JPH0324627B2 - - Google Patents
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- JPH0324627B2 JPH0324627B2 JP57181514A JP18151482A JPH0324627B2 JP H0324627 B2 JPH0324627 B2 JP H0324627B2 JP 57181514 A JP57181514 A JP 57181514A JP 18151482 A JP18151482 A JP 18151482A JP H0324627 B2 JPH0324627 B2 JP H0324627B2
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は免疫学的検定の分野に関するものであ
り、且つ更に詳細には、検出すべき免疫学的物質
に対して特異的な免疫学的同族体（homelog）更
に標識物質に結合させること（attachment）が
可能である水溶性重合体骨格に結合させることに
（coupling）よつて生成せしめる免疫学的検定試
薬に関するものである。
り、且つ更に詳細には、検出すべき免疫学的物質
に対して特異的な免疫学的同族体（homelog）更
に標識物質に結合させること（attachment）が
可能である水溶性重合体骨格に結合させることに
（coupling）よつて生成せしめる免疫学的検定試
薬に関するものである。
体液中の異物の中の検出は、病的状態の正しい
診断とそれに対する適切な治療の選択に対して必
須であることが多い。一般に抗原と呼ばれる異物
は、その抗原と特異的に反応する相当する抗体の
生成を刺激する能力を伴なつていることがある。
抗体自体は、抗原の存在に応じて、その特定の抗
原との反応によつて生成する蛋白質である。抗体
は免疫グロブリンと呼ばれる特別なグループの血
清蛋白質から成つている。その抗体のグループは
抗原と特異的に反応することができる限られた蛋
白質のグループから成つているけれども、抗原と
して作用することができる。蛋白質、多くの多糖
類、核蛋白物、リポ蛋白質、多くの合成ポリペプ
チド並びに、蛋白質または合成ポリペプチドに対
して適当に結合している（linked）の場合に、ハ
プテンと呼ばれる、その他の多くの小さな分子を
包含する、多種多様の高分子が存在する。
診断とそれに対する適切な治療の選択に対して必
須であることが多い。一般に抗原と呼ばれる異物
は、その抗原と特異的に反応する相当する抗体の
生成を刺激する能力を伴なつていることがある。
抗体自体は、抗原の存在に応じて、その特定の抗
原との反応によつて生成する蛋白質である。抗体
は免疫グロブリンと呼ばれる特別なグループの血
清蛋白質から成つている。その抗体のグループは
抗原と特異的に反応することができる限られた蛋
白質のグループから成つているけれども、抗原と
して作用することができる。蛋白質、多くの多糖
類、核蛋白物、リポ蛋白質、多くの合成ポリペプ
チド並びに、蛋白質または合成ポリペプチドに対
して適当に結合している（linked）の場合に、ハ
プテンと呼ばれる、その他の多くの小さな分子を
包含する、多種多様の高分子が存在する。
抗体−抗原反応の特異性は、病的状態または正
常状態の診断において、且つさらに詳しくは抗原
性決定子の検出において、利用されている。本明
細書において用いる場合に、“免疫学的物質”と
いう語は、抗体または抗原のどちらかとして定義
するのに対して“免疫学的同族体”（lmmunolo
−gical homolog）という語は、免疫学的物質と
特異的に反応することができるその免疫学的物質
の補体と定義するものとする。それ故、議論する
免疫学的物質が抗体である場合には、免疫学的同
族体は、それに対してその抗体が特異的な抗原で
ある。同様にその逆の場合もある。
常状態の診断において、且つさらに詳しくは抗原
性決定子の検出において、利用されている。本明
細書において用いる場合に、“免疫学的物質”と
いう語は、抗体または抗原のどちらかとして定義
するのに対して“免疫学的同族体”（lmmunolo
−gical homolog）という語は、免疫学的物質と
特異的に反応することができるその免疫学的物質
の補体と定義するものとする。それ故、議論する
免疫学的物質が抗体である場合には、免疫学的同
族体は、それに対してその抗体が特異的な抗原で
ある。同様にその逆の場合もある。
この技術分野に精通するものの知識によれば、
抗原−抗体反応は、酵素免疫学的検定
（enzymeimmunoassay）、放射線標識免疫検定ま
たは高感度を有する免疫螢光法によつて明らかに
することができる。しかしながら、これらの方法
は、使用する標識物質の所在を見出し且つ定量す
るように設計した、一般に複雑な装置の感度に制
限される。
抗原−抗体反応は、酵素免疫学的検定
（enzymeimmunoassay）、放射線標識免疫検定ま
たは高感度を有する免疫螢光法によつて明らかに
することができる。しかしながら、これらの方法
は、使用する標識物質の所在を見出し且つ定量す
るように設計した、一般に複雑な装置の感度に制
限される。
抗原−抗体反応を検出するための公知の部類の
従来の方法は、トレーサー（tag）すなわち標識
物質による抗体の標識付け（lakeling）を包含す
る。しかしながら、この方法は、いくつかの欠点
を有している。抗体蛋白質はきわめて過敏な蛋白
質であつて、その反応性、すなわち、低濃度で存
在しているその免疫学的同族体とすら選択的に反
応するという能力、は蛋白質への標識物質の化学
的な付加、すなわち、変性によつて容易に失なわ
れる。そのほかの問題は、たとえば赤色励起螢光
染料のように螢光性は低いが望ましい染料分子
を、検出可能な範囲とするに充分な濃度で結合す
る（attach）ことが不可能であるということであ
る。一方において、あまり多量に過ぎる染料分子
を結合させると、たとえば抗体の変質が生じない
としても、抗体−染料複合体の疎水性の本質のた
めに、非特異的な着色が生じるものと思われる。
その上、多くの染料に存在する陽イオン電荷の存
在によつて生じる特異性の喪失が、このような系
を望ましくないものとしてしまう。
従来の方法は、トレーサー（tag）すなわち標識
物質による抗体の標識付け（lakeling）を包含す
る。しかしながら、この方法は、いくつかの欠点
を有している。抗体蛋白質はきわめて過敏な蛋白
質であつて、その反応性、すなわち、低濃度で存
在しているその免疫学的同族体とすら選択的に反
応するという能力、は蛋白質への標識物質の化学
的な付加、すなわち、変性によつて容易に失なわ
れる。そのほかの問題は、たとえば赤色励起螢光
染料のように螢光性は低いが望ましい染料分子
を、検出可能な範囲とするに充分な濃度で結合す
る（attach）ことが不可能であるということであ
る。一方において、あまり多量に過ぎる染料分子
を結合させると、たとえば抗体の変質が生じない
としても、抗体−染料複合体の疎水性の本質のた
めに、非特異的な着色が生じるものと思われる。
その上、多くの染料に存在する陽イオン電荷の存
在によつて生じる特異性の喪失が、このような系
を望ましくないものとしてしまう。
標識物質の免疫学的反応の部位における濃度
（それ故検出の感度）は、第一の免疫グロブリン
に対して向けた第二の免疫グロブリンが、通常の
方式で結合したいくつかの染料分子を有している
という、間接的な着色方法を用いることによつ
て、増大させることができる。第二の免疫グロブ
リンは一般に異種異性である、すなわち、それは
複数の場所に結合するから、第一の免疫グロブリ
ンへの第二の免疫グロブリンの結合が可能であ
る。その結果、検出すべき抗原に対して特異的な
第一の免疫グロブリン上への著るしく増大した数
の染料分子の結合は、抗原検出感度を増大させ
る。残念なことに、このような方法は２反応段階
を含み、それが自動化した装置におけるこの方法
の使用を不適当なものとする。その上、第二の抗
体系は検出感度を増大させはするけれども、これ
は先に述べた直接に標識付けした抗体系において
存在するものと同一の制限を受ける。
（それ故検出の感度）は、第一の免疫グロブリン
に対して向けた第二の免疫グロブリンが、通常の
方式で結合したいくつかの染料分子を有している
という、間接的な着色方法を用いることによつ
て、増大させることができる。第二の免疫グロブ
リンは一般に異種異性である、すなわち、それは
複数の場所に結合するから、第一の免疫グロブリ
ンへの第二の免疫グロブリンの結合が可能であ
る。その結果、検出すべき抗原に対して特異的な
第一の免疫グロブリン上への著るしく増大した数
の染料分子の結合は、抗原検出感度を増大させ
る。残念なことに、このような方法は２反応段階
を含み、それが自動化した装置におけるこの方法
の使用を不適当なものとする。その上、第二の抗
体系は検出感度を増大させはするけれども、これ
は先に述べた直接に標識付けした抗体系において
存在するものと同一の制限を受ける。
本発明の目的は、上記の方法によつて生じる非
特異的な結合に基づく反応性と感度の損失を、最
低限とすることにある。
特異的な結合に基づく反応性と感度の損失を、最
低限とすることにある。
別の部類の公知の従来の方法は、物理的な吸着
によつて結合するビオチン−アビジン複合体を使
用している。ビオチン−アビジンは共有結合によ
るものではないけれども、それにもかかわらずき
わめて高い結合定数を示す。ビオチンは、抗体と
比較して小さな分子であり、そのために抗体はそ
の表面に多数のビチオン分子を保持することがで
きる。ビオチニル化した抗体へのいくつかの標識
付けしたアビジンの付加は特異的な吸着をもたら
し、それによつて標識付けした抗体を与える。ア
ビジンもまた抗体の大きさの半分に満たない小さ
