JPS5879162A - 重合体骨格を用いる免疫学的試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的検定の分野に関するものであり、且つ
更に詳細には、検出すべき免疫学的物質に対して特異的
々免疫学的同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）更に標許：物質に
結合させること（ａｔｔａｃｈｍθｎｔ）が可能である
水浴性重合体骨格に結合させることに（ｃｏｕｐｌｉｎ
ｇ）　　よって生１ｉｘせしめる免疫学的検定試薬に関
するものである。

体液中の異物の検出は、病的状態の正しい診断とそ扛に
対する適切な治療の選択に対して必須であることが多い
つ一般に抗原と呼ばＣる異物は、その抗原と特異的に反
応する相当する抗体の生成　９− を刺激する能力を伴なっていることがある。抗体自体は
、抗原の存在に応じて、その特定の抗原との反応によっ
て生成する蛋白質である。抗体は免疫グロブリンと呼ば
する特別なグループの血清蛋白質から成っている。その
抗体のグループは抗原と特異的に反応することができる
限らｎた蛋白質のグループから成っているけｒｌ、ども
、抗原として作用することができる。蛋白ａ〜多くの多
糖類、核蛋白１ｊ勿、リポ蛋白質１多くの合ＩＪＶ’、
ポリペプチド並びに、蛋白質または合成ポリペプチドに
対して適当に結合している（ｌｉｎｋθｄ）場合に、ハ
ブテンと呼ばｎる、その他の多くの小さに分子を包含す
る１多種多様の亮分子が存在する。

抗体−抗原反応の荷具性は、病的状態または正常状態の
診断において１且つさらに１−シ＜は抗原性決定子の検
出において、利用さしているう本明細曹において用いる
場合にＣ′凭疫学的物質”とい−１０− う飴は、抗体捷たは抗原のどちらかとして定義するのに
対して゛免疫学的同族体″（１ｍｍｕｎｏｌｏ−ｇｉｃ
ａｌ　ｈｏｍｏｌｏｇ）という語は、免疫学的物質と特
異的に反応することができるその免疫学的物′Ｊ任の補
体と定義するものとする。そし故、議論する免疫学的物
質が抗体である場合には、免疫学的同族体は、そｎに対
してその抗体が特異的な抗原である。同様にその逆の場
合もある。

この技術分野に精通するものの知識によＥば〜抗原−抗
体反応は、酵素免疫学的検定（ｅｎｚｙｍｅ、ｔｍｍｕ
ｎｏａｓθａｙ）、放射線標誠免疫検定または畠感度を
有する免疫螢光法によって明らかにすることができる。

しかしながら、とｎらの方法は、使用する標識物質の所
在を見出し且つ定電するように設計した、一般に複雑な
装置の感度に制限さ【る。

抗原−抗体反応を検出するだめの公知の部類の従来の方
法は、トレーサー（ｔａｇ）すなわちｇ４　Ｎｉ＆物質
による抗体の標識付り（ｌａｋθ１．ｉｎｇ）　を包含
する。しかしながら、この方法（は、いくつかの欠点を
有している。抗体蛋白質はきわめて過敏な蛋白質であっ
て、その反応性、すなわち、低濃度で存在しているその
免疫学的同族体とすら選択的に反応するという能力、は
蛋白質への標識物質の化学的な付加、すなわち、変性に
よって容易に失なわｎる。そのほかの間融は、たとえば
赤色励起螢光染料のように螢光性は低いが望ましい染料
分子を、検出可能な範囲とするに充分女濃度で結合する
（ａｔｔａｃｈ）ことが不可能であるということである
。一方において・あまシ多量に過ぎる染料分子を結合さ
せると、たとえば抗体の変質が生じないとしても、抗体
−染料様合体の疎水性の本質のために、非特異的な着色
が生じるものと思わしる。その上、多くの染料に存在す
る聞イオン電荷の存在によって生じる特異性の喪失が、
このよう々糸を（７！ましくないものとしてしまうつ標
にλ物質の免疫学的）・４応の部位における濃度（そ扛
故検出の感度）は、第一の免疫グロブリンに対して向け
た第二の免疫グロブリンが、通常の方式で結合したいく
つかの染料分子を有しているという、間接的な着色方法
を用いることによって、３１（４大させることができる
。第二の免疫グロブリンは一般に異種特異性である、す
なわち、そγＬは複数の場所に結合するから、第一の免
疫グロブリンへの第二の免疫グロブリンの結合が可能で
ある。

その結果、検出すべき抗原に対して特異的な２ｔ４−の
免疫グロブリン上への著るしく」１Ｎ大した数の染料分
子の結合は、抗Ｊつ検出感度を増大させる。炒念なこと
に、このような方法は２反応段階を含み、そｎが自動化
した装置におけるこの方法の使用を不適当なものとする
。その上、第二の抗体系は検−１３− 高感度を増大させけするけ扛ども１こｎは先に述べた直
接に標識付けした抗体系において存在するものと同一の
制限を受ける。

