ遺伝子の存在について以下のようにして分
析する。すなわち、コロニーが担持するプラスミドＤＮ
Ａを精製し、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼと共にｉ
ｎ ＶｉｔｒＯでインキュベートしてＦｏｋＩ消化に対
して低抗性か否かを決定する。また、このクローンの全
細胞ＤＮＡ （染色体およびプラスミド）も精製してＦ
ｏｋＩ制限エンドヌクレアーぜと共にインキュベ−１〜
する。
ＦｏｋＩメチラーゼ遺伝子を担持するクローンのＤＮＡ
は充分に修飾されているはずであり、プラスミドＤＮＡ
と全ＤＮＡは両方とも消化に対して実質的または完全に
抵抗性であるはずである。
は充分に修飾されているはずであり、プラスミドＤＮＡ
と全ＤＮＡは両方とも消化に対して実質的または完全に
抵抗性であるはずである。
（８） ステップ（７）でＦｏｋＩメチラーゼ遺伝子
を担持していることが確認されたクローンの粗抽出物を
調製し、この抽出物のＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーぜ
活性を検定することによって、ＦｏｋＩ制限エンドヌク
レアーゼを担持するクローンを同定する。この際、プラ
スミドが形質転換によって移入されているＥ 、 ｃｏ
ｌｉ ８８２９４ （ＡＴＣＣ３３６２５）のようなｅ
ｎｄｏＡ−株から粗細胞抽出物を調製すると、その抽出
物中のＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の測定は容
易になる。
を担持していることが確認されたクローンの粗抽出物を
調製し、この抽出物のＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーぜ
活性を検定することによって、ＦｏｋＩ制限エンドヌク
レアーゼを担持するクローンを同定する。この際、プラ
スミドが形質転換によって移入されているＥ 、 ｃｏ
ｌｉ ８８２９４ （ＡＴＣＣ３３６２５）のようなｅ
ｎｄｏＡ−株から粗細胞抽出物を調製すると、その抽出
物中のＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の測定は容
易になる。
（９） ＦＯｋＩ制限および修飾遺伝子を担持してい
るクローンをｉｓ槽内のアンピシリン含有富化培地中で
増殖させることによって、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレア
ーゼを生産することができる。その後、細胞を遠心して
採集し、音波処理で破砕すると、ＦＯｋＩ制限エンドヌ
クレアーゼ活性を含有する粗細胞抽出物が生成する。
るクローンをｉｓ槽内のアンピシリン含有富化培地中で
増殖させることによって、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレア
ーゼを生産することができる。その後、細胞を遠心して
採集し、音波処理で破砕すると、ＦＯｋＩ制限エンドヌ
クレアーゼ活性を含有する粗細胞抽出物が生成する。
（１０） ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含
有する粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフ
ィーやイオン交換クロマ１−グラフィーのように標準的
なタンパク質精製技術によって精製する。
有する粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフ
ィーやイオン交換クロマ１−グラフィーのように標準的
なタンパク質精製技術によって精製する。
上に概略を記載した手順は本発明の好ましい実施態様で
あるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変える
ことができるということは当業者には明らかであろう。
あるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変える
ことができるということは当業者には明らかであろう。
以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示する
が、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはないものと名えられたい。
が、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはないものと名えられたい。
実施例
ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
（１） ＤＮＡの精製：
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔ
ｅｓ（ＩＦＯ１２５３６）の凍結した細胞１０ｇを氷上
で１時間＠凍した後２０ｄの２５％スクロース、 ５０
ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ８，０中に再懸濁させた。１０７の
０．２５ＨＥＤＴＡ ｐＨ８，０および６威の１０１ｎ
９／ｉリゾデーム（０，２５ＨＴｒｉｓ ｐＨ８，０中
）を加えた。この懸濁液を２時間氷上に保った後、２４
戒のＩＸ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５０ｍＨ丁
ｒｉｓ ｐＨ８，０，６７ｍＨＥＤＴＡおよび５Ｉ
！Ｉ１．の１０％ＳＤＳを加えて溶菌させた。
ｅｓ（ＩＦＯ１２５３６）の凍結した細胞１０ｇを氷上
