JPH0322981A - poly(A)と反応するモノクローン抗体を用いたpoly(A)↑+mRNAの精製法 - Google Patents

poly(A)と反応するモノクローン抗体を用いたpoly(A)↑+mRNAの精製法

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JPH0322981A
JPH0322981A JP15860789A JP15860789A JPH0322981A JP H0322981 A JPH0322981 A JP H0322981A JP 15860789 A JP15860789 A JP 15860789A JP 15860789 A JP15860789 A JP 15860789A JP H0322981 A JPH0322981 A JP H0322981A
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JP
Japan
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poly
antibody
mrna
cells
mouse
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JP15860789A
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Inventor
Yoshichika Kitagawa
良親 北川
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AKITA PREF GOV
Eiken Chemical Co Ltd
Original Assignee
AKITA PREF GOV
Eiken Chemical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野} 不発明はpoly (A)と沈降反応するモノクローン
抗体の製造、抗体の精製及びその利用に関するものであ
り、更に本発明の方法により製造されるモノクローン抗
体および利用法はa胞由来のごく少量の全RNAからp
oly (幻+重RN▲の分離に利用ざれる。
(従来の技術) 細胞由来のRNAからpoly (A)” mRMAを
分震するにはoligo (dT)一セルロースカツム
が一般に用いられている。また1最近ではoligo 
(4T)一セルロースパウダーが発売ざれ、遠心法によ
りpoly (A)+ mRMAを分離する方法が報告
ざれている。上記のoligo (d?)一セルロース
カラ五法及びoligo (d’!’J−セルロースパ
ウダー法のいづれもoligo (dT)とpoly 
(▲ノ十mRNAのpoly (▲)鎖の物理的ハイプ
リタイゼーションを原理としている。現在でもこれらの
方法によりpoly (▲)+鳳RMAは調製ぎれてい
る。しかし、いづれも高価で、かつ、全RMA量として
前者は数11gs後者でも数100μgが最低必要であ
り、操作も前者は特に繁雑である等の欠点があった。
(発明が解決しようとする課題ノ 上記に鑑みて不発明における抗体によるpaly (A
)” mRli▲ の分離法は、抗核酸抗体の強い沈降
反応性を利用することにより全RN▲の量は従来の技術
による方法の数分の1ないし数10分の1で済むように
しようとする。また、モノクローン抗体はマウス腹水に
よって大量生産を可能としようとする0更に、poly
 (▲J十鳳RNAの分離のみならず検出法として組織
化学分野への利用を可能としようとするものである。
(S題を解決するための手段冫 不発明は下記の手段を採用する。
(1)  va1y (A)●poly (dT)で免
疫したBALB/CマウスNa飽とマウスミエローマ細
1f8(P3−163▲g8)との細胞融合により得ら
れた八イプリドーマより、pol7(AJと反応する抗
体を生産すること。
ここではハイプリドーマクローンの名称を▲1と名づけ
、抗体の名称をA1抗体と名づける。ハイブリドーマは
BALB/Ovウス腹腔に注射して▲1抗体を含む腹水
を得た。
(2)  ▲1抗体を含む腹水にpoly (A)を加
え沈降反応した抗体の沈降物を5%ジメチルスルホキシ
ド(PH10.5)で解JIlざせ、DIAZ−1!ル
ロースカラムで分離すること〇 (8)  ▲1抗体と、フエ二一ルヒドラジン処理によ
り貧血にしたマウスの脾細胞由来のpoly (A)”
 !URN▲とを混合し、沈降反応により勢・oly 
(A)” 鳳RMAを沈澱として回収すること。
(4)  ▲1抗体と細胞由来の全RM▲との沈降物よ
りpoly (A戸鳳RMAを7ェノール処理により生
物活性をもつpoly (▲)’ waRM人として回
収すること。
ここでは、グロビンoDNAp8VMAG5とのドット
ハイプリダイゼーシ曹ンによりグロビンmRM▲量の定
量を行い、また、分離したpoly (▲)” tmR
MAの小麦胚芽無細胞蛋白質合或糸でのグロビンの合成
能を調べて前記生物活性を確めた。
(作 用) 本発明はpoly (▲】と反応して沈澱を形aするモ
ノクローン抗体を製造し、それを用いるためpoly 
(A)’ mRNAの新らしい分離手決トQ 6 @(
実施例冫 υ poly (▲J●poλycaT)とメチル化ア
ルプミンの複合体400μgでBAIIB/Oマウス(
♀4週令】を毎週1回、全部で5回免疫し、脾細胞約6
X1 0’個採取し、一方、培養して得たマウスミエロ
ーマm胞(P3−X63▲g8)6X10  と混合後
S44.4%ポリエチレングリコール1500を用いて
細胞融酋ざせハイプリドーマを得る。
2 当該ハイプリドーマの内、poly (A)と反応
する抗体を生産するハイプリドーマクローンを分離する
。抗体生産の検定はpoly (A)をボリL−リジン
でコートしたマイクロタイターフレートに吸着させ、ハ
イブリドーマ培養液を加え、培養液中に存在する抗体を
poly (A)と反応させへその後反応した抗体をバ
ーオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス1gG抗体とバーオ
キシダーゼ基質を用いて検出する。分離したハイプリド
ーマ▲1をnhr.n/Cマウス腹腔に注射し1▲1抗
体を含む腹水を得る。
9 ▲1抗体を含む腹水1QmlC p01y (A)
 2.5!agri−加え、生じる沈澱を3 Qmlの
5噂ジメチルスルホキシド(PH 10.5 )に溶解
後、DI▲1セルロース力ラムに力)らQ,1MNa0
1−5%ジメチルスルホキシド(PiilO.5)で素
通り画分を洗い流した後、更にQ,3 M N &01
−5%ジメチルスルホキシド(PH10.52で特異抗
体を分離回収する(図−1)o抗体液は10ml ) 
リス塩酸緩衝液で透析後冷凍保存する。回収抗体量は1
9.2mgである04)精製A1抗体の反応特異性を酵
素抗体免疫測定法により検定した。その結果、ボモボリ
マー核酸の内po1y (A) s 1’Ol7 (d
’!’八pol7 (1)spoly (do)  が
反応するが表−1に上げたような抗原は反応しなかった
5)抗体によって沈降するpoly (A)の大きさを
マウス5SRNA及びタバコモザイクウイルスRNA(
1.6K#1基】にpoly(A)ポリメラーゼと H
ATPを用いて種々の長ざのpoly(▲】を付加した
後、抗体と反応させ沈降するトリチウムを測定して決め
た。
その結果表−2に示すように最低20〜30塩基のpo
ly (A)があれば1.6K塩基のRN▲も定量的に
沈降することが確かめられた〇ω A1抗体がDNA,
rRNA,58RNA及びtRN▲等細胞に通常存在す
る核酸と反応しないこと及びpoly(A)” mRN
▲と反応すること(表−1)から、細胞の全HMAから
poly (A)” mRMAのみ分離することが可能
であbそれを確かめるために7エエルヒドラジン投与マ
ウス脾細胞から抽出した全RM▲からや・Oly (A
)4mRN▲(グロビンmPNAが最も多い}の分離を
行った。すなわち、脾細胞由来全R M A 200μ
gに▲1抗体100μgを加え沈澱から7ェノール法で
RN▲を回収し(約8μg)、そのRN&の中のグロビ
ンmRMA量を定量した。グロビンmRNA量はグロビ
ンoDNAを含むプラスミドpMβG5Tr:ニックト
ランスレーシ冒ンで3 2pラベルし、抗体で沈澱した
RNJLをナイロンメンプラン上に固定し゛てハイプリ
ダイズするドットプロット法で行った0その結果図−2
に示したように抗体で沈澱したRNA中にグロビンmR
N▲が最も多《回収ざれ、本方法によりpoly (幻
+!!IRNAが分離できることが確かめられた〇7)
 ωと同様にして抗体で沈降するpoly (▲】中m
RN▲を匝収し、そのRN▲の小麦胚芽無ma蛋白質合
或系における蛋白質翻訳活性を調べたところ表−6の結
果のごとく高いa訳活性があった。
丁なわち、分離したpoly (▲)+mRNAは分子
生物学の研究に十分使用しつる純度を有していると思わ
れる。
(発明の効果} 本発明によれば、全RNAの量は少量で済み、モノクロ
ーン抗体はマウス腹水として量産できる0 麓 /III
【図面の簡単な説明】
第1図はDIA罵セルロースカラムによる抗体の精製表
、第2図はドットハイプリダイゼーション表、表1は▲
1抗体の反応特異性を示し、表2はpoly (▲}鎖
を付加したRNAの反応を示し、表3は抗体で沈澱した
RN▲のin▼ltro蛋白合戒量を示丁0 E.coii yRk7A 丁otal  RNA Abppt Rl’JA Absup RFJA