本発明の目的は、上記の方法によって生じる非特異的な
結合に基づく反応性と感度の損失を、最低［艮とするこ
とにある、 別の部類の公知の従来の方法（弓１、物理的な吸着によ
って結合するビオチン−アビジン複合体を使用している
、ビオチンーアビジンは共有結合によるものではないけ
ｆども、そ扛にもかかわらずきわめて高い結合定数を示
す。ビオチンは、抗体と比較して小さな分子であり、そ
のために抗体はその表面に多数のビチオン分子を保持す
ることができる。ビオ千ニル化した抗体へのいくつかの
標識付けしたアビジンの付加は特異的な吸着をもたらし
１そ扛によって標識付けした抗体を与える。アビジンも
また抗体の大きさの半分に満たない小さ−１４− な分子であるから、アビノンに結合することができる染
料の量は制限さｎる１本発明の一目的は、この制限を除
き且つなお抗体を他の物質に結合させるためのビオチン
ーアビヅン方法の使用によって与えら扛る利点を享受す
ることにある。

免疫学的反応検出系の感度を増大させるための他の試み
は、染料の代りに放射性同位元素を使用している。放射
性同位元素は物理的に小さな標識であり、そｎによって
立体障害と感度の低下が最少限となって、もつとも高感
度の検出が可能となる。しかしながら、放射性同位元素
の使用には、ガンマ線を放Ω・ｊする同位元素、たとえ
ば１２５工の比較的短かい寿命、同位元素のガンマ線に
よる免疫学的反応性の低下、連邦規格に準拠する方法の
使用を必要とし且つまた高価で複雑な検出装置に加えて
精密な安全制御をも必要とする危険な放射性同位元素の
使用にかかわる衛生上の危険を包含する、多くの欠点が
ある。更にｔ放射線標識免疫検定は可溶性抗原に対して
適しているけ扛ども、こＩしは実際に平均化方法である
から細胞ごとの基準には容易には適用できない、放射性
標識免疫検定を自動化した流動細胞分析装置（ｆｌｏｗ
ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ）のために単一の細胞に鋭敏とするためには、進歩し
たラソオダラフ技術を必要とする。このような技術は、
緩速であり且つ手順はきわめて複雑であるものと予想さ
扛る、その結果として、放射性同位元素は一般に個々の
細胞分析には不適である。本発明の目的は一オートラソ
オグラフ技術と放射性免疫検定の感度を増大させる試薬
を提供すること及び放射性標識が抗体に極めて近接して
いるために直接的な標識付けによって通常生じる放射性
損傷の可能性を減少させることにある。

染料標識物質の代りとして使用する酵素は１基質の大き
な交代により感度の向上を提供する。このような方式は
、一般的な染料標識物質の使用のほかに余分の段階を必
要とするけ扛ども、螢光染料の使用において表わしるよ
うな光漂白問題が存在しない。その上１酵累の適当な選
択は、自動化した装置により容易に識別し且つ定量する
ことができる着色化合物または酸の生産を可能とする。

欠点としては、たとえば酵素が本質的に大きく且つ粘着
性であって、そのために抗体の変質をもたらすこと１及
び非特異的な結合に対する固有の酵素の性質または同族
体結合からの立体障害による特異性の喪失がある。その
上、＃素は保存寿命の問題を提供し、そｎによって臨床
環境における実用に対する有効性が低下する。細胞上の
特異的な構造の部位を決定しまたは測定するためには、
基質は細胞上に直接に、検出に好都合な形態、たとえば
、螢光化合物として、沈殿しなけｒばならな−１７− い、酵素系において一般に遭遇する問題は、固定し月つ
限らｆた酵素反応速度による感度の制限である。単に酵
素が基質に対して作用し続ける時間を長くすることによ
って為そｎに対する補償とすることが可能である。いう
までもなく、こγ１け臨床的な応用におけるかかる方法
の効率を低下させ且つ系の処理（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕ
ｔ）能力が最高にＭ要である自動化した方法におけるそ
の有用性を低下させる。本発明の目的は、向上した感度
を有する免疫反応を検出するための、酵素と適合する試
薬を提供することにある。

電子不透明着色剤は電子顕微性において有用な応用が認
めらｎているけｎども、このような系は、きわめて複雑
であり且つ時間のかかる操作を必要とし、そのためにそ
の臨床的な価値が著るしく低下する。この欠点は、ある
程度までは、分が１能の向上によって補償さ几る。電子
不透明着色剤は、−１８＝ フェライト化合物、すなわち、鉄またはコロイド性金を
含有する蛋白質を包含するが１しがし１こわらの化合物
は抗体よりも大きく、そ扛故、抗体の反応性に悪影響か
を）るものと考えら扛る。本発明の目的は、抗体に対す
るこのような影響を低下させると共に、電子的に密度が
高く且つ電子走査に不透明な試薬を提供することにあろ
う上記の問題の多くを克服するためのｉＩＬ米の試みは
、重合体粒子、すなわち、フルオレセインまたはその他
の標識物質を含有する微小球体の使用を包含する。一般
にこてＬらの重合体粒子は５０〜２０００マノメーター
の範囲の大きさであり、その結果、抗体によって卸１胞
に結合させることができる数は立体的に限定さ扛る。一
般に１粒子は多数の抗体でＯわ扛る。しかしながら、試
薬の大きさが物理的に犬であるために、免疫反応をもた
らすために適当な配置で、細胞上の抗原部位に抗体が接
近する機会が、著るしく低くなる。従来は、重合体粒子
は１乳化重合によってスチレンとビニルモノマーから１
１Ａ造さｎてきた。しかしながら、生成する疎水性の粒
子は、非特異的な結合並びにコロイド的不安定性を表わ
す欠点がある。後者の不安定性は、粉子表面への抗体の
結合によって一層大きくなる。微小球体の表面への抗体
の結合による」Ａ４体に対する表面変性効果もまた、欠
点の一つである。

