JPH0324620B2 - - Google Patents

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JPH0324620B2
JPH0324620B2 JP57179149A JP17914982A JPH0324620B2 JP H0324620 B2 JPH0324620 B2 JP H0324620B2 JP 57179149 A JP57179149 A JP 57179149A JP 17914982 A JP17914982 A JP 17914982A JP H0324620 B2 JPH0324620 B2 JP H0324620B2
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alcohol
glucose
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oxidase
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Hisao Oosawa
Izumi Kubo
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Fuji Electric Corporate Research and Development Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵もろみなどに生成されるグルコ
ースおよびアルコールを連続的に定量する方法に
関するものである。発酵管理上、もろみ中のこれ
ら２種の成分を定量することが重要であり、迅速
簡便かつ自動的な定量が強く要望されている。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for continuously quantifying glucose and alcohol produced in fermented mash and the like. In terms of fermentation management, it is important to quantify these two types of components in mash, and there is a strong demand for rapid, simple, and automatic quantitative determination.

従来、もろみの発酵管理は主として比重の変化
を目安として経験的に行なわれてきた。近年、こ
れが科学的に見直され、たとえば蒸米の溶解、糖
化、アルコール発酵の同時進行過程において糖お
よびアルコールの濃度変化により発酵管理を行な
う傾向にある。糖の測定法としては、現在、酵素
−比色法が一般的であり、この方法はグルコース
酸化酵素グルコースオキシダーゼとペルオキシダ
ーゼとを利用して酸化還元反応により変化する呈
色を比色定量するものである。しかしながら、こ
の方法は操作が煩雑で、測定に長時間を要すると
いう欠点がある。他方、アルコールの定量法とし
ては比重の自動測定或いは発酵過程で生成する
CO2ガスを測定する方法などがあるが、いずれも
アルコールを直接測定するものではないため、精
度が良くないという欠点がある。しかも上記の方
法は糖またはアルコールのいずれか一方のみを測
定する方法であり、これら両成分を測定するには
２種の方法および装置を別々に必要とする。 Conventionally, fermentation management of mash has been carried out empirically, mainly using changes in specific gravity as a guide. In recent years, this has been scientifically reconsidered, and there is a trend toward controlling fermentation by changing the concentration of sugar and alcohol during the simultaneous processes of dissolution, saccharification, and alcohol fermentation of steamed rice. Currently, the enzyme-colorimetric method is commonly used to measure sugar, and this method uses glucose oxidase, glucose oxidase, and peroxidase to colorimetrically quantify the color changes caused by redox reactions. be. However, this method has the disadvantage that the operation is complicated and the measurement takes a long time. On the other hand, methods for quantifying alcohol include automatic measurement of specific gravity or alcohol produced during the fermentation process.
There are methods to measure CO 2 gas, but none of them measure alcohol directly, so they have the disadvantage of poor accuracy. Moreover, the above method measures only either sugar or alcohol, and two separate methods and devices are required to measure both of these components.

本発明者等は、上記欠点を解消すべく鋭意検討
を重ねた結果、グルコースオキシダーゼとアルコ
ールオキシダーゼとを用いて糖およびアルコール
を酵素的に分解し、この分解反応に関与する物質
を電極法により定量すれば、発酵もろみなどにお
ける糖およびアルコールを連続的に定量すること
ができ、発酵管理上極めて有利であることを突き
止めた。 As a result of extensive studies to resolve the above drawbacks, the present inventors have decomposed sugar and alcohol enzymatically using glucose oxidase and alcohol oxidase, and quantified the substances involved in this decomposition reaction using an electrode method. It was found that this method allows for continuous quantitative determination of sugar and alcohol in fermented mash, etc., which is extremely advantageous in terms of fermentation management.

