JPH03247296A - 低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法 - Google Patents
低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法Info
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- JPH03247296A JPH03247296A JP4129790A JP4129790A JPH03247296A JP H03247296 A JPH03247296 A JP H03247296A JP 4129790 A JP4129790 A JP 4129790A JP 4129790 A JP4129790 A JP 4129790A JP H03247296 A JPH03247296 A JP H03247296A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、低分子量コンドロイチン硫酸の新規な製造方
法に関する。
法に関する。
（従来の技術〕
コンドロイチン硫酸は硫酸基をもつ多糖であり、動物の
軟骨組織から分離される。コンドロイチン硫酸の分子量
はそれが分離されたもとの組織によって異なるが、通常
５０００から２９０００の範囲にある。
軟骨組織から分離される。コンドロイチン硫酸の分子量
はそれが分離されたもとの組織によって異なるが、通常
５０００から２９０００の範囲にある。
低分子量コンドロイチン硫酸（または低粘性コンドロイ
チン硫酸として知られる）は、分子量が通常１０００か
ら６０００の範囲にある硫酸基を持つオリゴ糖の混合物
からなり、酵素的方法によって生産される。
チン硫酸として知られる）は、分子量が通常１０００か
ら６０００の範囲にある硫酸基を持つオリゴ糖の混合物
からなり、酵素的方法によって生産される。
酵素分解がコンドロイチン硫酸を部分的に分解する方法
として望ましいのは、出発物質の損失無しに、また不要
な副生物もなく、低分子量コンドロイチン硫酸が高収率
で得られるためである。酵素分解は、コンドロイチナー
ゼ（またはコンドロイチン硫酸リアーゼとして知られる
）を用いて行われるが、該酵素は、ある種のグリコシド
結合を切断し、多糖基質から鎖長の短くなったフラグメ
ントを生成させることができる。従来は、アースロバフ
タ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウ
ム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロテウス（ｐ
ｒｏｔｅｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ） 、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ＩＩ＋） 、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ） 、
ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ベネッケア（Ｂｅｎｅｃｋ
ｅａ）、またはミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ）の各属に属する細菌の発酵によって、コンドロイチ
ナーゼが得られている。これらの従来コンドロイチナー
ゼはすべて、熱失活に対して非常に感受性であり、５０
℃以上の温度では完全かつ不可逆に失活する。従って、
従来の酵素的な低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法
は５０℃以上の温度では行うことができない。アースロ
バクターオーレツセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｕｅｒｅｓｃｅｎｓ）ＯＭＴ ６７０２（ｒＡＭ１８
０１６）由来のコンドロイチナーゼを用いて５０℃以下
でコンドロイチン硫酸の重合を分解することからなる、
低分子量コンドロイチン硫酸の従来の酵素的製造方法は
、日本特許ＪＰ−０３９９５０（６８，０６，１２）に
公表されている［先例１〕。
として望ましいのは、出発物質の損失無しに、また不要
な副生物もなく、低分子量コンドロイチン硫酸が高収率
で得られるためである。酵素分解は、コンドロイチナー
ゼ（またはコンドロイチン硫酸リアーゼとして知られる
）を用いて行われるが、該酵素は、ある種のグリコシド
結合を切断し、多糖基質から鎖長の短くなったフラグメ
ントを生成させることができる。従来は、アースロバフ
タ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウ
ム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロテウス（ｐ
ｒｏｔｅｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ） 、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ＩＩ＋） 、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ） 、
ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ベネッケア（Ｂｅｎｅｃｋ
ｅａ）、またはミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ）の各属に属する細菌の発酵によって、コンドロイチ
ナーゼが得られている。これらの従来コンドロイチナー
ゼはすべて、熱失活に対して非常に感受性であり、５０
℃以上の温度では完全かつ不可逆に失活する。従って、
従来の酵素的な低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法
は５０℃以上の温度では行うことができない。アースロ
バクターオーレツセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｕｅｒｅｓｃｅｎｓ）ＯＭＴ ６７０２（ｒＡＭ１８
０１６）由来のコンドロイチナーゼを用いて５０℃以下
でコンドロイチン硫酸の重合を分解することからなる、
低分子量コンドロイチン硫酸の従来の酵素的製造方法は
、日本特許ＪＰ−０３９９５０（６８，０６，１２）に
公表されている［先例１〕。
最近、本発明者らは新規コンドロイチナーゼ生産菌バチ
ルス属菌菌株ＢＨ１００を発見し、該微生物を工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託し、該菌株は寄託番号Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ１０４０８を与えられた。本菌株は特願平１
−２０４７７０号（１９８９年８月９日）に示したよう
に耐熱性コンドロイチナーゼの新製法に利用されている
。従来の酵素と異なり、バチルス属菌菌株ＢＨ１１００
（ＦＥＲＰ−１０４０８）由来のコンドロイチナーゼは
耐熱性で、５０℃から９０℃までの温度で活性がある。
ルス属菌菌株ＢＨ１００を発見し、該微生物を工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託し、該菌株は寄託番号Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ１０４０８を与えられた。本菌株は特願平１
−２０４７７０号（１９８９年８月９日）に示したよう
に耐熱性コンドロイチナーゼの新製法に利用されている
。従来の酵素と異なり、バチルス属菌菌株ＢＨ１１００
（ＦＥＲＰ−１０４０８）由来のコンドロイチナーゼは
耐熱性で、５０℃から９０℃までの温度で活性がある。
（発明が解決しようとする課題〕
従来の低分子量コンドロイチン硫酸の酵素的製法は、一
つないしはそれ以上の実際上の応用を限定するような欠
点、例えば酵素の安定性が低いことや基質を分解するた
めの温度が低いといった欠点がある。従来の方法と比べ
で、耐熱性コンドロイチナーゼを用いる製法は、該耐熱
性コンドロイチナーゼが精製、保存、および５０″Ｃ以
下の温度での使用で優れた安定性を示すこと、さらによ
り速い反応速度を得るためにもっと高い９０℃までの温
度ですら使用することが可能であるという点で、有利で
ある。
つないしはそれ以上の実際上の応用を限定するような欠
点、例えば酵素の安定性が低いことや基質を分解するた
めの温度が低いといった欠点がある。従来の方法と比べ
で、耐熱性コンドロイチナーゼを用いる製法は、該耐熱
性コンドロイチナーゼが精製、保存、および５０″Ｃ以
下の温度での使用で優れた安定性を示すこと、さらによ
り速い反応速度を得るためにもっと高い９０℃までの温
度ですら使用することが可能であるという点で、有利で
ある。
本発明は、コンドロイチン硫酸をコンドロイチナーゼに
より５０〜９０℃で処理することを特徴とする低分子量
コンドロイチン硫酸の製造法にある。
より５０〜９０℃で処理することを特徴とする低分子量
コンドロイチン硫酸の製造法にある。
そして、このコンドロイチナーゼは好ましくはバチルス
属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、） ＢＨ１００株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ１０４０Ｂ）の産出するコンドロイチナーゼ
が用いられる。
属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、） ＢＨ１００株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ１０４０Ｂ）の産出するコンドロイチナーゼ
が用いられる。
更に、本発明は、上記コンドロイチナーゼに代えてバチ
ルス属に属するコンドロイチナーゼ生産菌の培養物、菌
体又はその処理物を使用し、これによりコンドロイチン