重合体粒子中に親水性の七ツマ−をｄｋ人することによ
って、粒子の疎水的な本質を克服しようとする試みが行
なわｉしている。しかし々から、このような試みは乳化
重合方法に限定さ扛る。粒子の組成の変化は非特異的な
結合とコロイド不安定性の問題を改善することができる
け７１．ども、とｔらの望１しくない特性は、重合体粒
子を合成するためには最低限度の計の疎水性モノマーを
必要とするという理由で、完全に排除することはできな
い。

このような重合体粒子検出系の一つは、モントニーらに
対する米国特許第４．２５４．０９６号に記さ扛ている
が、この特許は、水に不溶性という望ましくない特性を
有する親水性重合体粒子に対して共有結合した抗体を用
いる検定方法を記している。

完全に親水性のモノマーの場合においてすら、ドレーヤ
ーに対する米国特許第３．８５３．９８７号に記すよう
に１和、水性粒子とするために架橋剤を必要とする。本
発明の一目的は架橋剤の必要を排除することにある。

バーシュフェルトとイートンは米１ｍ特許第４゜１６９
、１３７号において・重合体骨格を用いて感度を増大さ
せる別の方法を記している。彼らは特に多数の螢光染料
分子が結合させである、第一アミン含有多官能性重合体
骨格、すなわち、ポＩＪ　ＩＪシンから成る抗原検出試
薬を記している。多官能−２１− 性重合体骨格をまたとえばグルタルアルデヒドのような
ソアルデヒドの使用によって、ポリリシン上の第一アミ
ンを通じて、抗体上の第一アミン部に共有結合させた。

このような方法は、抗原の１部位描υの感度の増大をも
たらすけγＬども１記載の方法論によっては、重大な制
限が存在する。特に、重合体は第一アミン含有重合体に
限定さｎるが、そｎは、その陽イオン性の電荷のために
、強い非特異的な結合を表わし、そ扛によってその特異
性が著るしく低下する。実際に、バーシュフェルトが記
しているタイプの重合体は、抗体が存在しなくても細胞
に結合することが認めら７ｔている。

ソアルデヒドカップリング剤の必要もまた別の欠点であ
る。こｎらの制限は、重合体骨格への種々の螢光染料の
好都合力結合を著るしく限定することになる。更に、ソ
アルデヒドの使用は、非第−アミン含有重合体骨格の抗
体への結合を許さない。

−２２− 生物学的応用に対して興味あるｐＨ範囲内で使用する場
合に、上記の系は陽イオン的に荷−１する傾向があり、
そのために静電的な相互作用によって、陰イオン的に荷
電した＾ｌｉｔ胞及び組織表面に非特異的に結合する。

生成するジアルデヒド、共有結合及び可逆的ジアルデヒ
ド反応の不安定性のために１バー７ユフエルドの試薬は
抗原部位と競争的に反応することができる著るしく解離
した重合体と抗体を含有するものと予測さｎる。

本発明の目的は、多くの検出器を有し、且つ疎水性及び
１場イオン電荷特性による非特異的な結合を回避すると
共にジアルデヒド結合剤の必要を回避すべき水浴性重合
体を使用する免疫学的物質検出分析方法を提供すること
にある。

本発明の他の目的は、向上した感度を有する免疫学的物
質を検出することができる試薬を提供することにある。

最低の疎水性を有する適当に荷電した重合体を提供する
ことによって、不都合な非特異的な結合をもたらす疎水
性重合体及び粒子並びに陽イオン的に荷電した複合体に
伴なう問題を、回避することにある。正味の陽電荷を有
していｋい、多数の標識物質を保有することができる水
ｍ性重合体を提供することもまた本発明の一目的である
。

更に他の目的は、簡単な保存と自動化装置中での効果的
な使用が可能な試薬を提供することにある。不発面の更
に他の目的は、自動化した細胞学装置において現在用い
らｆている技術を用いて検出することができる濃度と量
において、望ましいが、しかし螢光性の弱い、赤励起螢
光染料を使用することができる試薬を提供することにあ
る。

本発明の更に他の目的は、単一の試薬内で両成分のそｎ
ぞｎの利点を利用するために水浴性の重合体とアビソン
ービオチンを組み合わせて使用することにある。

本発明の原理は、概括的にいえば、検出すべき物質に対
して特異的な免疫学的同族体を、種々の中間的機構を通
じて、検出可能な標識機構として慟らくかまたはそｎを
保有する水浴性重合体に結合させることから成るｔ免疫
学的反応の検出に役立つ直接的及び間接的標識技術を用
いるものである。本明細書において使用する場合の水浴
性重合体という用語は通常の有機化学的な感覚において
用いら扛るものと同じ意味を包含し、水に不溶性（疎水
性）の重合体である共有架橋結合を必要とする微小球体
すなわち粒子として一般に公知であるものを包含しない
。その結果、本発明においては共有架橋結合剤を心安と
しない。一般に、本発明は枝分ｎした重合体に対する約
Ｉ　Ｘ　１０７　　ドルトンに至るまで及び約ｌＸ１０
９　ドルトンに至るまでの分子量を有する単一の鎖状重
合体を包含す　２５− る。枝分扛した重合体は、“骨格”連鎖の長さに沿うど
こかに共有結合的に結合した、同一または異神モノマー
から成る、複数の付加的な重合体連鎖を有する重合体“
骨格”連鎖を含有する水浴性重合体を包含する。枝分扛
した重合体に対する有用な類推物は）欠けている剛毛を
有していても有していなくてもよい針金の剛毛ブラシで
あるといえようつ 前記の目的に従って〜本発明の原理は、水溶性重合体を
使用する免疫学的物質検出試薬のいくつかの実施形態を
包含する。全実施形態が電荷特異性を備えているが、重
合体の電荷、重合体−標識物質複合体を形成するように
結合した標識物質を有する重合体の電荷、または抗体に
結合するための手段を有する重合体−標識物質複合体の
電荷の何ｔが特性的であるかが、異なっている。全実施
形態が重合体を同族体に結合させるための手段を−２６
− 包含する。

