JPH03236331A - 組織に対して特異的な治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的治療剤の分野に関するものであり、且
つ更に詳細には、組織に対して特異的な治療剤に関する
ものである。

体液中の異物の検出は、病的状態の正しい診断とそれに
対する適切な治療の選択に対して必須であることが多い
。一般に抗原と呼ばれる異物は、その抗原と特異的に反
応する相当する抗体の生戒明細書の浄書（内容に変更な
し） を刺激する能力を伴なっていることがある。抗体自体は
、抗原の存在に応じて、その特定の抗原との反応によっ
て生成する蛋白質である。抗体は免疫グロブリンと呼ば
れる特別なグループの血清蛋白質から成っている。その
抗体のグループは抗原と特異的に反応することができる
限られた蛋白質のグループから戒っているけれども、抗
原として作用することができる。蛋白質、多くの多糖類
、核蛋白質、リポ蛋白質、多くの合成ポリペプチド並び
に、蛋白質または合成ポリペプチドに対して適切に結合
している（ｌｉｎｋｅｄ）場合に、ハプテンと呼ばれる
、その他の多くの小さな分子を包含する、多種多様の高
分子が存在する。

抗体−抗原反応の特異性は、病的状態または正常状態の
診断において、且つ更に詳しくは抗原性決定子の検出に
おいて、利用されている。本明細書において用いる場合
に、”免疫学的物質”という語は、抗体または抗原のど
ちらかとして定義するのに対して“免疫学的同族体“　
（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　ｈｏｍｏｌｏｇ）と
いう語は、免疫学的物質と特異的に反応することができ
るその免疫学的物質の補体と定義するものとする。それ
故、議論する免疫学的物質が抗体である場合には、免疫
学的同族体は、それに対してその抗体が特異的な抗原で
ある。同様にその逆もある。

この技術分野に精通するものの知識によれば、抗原−抗
体反応は、酸素免疫学的検定（ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ）　、放射線標識免疫検定または高感度を
有する免疫蛍光法によって明らかにするとかできる。し
かしながら、これらの方法は、使用する標識物質の所在
を見出し且つ定量するように設計した、一般に複雑な装
置の感度に制限される。

抗原−抗体反応を検出するための公知の部類の従来の方
法は、トレーサー（ｔａｇ）すなわち標識物質による抗
体の標識付け（ｌａｋｅｌｉｎｇ）を包含する。しかし
ながら、この方法は、いくつかの欠点を有している。抗
体蛋白質はきわめて過敏な蛋白質であって、その反応性
、すなわち、低濃度で存在しているその免疫学的同族体
とすら選択的に反応するうという能力、は蛋白質への標
識物質の化学的な付加、すなわち、変成によって容易に
失われる。そのほかの問題は、たとえば赤色励起蛍光染
料のように蛍光性は低いが望ましい染料分子を、検出可
能な範囲とするに充分な濃度で結合する（ａｔｔａｃｈ
）ことが不可能であるということである。

一方において、あまり多量に過ぎる染料分子を結合させ
ると、たとえば抗体の変質が生じないとしても、抗体−
染料複合体の疎水性の本質のために、非特異的な着色が
生しるものと思われる。その上、多くの染料に存在する
陽イオン電荷の存在によって生じる特異性の喪失が、こ
のような系を望ましくないものとしてしまう。

標識物質の免疫学的反応の部位における濃度（それ故検
出の感度）は、第一の免疫グロブリンに対して向けた第
二の免疫グロブリンが、通常の方式で結合したいくつか
の染料分子を有しているという、間接的な着色方法を用
いることによって、増大させることができる。第二の免
疫グロブリンは一般に異種特異性である、すなわち、そ
れは複数の場所に結合するから、第一の免疫グロブリン
への第二の免疫グロブリンの結合が可能である。

その結果、検出すべき抗原に対して特異的な第一の免疫
グロブリン上への著しく増大した数の染料分子の結合は
、抗原検出感度を増大させる。残念なことに、このよう
な方法は２反応段階を含み、それが自動化した装置にお
けるこの方法の使用を不適当なものとする。その上、第
二の抗体系は検出感度を増大させはするけれども、これ
は先に述ベた直接に標識付けした抗体系において存在す
るものと同一の制限を受ける。