したがつて、本発明の目的は、発酵もろみなど
の試料中の糖およびアルコールを酵素電極法によ
り簡便迅速かつ自動的に測定しうる方法を提供す
ることにある。この方法は、必要な装置を適当に
配置することにより連続測定法として具体化する
こともできる。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for easily, quickly, and automatically measuring sugar and alcohol in a sample such as fermented mash using an enzyme electrode method. This method can also be implemented as a continuous measurement method by appropriately arranging the necessary equipment.

前記の目的を達成するため、本発明による醗酵
もろみ中の糖およびアルコールの定量法は、醗酵
もろみなどの試料中に含有されるグルコースとア
ルコールとを定量するに際し、反応セルの内部に
グルコースオキシダーゼからなる固定化酵素膜を
装着した過酸化水素電極を設置し、前記試料を前
記反応セル内に導入して前記電極と接触させ、前
記電極における電流値の増加によりグルコースを
前記反応セル内で測定し、その後アルコールオキ
シダーゼを水溶液として前記反応セル内に導入
し、前記電極における電流値の増加によりアルコ
ールを同一の前記反応セル内で順次測定すること
を特徴とする。 In order to achieve the above object, the method for quantifying sugar and alcohol in fermented mash according to the present invention is based on the method for quantifying sugar and alcohol contained in a sample such as fermented mash. A hydrogen peroxide electrode equipped with an immobilized enzyme membrane of Then, alcohol oxidase is introduced into the reaction cell as an aqueous solution, and alcohol is sequentially measured in the same reaction cell by increasing the current value at the electrode.

本発明の基礎となる原理を説明すれば次の通り
である。 The principle underlying the present invention will be explained as follows.

たとえば発酵もろみ中では下記の反応(1)および
(2)により発酵が進行している： （C6H10O5）o＋oH2O→oC6H12O6 (1) 澱 粉 グルコース C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2 (2) グルコース エチルアルコール (1)および(2)の反応は同時進行しており、発酵管
理を充分に行なうにはグルコースおよびアルコー
ルを同時測定することが望ましい。ここで、定量
すべき糖はグルコースであり、定量すべきアルコ
ールはエチルアルコールである。これら成分、す
なわちグルコースとエチルアルコールとは下記の
反応(3)および(4)により酵素的に定量することがで
きる： C6H12O6＋O2グルコースオキシダーゼ ――――――――――――→ C6H10O6＋H2O2 …(3) C2H5OH＋O2アルコールオキシダーゼ ――――――――――――→ CH3CHO＋H2O2 …(4) すなわち、グルコースオキシダーゼ
（EC1.1.3.4）およびアルコールオキシダーゼ
（EC1.1.3.13）の作用によりグルコースおよびエ
チルアルコールからはそれぞれH2O2（過酸化水
素）が生成され、これを過酸化水素電極により電
気信号に変換することでグルコースおよびエチル
アルコールをそれぞれ定量することができる。こ
こで、用いるグルコースオキシダーゼおよびアル
コールオキシダーゼはそれぞれグルコースおよび
アルコールに特異的に作用するため、試料中の他
の物質からH2O2が生成されることはなく、した
がつて精度の高い測定が可能である。 For example, in fermentation mash, the following reactions (1) and
Fermentation is progressing due to (2): (C 6 H 10 O 5 ) o + o H 2 O→ o C 6 H 12 O 6 (1) Starch Glucose C 6 H 12 O 6 →2C 2 H 5 OH+2CO 2 (2) Glucose Ethyl alcohol The reactions of (1) and (2) are proceeding simultaneously, and it is desirable to measure glucose and alcohol simultaneously in order to adequately control the fermentation. Here, the sugar to be determined is glucose, and the alcohol to be determined is ethyl alcohol. These components, namely glucose and ethyl alcohol, can be determined enzymatically by the following reactions (3) and (4): C 6 H 12 O 6 + O 2 glucose oxidase―――――――――― ――→ C 6 H 10 O 6 +H 2 O 2 …(3) C 2 H 5 OH＋O 2 alcohol oxidase――――――――――→ CH 3 CHO＋H 2 O 2 …(4) That is, H 2 O 2 (hydrogen peroxide) is generated from glucose and ethyl alcohol by the action of glucose oxidase (EC1.1.3.4) and alcohol oxidase (EC1.1.3.13), and this is electrically generated using a hydrogen peroxide electrode. Glucose and ethyl alcohol can be each quantified by converting them into signals. Since the glucose oxidase and alcohol oxidase used here act specifically on glucose and alcohol, H 2 O 2 is not generated from other substances in the sample, and therefore highly accurate measurements are possible. It is.