追加的な実施形態は、免疫学的同族体上の活性基１活性
カツノ′リング試薬、重合体上の活性基、君【合体上の
活性化可能な基、及びアビノンが重合体に結合し且つビ
オチンが免疫学的同族体に結合しているビオチン−アビ
ノン複合体から成るグループから選択する。追加的な実
施形態は更に重合体に結合した標識物質を包含していて
もよい、更に他の実施形態は非螢光性染料１螢光染料、
放射性同位元素、電子不透明物置、酵素、第一の免疫学
的同族体とは異なる特異性の第二の免疫学的同族体及び
微小球体から成るグループから選択する標識物質を備え
ている。好適実施形態は、ポリアクリル酬、ポリメタク
リル酸、ポリアクリルアミド　ｓ５　ｌ）ビニルアルコ
ール　ｓ５　リアリルアルコール、上記の重合体の組合
わせ、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシグロビ
ルセルロース、天然水浴性重合体及び合成水浴性重合体
から選択する水溶性重合体を備えている、 不発ｔｊｌｉのその他の目的及び理解は、図面を参照す
ることによって明白となる。

前記の目的に従って、第１図に示すような好適な免疫学
的物知検出試薬は、検出すべき免疫学的物質、ここでは
抗原、３０に対して特異的な免疫学的同族体、ここでは
免疫グロブリン１、を（ｉｆｔｉえている。この分野に
精通するものには明らかなように、各図中の様式化した
成分描写は相対的な割合ならびに明瞭とするための外観
に関して著るしく異なっている。更に注意すべきことは
〜一つの図に関する論睦げ、異なる標識物質が存在して
いるか捷たは異なる検定系で使用するということを除け
ば、他の図に対しても同様に適用することがでさるとい
うことである。免疫グロブリン１は、多数の標識物質３
が結合している水浴性の重合体２に結合している。（泉
詠物買３は螢光物質３は螢光染料であることが好ましい
け才１．ども、その代りとしてたとえは非イ１、・光性
染料１放躬性同位元素、電子不透１シ１物貝、酵素、ま
たは第一の同族体とは異なる特異性の第二の同族体のよ
うな他の標識物質を１吏用してもよい。あるいｉｌ″ｉ
また、第２図に示すように螢光体含有微小球体４を用い
ることもできる。第２図においては検出すべき抗原３０
が基質５１の鉄面に固定しである、同相免疫学的検定に
おける試檗の使用をも示している。

第１及び第２図を参照すると、水溶性重合体２は、細胞
に対する非特異的な結合を回１産するように選び、ぞ７
”Ｌによって最大の感度と免疫学的応答を可能とするこ
とが好都合でおる。そｎ故、陽イオン的に荷電しており
、そのために非特異的に結合するおそ扛のある重合体は
避けることが好ましい。避けることが好ましい、このよ
うな陽イオン−２９− 的に荷電した重合体の例は、第一アミン含有重合体であ
る。

好適な水溶性重合体は限イオン性（負）またはゼロの電
荷を有し且つポリアクリル酸１ポリメタクリルｒ讃、ポ
リアクリルアミド　、Ｈ９リビニルアルコール、ポリア
リルアルコール、こｒ−らの重合体の１５７々の可能な
組合わせ、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシグ
ロビルセルロース、天然水浴性重合体並びに合成水溶性
重合体から成るグループから選択することが理想的であ
る。しかしながら１（票ｈｊ“＆物質５．４の多くは、
特に染料タイ１の標識物質においては、陽イオン的に荷
電している傾向がル）ることが注目さ１．るゎこｎけ望
ましくン）い非特異的な結合を増大させる傾向があるか
ら、水溶性重合体をその陰イオン性を増大させるように
Ｆｉ・１節して１ぞｎによって望゛ましい感度に対して
悪影咎のある非特異的＠着色”性の増大を補ｆ？ｔす−
３０＝ ることか好都合である。

典型的には１．　ＯＯＯ〜１００．０００．０００ドル
トンの範囲の分子量を治する水浴性重合体は、望ましい
特異性を有する抗体に対して多くの染料型の物質を結合
させる能力を備えている。抗体の反応性に対する悪影響
を避けるためには結合が抗体から充分な距離にあるとい
うことがきわめて重要である。こｎ、らの要件は、たと
えばフルオレセイン寸たけアクリジンオレンジのような
他の染料ト比較して特徴的に小さな螢光を表わすことが
多い長波長すなわち赤色光励起螢光染料にかかわる場合
に、特に重要である。そｔ故、多くの染料分子６を治す
る水溶性重合体２を用いることによって、より高濃度の
螢光が提供さ扛・そ１．にょって・現在使用可能な自動
化装置によって免疫学的反応の存在をより容易に記録す
ることが可能となるために、感度の増大を達成すること
ができるっ水浴性重合体は酵素標識系において用いる場
合に一層の利益を表わす。酵素は、免疫グロブリンと同
様に、立体障害に対して敏感な活性部位を有する大きな
蛋白質である。免疫グロブリンと酵素との間の直接的な
結合は、免疫学的物質の添加に続く免疫学的物質とその
同族体の間の免疫学的反応の検出を許すけ扛ども、立体
障害のために不都合な低い感度を有している。免疫グロ
ブリンを単−一または複数の酔−素分子に結合させるた
めの水浴性重合体の有利な使用は、裔」１白質が他のも
のの存在による立体障害を受けない望ましい方式で作用
することを可能とする。その結果として、免疫学的検定
試薬は免疫学的物質の検出において増大した感度を表わ
す。