で１時間＠凍した後２０ｄの２５％スクロース、 ５０
ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ８，０中に再懸濁させた。１０７の
０．２５ＨＥＤＴＡ ｐＨ８，０および６威の１０１ｎ
９／ｉリゾデーム（０，２５ＨＴｒｉｓ ｐＨ８，０中
）を加えた。この懸濁液を２時間氷上に保った後、２４
戒のＩＸ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５０ｍＨ丁
ｒｉｓ ｐＨ８，０，６７ｍＨＥＤＴＡおよび５Ｉ
！Ｉ１．の１０％ＳＤＳを加えて溶菌させた。
１ｑられた溶液を、（前もって０．５ＨＴｒｉｓ、 ｐ
Ｈ８，０で平衡化した）フェノール７０ｄおよびクロロ
ホルムロ０ｄで抽出した。１りられた乳濁液を１０Ｋｒ
ｐｍで３０分遠心し、粘稠な上層を取り出し、１０ｍＨ
Ｔｒｙｓ ｐＨ８，０，１！ｎＨＥＤＴ八に対しこの液
を四回交換して透析した。次に、透析した溶液を最終濃
度１００刃／ｒｎｆ！。
Ｈ８，０で平衡化した）フェノール７０ｄおよびクロロ
ホルムロ０ｄで抽出した。１りられた乳濁液を１０Ｋｒ
ｐｍで３０分遠心し、粘稠な上層を取り出し、１０ｍＨ
Ｔｒｙｓ ｐＨ８，０，１！ｎＨＥＤＴ八に対しこの液
を四回交換して透析した。次に、透析した溶液を最終濃
度１００刃／ｒｎｆ！。
のＲＮａｓｅにより３７℃で１時間消化した。次に、Ｄ
ＮＡを沈澱させるために、ＮａＣａを最終濃度０．４Ｈ
まで加え、０．５５倍容量のイソプロピルアルコールを
重層し、相を一緒に混合することによってＤＮＡをガラ
ス捧に巻き付けて取り出した。このＤＮＡを１０ｍＨＴ
ｒｉｓ ｐＨ８，０，１ｍＨ［ＤＴＡ ニ再懸濁させて
４℃で貯蔵した。
ＮＡを沈澱させるために、ＮａＣａを最終濃度０．４Ｈ
まで加え、０．５５倍容量のイソプロピルアルコールを
重層し、相を一緒に混合することによってＤＮＡをガラ
ス捧に巻き付けて取り出した。このＤＮＡを１０ｍＨＴ
ｒｉｓ ｐＨ８，０，１ｍＨ［ＤＴＡ ニ再懸濁させて
４℃で貯蔵した。
（２） ＤＮＡの消化：
ＤＮＡを５０ｍＨＴｒｙｓ ｐＨ７，５，５Ｏｎ＋ＨＮ
ａＣｊ） 、 １０ｍＨＨｇｃｐ、 ２中に１００１１
３／ｒＲｆ！の濃度で希釈し、ＤＮＡ１埒当たり２ ｕ
ｎｉｔのＸｂａＩを加えた。１りられた溶液を１時間３
７℃にインキュベートした後、１２分間７２℃に加熱し
て消化を停止した。
ａＣｊ） 、 １０ｍＨＨｇｃｐ、 ２中に１００１１
３／ｒＲｆ！の濃度で希釈し、ＤＮＡ１埒当たり２ ｕ
ｎｉｔのＸｂａＩを加えた。１りられた溶液を１時間３
７℃にインキュベートした後、１２分間７２℃に加熱し
て消化を停止した。
（３） 連結および形質転換：
Ｘｂａ工テ消化したＨａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋ
ｅａｎｏｋｏｉｔ−肚のＤＮＡ４，０μび〈４０成〉を
、ＸｂａＩで開裂し脱リン酸化したＩ）Ｕ Ｃ１９２，
０埒（１０Ｉｉｉ）と混合した。
ｅａｎｏｋｏｉｔ−肚のＤＮＡ４，０μび〈４０成〉を
、ＸｂａＩで開裂し脱リン酸化したＩ）Ｕ Ｃ１９２，
０埒（１０Ｉｉｉ）と混合した。
１０成の５００ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１００ｍＨ
Ｈｇｂｉ！２，１００ｍＨＤＴＴ、 ５ｍＨＡＴＰ、お
よび４０成の滅菌蒸溜水を加えて容積を１００ｇとした
。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを３．７５度加え、得られた溶
液を４時間１６℃にインキュベートした後、クロロボル
ム２０成で抽出して滅菌した。連結した混合物 ８０ｐ
ｉを、１．０ｍの５０ｍＨＮａＣｉ！ 、 ５ｍＨクエ
ン酸Ｈａ３．６７ｍＨＣａＣ１！２と混合し、氷冷した
Ｅ 、 ｃｏｌｉ ｌ１Ｒ１（ＡＴＣＣ３１３４３）コ
ンピテント細胞を２．〇−加えた。得られた溶液を５分
間４２℃にインキュベートした後、８蛇の Ｌｕｒｔａ
−ブロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）を添加して３０℃で４時間
インキュベーションを続行した。
Ｈｇｂｉ！２，１００ｍＨＤＴＴ、 ５ｍＨＡＴＰ、お
よび４０成の滅菌蒸溜水を加えて容積を１００ｇとした
。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを３．７５度加え、得られた溶
液を４時間１６℃にインキュベートした後、クロロボル
ム２０成で抽出して滅菌した。連結した混合物 ８０ｐ
ｉを、１．０ｍの５０ｍＨＮａＣｉ！ 、 ５ｍＨクエ
ン酸Ｈａ３．６７ｍＨＣａＣ１！２と混合し、氷冷した
Ｅ 、 ｃｏｌｉ ｌ１Ｒ１（ＡＴＣＣ３１３４３）コ
ンピテント細胞を２．〇−加えた。得られた溶液を５分
間４２℃にインキュベートした後、８蛇の Ｌｕｒｔａ
−ブロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）を添加して３０℃で４時間
インキュベーションを続行した。
（４） セルライブラリー二
形質転換した細胞培養液を簡単に遠心した後、上清を捨
て、細胞を１□ＯｄのＬ −ｂｒｏｔｈに再懸濁させた
。そのうちの２００屑を、アンピシリンを１００、ｃｇ
／＠ｇ含有するＬｕｒｉａ−寒天（Ｌ−ａｇａｒ）プレ
ート上に接種した。−晩３０℃にインキュベートした後
、各プレートに２，５ｄの１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，
５゜＋ＯｍＨＨｇＣｌ２を満たし、形質転換コロニーを