本発明の目的は、上記の方法によって生じる非特異的な
結合に基づく反応性と感度の損失を、最低限とすること
にある。

別の部類の公知の従来の方法は、物理的な吸着によって
結合するビオチン−アビジン複合体を使用している。ビ
オチン−アビジンは共有結合によるものではないけれど
も、それにもかかわらずきわめて高い結合定数を示す。

ビオチンは、抗体と比較して小さな分子であり、そのた
めに抗体はその表面に多数のビオチン分子を保持するこ
とができる。ビオチニル化した抗体へのいくつかの標識
付け・したアビジンの付加は特異的な吸着をもたらし、
それによって標識付けした抗体を与える。アビジンもま
た抗体の大きさの半分に満たない小さな分子であるから
、アビジンに結合することがてきる染料の量は制限され
る。本発明の一目的は、この制限を除き且つなお抗体の
他の物質に結合させるためのビオチンーアヒンン方注の
使用によって与えられる利点を享受することにある。

免疫学的反応検出系の感度を増大させるための他の試み
は、染料の代りに放射性同位元素を使用している、放射
性同位元素は物理的に小さな標識であり、それによって
立体障害と感度の低下が最小限となって、もっとも高感
度の検出が可能となる。しかしながら、放射性同位元素
の使用には、ガンマ線を放射する同位元素たとえば＋２
５１の比較的短い寿命、同位元素のカンマ線による免疫
学的反応性の低下、連邦規格に準拠する方法の使用を必
要とし且つまた高価で複雑な検出装置に加えて精密な安
全制御をも必要とする危険な放射性同位元素の使用にか
かわる衛生上の危険を包含する、多くの欠点がある。更
に、放射線標識免疫検定は可溶性抗原に対して適してい
るけれども、これは実際に平均化方法であるから細胞ご
との基準には容易に適用できない。放射性標識免疫検定
を自動化した流動細胞分析装置（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅ
ｔｒｙ　　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）のために
単一の細胞に鋭敏とするためには、進歩したラジオグラ
フ技術を必要とする。

このような技術は、緩速であり且つ手順はきわめて複雑
であるものと予測される。その結果として、放射性同位
元素は一般に個々の細胞分析には不適切である。本発明
の目的は、オートラジオグラフ技術と放射性免疫検定の
感度を増大させる試薬を提供すること及び放射性標識が
抗体に極めて近接しているために直接的な標識付けによ
って通常生じる放射性損傷の可能性を減少させることに
ある。

染料標識物質の代りとして使用する酵素は、基質の大き
な交代により感度の向上を提供する。このような方式は
、一般的な染料標識物質の使用のほかに余分の段階を必
要とするけれども、蛍光染料の使用において表われるよ
うな光漂白問題が存在しない。その上、酵素の適当な選
択は、自動化した装置により容易に識別し且つ定量する
ことができる着色化合物または酸の生産を可能とする。

欠点としては、たとえば酵素が本質的に大きく且つ粘着
性であって、そのために抗体の変質をもたらすこと、及
び非特異的な結合に対する固有の酵素の性質または同族
体結合からの立体障害による特異性の喪失がある。その
上、酵素は保存寿命の問題を提供し、それによって臨床
環境における実用に対する有効性が低下する。細胞上の
特異的な構造の部位を決定しまたは測定するためには、
基質は細胞上に直接に、検出に好都合な形態、たとえば
、蛍光化合物として、沈殿しなければならない。酵素系
において一般に遭遇する問題は、固定し且つ限られた酵
素反応速度による感度の制限である。単に酵素が基質に
作用し続ける時間を長くすることによって、それに対す
る補償とすることが可能である。いうまでもな（、これ
は臨床的な応用におけるかかる方法の効率を低下させ且
つ系の処理（ｔｈｒｏｕｇｕ　−ｐｕｔ）能力が最高に
重要である自動化した方法におけるその有用性を低下さ
せる。

本発明の目的は、向上した感度を有する免疫反応を検出
するための、酵素と適合する試薬を提供することにある
。

電子不透明着色剤は電子顕微鏡において有用な応用が認
められるけれども。このような系は、きわめて複雑であ
り且つ時間のかかる操作を必要とし、そのためにその臨
床的な価値が著しく低下する。この欠点は、ある程度ま
では、分会可能の向上によって補償される。電子不透明
着色剤は、フェライト化合物、すなわち、鉄またはコロ
イド性金を含有する蛋白質を包含するが、しかし、これ
らの化合物は抗体よりも大きく、それ故、抗体の反応性
に悪影響があるものと考えられる。本発明の目的は、抗
体に対するこのような影響を低下させると共に、電子的
に密度が高く且つ電子走査に不透明な試薬を提供するこ
とにある。