な分子であるから、アビジンに結合することがで
きる染料の量は制限される。本発明の一目的は、
この制限を除き且つなお抗体を他の物質に結合さ
せるためのビオチン−アビジン方法の使用によつ
て与えられる利点を享受することにある。
によつて結合するビオチン−アビジン複合体を使
用している。ビオチン−アビジンは共有結合によ
るものではないけれども、それにもかかわらずき
わめて高い結合定数を示す。ビオチンは、抗体と
比較して小さな分子であり、そのために抗体はそ
の表面に多数のビチオン分子を保持することがで
きる。ビオチニル化した抗体へのいくつかの標識
付けしたアビジンの付加は特異的な吸着をもたら
し、それによつて標識付けした抗体を与える。ア
ビジンもまた抗体の大きさの半分に満たない小さ
な分子であるから、アビジンに結合することがで
きる染料の量は制限される。本発明の一目的は、
この制限を除き且つなお抗体を他の物質に結合さ
せるためのビオチン−アビジン方法の使用によつ
て与えられる利点を享受することにある。
免疫学的反応検出系の感度を増大させるための
他の試みは、染料の代りに放射性同位元素を使用
している。放射性同位元素は物理的に小さな標識
であり、それによつて立体障害と感度の低下が最
少限となつて、もつとも高感度の検出が可能とな
る。しかしながら、放射性同位元素の使用には、
ガンマ線を放射する同位元素、たとえば125Iの比
較的短かい寿命、同位元素のガンマ線による免疫
学的反応性の低下、連邦規格に準拠する方法の使
用を必要とし且つまた高価で複雑な検出装置に加
えて精密な安全制御をも必要とする危険な放射性
同位元素の使用にかかわる衛生上の危険を包含す
る、多くの欠点がある。更に、放射線標識免疫検
定は可溶性抗原に対して適しているけれども、こ
れは実際に平均化方法であるから細胞ごとの基準
には容易には適用できない。放射性標識免疫検定
を自動化した流動細胞分析装置（flow
cytometry instrumentation）のために単一の細
胞に鋭敏とするためには、進歩したラジオグラフ
技術を必要とする。このような技術は、緩速であ
り且つ手順はきわめて複雑であるものと予想され
る。その結果として、放射性同位元素は一般に
個々の細胞分析には不適である。本発明の目的
は、オートラジオグラフ技術と放射性免疫検定の
感度を増大させる試薬を提供すること及び放射性
標識が抗体に極めて近接しているために直接的な
標識付けによつて通常生じる放射性損傷の可能性
を減少させることにある。
他の試みは、染料の代りに放射性同位元素を使用
している。放射性同位元素は物理的に小さな標識
であり、それによつて立体障害と感度の低下が最
少限となつて、もつとも高感度の検出が可能とな
る。しかしながら、放射性同位元素の使用には、
ガンマ線を放射する同位元素、たとえば125Iの比
較的短かい寿命、同位元素のガンマ線による免疫
学的反応性の低下、連邦規格に準拠する方法の使
用を必要とし且つまた高価で複雑な検出装置に加
えて精密な安全制御をも必要とする危険な放射性
同位元素の使用にかかわる衛生上の危険を包含す
る、多くの欠点がある。更に、放射線標識免疫検
定は可溶性抗原に対して適しているけれども、こ
れは実際に平均化方法であるから細胞ごとの基準
には容易には適用できない。放射性標識免疫検定
を自動化した流動細胞分析装置（flow
cytometry instrumentation）のために単一の細
胞に鋭敏とするためには、進歩したラジオグラフ
技術を必要とする。このような技術は、緩速であ
り且つ手順はきわめて複雑であるものと予想され
る。その結果として、放射性同位元素は一般に
個々の細胞分析には不適である。本発明の目的
は、オートラジオグラフ技術と放射性免疫検定の
感度を増大させる試薬を提供すること及び放射性
標識が抗体に極めて近接しているために直接的な
標識付けによつて通常生じる放射性損傷の可能性
を減少させることにある。
染料標識物質の代りとして使用する酵素は、基
質の大きな交代により感度の向上を提供する。こ
のような方式は、一般的な染料標識物質の使用の
ほかに余分の段階を必要とするけれども、螢光染
料の使用において表われるような光標白問題が存
在しない。その上、酵素の適当な選択は、自動化
した装置により容易に識別し且つ定量することが
できる着色化合物または酸の生産を可能とする。
欠点としては、たとえば酵素が本質的に大きく且
つ粘着性であつて、そのために抗体の変質をもた
らすこと、及び非特異的な結合に対する固有の酵
素の性質または同族体結合からの立体障害による
特異性の喪失がある。その上、酵素は保存寿命の
問題を提供し、それによつて臨床環境における実
用に対する有効性が低下する。細胞上の特異的な
構造の部位を決定しまたは測定するためには、基
質は細胞上に直接に、検出に好都合な形態、たと
えば、螢光化合物として、沈殿しなければならな
い。酵素系において一般に遭遇する問題は、固定
し且つ限られた酵素反応速度による感度の制限で
ある。単に酵素が基質に対して作用し続ける時間
を長くすることによつて、それに対する補償とす
ることが可能である。いうまでもなく、これは臨
床的な応用におけるかかる方法の効率を低下させ
且つ系の処理（through−put）能力が最高に重
要である自動化した方法におけるその有用性を低
下させる。本発明の目的は、向上した感度を有す
る免疫反応を検出するための、酵素と適合する試
薬を提供することにある。
質の大きな交代により感度の向上を提供する。こ
のような方式は、一般的な染料標識物質の使用の
ほかに余分の段階を必要とするけれども、螢光染
料の使用において表われるような光標白問題が存
在しない。その上、酵素の適当な選択は、自動化
した装置により容易に識別し且つ定量することが
できる着色化合物または酸の生産を可能とする。
欠点としては、たとえば酵素が本質的に大きく且
つ粘着性であつて、そのために抗体の変質をもた
らすこと、及び非特異的な結合に対する固有の酵
素の性質または同族体結合からの立体障害による
特異性の喪失がある。その上、酵素は保存寿命の
問題を提供し、それによつて臨床環境における実
用に対する有効性が低下する。細胞上の特異的な
構造の部位を決定しまたは測定するためには、基
質は細胞上に直接に、検出に好都合な形態、たと
えば、螢光化合物として、沈殿しなければならな
い。酵素系において一般に遭遇する問題は、固定
し且つ限られた酵素反応速度による感度の制限で
ある。単に酵素が基質に対して作用し続ける時間
を長くすることによつて、それに対する補償とす
ることが可能である。いうまでもなく、これは臨
床的な応用におけるかかる方法の効率を低下させ
且つ系の処理（through−put）能力が最高に重
要である自動化した方法におけるその有用性を低
下させる。本発明の目的は、向上した感度を有す
る免疫反応を検出するための、酵素と適合する試
薬を提供することにある。
電子不透明着色剤は電子顕微鏡において有用な
応用が認められているけれども、このような系
は、きわめて複雑であり且つ時間のかかる操作を
必要とし、そのためにその臨床的な価値が著るし
く低下する。この欠点は、ある程度までは、分解
能の向上によつて補償される。電子不透明着色剤
は、フエライト化合物、すなわち、鉄またはコロ
イド性金を含有する蛋白質を包含するが、しか
し、これらの化合物は抗体よりも大きく、それ
故、抗体の反応性に悪影響があるものと考えられ
る。本発明の目的は、抗体に対するこのような影
響を低下させると共に、電子的に密度が高く且つ
電子走査に不透明な試薬を提供することにある。
応用が認められているけれども、このような系
は、きわめて複雑であり且つ時間のかかる操作を
必要とし、そのためにその臨床的な価値が著るし
く低下する。この欠点は、ある程度までは、分解
能の向上によつて補償される。電子不透明着色剤
は、フエライト化合物、すなわち、鉄またはコロ
イド性金を含有する蛋白質を包含するが、しか
し、これらの化合物は抗体よりも大きく、それ
故、抗体の反応性に悪影響があるものと考えられ
る。本発明の目的は、抗体に対するこのような影
響を低下させると共に、電子的に密度が高く且つ
電子走査に不透明な試薬を提供することにある。
上記の問題の多くを克服するための従来の試み
は、重合体粒子、すなわち、フルオレセインまた
はその他の標識物質を含有する微小球体の使用を
包含する。一般にこれらの重合体粒子は50〜2000
マノメーターの範囲の大きさであり、その結果、
抗体によつて細胞に結合させることができる数は
立体的に限定される。一般に、粒子は多数の抗体
で覆われる。しかしながら、試薬の大きさが物理
的に大であるために、免疫反応をもたらすために
適当な配置で、細胞上の抗原部位に抗体が接近す
る機会が、著るしく低くなる。従来は、重合体粒
子は、乳化重合によつてスチレンとビニルモノマ
ーから製造されてきた。しかしながら、生成する
疎水性の粒子は、非特異的な結合並びにコロイド
的不安定性を表わす欠点がある。後者の不安定性
は、粒子表面への抗体の結合によつて一層大きく
なる。微小球体の表面への抗体の結合による抗体
に対する表面変性効果もまた、欠点の一つであ
る。
は、重合体粒子、すなわち、フルオレセインまた
はその他の標識物質を含有する微小球体の使用を
包含する。一般にこれらの重合体粒子は50〜2000
マノメーターの範囲の大きさであり、その結果、
抗体によつて細胞に結合させることができる数は
立体的に限定される。一般に、粒子は多数の抗体
で覆われる。しかしながら、試薬の大きさが物理
的に大であるために、免疫反応をもたらすために
適当な配置で、細胞上の抗原部位に抗体が接近す
る機会が、著るしく低くなる。従来は、重合体粒
子は、乳化重合によつてスチレンとビニルモノマ
ーから製造されてきた。しかしながら、生成する
疎水性の粒子は、非特異的な結合並びにコロイド