全部掻き集めてプールした。
て、細胞を１□ＯｄのＬ −ｂｒｏｔｈに再懸濁させた
。そのうちの２００屑を、アンピシリンを１００、ｃｇ
／＠ｇ含有するＬｕｒｉａ−寒天（Ｌ−ａｇａｒ）プレ
ート上に接種した。−晩３０℃にインキュベートした後
、各プレートに２，５ｄの１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，
５゜＋ＯｍＨＨｇＣｌ２を満たし、形質転換コロニーを
全部掻き集めてプールした。
（５） プラスミドライブラリー二
２．５ｄのヒルライブラリーを、アンピシリンを１００
ｉ／ｄ含有するし−ｂｒｏｔｈ ５００ｄ中に接種した
。
ｉ／ｄ含有するし−ｂｒｏｔｈ ５００ｄ中に接種した
。
３０℃で一晩Ｓ撮培養した後、４０００ ｒｐｍで５分
遠心した。上清を捨て、細胞ベレットを１０ｒｄの２５
％スクロース、 ５（１ｍ１４ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，０
に室温テ再懸濁さセた。０．２５Ｈ［０丁Ａ、 ｔ）Ｈ
８，０を５ｄ１および１０η／ｄリゾチーム（０，２５
ＨＴｒｉｓ、 ｐＨ８，０中）を３ｄ加えた。得られた
溶液を氷上に１時間放置した俊、１２ｄのＩＸ Ｔｒ＋
ｔｏｎ Ｘ−１００，５０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ８，０，
６７ｍＨＥＤＴＡをピペットで激しく添加し、この懸濁
液を穏やかにかき回して溶菌を起こさせた。
遠心した。上清を捨て、細胞ベレットを１０ｒｄの２５
％スクロース、 ５（１ｍ１４ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，０
に室温テ再懸濁さセた。０．２５Ｈ［０丁Ａ、 ｔ）Ｈ
８，０を５ｄ１および１０η／ｄリゾチーム（０，２５
ＨＴｒｉｓ、 ｐＨ８，０中）を３ｄ加えた。得られた
溶液を氷上に１時間放置した俊、１２ｄのＩＸ Ｔｒ＋
ｔｏｎ Ｘ−１００，５０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ８，０，
６７ｍＨＥＤＴＡをピペットで激しく添加し、この懸濁
液を穏やかにかき回して溶菌を起こさせた。
溶菌した混合物を５０ｄのチューブに移して１７０００
ｒｐｍ 、 ４℃で４５分間遠心した。ピペットで十
清を取り出した。固体のＣｓＣρを２０．０９秤吊して
５０ｍのプラスチック製ネジブタ付きチューブに入れ、
このチューブ中に上清２２．Ｏｇをピペットで入れて混
合した。５ｍｇ／ｒｄのエチジウムプロミド（ｒｏｍＨ
Ｔｒｉｓ Ｄｌｌ ｓ、ｏ、 ７００１１１１４ Ｎ
ａＯ２，ｔｍｕ ＥＤＴＡ中）を１．０威加えた。この
溶液を、５／８１ｎｘ３ ｉｎの遠心管２木に移し、８
ｅｃｆｖａｎ Ｔ ｉ ７０ｏ−ター中４４０００ ｒ
ｌ）Ｉｎ 、 １７℃で４２時間回転させた。プラスミ
ドを集めるために、これらのチューブを聞き、紫外光を
照射して２本のケイ光バンドの下側の方を注射器で集め
た。各チューブから得た下側のバンドを合わせ、等容量
の、水で飽和した氷冷ｎ−ブタノールで四回抽出するこ
とによってエチジウムプロミドを除去した。
ｒｐｍ 、 ４℃で４５分間遠心した。ピペットで十
清を取り出した。固体のＣｓＣρを２０．０９秤吊して
５０ｍのプラスチック製ネジブタ付きチューブに入れ、
このチューブ中に上清２２．Ｏｇをピペットで入れて混
合した。５ｍｇ／ｒｄのエチジウムプロミド（ｒｏｍＨ
Ｔｒｉｓ Ｄｌｌ ｓ、ｏ、 ７００１１１１４ Ｎ
ａＯ２，ｔｍｕ ＥＤＴＡ中）を１．０威加えた。この
溶液を、５／８１ｎｘ３ ｉｎの遠心管２木に移し、８
ｅｃｆｖａｎ Ｔ ｉ ７０ｏ−ター中４４０００ ｒ
ｌ）Ｉｎ 、 １７℃で４２時間回転させた。プラスミ
ドを集めるために、これらのチューブを聞き、紫外光を
照射して２本のケイ光バンドの下側の方を注射器で集め
た。各チューブから得た下側のバンドを合わせ、等容量
の、水で飽和した氷冷ｎ−ブタノールで四回抽出するこ
とによってエチジウムプロミドを除去した。
抽出された溶液を、１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１
ｍＨＥＤＴ八を四回交換しながらこの液に対して透析し
た後、２倍容量のイソプロパツールと最終濃度が０．４
Ｈとなるのに充分な５８ Ｈａ（Ｊ！を添加して核酸を
沈澱させた。１ｑられた溶液を一晩−２０℃で保存した
後１５０００ ｒｌ）！ＩＩ、 ０℃で１５分遠心した
。上清を捨て、ペレットを１５分間風乾した侵、ｓｏｏ
ｍの１０ｍＨＴｒｉｓ ｐｉｔ ７．５．１ｍＨＥＤＴ
Ａに溶かして一２０℃で貯蔵した。プラスミドＤＮＡの
濃度は約１５０ｉ ／ ｍａｌであった。
ｍＨＥＤＴ八を四回交換しながらこの液に対して透析し
た後、２倍容量のイソプロパツールと最終濃度が０．４
Ｈとなるのに充分な５８ Ｈａ（Ｊ！を添加して核酸を
沈澱させた。１ｑられた溶液を一晩−２０℃で保存した
後１５０００ ｒｌ）！ＩＩ、 ０℃で１５分遠心した
。上清を捨て、ペレットを１５分間風乾した侵、ｓｏｏ
ｍの１０ｍＨＴｒｉｓ ｐｉｔ ７．５．１ｍＨＥＤＴ
Ａに溶かして一２０℃で貯蔵した。プラスミドＤＮＡの
濃度は約１５０ｉ ／ ｍａｌであった。
（６） プラスミドライブラリーの消化ニブラスミド
ライブラリーを１０ｍＨＴｒｙｓ ｐＨ７，５１０ｍＨ
ＨｇＣ＋！、、 、 ６ｍＨメルカプトエタノールＫ（
Ｊｌ中で３０７１１１９ ／ ｄに希釈した。ＦｏｋＩ
制限エンドヌクレアーゼを加えてＤＮＡＩＩｉ！ｇに付
き１６ ｕｎｉｔの濃度とし、チューブを１時間３７℃