上記の問題の多くを克服するための従来の試みは、重合
体粒子、すなわち、フルオレセインまたはその他の標識
物質を含有する微小球体の使用を包含する。一般にこれ
らの重合体粒子は５０〜２０００マノメーターの範囲の
大きさであり、その結果、抗体によって細胞に結合させ
ることができる数は立体的に限定される。一般に、粒子
は多数の抗体で覆われる。しかしながら、試薬の大きさ
が物理的に大であるために、免疫反応をもたらすために
適当な配置で、細胞上の抗原部位に抗体が接近する機会
が、著しくなる。従来は、重合体粒子は、乳化重合によ
ってスチレンとビニルモノマーから製造されてきた。し
かしながら、生成する疎水性の粒子は、非特異的な結合
並びにコロイド的不安定性を表わす欠点がある。後者の
不安定性は、粒子表面への抗体の結合によって一層大き
くなる。微小球体の表面への抗体の結合による抗体に対
する表面変性効果もまた、欠点の一つである。

重合体粒子中に親水性のモノマーを導入することによっ
て、粒子の疎水的な本質を克服しようとする試みが行な
れわている。しかしながら、このような試みは乳化重合
方法に限定される。粒子の組成の変化は非特異的な結合
とコロイド不安定性の問題を改善することができるけれ
ども、これらの望ましくない特性は、重合体粒子を合成
するためには最低限度の量の疎水性モノマーを必要とす
るという理由で、完全に排除することはできない。

このような重合体粒子検出系の一つは、モントニーらに
対する米国特許第４，２５４．０９６号に記されている
が、この特許は、水に不溶性という望ましくない特性を
有する親水性重合体粒子に対して共有結合した抗体を用
いる検定方法を記している。完全に親水性のモノマーの
場合においてすら、ドレーヤーに対する米国特許第３，
８５３．９８７号に記すように、親水性粒子とするため
に架橋剤を必要とする。本発明の一目的は架橋剤の必要
を排除することにある。

ハーンユフエルドとイートンは米国特許第４゜１６９．
１３７号において、重合体骨格を用いて感度を増大させ
る別の方法を記している。彼らは特に多数の蛍光染料分
子が結合させである、第一アミン含有多官能性重合体骨
格、すなわち、ポリリシンから成る抗原検出試薬を記し
ている。多官能性重合体骨格を、たとえばグルタルアル
デヒドのようなジアルデヒドの使用によって、ポリリシ
ン上の第一アミンを通じて、抗体上の第一アミン部に共
有結合させた。このような方法は、抗原の１部位当りの
感度の増大をもたらすけれども、記載の方法論によって
は、重大な制限が存在する。

特に、重合体は第一アミン含有重合体に限定されるが、
それは、その陽イオン性の電荷のために、強い非特異的
な結合を表わし、それによってその特異性が著しく低下
する。実際に、ハーンユフエルドが記しているタイプの
重合体は、抗体が存在しなくても細胞に結合することが
認められている。

ジアルデヒドカップリング剤の必要もまた別の欠点であ
る。これらの制限は、重合体骨格への種々の蛍光染料の
好都合な結合を著しく限定することになる。更に、ノア
ルデヒトの使用は、非第−アミン含有重合体骨格の抗体
への結合を許さない。

生物学的応用に対して興味あるｐＨ範囲内で使用する場
合に、上記の系は陽イオン的に荷電する傾向があり、そ
のために静電的な相互作用によって、陰イオン的に荷電
した細胞及び組織表面に非特異的に結合する。生成する
ンアルデヒド、共有結合及び可逆的ンアルデヒド反応の
不安定性のために、ハーノユフエルドの試薬は抗原部位
と競争的に反応することができる著しく解離した重合体
と抗体を含有するものと予測される。

本発明の目的は、多くの検出器を有し、且つ疎水性及び
陽イオン電荷特性による非特異的な結合を回避すると共
にジアルデヒド結合剤の必要を回避すべき水溶性重合体
を使用する免疫学的物質検出分析方法を提供することに
ある。