本発明け、抗原を伴なう特定の組織または腫傷細胞に対
しての単分枝系抗体と結び付いて、　−７曲の有用性を
示す。１合体は、治療物質すなわち治療剤の免疫グロブ
リン自体への直接的な結合のみによって可能であるより
も増大した治療剤の負荷を保持することができ且つその
上治療剤の結合による免疫グロブリンの変質の機会が低
下する。その結果として１薬品、ビタミン、薬剤、放射
光学的処理分子またはその他の特定部位すなわち性的部
位への送達が望ましい物質を保持する水浴性重合体に結
合した単分枝系抗体を局限させてそγしが特異的に腫傷
細胞を攻撃することを可能とし且つ増大した濃度の治療
材料を都合良く直接に標的部位に交付することができる
。

本発明においては生適合性重合体を使用することが好ま
しいう生適合性とは、不良の毒性効果を生じることがな
く、且つ細胞への非特異的結合才たは凝集タイプの集合
体を与える格子状構造の生成をボ■けることができるよ
うに重合体を選択することを意味する。そｎ故、好適実
施形態において−３３− は１ポリアクリル酵及びポリアクリルアミドを使用する
が、両型合体は共にフリーラソカルカ法によって重合さ
せた水浴性モノマーから成るけｒ、ども）アニオン／カ
チオン重合及び縮合方法を使用することもできる。更に
、官能基を有する七ツマ−を用いて重合体を生成させ、
そ扛によって後にその官能基をたとえば染料のような綜
識物貿または免疫学的物質と反応さぜるために用いるこ
とができるようにすることが有利であることが認めら扛
ている。このような官能基を有するモノマーの例は塩イ
ｌ、アクリロイルを包含する。生成するポリ塩化アクリ
ロイル（σ１１第一アミンと反応してアミド結合を形成
することができる活性塩素原子を有している。しかしな
がら、官能基はこｎだけに限定さ扛ることはなく、その
代りにヒドロキシル、チオシアナート１可ンチオシアナ
ート、塩化スルホニル、スクシンイミド及びジクロロト
リアヅニ−３４＝ ルなどを包含するその他の基を用いることができるとい
うことに注意すべきである、 公知の有機化学的手法に従って、重合体上の官能基と染
料の反応を刺激するために１染料を加温すること及び／
またはそｎを触媒の存在で使用することが必要な場合が
ある１重合体に付加する染料の量は１副度比を制御する
ことによって、または染料に対するものと抗体に対する
ものとで異なる官能基を使用することによって、具合良
く調節することができる。このこと１１いう捷でもなく
、一般に染料は重合体と反応すべきただ一つの官能基反
応部位を有しているのみであるという事実によって可能
となる。

公知の技術に従えば、重合体に標識物質をつけるのに有
利に使用することができる他の方法はａ）標識物質上の
活性化さ扛た基を使用すること、ｂ）外部活性化試薬を
使用することと、ｃ）第一部分と第二部分とを有するこ
扛らの標識物質において、結合した第一部分を有する単
量体を１合して１に合体を形成し１次いで該第一部分に
結合させるための第二部分を付加する、ａ）標識物質を
該単量体と共重合させることを含む。

第５図は）この場合に微小球４を支持するｉｆ＜合体２
に対する免疫グロブリンの結合を行うためにアビジン６
−ビオチン５複合体（ａｖｉｄｉｎ　　６−ｂｉＯｔｉ
ｎ　　５　　ＱＯｍｐｌｅＸ）の使用を示す、小合体は
染料及び先に述べた標識物質群から選ば扛た他の一員の
如き種々のＲ識タイプ物貿（ｍａｒｋｅｒｔｙｐｅ　　
５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ）（７）担体であることができる
。ビオチンーアビソ／はその格段に強い結合特性その化
学的安定性及び感度増幅の故に有利に使用することがで
きる。ビオチン５け良く知ら汎た方法によって免疫グロ
グリ／に容易に結合さγ１２、そしてその小さな寸法の
故に、免疫グロブリンの反応性に対して殆んど影智を及
はさないか又は全だ゛影響を及はさなく、そして更にい
くつかのものけ抗体に結合さｎて増加した感受性を生じ
る。ビオチンと対照的に、アビノン分子は相当大きく、
■−１つ過去においてフルオレセイン及び他の染料タイ
グ物賀を直接支持するように使用さγＬだ。しかしなが
ら、本発明Ｖｉ唯重重合体抗体にカップルさせるために
のみアビジンを有利に使用する。、重合体ははるかに多
くのフルオレセイン又はアビソン以久の他の染料タイグ
物質を支持することができるので、結果は免疫学的同族
体と関連した染料の濃度はより犬となり、とｎ７はより
大きい感受性を与える。、１個のみの重合体分子がアビ
ジン分子轟り、晴合さ扛ることを確実にすることは困難
であるけｆとも〜その代わりに抗体のビオチン化は正確
に制御することができる。