硫酸を５０〜９０℃で処理して低分子量コンドロイチン
硫酸を製造する方法も含まれる。
ルス属に属するコンドロイチナーゼ生産菌の培養物、菌
体又はその処理物を使用し、これによりコンドロイチン
硫酸を５０〜９０℃で処理して低分子量コンドロイチン
硫酸を製造する方法も含まれる。
なお、上記ヘバリナーゼ処理により得られた生成物の低
分子量コンドロイチン硫酸は常法により回収される。
分子量コンドロイチン硫酸は常法により回収される。
本発明で使用する耐熱性コンドロイチナーゼは、バチル
ス属菌菌株ＢＨ１１００（ＦＥＲＰ−１０４０８）の発
酵によって調製し、日本特許出願番号特願平１−２０４
７７０号（１９８９年８月９日）の「耐熱性コンドロイ
チナーゼ及びその製造法」に述べた従来の方法によって
精製した。
ス属菌菌株ＢＨ１１００（ＦＥＲＰ−１０４０８）の発
酵によって調製し、日本特許出願番号特願平１−２０４
７７０号（１９８９年８月９日）の「耐熱性コンドロイ
チナーゼ及びその製造法」に述べた従来の方法によって
精製した。
本発明で用いたコンドロイチナーゼの酵素学的な性質は
以下の通りである。
以下の通りである。
反応：
コンドロイチン−６−硫酸、コンドロイチン−４−硫酸
、さらにより限定された条件下でしよ、ヒアルロン酸、
およびデルマタン硫酸の脱離的開裂を触媒し、これらの
ムコ多糖から２３２ｎｍの紫外線吸収を示す鎖長の短く
なったフラグメントを生成させる。
、さらにより限定された条件下でしよ、ヒアルロン酸、
およびデルマタン硫酸の脱離的開裂を触媒し、これらの
ムコ多糖から２３２ｎｍの紫外線吸収を示す鎖長の短く
なったフラグメントを生成させる。
基質特異性：
コンドロイチン−６＝硫酸、コンドロイチン４−硫酸、
ヒアルロン酸、およびデルマタン硫酸を脱離的に開裂す
る相対反応速度は、それぞれおよそ１００％、９０％、
６０％、および１５％である。ヘパリン、ヘパラン硫酸
、デキストラン硫酸、およびポリガラクツロン酸は開裂
しなかった。
ヒアルロン酸、およびデルマタン硫酸を脱離的に開裂す
る相対反応速度は、それぞれおよそ１００％、９０％、
６０％、および１５％である。ヘパリン、ヘパラン硫酸
、デキストラン硫酸、およびポリガラクツロン酸は開裂
しなかった。
最適ｐＨおよび安定なｐＨの範囲：
活性の最適ｐＨはｐＨ５，５から６．５までの範囲内に
ある。該酵素は、７５℃１３０分後に１００％の活性を
維持しているという条件で、ｐＨ６，０から８．０の範
囲で安定である。
ある。該酵素は、７５℃１３０分後に１００％の活性を
維持しているという条件で、ｐＨ６，０から８．０の範
囲で安定である。
耐熱性：
ｐＨ６，０から８．０まテノ範囲で、７５℃、３０分間
の加熱後に酵素活性は１００％残存し、７５℃１３時間
の加熱後に活性は８０％以上残存している。
の加熱後に酵素活性は１００％残存し、７５℃１３時間
の加熱後に活性は８０％以上残存している。
最適温度範囲：
活性の最適温度は７５℃から８ｏ″Ｃの範囲内である。
無機イオンおよびその他の試薬の影響：Ｃｕ”、 Ｃｕ
”、 Ｚｎ２′″、 Ａｇ′″、およびｐｂ”の塩化物
は１ 、０ｍＭ存在下で、酵素活性をそれぞれ約９９％
。
”、 Ｚｎ２′″、 Ａｇ′″、およびｐｂ”の塩化物
は１ 、０ｍＭ存在下で、酵素活性をそれぞれ約９９％
。
９３％、７３％、４４％、および３６％低下させる。
Ｃａ”、 Ｍｇ”、 Ｍｎ”、 Ｂａ”、 ＬｉＺ＊、
ＮｉＺ＋、およびＣｏ”の塩化物は１．０ｍＭで活性
に影響を与えなかった。ジチオスレイトール、２−メル
カプトエタノール、Ｌ−システィン、ヨード酢酸、フェ
ニルメチルスルホニルフルオライド、エチレンジアミン
テトラ酢酸三ナトリウム、およびエチレングリコール（
β−アミノエチル−エーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’ 、Ｎ’
−テトラ酢酸は１＋＋＋Ｍで酵素活性に影響を与え
なかった。
ＮｉＺ＋、およびＣｏ”の塩化物は１．０ｍＭで活性
に影響を与えなかった。ジチオスレイトール、２−メル
カプトエタノール、Ｌ−システィン、ヨード酢酸、フェ
ニルメチルスルホニルフルオライド、エチレンジアミン
テトラ酢酸三ナトリウム、およびエチレングリコール（
β−アミノエチル−エーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’ 、Ｎ’
−テトラ酢酸は１＋＋＋Ｍで酵素活性に影響を与え
なかった。
分子量：
本酵素の分子量は、分子量既知の標準タンパク質を対照
とした、４から２０％の直線濃度勾配ゲルを用いたドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による測定では、５３０００である。
とした、４から２０％の直線濃度勾配ゲルを用いたドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による測定では、５３０００である。
生成物の低分子量コンドロイチン硫酸はコンドロイチン
硫酸にコンドロイチナーゼを作用させることによって調