本発明の他の目的は、向上した感度を有する免疫学的物
質を検出することができる試薬を提供することにある。

最低の疎水性を有する適当に荷電した重合体を提供する
ことによって、不都合な非特異的な結合をもたらす疎水
性重合体及び粒子並びに陽イオン的に荷電した複合体に
伴なう問題を、回避することにある。正味の陽電荷を有
していない、多数の標識物質を保有することができる水
溶性重合体を提供することもまた本発明の一目的である
。

更に他の目的は、簡単な保存と自動化装置中での効果的
な使用が可能な試薬を提供することにある。本発明の更
に他の目的は、自動化した細胞学装置において現在用い
られている技術を用いて検出することができる濃度と量
において、望ましいが、しかし蛍光性の弱い、赤励起蛍
光染料を使用することができる試薬を提供することにあ
る。

本発明の更に他の目的は、単一の試薬内で同成分のそれ
ぞれの利点を利用するために水溶性の重合体とアジピン
−ビオチンを組み合わせて使用することにある。

本発明の原理は、概括的にいえば、検出すべき物質に対
して特異的な免疫学的同族体を、種々の中間的機構を通
じて、検出可能な標識機構として働らくかまたはそれを
保有する水溶性重合体に結合させることから成る、免疫
学的反応の検出に役立つ直接的及び間接的標識技術を用
いるものである。本明細書において使用する場合の水溶
性重合体という用語は通常の有機化学的な感覚において
用いられるものと同じ意味を包含し、水に不溶性（疎水
性）の重合体である共有架橋結合を必要とする微小球体
すなわち粒子として一般に公知であるものを包含しない
。その結果、本発明においては共有架橋結合剤を必要と
しない。一般に、本発明は枝分れした重合体に対する約
１×１０７ドルトンに至るまで及び約ｌＸｌ０’ドルト
ンに至るまでの分子量を有する単一の鎖状重合体を包含
する。枝分れした重合体は、“骨格”連鎖の長さに沿う
どこかに共有結合的に結合した、同一または異種モノマ
ーから成る、複数の付加的な重合体連鎖を有する重合体
“骨格”を含有する水溶性重合体を包含する。枝分れし
た重合体に対する有用な類推物は、欠けている剛毛を有
していても有していなくてもよい針金の剛毛ブラシであ
るといえよう。

前記の目的に従って、本発明の原理は、水溶性重合体を
使用する免疫学的物質検出試薬のいくつかの実施形態を
包含する。全実施形態が電荷特異性を備えているが、重
合体の電荷、重合体−標識物質複合体を形成するように
結合した標識物質を有する重合体の電荷、または抗体に
結合するための手段を有する重合体−標識物質複合体の
電荷の何れかが特性的であるかが、異なっている。全実
施形態が重合体を同族体に結合させるための手段を包含
する。

追加的な実施形態は、免疫学的同族体上の活性基、活性
カップリング試薬、重合体上の活性基、重合体上の活性
化可能な基、及びアビンンが重合体に結合し且つビオチ
ンが免疫学的同族体に結合しているビオチン−アンビン
複合体から成るグループから選択する。追加的な実施形
態は更に重合体に結合した標識物質を包含していてもよ
い。更に他の実施形態は非蛍光性染料、蛍光染料、放射
性同位元素、電子不透明物質、酵素、第一の免疫学的同
族体とは異なる特異性の第二の免疫学的同族体及び微小
球体から成るグループから選択する標識物質を備えてい
る。好適実施形態は、ポリアクリル酸、ポリメタクリル
酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ
アリルアルコール、上記の重合体の組合せ、ヒドロキン
エチルセルロース、ヒドロキンプロピルセルロース、天
然水溶性重合体及び合成水溶性重合体から選択する水溶
性重合体を備えている。