にインキュベートした。１２分間７２℃に加熱して反応
を停止させた。
ライブラリーを１０ｍＨＴｒｙｓ ｐＨ７，５１０ｍＨ
ＨｇＣ＋！、、 、 ６ｍＨメルカプトエタノールＫ（
Ｊｌ中で３０７１１１９ ／ ｄに希釈した。ＦｏｋＩ
制限エンドヌクレアーゼを加えてＤＮＡＩＩｉ！ｇに付
き１６ ｕｎｉｔの濃度とし、チューブを１時間３７℃
にインキュベートした。１２分間７２℃に加熱して反応
を停止させた。
（７） 形質転換：
１２、５μの消化したライブラリーをＥ， ｃｏｌｉ
Ｒｆｔ１株に形質転換し、アンピシリンを１００ｐ９／
ｍ含有するｌ−ａｇａｒプレートに接種して一晩３０℃
にインキュベートした。ＦｏｋＩ消化によって、未消化
のプラスミドによる形質転換の場合と比較して形質転換
体の数は１／１（１２）に減少した。プレート上で生き
残ったコロニーから１４個のコロニーを採り、それぞれ
、１０７のアンピシリン含有１−ｂｒｏｔｈ中に接種し
てミニカルチャー（小培養物）を調製し、アンピシリン
を含有するＬ − ａｇａｒプレート上に画線してマス
ターストックを調製した。
Ｒｆｔ１株に形質転換し、アンピシリンを１００ｐ９／
ｍ含有するｌ−ａｇａｒプレートに接種して一晩３０℃
にインキュベートした。ＦｏｋＩ消化によって、未消化
のプラスミドによる形質転換の場合と比較して形質転換
体の数は１／１（１２）に減少した。プレート上で生き
残ったコロニーから１４個のコロニーを採り、それぞれ
、１０７のアンピシリン含有１−ｂｒｏｔｈ中に接種し
てミニカルチャー（小培養物）を調製し、アンピシリン
を含有するＬ − ａｇａｒプレート上に画線してマス
ターストックを調製した。
（８） 生き残った個体の解析：
上記第７項で得られた１４個の生き残りのコロニーを１
０ｍになるまで増殖させ、これらが担持するプラスミド
を、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ ａｎｄ ｔ＋ｏ＋ｙ， Ｎｕ
ＣｌｅｉＣＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、 ７ ： １５１
３ （１９７９）の方法を応用した以下のｍｉｎｉｐｒ
ｅｐ精製法によって調製した。
０ｍになるまで増殖させ、これらが担持するプラスミド
を、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ ａｎｄ ｔ＋ｏ＋ｙ， Ｎｕ
ＣｌｅｉＣＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、 ７ ： １５１
３ （１９７９）の方法を応用した以下のｍｉｎｉｐｒ
ｅｐ精製法によって調製した。
ｍｉｎｉｐｒｅｐ法：
各培養物を８００Ｏ ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨
てて得られた細胞ベレットを、１ｑ／ｄリゾチームを含
有する １．０−の２５ｍＨ 丁ｒｉｓ １０ｎ＋Ｈ
ＥＤＴＡ ５０ｎＨグル］−ス， ｐＨ ８．０中に
再懸濁させた。室温に１０分間装いた後、各チューブに
２．Ｏｄの０． ２８ＮａＯＨ， １％ＳＯＳを加え、
チューブを＠盪して細胞を溶解し、次いで氷上に置いた
。溶液が透明になってから各々３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ ４．８）を１．５−ずつ加えてＩＩした。生じた沈
澱を１５０００ ｒｐｍ 。
てて得られた細胞ベレットを、１ｑ／ｄリゾチームを含
有する １．０−の２５ｍＨ 丁ｒｉｓ １０ｎ＋Ｈ
ＥＤＴＡ ５０ｎＨグル］−ス， ｐＨ ８．０中に
再懸濁させた。室温に１０分間装いた後、各チューブに
２．Ｏｄの０． ２８ＮａＯＨ， １％ＳＯＳを加え、
チューブを＠盪して細胞を溶解し、次いで氷上に置いた
。溶液が透明になってから各々３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ ４．８）を１．５−ずつ加えてＩＩした。生じた沈
澱を１５０００ ｒｐｍ 。
４℃で１０分間遠心して沈まぜた。（ｑられた上清を各
々、イソプロパツールを３戒含有する遠心管に流し入れ
て混合した。室温で１０分経った後遠心管を１５０００
ｒｐｍで１０分間遠心して沈澱した核酸をベレット化
した。上清を捨て、ベレットを室温で３０分風乾した。
々、イソプロパツールを３戒含有する遠心管に流し入れ
て混合した。室温で１０分経った後遠心管を１５０００
ｒｐｍで１０分間遠心して沈澱した核酸をベレット化
した。上清を捨て、ベレットを室温で３０分風乾した。
乾燥した後ベレットを８５０屑の１Ｏｎ＋Ｈ Ｔｒｉｓ
， Ｉｎ＋Ｈ ＥＤＴＡ， ｐｔｌ ８、Ｏに再懸濁さ
せた。
， Ｉｎ＋Ｈ ＥＤＴＡ， ｐｔｌ ８、Ｏに再懸濁さ
せた。
５８ ＮａＣｆｌを７５ハずつ加え、ｊｑられた溶液を
、５７５戟のイソプロパツールを含有するＥｐｐｅｎｄ
ｏｒｆチューブに移し、室温で１０分かけて再度沈澱さ
せた。
、５７５戟のイソプロパツールを含有するＥｐｐｅｎｄ
ｏｒｆチューブに移し、室温で１０分かけて再度沈澱さ
せた。
次に、チュ，−ブをｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で４５秒間回
転し、上清を捨ててペレットを風乾した。このベレット
を、次いで、ＲＮａｓｅを１００ｉ／ｍ含有する５００
４の１０ｍＨ Ｔｒｙｓ，１ｍＨ ＥＤＴＡ， ｐＨ
８．０に溶解し、１時間３７℃にインキュベートしてＲ
ＮＡを消化した。５０成の５Ｈ ＮａＧ、次いで３５０
薦のイソプロパツールを添加してＤＮＡをもう一度沈澱