製される。反応は、タンパク質濃度として０．０５から
５■／ｄのコンドロイチナーゼを含む反応液を用い、１
．０から１００■／戚のコンドロイチン硫酸のバッファ
ー水溶液（ｐＨ５から８）を用いて行う。通常、バッフ
ァーは０．０１から０．２Ｍの濃度で使用され、５から
８の範囲のｐＨを与えるあらゆるバッファーを一船に使
用することができ、例えば燐酸カリウム、燐酸ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、はう酸ナトリウム、及びヘペス（
ＦＩＥＰＥＳ）が典型的な例として挙げられる。出発物
質として用いたコンドロイチン硫酸は、豚、牛、羊、鮫
、いか、鯨または他の動物組織に由来し、遊離のコンド
ロイチン硫酸または塩として使用される。このコンドロ
イチン硫酸は豚、牛、羊またはその他の動物組成から常
法により調製されたものが用いられる。反応は５０″Ｃ
から９０℃で行うが、６５℃から８０℃までが望ましい
。反応の程度は、反応生成物の２３２ｎｍの吸光度の増
加を継続的にまたは頻繁にモニターすることにより、測
定する。反応は完了するまで行うことができ、それは反
応生成物の吸光度がもはや増加しないことで示される。
硫酸にコンドロイチナーゼを作用させることによって調
製される。反応は、タンパク質濃度として０．０５から
５■／ｄのコンドロイチナーゼを含む反応液を用い、１
．０から１００■／戚のコンドロイチン硫酸のバッファ
ー水溶液（ｐＨ５から８）を用いて行う。通常、バッフ
ァーは０．０１から０．２Ｍの濃度で使用され、５から
８の範囲のｐＨを与えるあらゆるバッファーを一船に使
用することができ、例えば燐酸カリウム、燐酸ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、はう酸ナトリウム、及びヘペス（
ＦＩＥＰＥＳ）が典型的な例として挙げられる。出発物
質として用いたコンドロイチン硫酸は、豚、牛、羊、鮫
、いか、鯨または他の動物組織に由来し、遊離のコンド
ロイチン硫酸または塩として使用される。このコンドロ
イチン硫酸は豚、牛、羊またはその他の動物組成から常
法により調製されたものが用いられる。反応は５０″Ｃ
から９０℃で行うが、６５℃から８０℃までが望ましい
。反応の程度は、反応生成物の２３２ｎｍの吸光度の増
加を継続的にまたは頻繁にモニターすることにより、測
定する。反応は完了するまで行うことができ、それは反
応生成物の吸光度がもはや増加しないことで示される。
あるいはまた、反応が完了する前に、必要とする反応生
成物の平均分子量に対応した吸光度の値に達したときに
、終了させることができる。反応終了には通常０．１か
ら１００時間を要するが、必要な総時間数は反応温度、
コンドロイチン硫酸濃度、および反応液に使用したコン
ドロイチナーゼの総量に依る。本発明に従って生産され
た低分子量コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン硫酸
から誘導された硫酸基を持つオリゴ糖の混合物で、三糖
、四糖、六糖、およびそれ以上の分子量範囲１ｏｏｏが
ら６０００までのオリゴ糖を含む。コンドロイチン硫酸
にコンドロイチナーゼを作用させて生産された低分子量
コンドロイチン硫酸は、通常のイオン交換クロマトグラ
フィーやゲル濾過クロマトグラフィーといった常法によ
って反応液から回収される。必要ならば、例えば適当な
溶媒沈澱、乾燥、または凍結乾燥によって、生成物を濃
縮することができる。
成物の平均分子量に対応した吸光度の値に達したときに
、終了させることができる。反応終了には通常０．１か
ら１００時間を要するが、必要な総時間数は反応温度、
コンドロイチン硫酸濃度、および反応液に使用したコン
ドロイチナーゼの総量に依る。本発明に従って生産され
た低分子量コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン硫酸
から誘導された硫酸基を持つオリゴ糖の混合物で、三糖
、四糖、六糖、およびそれ以上の分子量範囲１ｏｏｏが
ら６０００までのオリゴ糖を含む。コンドロイチン硫酸
にコンドロイチナーゼを作用させて生産された低分子量
コンドロイチン硫酸は、通常のイオン交換クロマトグラ
フィーやゲル濾過クロマトグラフィーといった常法によ
って反応液から回収される。必要ならば、例えば適当な
溶媒沈澱、乾燥、または凍結乾燥によって、生成物を濃
縮することができる。
本発明では、コンドロイチナーゼは（固定化さレナイ）
遊離型で使用される。コンドロイチナーゼを常法にした
がって固定化した後使用しうることは、明らかに本発明
の範囲にある。常法とはたとえば、（１）イオン交換樹
脂等の固相支持体に吸着させる、（２）シアノーゲンー
ブロマイドで活性化されたセファロース等の固相支持体
に共有結合させる、（３）限外濾過膜、ホローファイバ
ーフィルター等を用いてバイオリアクターに保持させる
、ことである。さらに、固定化されたコンドロイチナー
ゼを包含するりアクタ−にコンドロイチン硫酸を連続的
に添加することによって、低分子量コンドロイチン硫酸