的不安定性を表わす欠点がある。後者の不安定性
は、粒子表面への抗体の結合によつて一層大きく
なる。微小球体の表面への抗体の結合による抗体
に対する表面変性効果もまた、欠点の一つであ
る。
重合体粒子中に親水性のモノマーを導入するこ
とによつて、粒子の疎水的な本質を克服しようと
する試みが行なわれている。しかしながら、この
ような試みは乳化重合方法に限定される。粒子の
組成の変化は非特異的な結合とコロイド不安定性
の問題を改善することができるけれども、これら
の望ましくない特性は、重合体粒子を合成するた
めには最低限度の量の疎水性モノマーを必要とす
るという理由で、完全に排除することはできな
い。このような重合体粒子検出系の一つは、モン
トニーらに対する米国特許第4254096号に記され
ているが、この特許は、水に不溶性という望まし
くない特性を有する親水性重合体粒子に対して共
有結合した抗体を用いる検定方法を記している。
完全に親水性のモノマーの場合においてすら、ド
レーヤーに対する米国特許第3853987号に記すよ
うに、親水性粒子とするために架橋剤を必要とす
る。本発明の一目的は架橋剤の必要を排除するこ
とにある。
とによつて、粒子の疎水的な本質を克服しようと
する試みが行なわれている。しかしながら、この
ような試みは乳化重合方法に限定される。粒子の
組成の変化は非特異的な結合とコロイド不安定性
の問題を改善することができるけれども、これら
の望ましくない特性は、重合体粒子を合成するた
めには最低限度の量の疎水性モノマーを必要とす
るという理由で、完全に排除することはできな
い。このような重合体粒子検出系の一つは、モン
トニーらに対する米国特許第4254096号に記され
ているが、この特許は、水に不溶性という望まし
くない特性を有する親水性重合体粒子に対して共
有結合した抗体を用いる検定方法を記している。
完全に親水性のモノマーの場合においてすら、ド
レーヤーに対する米国特許第3853987号に記すよ
うに、親水性粒子とするために架橋剤を必要とす
る。本発明の一目的は架橋剤の必要を排除するこ
とにある。
ハーシユフエルドとイートンは米国特許第
4169137号において、重合体骨格を用いて感度を
増大させる別の方法を記している。彼らは特に多
数の螢光染料分子が結合させてある、第一アミン
含有多官能性重合体骨格、すなわち、ポリリシン
から成る抗原検出試薬を記している。多官能性重
合体骨格を、たとえばグルタルアルデヒドのよう
なジアルデヒドの使用によつて、ポリリシン上の
第一アミンを通じて、抗体上の第一アミン部に共
有結合させた。このような方法は、抗原の１部位
当りの感度の増大をもたらすけれども、記載の方
法論によつては、重大な制限が存在する。特に、
重合体は第一アミン含有重合体に限定されるが、
それは、その陽イオン性の電荷のために、強い非
特異的な結合を表わし、それによつてその特異性
が著るしく低下する。実際に、ハーシユフエルド
が記しているタイプの重合体は、抗体が存在しな
くても細胞に結合することが認められている。ジ
アルデヒドカツプリング剤の必要もまた別の欠点
である。これらの制限は、重合体骨格への種々の
螢光染料の好都合な結合を著るしく限定すること
になる。更に、ジアルデヒドの使用は、非第一ア
ミン含有重合体骨格の抗体への結合を許さない。
生物学的応用に対して興味あるPH範囲内で使用す
る場合に、上記の系は陽イオン的に荷電する傾向
があり、そのために静電的な相互作用によつて、
陰イオン的に荷電した細胞及び組識表面に非特異
的に結合する。生成するジアルデヒド、共有結合
及び可逆的ジアルデヒド反応の不安定性のため
に、ハーシユフエルドの試薬は抗原部位と競争的
に反応することができる著るしく解離した重合体
と抗体を含有するものと予測される。
4169137号において、重合体骨格を用いて感度を
増大させる別の方法を記している。彼らは特に多
数の螢光染料分子が結合させてある、第一アミン
含有多官能性重合体骨格、すなわち、ポリリシン
から成る抗原検出試薬を記している。多官能性重
合体骨格を、たとえばグルタルアルデヒドのよう
なジアルデヒドの使用によつて、ポリリシン上の
第一アミンを通じて、抗体上の第一アミン部に共
有結合させた。このような方法は、抗原の１部位
当りの感度の増大をもたらすけれども、記載の方
法論によつては、重大な制限が存在する。特に、
重合体は第一アミン含有重合体に限定されるが、
それは、その陽イオン性の電荷のために、強い非
特異的な結合を表わし、それによつてその特異性
が著るしく低下する。実際に、ハーシユフエルド
が記しているタイプの重合体は、抗体が存在しな
くても細胞に結合することが認められている。ジ
アルデヒドカツプリング剤の必要もまた別の欠点
である。これらの制限は、重合体骨格への種々の
螢光染料の好都合な結合を著るしく限定すること
になる。更に、ジアルデヒドの使用は、非第一ア
ミン含有重合体骨格の抗体への結合を許さない。
生物学的応用に対して興味あるPH範囲内で使用す
る場合に、上記の系は陽イオン的に荷電する傾向
があり、そのために静電的な相互作用によつて、
陰イオン的に荷電した細胞及び組識表面に非特異
的に結合する。生成するジアルデヒド、共有結合
及び可逆的ジアルデヒド反応の不安定性のため
に、ハーシユフエルドの試薬は抗原部位と競争的
に反応することができる著るしく解離した重合体
と抗体を含有するものと予測される。
本発明の目的は、多くの検出器を有し、且つ疎
水性及び陽イオン電荷特性による非特異的な結合
を回避すると共にジアルデヒド結合剤の必要を回
避すべき水溶性重合体を使用する免疫学的物質検
出分析方法を提供することにある。
水性及び陽イオン電荷特性による非特異的な結合
を回避すると共にジアルデヒド結合剤の必要を回
避すべき水溶性重合体を使用する免疫学的物質検
出分析方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、向上した感度を有する免
疫学的物質を検出することができる試薬を提供す
ることにある。最低の疎水性を有する適当に荷電
した重合体を提供することによつて、不都合な非
特異的な結合をもたらす疎水性重合体及び粒子並
びに陽イオン的に荷電した複合体に伴なう問題
を、回避することにある。正味の陽電荷を有して
いない、多数の標識物質を保有することができる
水溶性重合体を提供することもまた本発明の一目
的である。
疫学的物質を検出することができる試薬を提供す
ることにある。最低の疎水性を有する適当に荷電
した重合体を提供することによつて、不都合な非
特異的な結合をもたらす疎水性重合体及び粒子並
びに陽イオン的に荷電した複合体に伴なう問題
を、回避することにある。正味の陽電荷を有して
いない、多数の標識物質を保有することができる
水溶性重合体を提供することもまた本発明の一目
的である。
更に他の目的は、簡単な保存と自動化装置中で
の効果的な使用が試薬を提供することにある。本
発面の更に他の目的は、自動化した細胞学装置に
おいて現在用いられている技術を用いて検出する
ことができる濃度と量において、望ましいが、し
かし螢光性の弱い、赤励起螢光染料を使用するこ
とができる試薬を提供することにある。
の効果的な使用が試薬を提供することにある。本
発面の更に他の目的は、自動化した細胞学装置に
おいて現在用いられている技術を用いて検出する
ことができる濃度と量において、望ましいが、し
かし螢光性の弱い、赤励起螢光染料を使用するこ
とができる試薬を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、単一の試薬内で両成
分のそれぞれの利点を利用するために水溶性の重
合体とアビジン−ビオチンを組み合わせて使用す
ることにある。
分のそれぞれの利点を利用するために水溶性の重
合体とアビジン−ビオチンを組み合わせて使用す
ることにある。
本発明の原理は、概括的にいえば、検出すべき
物質に対して特異的な免疫学的同族体を、種々の
中間的機構を通じて、検出可能な標識機構として
働らくかまたはそれを保有する水溶性重合体に結
合させることから成る、免疫学的反応の検出に役
立つ直接的及び間接的標識技術を用いるものであ
る。本明細書において使用する場合の水溶性重合
体という用語は通常の有機化学的な感覚において
用いられるものと同じ意味を包含し、水に不溶性
（疎水性）の重合体である共有架橋結合を必要と
する微小球体すなわち粒子として一般に公知であ
るものを包含しない。その結果、本発明において
は共有架橋結合剤を必要としない。一般に、本発
明は枝分れした重合体に対する約１×107ドルト
ンに至るまで及び約１×109ドルトンに至るまで
の分子量を有する単一の鎖状重合体を包含する。
枝分れした重合体は、“骨格”連鎖の長さに沿う
どこかに共有結合的に結合した、同一または異種
モノマーから成る、複数の付加的な重合体連鎖を
有する重合体“骨格”連鎖を含有する水溶性重合
体を包含する。枝分れした重合体に対する有用な
類推物は、欠けている剛毛を有していても有して
いなくてもよい針金の剛毛ブラシであるといえよ
う。
物質に対して特異的な免疫学的同族体を、種々の
中間的機構を通じて、検出可能な標識機構として
働らくかまたはそれを保有する水溶性重合体に結
合させることから成る、免疫学的反応の検出に役
立つ直接的及び間接的標識技術を用いるものであ
る。本明細書において使用する場合の水溶性重合
体という用語は通常の有機化学的な感覚において
用いられるものと同じ意味を包含し、水に不溶性
（疎水性）の重合体である共有架橋結合を必要と
する微小球体すなわち粒子として一般に公知であ
るものを包含しない。その結果、本発明において
は共有架橋結合剤を必要としない。一般に、本発
明は枝分れした重合体に対する約１×107ドルト
ンに至るまで及び約１×109ドルトンに至るまで
の分子量を有する単一の鎖状重合体を包含する。