第４図は、ビオチン５が連結させである免疫学−５７− 的相同体または免疫グロブリン１の使用による細胞表面
上の免疫学的物π１″！たは抗原部位２１の定茸と局在
イヒにおける本発明の利用を実証する。ビオチンにｊ：
　７１（解性重合体２に結合したアビヅン乙に物理的に
吸着し、一方、１ｉ１合体は標識物Ｔ■３を保持するこ
とができる。ビオチン−アビεノンを使用する試薬にお
いては、ビオチニル化した抗体を先ず抗原と反応させ１
次いで試薬のアビノン結合部分を付加させることが好適
である。

本発明の適応性は、固相免疫学的検定の様式化した図を
示している第５図において更に実証さｎる。検出すべき
抗原７１に対して感応性である免疫グロブリン１け、表
面５１上に固定してあシ且つ抗原を含有する試料は固定
した免疫グロブリン表面と接触し、ている。次いで、抗
原に対して感応性であり、目つ標識物質３を有する重合
体２に連結した免疫グロブリン１を有する本発明の試薬
を表　５８− 面上で洗う６螢光甘たは他の標識物質の定量は存在する
抗原の量及びその精密な局在化に関しての直接的なＭｌ
ｎを可能とする。拡大した図においてに１標識物質は、
基質４１との反応性を有し且つそわ、を個々に検出する
ことが可能な４２と４３に分解する酵素４０であるっ 第６図はさらに本発明の大きな適応性を実証するもので
１標識物貿３を保持する水ｍ併重合体２の抗原８０への
連結を示しており、そｒによって抗原８０けそ【に対し
て特異的な免疫グロブリン標識物質を保持する別の重合
体に結合させてあってもよい。更に標識付けしてない抗
原８０を存在させてｔこの分野で公知の方法を応用する
抑制方式の検定を用いてもよい。

免疫学的物質及び免疫学的同族体という術語の使用によ
って示さ扛るように、多くの場合に、標識物質を保持す
る重合体を抗原に結合させることによって、細胞または
基質の表面上に同定した、または水浴液中に存在する抗
体の存在を検出することが可能な試薬を生成せしめるこ
とができるということを了解すべきである。

この分野に精通するものにおいては、本発明の精神捷た
は範囲から逸脱することなく、他の多くの成分の変更ま
たは組み合わせが可ｆｊｉ’：であることを了解すべき
である。

実施例　１ 約５０％（］（毎による）のアクリル酸と５０％（重量
に、しる）のアクリルアミドから成り且つ非螢光性のモ
ノマー１００当りに１の螢光性モノマーを含有する共重
合体を、ヅメチルホルムアミド（Ｄ　Ｍ　Ｆ　）中に各
モノマーを溶解し且つ開始剤として２５％（モノマーの
重量１に対して）の４．４′−アゾビス（４−シアン吉
草酸）を添加してｔ素工に６５℃で１６時間重合させる
ことによって、製造した。螢光性のモノマーは零モル量
のフルオレセインアミンと塩化アクリロイルを室温で反
応させることによって製造した。重合後に１重合しなか
った成分を無水ホルムアミド°中のビオケ゛ルＰ−１０
上のケ°ルｒ過によって除去した。１５ｒｎｇの螢光性
重合体を３４■のカルｓｒニルヅイミダゾール（存在す
るカルボキシル基の数の２倍に等しい量）で処理し且つ
そｎを室温で３０分間反応させることによって活性化し
た。、６０■のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（カルボ
キシル基の存在数の５倍）を加オて室温で３０分間反応
させた。かくして荘たスクシンイミドエステル含有正合
体を無水アセトンを用いる沈殿によって濃縮し、アセト
ンで洗浄したのち１アセトン中で保存した。

単分枝系抗体実験のために、１ツの活性化重合−４１一 体を窒素下に乾燥した。１００μｔのリン酸塩緩衝食塩
水中の０．５　ｍｌ、のホウ酸ナトリウム（０，１２５
Ｍ）と２００μｆのｏｘ’ｒ３にュージャージー叶１、
ラリタン１ルート２０２、オルン製薬社から入手するこ
とができる学分子系抗体に向けたＴ−細胞）を水浴性重
合体に加え、その混合物を室温で６０分間培養した。か
くして得たＯＫＴ　Ｍ−重合体を、Ｔ−細胞計数のため
のオルソプロトコール（このプロトコールは参考として
ここに誉げろものであって１ニューツヤ−ジー＄１　、
ラリタン、ルート２０２、オルソ診断システム社から入
手することができる）を用いて検定し、た。この方法は
本質的に以下のような手順を包含する：全血を螢光的に
標識付けした抗体と反応でせる。塩化アンモニウムに基
づく鵜解試薬による赤血球の浴Ｍ後に、リンパ球を、そ
の前方及び９０°光散乱特性によって他の白血球と識別
する。゛オルンスベクー　４２− トラム■（”流動細胞分析計（オルン診断システム社か
ら入手することができる）によって螢光データを集め且
つ上記のような特性光散乱によってリンパ球を同定する
。こ７１は、標識付けしたリンパ球と、１票識付けして
ないリンパ球を識別し且つその割合を計労することを可
能とするヒストグラム表示を提供する。このようにして
検定すると、■合体−ＯＫ　’１１’　３は６４％の０
ＫＴ３陽性リンパ球を示すのに対して通常の０ＫＴ５は
６６％の陽性リンパ球（顕著には相違していない）を示
した。同時に重合体−ＯＫＴ３け、平均必光がより高く
且つ最高の螢光チャンネルにおいてより多くのカウント
が存在するという点でＮ増大した標識付けを示した。