本発明のその他の目的及び理解は、図面を参照すること
によって明白となる。

前記の目的に従って、第１図に示すような好適な免疫学
的物質検出試薬は、検出すべき免疫学的物質、ここでは
抗原、３０に対して特異的な免疫学的同族体、ここでは
免疫グロブリン１、を備えている。この分野に精通する
ものには明らかなように、各図中の様式化した成分描写
は相対的な割合ならびに明瞭とするための外観に関して
著るしく異なっている。更に注意すべきことは、一つの
図に関する議論は、異なる標識物質が存在しているかま
たは異なる検定系で使用するということを除けば、他の
図に対しても同様に適用することができるということで
ある。免疫グロブリン１は、多数の標識物質３が結合し
ている水溶性の重合体２に結合している。標識物質３は
蛍光物質３は蛍光染料であることが好ましいけれども、
その代りとしてたとえば非蛍光性染料、放射性同位元素
、電子不透明物質、酵素、または第一の同族体とは異な
る特異性の第二の同族体のような他の標識物質を使用し
てもよい。あるいはまた、第２図に示すように蛍光体含
有微小球体４を用いることもできる。第２図においては
検出すべき抗原３０が基質５１の表面に固定しである、
固相免疫学的検定における試薬の使用をも示している。

第１及び第２図を参照すると、水溶性重合体２は、細胞
に対する非特異的な結合を回避するように選び、それに
よっては最大の感度と免疫学的応答を可能とすることが
好都合である。それ故、陽イオン的に荷電しており、そ
のために非特異的に結合するおそれのある重合体は避け
ることが好ましい。避けることが好ましい、このような
陽イオン的に荷電した重合体の例は、第一アミン含有重
合体である。

好適な水溶性重合体は陰イオン性（負）またはセロの電
荷を有し且つポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ
アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルア
ルコール、これらの重合体の種々の可能な組合わせ、ヒ
ドロキシエチルセルロース、ヒドロキンプロピルセルロ
ース、天然水溶性重合体並びに合成水溶性重合体から成
るグループから選択することが理想的である。しかしな
がら、標識物質３．４の多くは、特に染料タイプの標識
物質においては、陽イオン的に荷電している傾向がある
ことが注目される。これは望ましくない非特異的な結合
を増大させる傾向があるから、水溶性重合体をその陰イ
オン性を増大させるように調節して、それによって望ま
しい感度に対して悪影響のある非特異的“着色”性の増
大を補償することが好都合である。

典型的には１．０００〜１００．０００．ＯＯ０ドルト
ンの範囲の分子量を有する水溶性重合体は、望ましい特
異性を有する抗体に対して多くの染料型の物質を結合さ
せる能力を備えている。抗体の反応性に対する悪影響を
避けるためには結合が抗体から充分な距離にあるという
ことがきわめて重要である。これらの要件は、たとえば
フルオレセインまたはアクリンンオレンジのような他の
染料と比較して特徴的に小さな蛍光を表わすことが多い
長波長すなわち赤色光励起蛍光染料にかかわる場合に、
特に重要である。それ故、多くの染料分子３を有する水
溶性重合体２を用いることによって、より高濃度の蛍光
が提供され、それによって、現在使用可能な自動化装置
によって免疫学的反応の存在をより容易に記録すること
が可能となるために、感度の増大を達成することができ
る。　水溶性重合体は酵素標識系において用いる場合に
一層の利益を表わす。酵素は、免疫グロブリンと同様に
、立体障害に対して敏感な活性部位を有する大きな蛋白
質である。免疫グロブリンと酵素との間の直接的な結合
は、免疫学的物質の添加に続く免疫学的物質とその同族
体の間の免疫学的反応の検出を許すけれども、立体障害
のために不都合な低い感度を有している。免疫グロブリ
ンを単一または複数の酵素分子に結合させるための水溶
性重合体の有利な使用は、各蛋白質が他のものの存在に
よる立体障害を受けない望ましい方式で作用することを
可能とする。その結果として、免疫学的検定試薬は免疫
学的物質の検出において増大した感度を表わす。

本発明は、抗原を伴なう特定の組織または腫瘍細胞に対
しての単分枝系抗体と結び付いて、−眉の有用性を示す
。重合体は、治療物質すなわち治療剤の免疫グロブリン
自体への直接的な結合のみによって可能であるよりも増
大した治療剤の負荷を保持することができ且つその上治
療剤の結合による免疫グロブリンの変質の機会が低下す
る。その結果として、薬品、ビタミン、薬剤、放射光学
的処理分子またはその他の特定部位すなわち標的部位へ
の送達が望ましい物質を保持する水溶性重合体に結合し
た単分枝系抗体を局限させてそれが特異的に腫瘍細胞を
攻撃することを可能とし且つ増大した濃度の治療材料を
都合良（直接に標的部位に交付することができる。