枝分れした重合体は、“骨格”連鎖の長さに沿う
どこかに共有結合的に結合した、同一または異種
モノマーから成る、複数の付加的な重合体連鎖を
有する重合体“骨格”連鎖を含有する水溶性重合
体を包含する。枝分れした重合体に対する有用な
類推物は、欠けている剛毛を有していても有して
いなくてもよい針金の剛毛ブラシであるといえよ
う。
前記の目的に従つて、本発明の原理は、水溶性
重合体を使用する免疫学的物質検出試薬のいくつ
かの実施形態を包含する。全実施形態が電荷特異
性を備えているが、重合体の電荷、重合体−標識
物質複合体を形成するように結合した標識物質を
有する重合体の電荷、または抗体に結合するため
の手段を有する重合体−標識物質複合体の電荷の
何れが特性的であるかが、異なつている。全実施
形態が重合体を同族体に結合させるための手段を
包含する。
重合体を使用する免疫学的物質検出試薬のいくつ
かの実施形態を包含する。全実施形態が電荷特異
性を備えているが、重合体の電荷、重合体−標識
物質複合体を形成するように結合した標識物質を
有する重合体の電荷、または抗体に結合するため
の手段を有する重合体−標識物質複合体の電荷の
何れが特性的であるかが、異なつている。全実施
形態が重合体を同族体に結合させるための手段を
包含する。
追加的な実施形態は、免疫学的同族体上の活性
基、活性カツプリング試薬、重合体上の活性基、
重合体上の活性化可能な基、及びアビジンが重合
体に結合し且つビオチンが免疫学的同族体に結合
しているビオチン−アビジン複合体から成るグル
ープから選択する。追加的な実施形態は更に重合
体に結合した標識物質を包含していてもよい。更
に他の実施形態は非螢光性染料、螢光染料、放射
性同位元素、電子不透明物質、酵素、第一の免疫
学的同族体とは異なる特異性の第二の免疫学的同
族体及び微小球体から成るグループから選択する
標識物質を備えている。好適実施形態は、ポリア
クリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミ
ド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコー
ル、上記の重合体の組合わせ、ヒドロキシエチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、天
然水溶性重合体及び合成水溶性重合体から選択す
る水溶性重合体を備えている。
基、活性カツプリング試薬、重合体上の活性基、
重合体上の活性化可能な基、及びアビジンが重合
体に結合し且つビオチンが免疫学的同族体に結合
しているビオチン−アビジン複合体から成るグル
ープから選択する。追加的な実施形態は更に重合
体に結合した標識物質を包含していてもよい。更
に他の実施形態は非螢光性染料、螢光染料、放射
性同位元素、電子不透明物質、酵素、第一の免疫
学的同族体とは異なる特異性の第二の免疫学的同
族体及び微小球体から成るグループから選択する
標識物質を備えている。好適実施形態は、ポリア
クリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミ
ド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコー
ル、上記の重合体の組合わせ、ヒドロキシエチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、天
然水溶性重合体及び合成水溶性重合体から選択す
る水溶性重合体を備えている。
本発明のその他の目的及び理解は、図面を参照
することによつて明白となる。
することによつて明白となる。
前記の目的に従つて、第１図に示すような好適
な免疫学的物質検出試薬は、検出すべき免疫学的
物質、ここでは抗原、30に対して特異的な免疫学
的同族体、ここでは免疫グロブリン１、を備えて
いる。この分野に精通するものには明らかなよう
に、各図中の様式化した成分描写は相対的な割合
ならびに明瞭とするための外観に関して著るしく
異なつている。更に注意すべきことは、一つの図
に関する論議は、異なる標識物質が存在している
かまたは異なる検定系で使用するということを除
けば、他の図に対しても同様に適用することがで
きるということである。免疫グロブリン１は、多
数の標識物質３が結合している水溶性の重合体２
に結合している。標識物質３は螢光物質３は螢光
染料であることが好ましいけれども、その代りと
してたとえば非螢光性染料、放射性同位元素、電
子不透明物質、酵素、または第一の同族体とは異
なる特異性の第二の同族体のような他の標識物質
を使用してもよい。あるいはまた、第２図に示す
ように螢光体含有微小球体４を用いることもでき
る。第２図においては検出すべき抗原３０が基質
５１の表面に固定してある、固相免疫学的検定に
おける試薬の使用をも示している。
な免疫学的物質検出試薬は、検出すべき免疫学的
物質、ここでは抗原、30に対して特異的な免疫学
的同族体、ここでは免疫グロブリン１、を備えて
いる。この分野に精通するものには明らかなよう
に、各図中の様式化した成分描写は相対的な割合
ならびに明瞭とするための外観に関して著るしく
異なつている。更に注意すべきことは、一つの図
に関する論議は、異なる標識物質が存在している
かまたは異なる検定系で使用するということを除
けば、他の図に対しても同様に適用することがで
きるということである。免疫グロブリン１は、多
数の標識物質３が結合している水溶性の重合体２
に結合している。標識物質３は螢光物質３は螢光
染料であることが好ましいけれども、その代りと
してたとえば非螢光性染料、放射性同位元素、電
子不透明物質、酵素、または第一の同族体とは異
なる特異性の第二の同族体のような他の標識物質
を使用してもよい。あるいはまた、第２図に示す
ように螢光体含有微小球体４を用いることもでき
る。第２図においては検出すべき抗原３０が基質
５１の表面に固定してある、固相免疫学的検定に
おける試薬の使用をも示している。
第１及び第２図を参照すると、水溶性重合体２
は、細胞に対する非特異的な結合を回避するよう
に選び、それによつて最大の感度と免疫学的応答
を可能とすることが好都合である。それ故、陽イ
オン的に荷電しており、そのために非特異的に結
合するおそれのある重合体は避けることが好まし
い。避けることが好ましい、このような陽イオン
的に荷電した重合体の例は、第一アミン含有重合
体である。
は、細胞に対する非特異的な結合を回避するよう
に選び、それによつて最大の感度と免疫学的応答
を可能とすることが好都合である。それ故、陽イ
オン的に荷電しており、そのために非特異的に結
合するおそれのある重合体は避けることが好まし
い。避けることが好ましい、このような陽イオン
的に荷電した重合体の例は、第一アミン含有重合
体である。
好適な水溶性重合体は陰イオン性（負）または
ゼロの電荷を有し且つポリアクリル酸、ポリメタ
クリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアル
コール、ポリアリルアルコール、これらの重合体
の種々の可能な組合わせ、ヒドロキシエチルセル
ロース、ヒドロキシプロピルセルロース、天然水
溶性重合体並びに合成水溶性重合体から成るグル
ープから選択することが理想的である。しかしな
がら、標識物質３，４の多くは、特に染料タイプ
の標識物質においては、陽イオン的に荷電してい
る傾向があることが注目される。これは望ましく
ない非特異的な結合を増大させる傾向があるか
ら、水溶性重合体をその陰イオン性を増大させる
ように調節して、それによつて望ましい感度に対
して悪影響のある非特異的“着色”性の増大を補
償することが好都合である。
ゼロの電荷を有し且つポリアクリル酸、ポリメタ
クリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアル
コール、ポリアリルアルコール、これらの重合体
の種々の可能な組合わせ、ヒドロキシエチルセル
ロース、ヒドロキシプロピルセルロース、天然水
溶性重合体並びに合成水溶性重合体から成るグル
ープから選択することが理想的である。しかしな
がら、標識物質３，４の多くは、特に染料タイプ
の標識物質においては、陽イオン的に荷電してい
る傾向があることが注目される。これは望ましく
ない非特異的な結合を増大させる傾向があるか
ら、水溶性重合体をその陰イオン性を増大させる
ように調節して、それによつて望ましい感度に対
して悪影響のある非特異的“着色”性の増大を補
償することが好都合である。
典型的には1000〜100000000ドルトンの範囲の
分子量を有する水溶性重合体は、望ましい特異性
を有する抗体に対して多くの染料型の物質を結合
させる能力を備えている。抗体の反応性に対する
悪影響を避けるためには結合が抗体から充分な距
離にあるということがきわめて重要である。これ
らの要件は、たとえばフルオレセインまたはアク
リジンオレンジのような他の染料と比較して特徴
的に小さな螢光を表わすことが多い長波長すなわ
ち赤色光励起螢光染料にかかわる場合に、特に重
要である。それ故、多くの染料分子３を有する水
溶性重合体２を用いることによつて、より高濃度
の螢光が提供され、それによつて、現在使用可能
な自動化装置によつて免疫学的反応の存在をより
容易に記録することが可能となるために、感度の
増大を達成することができる。
分子量を有する水溶性重合体は、望ましい特異性
を有する抗体に対して多くの染料型の物質を結合
させる能力を備えている。抗体の反応性に対する
悪影響を避けるためには結合が抗体から充分な距
離にあるということがきわめて重要である。これ
らの要件は、たとえばフルオレセインまたはアク
リジンオレンジのような他の染料と比較して特徴
的に小さな螢光を表わすことが多い長波長すなわ