本発明に用いる過酸化水素電極としてはポーラ
ログラフ型のものを用いることができる。過酸化
水素の定量は常法により用なうことができ、
H2O2の酸化電流を測定する。得られる電流値は
試料中の基質濃度と比例するので、グルコースお
よびアルコールの定量を行なうことができる。 As the hydrogen peroxide electrode used in the present invention, a polarographic type can be used. Hydrogen peroxide can be determined using conventional methods.
Measure the oxidation current of H2O2 . Since the obtained current value is proportional to the substrate concentration in the sample, glucose and alcohol can be quantified.

以下、添付図面を参照して本発明を実施例につ
き説明する。 Hereinafter, the present invention will be described by way of example with reference to the accompanying drawings.

第１図は糖およびアルコールの検出部の例を示
し、ここで１０は過酸化水素電極、１２はそのリ
ード線、１４は温度補正用サーミスタ、１６はそ
のリード線、１８は反応セル、２０は定量すべき
もろみなどの溶液で満たしたセル室をそれぞれ示
す。２２は注入口、２４は撹拌用のダイヤフラム
をそれぞれ示す。セル室２０は一定の容積（0.4
ml）を有し、一定温度（20゜〜40℃）に保持され
る。 FIG. 1 shows an example of a sugar and alcohol detection section, where 10 is a hydrogen peroxide electrode, 12 is its lead wire, 14 is a temperature compensation thermistor, 16 is its lead wire, 18 is a reaction cell, and 20 is a Each cell chamber is shown filled with a solution such as mash to be quantified. 22 represents an injection port, and 24 represents a diaphragm for stirring. The cell chamber 20 has a constant volume (0.4
ml) and maintained at a constant temperature (20° to 40°C).

次に、本発明に使用する過酸化水素電極の例を
第２図に示し、ここで３０は白金極、３４は銀極
であり、３２はこれら両極間の絶縁層である。ま
た、３６はＯ−リング保持用ガイド、３８はＯ−
リング、４０はグルコースオキシダーゼの固定化
酵素膜である。 Next, an example of a hydrogen peroxide electrode used in the present invention is shown in FIG. 2, where 30 is a platinum electrode, 34 is a silver electrode, and 32 is an insulating layer between these two electrodes. Further, 36 is an O-ring holding guide, 38 is an O-ring holding guide, and 38 is an O-ring holding guide.
The ring 40 is an immobilized enzyme membrane of glucose oxidase.

さらに、第３図に糖およびアルコールの検出装
置の例を示し、ここで５２は第１図に示した検出
部であり、そこへ緩衝液５０が液送りポンプ５４
により給送される。５６は廃液溜めである。電極
をポーラログラフ装置５８に接続し、さらに表示
部６０に接続する。 Furthermore, FIG. 3 shows an example of a sugar and alcohol detection device, where 52 is the detection section shown in FIG.
It is fed by. 56 is a waste liquid reservoir. The electrodes are connected to a polarographic device 58 and further connected to a display section 60.

第１〜３図を参照して本発明の方法の実施例を
説明すれば次の通りである。 An embodiment of the method of the present invention will be described below with reference to FIGS. 1 to 3.