本発明においては生適合性重合体を使用することが好ま
しい。生適合性とは、不良の毒性効果を生じることがな
（、且つ細胞への非特異的結合または凝集タイプの集合
体を与える格子状構造の生成を避けることができるよう
に重合体を選択することを意味する。それ故、好適実施
形態においては、ポリアクリル酸及びポリアクリルアミ
ドを使用するが、両型合体は共にフリーラジカル方法に
よって重合させた水溶性モノマーから成るけれども、ア
ニオン／カチオン重合及び縮合方性を使用することもで
きる。更に、官能基を有するモノマーを用いて重合体を
生成させ、それによって後にその官能基をたとえば染料
のような標識物質または免疫学的物質と反応させるため
に用いることができるようにすることが有利であること
が認められている。このような官能基を有するモノマー
の例は塩化アクリロイルを包含する。生成するポリ塩化
アクリロイルは、第一アミンと反応してアミド結合を形
成することができる活性塩素原子を有している。しかし
ながら、官能基はこれだけに限定されることはなく、そ
の代りにヒドロキンル、チオシアナート、イソチオシア
ナート、塩化スルホニル、スクシンイミド及びジクロロ
トリアノニルなどを包含するその他の基を用いることが
できるということに注意すべきである。

公知の有機化学的手法に従って、重合体上の官能基と染
料の反応を刺激するために、染料を加温すること及び／
またはそれを触媒の存在で使用することが必要な場合が
ある。重合体に付加する染料の量は、濃度比を制御する
ことによって、または染料に対するものと抗体に対する
ものとで異なる官能基を使用することによって、具合良
く調節することができる。このことは、いうまでもなく
、一般に染料は重合体と反応すべきただ一つの官能基反
応部位を有しているのみであるという事実によって可能
となる。

公知の技術に従えば、重合体に標識物質をつけるのに有
利に使用することができる他の方法はａ）標識物質上の
活性化された基を使用すること、ｂ）外部活性化試薬を
使用することと、Ｃ）第一部分と第二部分とを有するこ
れらの標識部分において、結合した第一部分を有する単
量体を重合して重合体を形威し、次いで該第一部分に結
合させるための第二部分を付加する、ｄ）標識物質を該
単量体と共重合させることを含む。

第３図は、この場合に微小球４を支持する重合体２に対
する免疫グロブリンの結合を行うためにアビジン６−ビ
オチン５複合体（ａｖｉｄｉｎ　６−ｂｉｏｔｉｎ　５
　　ｃｏｍｐｌｅｘ）の使用を示す。重合体は染料及び
先に述べた標識物質群から選ばれた他の一員の如き種々
の標識タイプ物質（ｍａｒｋｅｒ　ｔｙｐｅ　５ｕｂｓ
ｔａｎｃｅｓ）の担体であることができる。ビオチン−
アビジンはその格段に強い結合特性その化学的安定性及
び感度増幅の故に有利に使用することができる。

ビオチン５は良く知られた方法によって免疫グロブリン
に容易に結合され、そしてその小さな寸法の故に、免疫
グロブリンの反応性に対して殆んど影響を及ぼさないか
又は全熱影響を及ぼさなく、そして更にいくつかのもの
は抗体に結合されて増加した感受性に生じる。ビオチン
と対照的に、アビジン分子は相当大きく、且つ過去にお
いてフルオレセイン及び他の染料タイプ物質を直接支持
するように使用された。しかしながら、本発明は唯重合
体を抗体にカップルさせるためにのみアビジンを有利に
使用する。重合体ははるかに多くのフルオレセイン又は
アビジン以外の他の染料タイプ物質を支持することがで
きるので、結果は免疫学的同族体と関連した染料の濃度
はより大となり、これはより大きい感受性を与える。１
個のみの重合体分子がアビジン分子当り結合されること
を確実にすることは困難であるけれども、その代わりに
抗体のビオチン化は正確に制御することができる。

第４図は、ビオチン５が連結させである免疫学的相同体
または免疫グロブリン１の使用による細胞表面上の免疫
学的物質または抗原部位２１の定量と局在化における本
発明の利用を実証する。ビオチンは水溶性重合体２に結
合したアビジン６に物理的に吸着し、一方、重合体は標
識物質３を保持することができる。ビオチン−アビジン
を使用する試薬においては、ビオチニル化した抗体を先
ず抗原と反応させ、次いで試薬のアビジン結合部分を付
加させることが好適である。