ち赤色光励起螢光染料にかかわる場合に、特に重
要である。それ故、多くの染料分子３を有する水
溶性重合体２を用いることによつて、より高濃度
の螢光が提供され、それによつて、現在使用可能
な自動化装置によつて免疫学的反応の存在をより
容易に記録することが可能となるために、感度の
増大を達成することができる。
水溶性重合体は酵素標識系において用いる場合
に一層の利益を表わす。酵素は、免疫グロブリン
と同様に、立体障害に対して敏感な活性部位を有
する大きな蛋白質である。免疫グロブリンと酵素
との間の直接的な結合は、免疫学的物質の添加に
続く免疫学的物質とその同族体の間の免疫学的反
応の検出を許すけれども、立体障害のために不都
合な低い感度を有している。免疫グロブリンを単
一または複数の酵素分子に結合させるための水溶
性重合体の有利な使用は、各蛋白質が他のものの
存在による立体障害を受けない望ましい方式で作
用することを可能とする。その結果として、免疫
学的検定試薬は免疫学的物質の検出において増大
した感度を表わす。
に一層の利益を表わす。酵素は、免疫グロブリン
と同様に、立体障害に対して敏感な活性部位を有
する大きな蛋白質である。免疫グロブリンと酵素
との間の直接的な結合は、免疫学的物質の添加に
続く免疫学的物質とその同族体の間の免疫学的反
応の検出を許すけれども、立体障害のために不都
合な低い感度を有している。免疫グロブリンを単
一または複数の酵素分子に結合させるための水溶
性重合体の有利な使用は、各蛋白質が他のものの
存在による立体障害を受けない望ましい方式で作
用することを可能とする。その結果として、免疫
学的検定試薬は免疫学的物質の検出において増大
した感度を表わす。
本発明は、抗原を伴なう特定の組織または腫瘍
細胞に対しての単分枝系抗体と結び付いて、一層
の有用性を示す。重合体は、治療物質すなわち治
療剤の免疫グロブリン自体への直接的な結合のみ
によつて可能であるよりも増大した治療剤の負荷
を保持することができ且つその上治療剤の結合に
よる免疫グロブリンの変質の機会が低下する。そ
の結果として、薬品、ビタミン、薬剤、放射光学
的処理分子またはその他の特定部位すなわち標的
部位への送達が望ましい物質を保持する水溶性重
合体に結合した単分枝系抗体を局限させてそれが
特異的に腫瘍細胞を攻撃することを可能とし且つ
増大した濃度の治療材料を都合良く直接に標的部
位に交付することができる。
細胞に対しての単分枝系抗体と結び付いて、一層
の有用性を示す。重合体は、治療物質すなわち治
療剤の免疫グロブリン自体への直接的な結合のみ
によつて可能であるよりも増大した治療剤の負荷
を保持することができ且つその上治療剤の結合に
よる免疫グロブリンの変質の機会が低下する。そ
の結果として、薬品、ビタミン、薬剤、放射光学
的処理分子またはその他の特定部位すなわち標的
部位への送達が望ましい物質を保持する水溶性重
合体に結合した単分枝系抗体を局限させてそれが
特異的に腫瘍細胞を攻撃することを可能とし且つ
増大した濃度の治療材料を都合良く直接に標的部
位に交付することができる。
本発明においては生適合性重合体を使用するこ
とが好ましい。生適合性とは、不良の毒性効果を
生じることがなく、且つ細胞への非特異的結合ま
たは凝集タイプの集合体を与える格子状構造の生
成を避けることができるように重合体を選択する
ことを意味する。それ故、好適実施形態において
は、ポリアクリル酸及びポリアクリルアミドを使
用するが、両重合体は共にフリーラジカル方法に
よつて重合させた水溶性モノマーから成るけれど
も、アニオン／カチオン重合及び縮合方法を使用
することもできる。更に、官能基を有するモノマ
ーを用いて重合体を生成させ、それによつて後に
その官能基をたとえば染料のような標識物質また
は免疫学的物質と反応させるために用いることが
できるようにすることが有利であることが認めら
れている。このような官能基を有するモノマーの
例は塩化アクリロイルを包含する。生成するポリ
塩化アクリロイルは、第一アミンと反応してアミ
ド結合を形成することができる活性塩素原子を有
している。しかしながら、官能基はこれだけに限
定されることはなく、その代りにヒドロキシル、
チオシアナート、イソチオシナート、塩化スルホ
ニル、スクシンイミド及びジクロロトリアジニル
などを包含するその他の基を用いることができる
ということに注意すべきである。
とが好ましい。生適合性とは、不良の毒性効果を
生じることがなく、且つ細胞への非特異的結合ま
たは凝集タイプの集合体を与える格子状構造の生
成を避けることができるように重合体を選択する
ことを意味する。それ故、好適実施形態において
は、ポリアクリル酸及びポリアクリルアミドを使
用するが、両重合体は共にフリーラジカル方法に
よつて重合させた水溶性モノマーから成るけれど
も、アニオン／カチオン重合及び縮合方法を使用
することもできる。更に、官能基を有するモノマ
ーを用いて重合体を生成させ、それによつて後に
その官能基をたとえば染料のような標識物質また
は免疫学的物質と反応させるために用いることが
できるようにすることが有利であることが認めら
れている。このような官能基を有するモノマーの
例は塩化アクリロイルを包含する。生成するポリ
塩化アクリロイルは、第一アミンと反応してアミ
ド結合を形成することができる活性塩素原子を有
している。しかしながら、官能基はこれだけに限
定されることはなく、その代りにヒドロキシル、
チオシアナート、イソチオシナート、塩化スルホ
ニル、スクシンイミド及びジクロロトリアジニル
などを包含するその他の基を用いることができる
ということに注意すべきである。
公知の有機化学的手法に従つて、重合体上の官
能基と染料の反応を刺激するために、染料を加温
すること及び／またはそれを触媒の存在で使用す
ることが必要な場合がある。重合体に付加する染
料の量は、濃度比を制御することによつて、また
は染料に対するものと抗体に対するものとで異な
る官能基を使用することによつて、具合良く調節
することができる。このことは、いうまでもな
く、一般に染料は重合体と反応すべきただ一つの
官能基反応部位を有しているのみであるという事
実によつて可能となる。
能基と染料の反応を刺激するために、染料を加温
すること及び／またはそれを触媒の存在で使用す
ることが必要な場合がある。重合体に付加する染
料の量は、濃度比を制御することによつて、また
は染料に対するものと抗体に対するものとで異な
る官能基を使用することによつて、具合良く調節
することができる。このことは、いうまでもな
く、一般に染料は重合体と反応すべきただ一つの
官能基反応部位を有しているのみであるという事
実によつて可能となる。
公知の技術に従えば、重合体に標識物質をつけ
るのに有利に使用することができる他の方法は
ａ）標識物質上の活性化された基を使用するこ
と、ｂ）外部活性化試薬を使用することと、ｃ）
第一部分と第二部分とを有するこれらの標識物質
において、結合した第一部分を有する単量体を重
合して重合体を形成し、次いで該第一部分に結合
させるための第二部分を付加する、ｄ）標識物質
を該単量体と共重合させることを含む。
るのに有利に使用することができる他の方法は
ａ）標識物質上の活性化された基を使用するこ
と、ｂ）外部活性化試薬を使用することと、ｃ）
第一部分と第二部分とを有するこれらの標識物質
において、結合した第一部分を有する単量体を重
合して重合体を形成し、次いで該第一部分に結合
させるための第二部分を付加する、ｄ）標識物質
を該単量体と共重合させることを含む。
第３図は、この場合に微小球４を支持する重合
体２に対する免疫グロブリンの結合を行うために
アビジン６−ビオチン５複合体（avidin6−
biotin5 complex）の使用を示す。重合体は染料
及び先に述べた標識物質群から選ばれた他の一員
の如き種々の標識タイプ物質（markertype
substances）の担体であることができる。ビオチ
ン−アビジンはその格段に強い結合特性その化学
的安定性及び感度増幅の故に有利に使用すること
ができる。ビオチン５は良く知られた方法によつ
て免疫グロブリンに容易に結合され、そしてその
小さな寸法の故に、免疫グロブリンの反応性に対
して殆んど影響を及ぼさないか又は全然影響を及
ぼさなく、そして更にいくつかのものは抗体に結
合されて増加した感受性を生じる。ビオチンと対
照的に、アビジン分子は相当大きく、且つ過去に
おいてフルオレセイン及び他の染料タイプ物質を
直接支持するように使用された。しかしながら、
本発明は唯重合体を抗体にカツプルさせるために
のみアビジンを有利に使用する。重合体ははるか
に多くのフルオレセイン又はアビジン以外の他の
染料タイプ物質を支持することができるので、結
果は免疫学的同族体と関連した染料の濃度はより
大となり、これはより大きい感受性を与える。１
個のみの重合体分子がアビジン分子当り結合され
ることを確実にすることは困難であるけれども、
その代わりに抗体のビオチン化は正確に制御する
ことができる。
体２に対する免疫グロブリンの結合を行うために
アビジン６−ビオチン５複合体（avidin6−
biotin5 complex）の使用を示す。重合体は染料
及び先に述べた標識物質群から選ばれた他の一員
の如き種々の標識タイプ物質（markertype
substances）の担体であることができる。ビオチ
ン−アビジンはその格段に強い結合特性その化学
的安定性及び感度増幅の故に有利に使用すること
ができる。ビオチン５は良く知られた方法によつ
て免疫グロブリンに容易に結合され、そしてその
小さな寸法の故に、免疫グロブリンの反応性に対
して殆んど影響を及ぼさないか又は全然影響を及
ぼさなく、そして更にいくつかのものは抗体に結
合されて増加した感受性を生じる。ビオチンと対
照的に、アビジン分子は相当大きく、且つ過去に
おいてフルオレセイン及び他の染料タイプ物質を