過酸化水素電極１０には固定化グルコースオキ
シダーゼ膜４０を装着して用いた。緩衝液５０と
しては0.1M燐酸緩衝液（PH7.0）を用いた。もろ
みなどの試料を注入口２２からセル室２０内に注
入すると、シリコンダイヤフラム２４により撹拌
されて、セル内で緩衝液により均一に希釈され
る。かくして、試料中のグルコースは固定化グル
コースオキシダーゼ膜４０と接触しかつ酸化され
てH2O2を発生し、これにより過酸化水素電極１
０の電流値は上昇して暫時定常状態に達する。こ
の時の電流増加分はグルコース量に比例するの
で、その定量ができる。ここで、アルコールオキ
シダーゼ溶液を注入口２２より注入すると、試料
中のアルコールが酸化されてH2O2を発生し、再
び過酸化水素電極１０の電流値が増加する。一定
時間後の増加分または増加率によりアルコールを
定量することができる。定量後は、緩衝液５０に
よりセル室２０内を洗浄し、その廃液は液送りポ
ンプ５４により廃液溜め５６に送られる。洗浄に
より電流値が試料注入前の値に戻つたら、再び新
たな試料を注入することができ、かくして反復連
続測定を行なうことができる。試料の注入は自動
サンプラーを取り付ければ自動的に行なうことも
可能である。 An immobilized glucose oxidase membrane 40 was attached to the hydrogen peroxide electrode 10 for use. As the buffer solution 50, 0.1M phosphate buffer (PH7.0) was used. When a sample such as mash is injected into the cell chamber 20 through the injection port 22, it is stirred by the silicon diaphragm 24 and uniformly diluted with a buffer solution within the cell. Thus, the glucose in the sample contacts the immobilized glucose oxidase membrane 40 and is oxidized to generate H 2 O 2 , which causes the hydrogen peroxide electrode 1
The current value of 0 increases and reaches a steady state for a while. Since the current increase at this time is proportional to the amount of glucose, it can be quantified. Here, when the alcohol oxidase solution is injected through the injection port 22, the alcohol in the sample is oxidized to generate H 2 O 2 and the current value of the hydrogen peroxide electrode 10 increases again. Alcohol can be quantified based on the amount of increase or rate of increase after a certain period of time. After the quantitative determination, the inside of the cell chamber 20 is washed with the buffer solution 50, and the waste liquid is sent to the waste liquid reservoir 56 by the liquid feed pump 54. When the current value returns to the value before sample injection by washing, a new sample can be injected again, thus making it possible to carry out repeated and continuous measurements. Sample injection can also be performed automatically by installing an automatic sampler.

上記の方法により実際にグルコースおよびアル
コールを定量した場合の電流変化を第４図に示
す。試料を注入すると（時点１００）、電極電流
値は約30秒後に定常状態に達した。１分後にアル
コールオキシダーゼ溶液を注入すると（時点１０
２）、電流値は再び上昇した。アルコールオキシ
ダーゼを注入してから２分後に洗浄を開始し（時
点１０４）、１分間で電流は試料注入前の値に戻
つた。グルコースおよびアルコール標準液で予め
検量線を作成するか、或いは装置を較正しておけ
ば、第４図のΔi1からグルコースを、またΔi2から
アルコールをそれぞれ定量し、表示させることが
できる。 FIG. 4 shows current changes when glucose and alcohol were actually determined by the above method. When the sample was injected (time point 100), the electrode current value reached steady state after about 30 seconds. When alcohol oxidase solution is injected after 1 minute (time point 10)
2), the current value rose again. Washing was started 2 minutes after alcohol oxidase injection (time point 104), and within 1 minute the current returned to the value before sample injection. If a calibration curve is prepared in advance using glucose and alcohol standard solutions or the device is calibrated, glucose can be determined from Δi 1 in FIG. 4, and alcohol can be determined from Δi 2 in FIG. 4 and displayed.