本発明の適応性は、固相免疫学的検定の様式化した図を
した示している第５図において更に実証される。検出す
べき抗原７１に対して感応性である免疫グロブリン１は
、表面５１上に固定してあり且つ抗原を含有する試料は
固定した免疫グロブリン表面と接触している。次いて、
抗原に対して感応性であり且つ標識物質３を有する重合
体２に連結した免疫グロブリン１を有する本発明の試薬
を表面上で洗う。蛍光または他の標識物質の定量は存在
する抗原の量及びその精密な局在化に関しての直接的な
計算を可能とする。拡大した図においては、標識物質は
、基質４１との反応性を有し且つそれを個々に検出する
ことが可能な４２と４３に分解する酵素４０である。

第６図はさらに本発明の大きな適応性を実証するもので
、標識物質３を保持する水溶性重合体２の抗原８０への
連結を示しており、それによって抗原８０はそれに対し
て特異的な免疫グロブリンｌと接触することができ、且
つその免疫グロブリンは表面５１上に固定してあっても
よいし、あるいは標識物質を保持する別の重合体に結合
させてあってもよい。更に標識付けしてない抗原８０を
存在させて、この分野で公知の方法を応用する抑制方式
の検定を用いてもよい。

免疫学的物質及び免疫学的同族体という術語の使用によ
って示されるように、多くの場合に、標識物質を保持す
る重合体を抗原に結合させることによって、細胞または
基質の表面上に固定した、または水溶液中に存在する抗
体の存在を検出することが可能な試薬を生成せしめるこ
とができるということを了解すべきである。

この分野に精通するものにおいては、本発明の精神また
は範囲から逸脱することなく、他の多くの成分の変更ま
たは組み合わせが可能であることを了解すべきである。

実施例１ 約５０％（重量による）のアクリル酸と５０％（重量に
よる）のアクリルアミドから威り且つ非蛍光性のモノマ
ー１００当りに１の蛍光性モノマーを含有する共重合体
を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に各モノマーを
溶解し且つ開始剤として２．５％（モノマーの重量に対
して）の４．４′−アゾビス（４−シアノ吉草酸）を添
加して窒素下に６５℃で１６時間重合させることによっ
て、製造した。蛍光性のモノマーは等モル量のフルオレ
セインアミンと塩化アクリロイルを室温で反応させるこ
とによって製造した。重合後に、重合しなかった成分を
無水ホルムアミド中のビオゲルＰ−１０上のゲル濾過に
よって除去した。１５ｍｇの蛍光性重合体を３４ｍｇの
カルボニルジイミダゾール（存在するカルボキシル基の
数の２倍に等しい量）で処理し且つそれを室温で３０分
間反応させることによって活性化した。６０ｍｇのＮ−
ヒドロキンスクシンイミド（カルボキシル基の存在数の
５倍）を加えて室温で３０分間反応させた。かくした得
たスクシンイミドエステル含有重合体を無水アセトンを
用いる沈殿によって濃縮し、アセトンで洗浄したのち、
アセトン中で保存した。

単分枝系抗体実験のために、１ｍｇの活性化重合体を窒
素下に乾燥した。１００μｌのリン酸塩緩衝食塩水中の
Ｑ、５ｍｌのホウ酸ナトリウム（０，１２５Ｍ）と２０
０μｇの０ＫＴ３　にュージャーンー州、ラリタン、ル
ート２０２、オルソ製薬柱から入手することができる単
分子系抗体に向けたＴ−細胞）を水溶性重合体に加え、
その混合物を室温で３０分間培養した。かくして得た０
ＫＴ３重合体を、Ｔ−細胞計数のためのオルソプロトコ
ール（このプロトコールは参考としてここに挙げるもの
であって、ニューシャーシー州、ラリタン、ルート２０
２、オルソ診断システム社から入手することができる）
を用いて検定した。この方法は本質的に以下のような手
順を包含する。全血を蛍光的に標識付けした抗体と反応
させる。塩化アンモニウムに基づく溶解試薬による赤血
球の溶解後に、リンパ球を、その前方及び９０°光散乱
特性によって他の白血球と識別する。“オルソスペクト
ラムＩＩＩ”流動細胞分析計（オルソ診断システム社か
ら入手することができる）によって蛍光データを集め且
つ滋養機のような特性光散乱によってリンパ球を同定す
る。これは、標識付けしたリンパ球と標識付けしてない
リンパ球を識別し且つその割合を計算することを可能と
するヒストグラム表示を提供する。このようにして検定
すると、重合体−０ＫＴ３は６４％の０ＫＴ３陽性リン
パ球を示すのに対して通常の０ＫＴ３は６６％の陽性リ
ンパ球（顕著には相違していない）を示した。同時に重
合体−０ＫＴ３は、平均蛍光がより高く且つ最高の蛍光
チャンネルにおいてより多くのカウントが存在するとい
う点で、増大した標識付けを示した。