実施例　２ ２００７４ｆのＯＫＴ　５　（１，３Ｘ　１０−’モル
）を、２００μｔの０．１　Ｍホウ酸ナトリウムの最終
容Ｍ中で、２．６Ｘ　１０−’　モルのビオチニルＮ−
ヒドロキシスクシンイミド（ＤＭＦ中２．６μｔ＞と、
室温で２時間反応させた。この処理は、５０−の標識付
けを推定して抗体当り１０の計算ビオチン基を導入した
。一方、６８０μｍの精製したアビダンを２００μｔの
０．１２５　Ｍホウ酸ナトリウム中の実施例１における
ようにして調製した２、５〜の乾灯″した、フルオレセ
イン−重合体に加え室温で１時ＩＬＩＩ反応させた。１
０μｔのビオチニル化ＯＫＴ　３を５０μｔの軟膜（５
Ｘ１０’の白血球）と混合して、室ｌ昌で３０分間培養
した。

１、５　ｍｌずつのリン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄して
５非結合ＯＫＴ　５−ビオチンを除いたのち、２０μｌ
のアビノンー重合体を加え（比較のためにフルオレセイ
ンーアビノンをも用いた）、その混合物を室温で３０分
間培養しブζ、試相を１．５　ｍｅのリン酸塩緩衝食塩
水で２回洗浄し、実施例１におけけるようにして赤血球
を溶解したのち、実施例１におけるようにしてオルソス
ペクトラム■によって分析した。その結果ｄ〜従来の方
法で標識付けしたアビジ／と比較して向上した標識付け
を示した。こＣけ螢光性の重合体が容易に検出可能であ
り月つアビノンに共有結合し、一方、そ【が次いで細胞
表面上のビオチニル化したＯＫＴ　５に対して効果的に
結合することを実証するものである。

この技術分野の精通者には容易に認識することができる
適切な条件下に、フルオレセインの代りに他の標識物質
を使用することができるということは１明白なことであ
ろう、