以上の説明から明らかなように、本発明によれ
ば、過酸化水素電極として、グルコースオキシダ
ーゼの固定化酵素膜を使用したものを用い、最初
グルコースオキシダーゼの酵素的分解により
H2O2を生成させて前記過酸化水素電極により試
料中のグルコースを定量し、次いでアルコールオ
キシダーゼ溶液を注入することにより、試料中の
アルコールが酸化されてH2O2を発生し、これに
より前記過酸化水素電極により試料中のアルコー
ルを定量することができる。 As is clear from the above description, according to the present invention, a hydrogen peroxide electrode using an enzyme membrane with immobilized glucose oxidase is used, and the hydrogen peroxide electrode is initially decomposed by enzymatic decomposition of glucose oxidase.
By generating H 2 O 2 and quantifying glucose in the sample using the hydrogen peroxide electrode, and then injecting an alcohol oxidase solution, the alcohol in the sample is oxidized to generate H 2 O 2 , thereby Alcohol in a sample can be quantitatively determined using the hydrogen peroxide electrode.

従つて、本発明によれば、複数の電極を使用す
ることなく、グルコースオキシダーゼの固定化酵
素膜を使用した過酸化水素電極のみを使用して、
同一の反応セル内でグルコースとアルコールの２
成分の定量を連続的にしかも自動的に達成するこ
とができる。 Therefore, according to the present invention, without using multiple electrodes, only a hydrogen peroxide electrode using an enzyme membrane with immobilized glucose oxidase is used.
2 of glucose and alcohol in the same reaction cell
Quantification of components can be achieved continuously and automatically.

このように本発明では、同一の電極、固定化酵
素膜および反応セルを利用することから、構成の
簡素化を容易に達成することができる。 As described above, in the present invention, since the same electrode, immobilized enzyme membrane, and reaction cell are used, the configuration can be easily simplified.

また、本発明では、複数の電極を使用しないた
め、複数の酵素電極を使用した際に発生し易い電
極の相互干渉がなく、適正かつ正確な複数成分の
定量を実現することができる。すなわち、複数個
の酵素電極として、例えばＡ電極（±）とＢ電極
（±）がある場合に、Ａ電極（＋）とＢ電極（−）
の間で電流のやりとりを生じ、このため酸化還元
電極においては電極電位が変化する等の問題が発
生する。そこで、電極を入れる槽の形状や電極自
体の構成を考慮することも可能であるが、この場
合にも測定精度に信頼性を欠き、電極の相互干渉
による問題を解消することは困難である。 Furthermore, in the present invention, since multiple electrodes are not used, there is no mutual interference between the electrodes, which tends to occur when multiple enzyme electrodes are used, and proper and accurate quantification of multiple components can be achieved. In other words, if there are multiple enzyme electrodes, for example A electrode (±) and B electrode (±), A electrode (+) and B electrode (-)
Current exchange occurs between the two, which causes problems such as changes in electrode potential at the redox electrode. Therefore, it is possible to consider the shape of the tank in which the electrodes are placed and the structure of the electrodes themselves, but in this case as well, the measurement accuracy lacks reliability and it is difficult to eliminate problems caused by mutual interference between the electrodes.