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)poly(A)・poly(dT)で免疫したB
    ALB/Cマウス脾細胞とマウスミエローマ細胞(P3
    −X63Ag8)との細胞融合により得られたハイプリ
    ドーマより、poly(A)と反応する抗体を生産する
    ことを特徴とするpoly(A)と反応するモノクロー
    ン抗体の製造法。
  2. (2)請求項(1)のハイプリドーマクローン抗体を含
    むBALB/Cマウスの腹水にpoly(A)を加え沈
    降反応した抗体の沈降物をジメチルスルホキシドで解離
    させ、DEAZセルロースカラムで分離するハイプリド
    ーマクローン抗体の分離法。
  3. (3)請求項(1)のハイプリドーマクローン抗体とp
    oly(A)^+mRNAとを混合し、沈降反応により
    poly(A)^mRNAを沈澱として回収するpol
    y(A)^+mRNAの回収法。
  4. (4)請求項(1)のハイプリドーマクローン抗体と細
    胞由来の全RNAとの沈降物よりpoly(A)^+m
    RNAをフェノール処理により生物活性をもつpoly
    (A)^+mRNAを回収するpoly(A)^+mR
    NAの回収法。
JP15860789A 1989-06-21 1989-06-21 poly(A)と反応するモノクローン抗体を用いたpoly(A)↑+mRNAの精製法 Pending JPH0322981A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005080565A1 (ja) * 2004-02-20 2005-09-01 Japan Science And Technology Agency Dnaメチル化分析用dnaアレイ及びその製造方法並びにdnaメチル化分析方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005080565A1 (ja) * 2004-02-20 2005-09-01 Japan Science And Technology Agency Dnaメチル化分析用dnaアレイ及びその製造方法並びにdnaメチル化分析方法
JPWO2005080565A1 (ja) * 2004-02-20 2007-10-25 独立行政法人科学技術振興機構 Dnaメチル化分析用dnaアレイ及びその製造方法並びにdnaメチル化分析方法
JP4688792B2 (ja) * 2004-02-20 2011-05-25 独立行政法人科学技術振興機構 Dnaメチル化分析用dnaアレイ及びその製造方法並びにdnaメチル化分析方法

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