実施例２ ２０ＯＡ１ｇの○ＫＴ３　（１，３Ｘ１０−’モル）を
、２００μｍの０．１Ｍホウ酸ナトリウムの最終容量中
で、２．６Ｘ１０−’モルのヒオチニルＮヒドロキンス
クンンイミド（ＤＭＦ中２６μｍ）と、室温で２時間反
応させた。この処理は、５０％の標識付けを推定して抗
体当り１０の計算ビオチン基を導入した。一方、６８０
μｇの精製したアビジンを２００μ】の０．１２３Ｍホ
ウ酸ナトリウム中の実施例１におけるようにして調製し
た２、５ｍｇの乾燥した、フルオレセイン−重合体に加
え室温で１時間反応させた。１０μｍのビオチニル化０
ＫＴ３を５０μｍの軟膜（５Ｘ１０５の白血球）と混合
して、室温で３０分間培養した。

１．５ｍｌずつのリン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄して、
非結合０ＫＴ３−ビオチンを除いたのち、２０μｍのア
ビジン−重合体を加え（比較のためにフルオレセイン−
アビジンをも用いた）、その混合物を室温で３０分間培
養した。試料を１．５ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水で２回
洗浄し、実施例１におけるようにして赤血球を溶解した
のち、実施例１におけるようにしてオルソスペクトラム
ＩＩＩによって分析した。その結果は、従来の方法で標
識付けしたアビジンと比較して向上した標識付けを示し
た。これは蛍光性の重合体が容易に検出可能であり且つ
アビジンに共有結合し、一方、それが次いで細胞表面上
のビオチニル化した○ＫＴ３に対して効果的に結合する
ことを実証するものである。

この技術分野の精通者には容易に認識することができる
適切な条件下に、フルオレセインの代りに他の標識物質
を使用することができるということは、明白なことであ
ろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は微小球体以外の標識物質保持水溶性重合体が結
合させである免疫グロブリンを示している好適実施形態
の様式化した図である。 第２図は標識物質として微小球体を使用する本発明のも
うひとつの実施形態を示している。 第３図はビオチン−アビジンの使用によって微小球体標
識物質を有する水溶性重合体に対して結合した免疫グロ
ブリンの様式化した図である。 第４図は細胞表面抗原の検出のための本発明の実施形態
の様式化した図である。 第５図は本発明の実施形態を使用する多価抗原のための
固相抗原検出系の様式化した図である。 第６図は標識物質を有し且つ当該抗原に結合させた水溶
性重合体を使用する固相抗原検出系の別の様式化した図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）ゼロよりも大きくない電荷を有している水溶性
   重合体； ｂ）重合体に対して結合した、抗原に対して特異的な、
   抗体；及び ｃ）重合体に結合しており且つ化学療法物質、放射線療
   法物質、ビタミン、腫瘍抑制剤及び抗原部位に送付する
   ことが望まれる組織に作用する材料より成る群から選ば
   れる治療物質、 から成る、結合した抗原を有する、組織に対して特異的
   な治療剤。 ２、水溶性重合体がポリアクリル酸、ポリメタクリル酸
   、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリア
   リルアルコール、上記の重合体の組合わせ、ヒドロキシ
   エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、天
   然水溶性重合体及び合成水溶性重合体より成る群から選
   ばれる、特許請求の範囲第１項記載の治療剤。 ３、抗体が抗体上の活性基、活性カップリング剤、重合
   体上の活性基、重合体上の活性化しうる基、共有結合及
   びビオチン−アビジン複合体より成る群から選ばれる結
   合手段によって重合体に結合されている、特許請求の範
   囲第２項記載の治療剤。