以上、本発明の好適実施例を、たとえば発酵も
ろみのグルコースおよびアルコールの定量につき
説明したが、本発明はビール、ワインなどアルコ
ール発酵管理用として利用することができる。ま
た、発酵管理以外に、アルコール飲料の品質管理
にも応用できる。さらに、本発明は、上記に説明
した試料中の糖とアルコールの定量の他に、 Ａ→Ｂ＋グルコース Ｃ→Ｄ＋アルコール Ｅ→Ｆ＋グルコース＋アルコール のように、グルコースとアルコールとを生成する
物質Ａ、Ｃ、Ｅ或いはＢ、Ｄ、Ｆの分析にも利用
できるであろう。 The preferred embodiments of the present invention have been described above, for example, for the determination of glucose and alcohol in fermented mash, but the present invention can also be used for controlling alcoholic fermentation of beer, wine, etc. In addition to fermentation control, it can also be applied to quality control of alcoholic beverages. Furthermore, in addition to the above-described quantitative determination of sugar and alcohol in a sample, the present invention also provides a substance A that produces glucose and alcohol, such as A→B+glucose C→D+alcohol E→F+glucose+alcohol; It may also be used for analysis of C, E or B, D, F.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図は本発明方法に使用する装置の検出部の
平面図、第２図はポーラログラフ用過酸化水素電
極の構造を示す横断面図、第３図は本発明の方法
を実施するグルコース・アルコール分析装置の一
系統図、第４図はポーラログラフ装置の出力、す
なわち本発明の定量法の状態を示すグラフであ
る。 １０…過酸化水素電極、１２…リード線、１４
…温度補正用サーミスタ、１６…リード線、１８
…反応セル、２０…セル室、２２…注入口、２４
…シリコンダイヤフラム、３０…白金極、３２…
絶縁層、３４…銀極、３６…Ｏ−リング保持用ガ
イド、３８…Ｏ−リング、４０…固定化酵素膜、
５０…緩衝液、５２…検出部、５４…液送りポン
プ、５６…廃液溜め、５８…ポーラログラフ装
置、６０…表示部、１００…試料注入時点、１０
２…アルコールオキシダーゼ注入時点、１０４…
洗浄開始時点。 Fig. 1 is a plan view of the detection section of the device used in the method of the present invention, Fig. 2 is a cross-sectional view showing the structure of a hydrogen peroxide electrode for polarography, and Fig. 3 is a glucose-alcohol-containing device used in the method of the present invention. FIG. 4, which is a system diagram of the analyzer, is a graph showing the output of the polarographic device, that is, the state of the quantitative method of the present invention. 10...Hydrogen peroxide electrode, 12...Lead wire, 14
...Temperature correction thermistor, 16...Lead wire, 18
...Reaction cell, 20...Cell chamber, 22...Inlet, 24
...Silicon diaphragm, 30...Platinum electrode, 32...
Insulating layer, 34... Silver electrode, 36... O-ring holding guide, 38... O-ring, 40... Immobilized enzyme membrane,
50... Buffer solution, 52... Detection section, 54... Liquid feed pump, 56... Waste liquid reservoir, 58... Polarographic device, 60... Display section, 100... Time of sample injection, 10
2...At the time of alcohol oxidase injection, 104...
At the start of cleaning.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １ 醗酵もろみなどの試料中に含有されるグルコ
ースとアルコールとを定量するに際し、反応セル
の内部にグルコースオキシダーゼからなる固定化
酵素膜を装着した過酸化水素電極を設置し、前記
試料を前記反応セル内に導入して前記電極と接触
させ、前記電極における電流値の増加によりグル
コースを前記反応セル内で測定し、その後アルコ
ールオキシダーゼを水溶液として前記反応セル内
に導入し、前記電極における電流値の増加により
アルコールを同一の前記反応セル内で順次測定す
ることを特徴とする醗酵もろみ中の糖およびアル
コールの定量法。1. When quantifying glucose and alcohol contained in a sample such as fermentation mash, a hydrogen peroxide electrode equipped with an immobilized enzyme membrane made of glucose oxidase is installed inside a reaction cell, and the sample is transferred to the reaction cell. glucose is measured in the reaction cell by increasing the current value at the electrode, and then introducing alcohol oxidase as an aqueous solution into the reaction cell to increase the current value at the electrode. 1. A method for quantifying sugar and alcohol in fermented mash, comprising sequentially measuring alcohol in the same reaction cell.
JP57179149A 1982-10-14 1982-10-14 Quantitative determination of sugar and alcohol in fermentation mash Granted JPS5968663A (en)

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JP57179149A JPS5968663A (en) 1982-10-14 1982-10-14 Quantitative determination of sugar and alcohol in fermentation mash

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JPS5544954A (en) * 1978-09-26 1980-03-29 Toyo Jozo Co Ltd Multi-item analyzing method and device
JPS56103364A (en) * 1980-01-22 1981-08-18 Toyo Jozo Co Ltd Simultaneous measuring apparatus for multi-items

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