直接支持するように使用された。しかしながら、
本発明は唯重合体を抗体にカツプルさせるために
のみアビジンを有利に使用する。重合体ははるか
に多くのフルオレセイン又はアビジン以外の他の
染料タイプ物質を支持することができるので、結
果は免疫学的同族体と関連した染料の濃度はより
大となり、これはより大きい感受性を与える。１
個のみの重合体分子がアビジン分子当り結合され
ることを確実にすることは困難であるけれども、
その代わりに抗体のビオチン化は正確に制御する
ことができる。
第４図は、ビオチン５が連結させてある免疫学
的相同体または免疫グロブリン１の使用による細
胞表面上の免疫学的物質または抗原部位２１の定
量と局在化における本発明の利用を実証する。ビ
オチンは水溶性重合体２に結合したアビジン６に
物理的に吸着し、一方、重合体は標識物質３を保
持することができる。ビオチン−アビジンを使用
する試薬においては、ビオチニル化した抗体を先
ず抗原と反応させ、次いで試薬のアビジン結合部
分を付加させることが好適である。
的相同体または免疫グロブリン１の使用による細
胞表面上の免疫学的物質または抗原部位２１の定
量と局在化における本発明の利用を実証する。ビ
オチンは水溶性重合体２に結合したアビジン６に
物理的に吸着し、一方、重合体は標識物質３を保
持することができる。ビオチン−アビジンを使用
する試薬においては、ビオチニル化した抗体を先
ず抗原と反応させ、次いで試薬のアビジン結合部
分を付加させることが好適である。
本発明の適応性は、固相免疫学的検定の様式化
した図を示している第５図において更に実証され
る。検出すべき抗原７１に対して感応性である免
疫グロブリン１は、表面５１上に固定してあり且
つ抗原を含有する試料は固定した免疫グロブリン
表面と接触している。次いで、抗原に対して感応
性であり且つ標識物質３を有する重合体２に連結
した免疫グロブリン１を有する本発明の試薬を表
面上で洗う。螢光または他の標識物質の定量は存
在する抗原の量及びその精密な局在化に関しての
直接的な計算を可能とする。拡大した図において
は、標識物質は、基質４１との反応性を有し且つ
それを個々に検出することが可能な４２と４３に
分解する酵素４０である。
した図を示している第５図において更に実証され
る。検出すべき抗原７１に対して感応性である免
疫グロブリン１は、表面５１上に固定してあり且
つ抗原を含有する試料は固定した免疫グロブリン
表面と接触している。次いで、抗原に対して感応
性であり且つ標識物質３を有する重合体２に連結
した免疫グロブリン１を有する本発明の試薬を表
面上で洗う。螢光または他の標識物質の定量は存
在する抗原の量及びその精密な局在化に関しての
直接的な計算を可能とする。拡大した図において
は、標識物質は、基質４１との反応性を有し且つ
それを個々に検出することが可能な４２と４３に
分解する酵素４０である。
第６図はさらに本発明の大きな適応性を実証す
るもので、標識物質３を保持する水溶性重合体２
の抗原８０への連結を示しており、それによつて
抗原８０はそれに対して特異的な免疫グロブリン
１と接触することができ、且つその免疫グロブリ
ンは表面５１上に固定してあつてもよいし、ある
いは標識物質を保持する別の重合体に結合させて
あつてもよい。更に標識付けしてない抗原８０を
存在させて、この分野で公知の方法を応用する抑
制方式の検定を用いてもよい。
るもので、標識物質３を保持する水溶性重合体２
の抗原８０への連結を示しており、それによつて
抗原８０はそれに対して特異的な免疫グロブリン
１と接触することができ、且つその免疫グロブリ
ンは表面５１上に固定してあつてもよいし、ある
いは標識物質を保持する別の重合体に結合させて
あつてもよい。更に標識付けしてない抗原８０を
存在させて、この分野で公知の方法を応用する抑
制方式の検定を用いてもよい。
免疫学的物質及び免疫学的同族体という術語の
使用によつて示されるように、多くの場合に、標
識物質を保持する重合体を抗原に結合させること
によつて、細胞または基質の表面上に固定した、
または水溶液中に存在する抗体の存在を検出する
ことが可能な試薬を生成せしめることができると
いうことを了解すべきである。
使用によつて示されるように、多くの場合に、標
識物質を保持する重合体を抗原に結合させること
によつて、細胞または基質の表面上に固定した、
または水溶液中に存在する抗体の存在を検出する
ことが可能な試薬を生成せしめることができると
いうことを了解すべきである。
この分野に精通するものにおいては、本発明の
精神または範囲から逸脱することなく、他の多く
の成分の変更または組み合わせが可能であること
を了解すべきである。
精神または範囲から逸脱することなく、他の多く
の成分の変更または組み合わせが可能であること
を了解すべきである。
実施例 １
約50％（重量による）のアクリル酸と50％（重
量による）のアクリルアミドから成り且つ非螢光
性のモノマー100当りに１の螢光性モノマーを含
有する共重合体を、ジメチルホルムアミド
（DMF）中に各モノマーを溶解し且つ開始剤とし
て2.5％（モノマーの重量に対して）の４，4′−
アゾビス（４−シアノ吉草酸）を添加して窒素下
に65℃で16時間重合させることによつて、製造し
た。螢光性のモノマーは等モル量のフルオレセイ
ンアミンと塩化アクリロイルを室温で反応させる
ことによつて製造した。重合後に、重合しなかつ
た成分を無水ホルムアミド中のビオゲルＰ−10上
のゲル過によつて除去した。15mgの螢光性重合
体を34mgのカルボニルジイミダゾール（存在する
カルボキシル基の数の２倍に等しい量）で処理し
且つそれを室温で30分間反応させることによつて
活性化した。60mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（カルボキシル基の存在数の５倍）を加えて室
温で30分間反応させた。かくして得たスクシンイ
ミドエステル含有重合体を無水アセトンを用いる
沈殿によつて濃縮し、アセトンで洗浄したのち、
アセトン中で保存した。
量による）のアクリルアミドから成り且つ非螢光
性のモノマー100当りに１の螢光性モノマーを含
有する共重合体を、ジメチルホルムアミド
（DMF）中に各モノマーを溶解し且つ開始剤とし
て2.5％（モノマーの重量に対して）の４，4′−
アゾビス（４−シアノ吉草酸）を添加して窒素下
に65℃で16時間重合させることによつて、製造し
た。螢光性のモノマーは等モル量のフルオレセイ
ンアミンと塩化アクリロイルを室温で反応させる
ことによつて製造した。重合後に、重合しなかつ
た成分を無水ホルムアミド中のビオゲルＰ−10上
のゲル過によつて除去した。15mgの螢光性重合
体を34mgのカルボニルジイミダゾール（存在する
カルボキシル基の数の２倍に等しい量）で処理し
且つそれを室温で30分間反応させることによつて
活性化した。60mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（カルボキシル基の存在数の５倍）を加えて室
温で30分間反応させた。かくして得たスクシンイ
ミドエステル含有重合体を無水アセトンを用いる
沈殿によつて濃縮し、アセトンで洗浄したのち、
アセトン中で保存した。
単分枝系抗体実験のために、１mgの活性化重合
体を窒素下に乾燥した。100μのリン酸塩緩衝
食塩水中の0.5mlのホウ酸ナトリウム（0.125M）
と200μｇのOKT3（ニユージヤージー州、ラリタ
ン、ルート202、オルソ製薬社から入手すること
ができる単分子系抗体に向けたＴ−細胞）を水溶
性重合体に加え、その混合物を室温で30分間培養
した。かくして得たOKT3−重合体を、Ｔ−細胞
計数のためのオルソプロトコール（このプロトコ
ールは参考としてここに挙げるものであつて、ニ
ユージヤージー州、ラリタン、ルート202、オル
ソ診断システム社から入手することができる）を
用いて検定した。この方法は本質的に以下のよう
な手順を包含する：全血を螢光的に標識付けした
抗体と反応させる。塩化アンモニウムに基づく溶
解試薬による赤血球の溶解後に、リンパ球を、そ
の前方及び90゜光散乱特性によつて他の白血球と
識別する。“オルソスペクトラム”流動細胞分
析計（オルソ診断システム社から入手することが
できる）によつて螢光データを集め且つ上記のよ
うな特性光散乱によつてリンパ球を同定する。こ
れは、標識付けしたリンパ球と標識付けしてない
リンパ球を識別し且つその割合を計算することを
可能とするヒストグラム表示を提供する。このよ
うにして検定すると、重合体−OKT3は64％の
OKT3陽性リンパ球を示すのに対して通常の
OKT3は66％の陽性リンパ球（顕著には相違して
いない）を示した。同時に重合体−OKT3は、平
均螢光がより高く且つ最高の螢光チヤンネルにお
いてより多くのカウントが存在するという点で、
増大した標識付けを示した。
体を窒素下に乾燥した。100μのリン酸塩緩衝
食塩水中の0.5mlのホウ酸ナトリウム（0.125M）
と200μｇのOKT3（ニユージヤージー州、ラリタ
ン、ルート202、オルソ製薬社から入手すること
ができる単分子系抗体に向けたＴ−細胞）を水溶
性重合体に加え、その混合物を室温で30分間培養
した。かくして得たOKT3−重合体を、Ｔ−細胞
計数のためのオルソプロトコール（このプロトコ
ールは参考としてここに挙げるものであつて、ニ
ユージヤージー州、ラリタン、ルート202、オル
ソ診断システム社から入手することができる）を
用いて検定した。この方法は本質的に以下のよう
な手順を包含する：全血を螢光的に標識付けした
抗体と反応させる。塩化アンモニウムに基づく溶
解試薬による赤血球の溶解後に、リンパ球を、そ
の前方及び90゜光散乱特性によつて他の白血球と
識別する。“オルソスペクトラム”流動細胞分