させた。室温で１０分後、４５秒間遠心してＤＮＡを沈
ませ、上清を捨て、得られたベレンを１５０成の１０ｍ
Ｈ丁ｒｙｓ、 １ｍＨＥＤＴＡ、 ｐｌ＋ ８．０に再
溶解した。次いで、プラスミドｍ１ｎｉｐｒｅｐ （小
調製物）をＦｏｋＩとｘｂａ■で消化して解析した。
転し、上清を捨ててペレットを風乾した。このベレット
を、次いで、ＲＮａｓｅを１００ｉ／ｍ含有する５００
４の１０ｍＨ Ｔｒｙｓ，１ｍＨ ＥＤＴＡ， ｐＨ
８．０に溶解し、１時間３７℃にインキュベートしてＲ
ＮＡを消化した。５０成の５Ｈ ＮａＧ、次いで３５０
薦のイソプロパツールを添加してＤＮＡをもう一度沈澱
させた。室温で１０分後、４５秒間遠心してＤＮＡを沈
ませ、上清を捨て、得られたベレンを１５０成の１０ｍ
Ｈ丁ｒｙｓ、 １ｍＨＥＤＴＡ、 ｐｌ＋ ８．０に再
溶解した。次いで、プラスミドｍ１ｎｉｐｒｅｐ （小
調製物）をＦｏｋＩとｘｂａ■で消化して解析した。
（９） ＦｏｋＩメチラーゼ遺伝子クローン：解析し
たプラスミドのうち１１個が、ＦｏｋＩに対して感受性
でありＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏ
ｋｏｉｔｅｓのＤＮＡのランダムな断片を担持している
ことが判明した。これらのプラスミドはにせものである
ので捨てた。残りの３個のプラスミドは、ＦｏｋＩに対
して耐性であり、１３ ｋｂの長さのＸｂａＩ断片を１
個担持していることが判明した（第２図）。これらのプ
ラスミドは同一であるように思われた。
たプラスミドのうち１１個が、ＦｏｋＩに対して感受性
でありＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏ
ｋｏｉｔｅｓのＤＮＡのランダムな断片を担持している
ことが判明した。これらのプラスミドはにせものである
ので捨てた。残りの３個のプラスミドは、ＦｏｋＩに対
して耐性であり、１３ ｋｂの長さのＸｂａＩ断片を１
個担持していることが判明した（第２図）。これらのプ
ラスミドは同一であるように思われた。
これらのうちのひとつｐＨＬ１０９ＲＨ１１９−１をさ
らに解析したところ、ＦｏｋＩ修飾メチラーゼ遺伝子を
担持しているばかりでなく、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子も担持していることが示された。
らに解析したところ、ＦｏｋＩ修飾メチラーゼ遺伝子を
担持しているばかりでなく、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子も担持していることが示された。
（１０） ＦｏｋＩ制限遺伝子クローン：ｐＨＬ１０
９ＲＨ１１９−１は、形質転換によってこのプラスミド
が移入されているＥ 、 ｃｏｌｉ ８８２９４株（＾
ＴＣＣ３３６２９）から調製した抽出物を検定すること
により、ＦＯｋ丁制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を担持
していることが判明した。
９ＲＨ１１９−１は、形質転換によってこのプラスミド
が移入されているＥ 、 ｃｏｌｉ ８８２９４株（＾
ＴＣＣ３３６２９）から調製した抽出物を検定すること
により、ＦＯｋ丁制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を担持
していることが判明した。
エンドヌクレアーゼアッセイ：
Ｆｏｋエエンドヌクレアーピ活性について検定するため
に２秤の溶液を調製した。
に２秤の溶液を調製した。
（ｉ） ＩＯＸ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液；１０
０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１００ｍＨＨｏＣｉ！２
．６０ｍＨメルメルトエ タノール、 ２００ｍＨＫＣｊ）。
０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１００ｍＨＨｏＣｉ！２
．６０ｍＨメルメルトエ タノール、 ２００ｍＨＫＣｊ）。
（ｉｉ） 消化反応用ｍｉｘ：１８成λＤＮ△（６３
０埒／ ｄ ）５６成の１０Ｘ制限エンドヌク レアーゼ緩衝液、４８６成蒸 溜水。
０埒／ ｄ ）５６成の１０Ｘ制限エンドヌク レアーゼ緩衝液、４８６成蒸 溜水。
以下のようにして細胞抽出物を調製した。
培養物５０ｍ１を、１００埒／威アンピシリンを含有す
るし−ｂｒｏｔｈ中３０℃で一晩増殖させた。この細胞
を４００Ｏｒｐｍで５分間遠心してベーン１−化した後
、４ｄの１０ｍＨＫＰＯ４Ｄｌｌ ７．５．１０ｍ）ｌ
メルカプ１〜エタノール、 ０．１ｍＨＥＤＴＡ中に再
懸濁させた。同じ緩衝液中に １．ｇ＃Ｉ／ｄのリゾチ
ームを含有する液を０５戒加え、得られた懸濁液を１時
間氷上に放置した。この懸濁液１ｄを１０秒ずつ三回穏
やかに音波処理して細胞を破砕した。このチューブを１
０分間ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で回転させ、１ｑられた上
清を細胞抽出物として使用した。この抽出物を検定する
ために、消化反応用ｍｉｘを５本のチューブに、最初の
１木には１００／ｆ、残りの３本には５０ｄずつ分注し
た。最初のチューブに抽出物１５蔗を入れて混合した。
るし−ｂｒｏｔｈ中３０℃で一晩増殖させた。この細胞
を４００Ｏｒｐｍで５分間遠心してベーン１−化した後
、４ｄの１０ｍＨＫＰＯ４Ｄｌｌ ７．５．１０ｍ）ｌ
メルカプ１〜エタノール、 ０．１ｍＨＥＤＴＡ中に再