【図面の簡単な説明】

第１図は微小球体以外の標識物質保持水浴性重合体が結
合させである免疫グロブリンを示している好適実施形態
の様式化した図である・第２図は標識物質として微小球
体を使用する不一　４５− 発明のもう一つの実施形態を示している。 第３図はビオチンーアビノンの使用によって微小球体標
識物質を有する水浴性重合体に対して結合した免疫グロ
ブリンの様式化した図である。 第４図は細胞界面抗原の検出のための本発明の実施形態
の様式化した図である。 １尼５図は本発明の実施形態を使用する多価抗原のため
の同相抗原検出系の様式化した図である。 ＠６図社標識物質を有（−且つ当該抗原に結合させた水
溶性重合体を使用する固相抗原検出系の別の様式化した
図である。 特許出願人　オーフ・ダイアグツステック・システムズ
・インコーボレーテツド ４６− １Ｊ−よ い− 手続補正書（自発） 昭和５７年ｉ２Ｊ］ｌｌ」 特許庁長官　若　杉　オロ　夫　　　殿１、事件の表小 Ｉ〆Ｑ’ａ；ｉ１１昭５７−１８１５１４号２、発明の
名称 布付体骨格を用いる免役学的試薬 ３補ｉ［をする名 事件との関係　　特許出願人 ４代　理　人〒１０７ 住　　所　　　東京都港区赤坂１丁目９番１５号６、補
１１のｚｊ象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）検出すべき物質に対して特異的な免疫学的同族
   体； ｂ）ゼロよりも大きくない正味の電荷を有している水溶
   性重合体：及び Ｃ）水浴性重合体を上記同族体に結合する手段、から成
   る免疫学的物質の検出試薬９ ２、ａ）検出すべき物質に対して特異的な免疫学的同族
   体； ｂ）結合してゼロよりも大きくない正味の電荷を有して
   いる、水溶性重合体−標識物質複合体；及び Ｃ）水浴性重合体を該同族体に結合する手段、から成る
   免疫学的物質検出試薬。 ５、　ａ　）検出すべき物質に対して特異的な免疫学学
   的同族体：及び ｂ）結合した標識物質及び重合体を同族体に結合する手
   段を有する水浴性重合体、ここで重合体−標識物質−結
   合手段の全複合体はゼロよりも大きくない正味の電荷を
   有している、から成る免疫学的物質の検出試薬。 ４、結合手段が同族体上のγ１ち性基、活性カッブリン
   グ試薬、重合体上の活性基、重合体上の活性化しうる基
   ）共有結合及びビオチン−アビジン泡合体より成る群か
   ら選らばｎ、る、萌許請求の範囲第１または第２項記載
   の免疫学的物質の検出試薬。 ５　試薬が７１ｊ合体に結合した標識物質をさらに包容
   する、特許請求の範囲第１項記載の免疫学的物′Ｊ！ｒ
   の検出試薬。 ６　標識物質が非螢光性染オ・」、螢光染料、放射１〈
   に同位元素、′ｒ４．子不透明物質、酵素、第一の同族
   体とは異なる特異性を有する第二の免疫学的同族体及び
   微小球体より成る群から選らば牡る、％許請求の範囲第
   ２．３または５項記載の免疫学的物質の検出試薬。 Ｚ　水浴性重合体がポリアクリル酸　、＋’４　ｌ）メ
   タクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコー
   ル、ポリアリルアルコール、上記の重合体の組合ワせ、
   ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセル
   ロース、天然水浴性重合体及び合成水溶性１１町合体よ
   り成る群から選らげｎる、特許請求の範囲第１．２また
   は３項記載の免疫学的物質の検出試薬。 ａａ）検出すべき物質に対して特異的な第一の免疫学的
   同族体； ｂ）ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル
   アミド　、ｌ？リビニルアルコール、ポリアリルアルコ
   ール、上記の重合体の組合わせ、ヒドロキシエチルセル
   ロース、ヒドロキシプロピルセルロース、天然水浴性重
   合体及び合成水浴性重合体より成る群から選らげｎる、
   ゼロよりも大きくない電荷を有している水浴性重合体、
   この重合体はさらにそγＬと結合する非螢光性染料、螢
   光染料、放射性同位元素、電子不透明物質、酵素及び第
   一の同族体とは異なる特異性の第二の免疫学的同族体並
   びに微小球体より成る群から選らばｎる標識物質を有す
   る；及びＣ）重合体−標識複合体を第一の同族体に結合
   する手段１ から成る免疫学的物質の検出試薬。 ９、ａ）検出すべき物質に対して特異的な第一の免疫学
   約同族体； ｂ）ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル
   アミド、ぼりビニルアルコール、ポリアリルアルコール
   、上記の重合体の絹合わせ、ヒドロキシエチルセルロー
   ス、ヒドロキシプロピルセルロース、天然水浴性重合体
   及び合成水浴性重合体より成る徂・から選択さし且つそ
   扛と結合する非螢光性染料１螢光染料、放射性同位元素
   ）電子不透明物質１酵素及び第一の同族体ゼロよシも大
   きくない正味の電荷を有している；及び Ｃ）重合体−標識物質複合体を第一の同族体に結合する
   手段、 から成る免疫学的物質の検出試薬。 １０ａ）検出すべき物質に対して特異的な第一の免疫学
   的同族体；及び ｂ）ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル
   アミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール
   、上記の重合体の組合わせ、＝　５− ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセル
   ロース、天然水浴性重合体及び合成水浴性重合体よシ成
   る群から選ばする水浴性重合体、ここでこの重合体はそ
   ｎと結合する非螢光性染料）螢光染料、放射性同位元素
   、電子不透明物質、酵素、第一の相同体とは異なる特異
   性の第二の免疫学的同族体及び微小球体より成る群から
   選らば【る標識物質を有し且つこの重合体は、そｒと結
   合した〜第一の同族体に対して重合体を結合する手段を
   有し、そして重合体−標識物質−結合手段の全複合体は
   ゼロよりも大きくない正味の電荷を有している、 から成る免疫学的物質検出試薬。 １１、結合手段に同族体上の活性基、活性カップ゛リン
   グ試薬、重合体上の活性基、１（【合体上の活性化しう
   る基、共有結合及びビオチン−アビノン複合体より成る
   群から選らばｎる、特許請求の範　６− 門弟８１９または１０項記載の免疫学的物質の検出試薬
   。 １２　結合手段がビチオンーアビヅンの複合体であり１
   」、つ標識物質が螢光染料である、特許請求の範囲第２
   ．３％　５％　８．９廿たは１０項記載の免疫学的物質
   の検ＩＪｊ試薬。 １３、ａ）元疫学的物質は組織と結合した部位に存在す
   る抗原であり； ｂ）免疫学的同族体は抗原に対して特異的な抗体であり
   ；且つ Ｃ）４ｔ＋識物質（−１、化学療法物質、放射線療法物
   質、ビタミン、腫瘍抑制剤）及び抗原部位に送付するこ
   とが望ま汎る組織に作用する材料より成る群から選らば
   扛る治療物質で置換さ扛ている、 堝・１杵請求の範囲第５項記載の試薬。 １４、ａ）ゼロよりも大きく々い電荷を有している水溶
   性重合体； ｂ）重合体に対して結合した、抗原に対して特異的な、
   抗体；及び Ｃ）　ｊＩｉ（合体に結合しており且つ化学療法物質、
   放射線療法物質、ビタミン、腫瘍抑制剤及び抗原部位に
   送付することが望ｉｎる組織に作用する材料より成る群
   から選らば扛る治療物質、から成る、結合した抗原を有
   する、組織に対して特異的な治療剤っ １５　水溶性重合体がポリアクリル酸、ポリメタクリル
   酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ
   アリルアルコール、上記の重合体の川合わせ、ヒドロキ
   シエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、
   天然水溶性重合体及び合成水ｆ８件重合体より成る群か
   ら選らばｎる、η４許請求の範囲第１４項記載の治療剤
   。 １６、抗体が構体上の活性基Ｓ活性カツフ”リング剤、
   ■「合体上の活性基、重合体上の活性化しうる基）共有
   結合及びビオチン−アビノン複合体より成る群から選ら
   ばｎる結合手段によって重合体に結合さ扛ている１特許
   請求の範囲第１５項記載の治療剤っ