析計（オルソ診断システム社から入手することが
できる）によつて螢光データを集め且つ上記のよ
うな特性光散乱によつてリンパ球を同定する。こ
れは、標識付けしたリンパ球と標識付けしてない
リンパ球を識別し且つその割合を計算することを
可能とするヒストグラム表示を提供する。このよ
うにして検定すると、重合体−OKT3は64％の
OKT3陽性リンパ球を示すのに対して通常の
OKT3は66％の陽性リンパ球（顕著には相違して
いない）を示した。同時に重合体−OKT3は、平
均螢光がより高く且つ最高の螢光チヤンネルにお
いてより多くのカウントが存在するという点で、
増大した標識付けを示した。
実施例 ２
200μｇのOKT3（1.3×10-9モル）を、200μの
0.1Mホウ酸ナトリウムの最終容量中で、2.6×
10-8モルのビオチニルＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド（DMF中2.6μ）と、室温で２時間反応さ
せた。この処理は、50％の標識付けを推定して抗
体当り10の計算ビオチン基を導入した。一方、
680μｇの精製したアビジンを200μの0.123Mホ
ウ酸ナトリウム中の実施例１におけるようにして
調製した2.5mgの乾燥した、フルオレセイン−重
合体に加え室温で１時間反応させた。10μのビ
オチニル化OKT3を50μの軟膜（５×105の白血
球）と混合して、室温で30分間培養した。1.5ml
ずつのリン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄して、非結
合OKT3−ビオチンを除いたのち、20μのアビ
ジン−重合体を加え（比較のためにフルオレセイ
ン−アビジンをも用いた）、その混合物を室温で
30分間培養した。試料を1.5mlのリン酸塩緩衝食
塩水で２回洗浄し、実施例１におけけるようにし
て赤血球を溶解したのち、実施例１におけるよう
にしてオルソスペクトラムによつて分析した。
その結果は、従来の方法で標識付けしたアビジン
と比較して向上した標識付けを示した。これは螢
光性の重合体が容易に検出可能であり且つアビジ
ンに共有結合し、一方、それが次いで細胞表面上
のビオチニル化したOKT3に対して効果的に結合
することを実証するものである。
0.1Mホウ酸ナトリウムの最終容量中で、2.6×
10-8モルのビオチニルＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド（DMF中2.6μ）と、室温で２時間反応さ
せた。この処理は、50％の標識付けを推定して抗
体当り10の計算ビオチン基を導入した。一方、
680μｇの精製したアビジンを200μの0.123Mホ
ウ酸ナトリウム中の実施例１におけるようにして
調製した2.5mgの乾燥した、フルオレセイン−重
合体に加え室温で１時間反応させた。10μのビ
オチニル化OKT3を50μの軟膜（５×105の白血
球）と混合して、室温で30分間培養した。1.5ml
ずつのリン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄して、非結
合OKT3−ビオチンを除いたのち、20μのアビ
ジン−重合体を加え（比較のためにフルオレセイ
ン−アビジンをも用いた）、その混合物を室温で
30分間培養した。試料を1.5mlのリン酸塩緩衝食
塩水で２回洗浄し、実施例１におけけるようにし
て赤血球を溶解したのち、実施例１におけるよう
にしてオルソスペクトラムによつて分析した。
その結果は、従来の方法で標識付けしたアビジン
と比較して向上した標識付けを示した。これは螢
光性の重合体が容易に検出可能であり且つアビジ
ンに共有結合し、一方、それが次いで細胞表面上
のビオチニル化したOKT3に対して効果的に結合
することを実証するものである。
この技術分野の精通者には容易に認識すること
ができる適切な条件下に、フルオレセインの代り
に他の標識物質を使用することができるというこ
とは、明白なことであろう。
ができる適切な条件下に、フルオレセインの代り
に他の標識物質を使用することができるというこ
とは、明白なことであろう。
第１図は微小球体以外の標識物質保持水溶性重
合体が結合させてある免疫グロブリンを示してい
る好適実施形態の様式化した図である。第２図は
標識物質として微小球体を使用する本発明のもう
一つの実施形態を示している。第３図はビオチン
−アビジンの使用によつて微小球体標識物質を有
する水溶性重合体に対して結合した免疫グロブリ
ンの様式化した図である。第４図は細胞表面抗原
の検出のための本発明の実施形態の様式化した図
である。第５図は本発明の実施形態を使用する多
価抗原のための固相抗原検出系の様式化した図で
ある。第６図は標識物質を有し且つ当該抗原に結
合させた水溶性重合体を使用する固相抗原検出系
の別の様式化した図である。
合体が結合させてある免疫グロブリンを示してい
る好適実施形態の様式化した図である。第２図は
標識物質として微小球体を使用する本発明のもう
一つの実施形態を示している。第３図はビオチン
−アビジンの使用によつて微小球体標識物質を有
する水溶性重合体に対して結合した免疫グロブリ
ンの様式化した図である。第４図は細胞表面抗原
の検出のための本発明の実施形態の様式化した図
である。第５図は本発明の実施形態を使用する多
価抗原のための固相抗原検出系の様式化した図で
ある。第６図は標識物質を有し且つ当該抗原に結
合させた水溶性重合体を使用する固相抗原検出系
の別の様式化した図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ａ 検出すべき物質に対して特異的な免疫学
的同族体； ｂ ゼロよりも大きくない正味の電荷を有してい
る水溶性で実質的に非架橋で且つ非第１級アミ
ン含有重合体；及び ｃ それぞれの水溶性重合体に実質的に１個の同
族体を結合する結合剤、 から成り、互いに結合している免疫学的物質の検
出試薬。 ２ ａ 検出すべき物質に対して特異的な免疫学
的同族体； ｂ 結合してゼロよりも大きくない正味の電荷を
有している、水溶性重合体−標識物質複合体で
あり、該重合体は非第１級アミン含有且つ非架
橋重合体である、及び ｃ それぞれの水溶性重合体に実質的に１個の同
族体を結合する結合剤、 から成り、互いに結合している免疫学的物質検出
試薬。 ３ ａ 検出すべき物質に対して特異的な免疫学
的同族体；及び ｂ 結合した標識物質及びそれぞれの重合体に実
質的に１個の同族体を結合する結合剤を有する
水溶性重合体、ここで重合体−標識物質−結合
剤の全複合体はゼロよりも大きくない正味の電
荷を有していて、該重合体は非第１級アミン含
有且つ非架橋重合体である、 から成り、互いに結合している免疫学的物質の検
出試薬。 ４ 結合剤が同族体上の活性基、活性カツプリン
グ試薬、重合体上の活性基、重合体上の活性化し
うる基、共有結合及びビオチン−アビジン複合体
より成る群から選ばれる、特許請求の範囲第１項
記載の免疫学的物質の検出試薬。 ５ 結合剤が同族体上の活性基、活性カツプリン
グ試薬、重合体上の活性基、重合体上の活性化し
うる基、共有結合及びビオチン−アビジン複合体
より成る群から選ばれる、特許請求の範囲第２項
記載の免疫学的物質の検出試薬。 ６ 試薬が重合体に結合した標識物質をさらに包
合する、特許請求の範囲第１項記載の免疫学的物
質の検出試薬。 ７ 標識物質が非蛍光性染料、蛍光染料、放射性
同位元素、電子不透明物質、酵素、第一の同族体
とは異なる特異性を有する第二の免疫学的同族体
及び微小球体より成る群から選ばれる、特許請求
の範囲第２項記載の免疫学的物質の検出試薬。 ８ 標識物質が非蛍光性染料、蛍光染料、放射性
同位元素、電子不透明物質、酵素、第一の同族体
とは異なる特異性を有する第二の免疫学的同族体
及び微小球体より成る群から選ばれる、特許請求
の範囲第３項記載の免疫学的物質の検出試薬。 ９ 標識物質が非蛍光性染料、蛍光染料、放射性
同位元素、電子不透明物質、酵素、第一の同族体
とは異なる特異性を有する第二の免疫学的同族体
及び微小球体より成る群から選ばれる、特許請求
の範囲第６項記載の免疫学的物質の検出試薬。 １０ 水溶性重合体がポリアクリル酸、ポリメタ
クリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアル
コール、ポリアリルアルコール、上記の重合体の
組合わせ、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロ
キシプロピルセルロース、天然水溶性重合体及び
合成水溶性重合体より成る群から選ばれる、特許
請求の範囲第１項記載の免疫学的物質の検出試
薬。 １１ 水溶性重合体がポリアクリル酸、ポリメタ
クリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアル
コール、ポリアリルアルコール、上記の重合体の
組合わせ、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロ
キシプロピルセルロース、天然水溶性重合体及び
合成水溶性重合体より成る群から選ばれる、特許
請求の範囲第２項記載の免疫学的物質の検出試
薬。 １２ 水溶性重合体がポリアクリル酸、ポリメタ
クリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアル
コール、ポリアリルアルコール、上記の重合体の
組合わせ、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロ
キシプロピメセルロース、天然水溶性重合体及び
合成水溶性重合体より成る群から選ばれる、特許
請求の範囲第３項記載の免疫学的物質の検出試
薬。 １３ 結合剤がビチオン−アビジンの複合体であ