懸濁させた。同じ緩衝液中に １．ｇ＃Ｉ／ｄのリゾチ
ームを含有する液を０５戒加え、得られた懸濁液を１時
間氷上に放置した。この懸濁液１ｄを１０秒ずつ三回穏
やかに音波処理して細胞を破砕した。このチューブを１
０分間ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で回転させ、１ｑられた上
清を細胞抽出物として使用した。この抽出物を検定する
ために、消化反応用ｍｉｘを５本のチューブに、最初の
１木には１００／ｆ、残りの３本には５０ｄずつ分注し
た。最初のチューブに抽出物１５蔗を入れて混合した。
最初のチューブから５０成を取り出して第二のチューブ
に移して祿合した。このようにして、最初のチューブは
ＤＮＡｌｌＪｇ当たり抽出物７．５戒、第２のチューブ
は３．７５Ｉ１１／埒、第３のチューブは１．８８ｐｆ
ｌ／Ａ９．等とした。各々５０屑ずつ含有するこれらの
チューブを１時間３７℃にインキュベ−１−した後、各
チューブのサンプル２０屑をゲル電気泳動によって分析
した。この抽出物は、１ｍに付き約１００ ｕｎｉｔの
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを含有することが判明した
。これは、細胞１ｇ当たり約１５００ｕｎｉｔに相当す
る（第３図）。
に移して祿合した。このようにして、最初のチューブは
ＤＮＡｌｌＪｇ当たり抽出物７．５戒、第２のチューブ
は３．７５Ｉ１１／埒、第３のチューブは１．８８ｐｆ
ｌ／Ａ９．等とした。各々５０屑ずつ含有するこれらの
チューブを１時間３７℃にインキュベ−１−した後、各
チューブのサンプル２０屑をゲル電気泳動によって分析
した。この抽出物は、１ｍに付き約１００ ｕｎｉｔの
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを含有することが判明した
。これは、細胞１ｇ当たり約１５００ｕｎｉｔに相当す
る（第３図）。
第１図は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニ
ングおよび生産する方法の概略を示す。 第２図は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼおよび修飾
メチラーゼをコードしているＦ、 ｏｋｅａｎｏｋｏ−
町のＤＮＡの６ＫｂＸｂａＩ２に断片の制限地図であり
、この断片をｐＵ Ｃ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）のＸ
ｂａＩ部位にクローニングしてｐＨＬ１０９ＲＨ１１９
−１を０１作した。 第３図は、Ｉ）ＨＬ１０９ＲＨ１１９−１を担持するＥ
、ｃｏｌｉＨＨ２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）の細胞抽
出物中のＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示すア
ガロースゲルの写真である。
ングおよび生産する方法の概略を示す。 第２図は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼおよび修飾
メチラーゼをコードしているＦ、 ｏｋｅａｎｏｋｏ−
町のＤＮＡの６ＫｂＸｂａＩ２に断片の制限地図であり
、この断片をｐＵ Ｃ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）のＸ
ｂａＩ部位にクローニングしてｐＨＬ１０９ＲＨ１１９
−１を０１作した。 第３図は、Ｉ）ＨＬ１０９ＲＨ１１９−１を担持するＥ
、ｃｏｌｉＨＨ２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）の細胞抽
出物中のＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示すア
ガロースゲルの写真である。
Claims (13)
- （１）Ｆｏｋ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む
クローニングベクター。 - （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含有す
る形質転換された宿主。 - （３）Ｆｏｋ I 遺伝子が、￥Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏ−ｉｔｅｓ￥ ＩＦＯ １２
５３６から切り出されたものである、請求項１に記載の
クローニングベクター。 - （４）Ｆｏｋ I 修飾遺伝子を含むクローニングベクタ
ー。 - （５）請求項４に記載のクローニングベクターを含有す
る形質転換された宿主。 - （６）（ａ）￥Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅ
ａｎｏｋｏｉｔｅｓ￥に由来するＤＮＡからライブラリ
ーを形成し、 （ｂ）Ｆｏｋ I 修飾遺伝子を含有するクローンを単離
し、 （ｃ）修飾遺伝子を含有するクローンをスクリーニング
し、 （ｄ）Ｆｏｋ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を同時
に含有しているクローンを単離する ことからなる、Ｆｏｋ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子のクローニング方法。 - （７）前記ライブラリーを、 （ａ）￥Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏ
ｋｏｉｔｅｓ￥ ＩＦＯ １２５３６に由来するＤＮＡ
を精製するステップ、 （ｂ）精製したＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成する
ステップ、 （ｃ）この断片をクローニングベクターに連結するステ
ップ、 （ｄ）ステップ（ｃ）のクローニングベクターで宿主細
胞を形質転換してセルライブラリーを形成するステップ
、 （ｅ）このセルライブラリーから組換えベクターを精製
してプラスミドライブラリーを形成するステップ によつて形成する、請求項６に記載の方法。 - （８）クローニングベクターがｐＵＣ１９である、請求
項７に記載の方法。 - （９）宿主細胞が￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥のｈｓｄＲ＾−株で
ある、請求項７に記載の方法。 - （１０）プラスミドライブラリーをＦｏｋ I で消化し
て消化プールを形成し、この消化プールを宿主細胞中に
形質転換し、修飾遺伝子を含有するクローンを選択する
ことによつて、Ｆｏｋ I 修飾遺伝子を含有するクロー
ンを単離する、請求項７に記載の方法。 - （１１）（ａ）￥Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋ
ｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ￥に由来するＤＮＡを精製し、 （ｂ）精製したＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ
で消化してＤＮＡ断片を形成し、（ｃ）この断片をクロ
ーニングベクターに連結してＤＮＡ混合物を形成し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡ混合物で宿主細胞を形質
転換してライブラリーを形成し、（ｅ）Ｆｏｋ I 修飾
メチラーゼ遺伝子を含有するクローンを単離し、 （ｆ）Ｆｏｋ I 修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクロ
ーンをスクリーニングし、Ｆｏｋ I 制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子を同時に含有しているクローンを単離し、 （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含有する宿主細胞を
培養し、 （ｈ）この培養物からＦｏｋ I 制限エンドヌクレアー
ゼを回収する ことからなる、Ｆｏｋ I 制限エンドヌクレアーゼの製
造方法。 - （１２）クローニングベクターがプラスミドまたはウィ
ルスのＤＮＡ分子である、請求項１１に記載の方法。 - （１３）プラスミドがｐＵＣ１９である、請求項１２に
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US134,236 | 1987-12-17 | ||
| US07/134,236 US4999294A (en) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | Method for producing the FokI restriction endonuclease and methylase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022370A true JPH022370A (ja) | 1990-01-08 |
Family
ID=22462394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63319327A Pending JPH022370A (ja) | 1987-12-17 | 1988-12-16 | ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4999294A (ja) |
| EP (1) | EP0321266B1 (ja) |
| JP (1) | JPH022370A (ja) |
| AT (1) | ATE103637T1 (ja) |
| DE (1) | DE3888804T2 (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5238821A (en) * | 1989-05-16 | 1993-08-24 | Genzyme Corporation | Endo F-free PNGase |
| US5298404A (en) * | 1989-10-13 | 1994-03-29 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Hpa I restriction endonuclease and methylase |
| US5192676A (en) * | 1991-02-05 | 1993-03-09 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same |
| US5200337A (en) * | 1991-10-25 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, apo i, obtainable from arthrobacter protophormiae and a process for producing the same |
| EP0756286B1 (en) | 1995-07-24 | 2000-01-26 | STMicroelectronics S.r.l. | Flash EEPROM with on-chip erase source voltage generator |
| US7563600B2 (en) * | 2002-09-12 | 2009-07-21 | Combimatrix Corporation | Microarray synthesis and assembly of gene-length polynucleotides |
| EP2548953A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-01-23 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| US8053191B2 (en) | 2006-08-31 | 2011-11-08 | Westend Asset Clearinghouse Company, Llc | Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits |
| US10207240B2 (en) | 2009-11-03 | 2019-02-19 | Gen9, Inc. | Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly |
| US9216414B2 (en) | 2009-11-25 | 2015-12-22 | Gen9, Inc. | Microfluidic devices and methods for gene synthesis |
| US9217144B2 (en) | 2010-01-07 | 2015-12-22 | Gen9, Inc. | Assembly of high fidelity polynucleotides |
| WO2012078312A2 (en) | 2010-11-12 | 2012-06-14 | Gen9, Inc. | Methods and devices for nucleic acids synthesis |
| US10457935B2 (en) | 2010-11-12 | 2019-10-29 | Gen9, Inc. | Protein arrays and methods of using and making the same |
| EP2748318B1 (en) | 2011-08-26 | 2015-11-04 | Gen9, Inc. | Compositions and methods for high fidelity assembly of nucleic acids |
| US9150853B2 (en) | 2012-03-21 | 2015-10-06 | Gen9, Inc. | Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis |
| CN104603286B (zh) | 2012-04-24 | 2020-07-31 | Gen9股份有限公司 | 在体外克隆中分选核酸和多重制备物的方法 |
| CN104685116A (zh) | 2012-06-25 | 2015-06-03 | Gen9股份有限公司 | 用于核酸组装和高通量测序的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc | |
| ATE113653T1 (de) * | 1986-06-06 | 1994-11-15 | New England Biolabs Inc | Verfahren zur klonierung eines restriktionsmodifizierungssystems. |
-
1987
- 1987-12-17 US US07/134,236 patent/US4999294A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-12-16 AT AT88311917T patent/ATE103637T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-16 DE DE3888804T patent/DE3888804T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-16 JP JP63319327A patent/JPH022370A/ja active Pending
- 1988-12-16 EP EP88311917A patent/EP0321266B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0321266A3 (en) | 1990-03-21 |
| DE3888804T2 (de) | 1994-11-10 |
| EP0321266A2 (en) | 1989-06-21 |
| EP0321266B1 (en) | 1994-03-30 |
| ATE103637T1 (de) | 1994-04-15 |
| DE3888804D1 (de) | 1994-05-05 |
| US4999294A (en) | 1991-03-12 |
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