り且つ標識物質が蛍光染料である、特許請求の範
囲第２項記載の免疫学的の検出試薬。 １４ 結合手段がビチオン−アビジンの複合体で
あり且つ標識物質が蛍光染料である、特許請求の
範囲第３項記載の免疫学的物質の検出試薬。 １５ 結合手段がビチオン−アビジンの複合体で
あり且つ標識物質が蛍光染料である、特許請求の
範囲第６項記載の免疫学的物質の検出試薬。 １６ ａ 免疫学的物質は組織と結合した部位に
存在する抗原であり； ｂ 免疫学的同族体は抗原に対して特異的な抗体
であり；且つ ｃ 標識物質は、化学療法物質、放射線療法物
質、ビタミン、腫瘍抑制剤、及び抗原部位に送
付することが望まれる組織に作用する材料より
成る群から選ばれる治療物質で置換されてい
る、 特許請求の範囲第６項記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/313,019 US4434150A (en) | 1981-10-19 | 1981-10-19 | Immunological reagents employing polymeric backbone possessing reactive functional groups |
| US313019 | 1981-10-19 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2217249A Division JPH03236331A (ja) | 1981-10-19 | 1990-08-20 | 組織に対して特異的な治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5879162A JPS5879162A (ja) | 1983-05-12 |
| JPH0324627B2 true JPH0324627B2 (ja) | 1991-04-03 |
Family
ID=23214037
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57181514A Granted JPS5879162A (ja) | 1981-10-19 | 1982-10-18 | 重合体骨格を用いる免疫学的試薬 |
| JP2217249A Pending JPH03236331A (ja) | 1981-10-19 | 1990-08-20 | 組織に対して特異的な治療剤 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2217249A Pending JPH03236331A (ja) | 1981-10-19 | 1990-08-20 | 組織に対して特異的な治療剤 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4434150A (ja) |
| EP (1) | EP0077671B1 (ja) |
| JP (2) | JPS5879162A (ja) |
| CA (1) | CA1200760A (ja) |
| DE (1) | DE3271843D1 (ja) |
Families Citing this family (90)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4973493A (en) * | 1982-09-29 | 1990-11-27 | Bio-Metric Systems, Inc. | Method of improving the biocompatibility of solid surfaces |
| US5258041A (en) * | 1982-09-29 | 1993-11-02 | Bio-Metric Systems, Inc. | Method of biomolecule attachment to hydrophobic surfaces |
| US5512329A (en) * | 1982-09-29 | 1996-04-30 | Bsi Corporation | Substrate surface preparation |
| US4722906A (en) * | 1982-09-29 | 1988-02-02 | Bio-Metric Systems, Inc. | Binding reagents and methods |
| US4663277A (en) * | 1983-05-20 | 1987-05-05 | Profile Diagnostic Sciences Inc. | Virus detection method and materials |
| US4687732A (en) * | 1983-06-10 | 1987-08-18 | Yale University | Visualization polymers and their application to diagnostic medicine |
| US4582810A (en) * | 1983-09-30 | 1986-04-15 | Becton, Dickinson And Company | Immuno-agglutination particle suspensions |
| EP0155224A3 (en) * | 1984-03-15 | 1987-05-06 | CHROMAGENICS, Inc. | Solid-borne complex bearing chromagen responsive functionality for antibody, antigen, receptor, or ligand detection |
| US4797363A (en) * | 1984-03-19 | 1989-01-10 | Board Of Trustees, University Of Illinois | Bacteriophages as recognition and identification agents |
| EP0164889A3 (en) * | 1984-05-07 | 1986-12-17 | HSC Research Development Corporation | Surface-treated polymeric substrates |
| GB8423228D0 (en) * | 1984-09-14 | 1984-10-17 | Unilever Plc | Specific binding materials |
| FI850481A0 (fi) * | 1985-02-06 | 1985-02-06 | Labsystems Oy | Foerfarande foer bestaemning av motmedel eller antigener. |
| US4735907A (en) * | 1985-03-18 | 1988-04-05 | Eastman Kodak Company | Stabilized fluorescent rare earth labels and labeled physiologically reactive species |
| US4824659A (en) * | 1985-06-07 | 1989-04-25 | Immunomedics, Inc. | Antibody conjugates |
| US4863875A (en) * | 1985-08-26 | 1989-09-05 | Gia Research Company, L.P. | Dye labelled antibodies as reagents for use in immunoassay systems |
| US4806311A (en) * | 1985-08-28 | 1989-02-21 | Miles Inc. | Multizone analytical element having labeled reagent concentration zone |
| DK112986D0 (da) * | 1986-03-11 | 1986-03-11 | Svenska Sockerfabriks Ab | Fremgangsmaade til detektion af komponenter i en proeve |
| US5263992A (en) * | 1986-10-17 | 1993-11-23 | Bio-Metric Systems, Inc. | Biocompatible device with covalently bonded biocompatible agent |
| SE454781B (sv) * | 1986-10-17 | 1988-05-30 | Wallac Oy | Hybridiseringsforfarande for detektion av polynukleotidsekvens |
| JPS63131064A (ja) * | 1986-11-13 | 1988-06-03 | プロフイル ダイアグノステイツク サイエンシス インコ−ポレイテツド | 蛋白質およびウイルスの検出法 |
| US5206178A (en) * | 1986-11-19 | 1993-04-27 | Genetic Systems Corporation | Membrane affinity concentration immunoassay |
| US4975532A (en) * | 1986-11-28 | 1990-12-04 | Sclavo, Inc. | Method to derivatize dextran |
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