生成物が調製されることは、明らかに本発明の範囲にあ
る。この場合、流速および基質濃度は望ましい平均分子
量の生成物を達成するように調整する。
遊離型で使用される。コンドロイチナーゼを常法にした
がって固定化した後使用しうることは、明らかに本発明
の範囲にある。常法とはたとえば、（１）イオン交換樹
脂等の固相支持体に吸着させる、（２）シアノーゲンー
ブロマイドで活性化されたセファロース等の固相支持体
に共有結合させる、（３）限外濾過膜、ホローファイバ
ーフィルター等を用いてバイオリアクターに保持させる
、ことである。さらに、固定化されたコンドロイチナー
ゼを包含するりアクタ−にコンドロイチン硫酸を連続的
に添加することによって、低分子量コンドロイチン硫酸
生成物が調製されることは、明らかに本発明の範囲にあ
る。この場合、流速および基質濃度は望ましい平均分子
量の生成物を達成するように調整する。
［実施例］
以下の実施例は本発明を説明するが、これに限定される
ことを意図しない。
ことを意図しない。
更に、コンドロイチナーゼに代えてバチルス属に属する
コンドロイチナーゼ生産菌の培養物、菌体又は粗酵素等
の菌体処理物を用いる方法も本発明の範囲である。
コンドロイチナーゼ生産菌の培養物、菌体又は粗酵素等
の菌体処理物を用いる方法も本発明の範囲である。
本酵素を取得するための望ましい方法は、例を挙げれば
以下の様になる。バチルスｓｐ、 ＢＨ１００株を、上
記の様な、誘導物質としてリッター当り１．０から２．
０グラムのコンドロイチン−６６ｘ酸を含有する適正な
培地において、３５℃から４５℃の好気性条件下で３６
から４０時間培養する。得られた培養物を、８０００Ｘ
ｇで３０分間遠心分離にかけ菌体を培養物の培養液上清
から除去する。固形硫酸アンモニウムを培養液上清に７
０％飽和まで加え、その溶液を５℃で最低３時間放置し
、粗コンドロイチナーゼを含有する沈澱物を形成させる
。この沈澱物を８０００Ｘｇで３０分間遠心分離にかけ
回収し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，４に溶解
する。この粗コンドロイチナーゼ溶液を、５℃で２４時
間、１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，４の１００容（
２回交換）に対して５℃で２４時間透析する。この透析
物を同緩衝液で平衡化した硫化セルロファインのカラム
にかけ、該酵素を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、 ｐＨ７
，４緩衝液中、０から０．３Ｍ ＮａＣ１の濃度勾配で
溶出した。約０．１１ＮａＣＩで溶出した活性分画を回
収し、アミコン門１０膜を使用して限外濾過により濃縮
した。この濃縮物は３００ｍＭのＮａＣ１を含有する５
（ｌａＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７，５で平衡化され
た５ＨＯＤＥＸ ＷＳ−２００３カラムを用い、ゲル
パーミェーション クロマトグラフで更に精製し、同緩
衝液で溶出された。こうして取得された活性フラクショ
ンは、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動による試験時に単一蛋白バンドにより示さ
れる様に、精製コンドロイチナーゼのみを含有する。
以下の様になる。バチルスｓｐ、 ＢＨ１００株を、上
記の様な、誘導物質としてリッター当り１．０から２．
０グラムのコンドロイチン−６６ｘ酸を含有する適正な
培地において、３５℃から４５℃の好気性条件下で３６
から４０時間培養する。得られた培養物を、８０００Ｘ
ｇで３０分間遠心分離にかけ菌体を培養物の培養液上清
から除去する。固形硫酸アンモニウムを培養液上清に７
０％飽和まで加え、その溶液を５℃で最低３時間放置し
、粗コンドロイチナーゼを含有する沈澱物を形成させる
。この沈澱物を８０００Ｘｇで３０分間遠心分離にかけ
回収し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，４に溶解
する。この粗コンドロイチナーゼ溶液を、５℃で２４時
間、１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，４の１００容（
２回交換）に対して５℃で２４時間透析する。この透析
物を同緩衝液で平衡化した硫化セルロファインのカラム
にかけ、該酵素を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、 ｐＨ７
，４緩衝液中、０から０．３Ｍ ＮａＣ１の濃度勾配で
溶出した。約０．１１ＮａＣＩで溶出した活性分画を回
収し、アミコン門１０膜を使用して限外濾過により濃縮
した。この濃縮物は３００ｍＭのＮａＣ１を含有する５
（ｌａＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７，５で平衡化され
た５ＨＯＤＥＸ ＷＳ−２００３カラムを用い、ゲル
パーミェーション クロマトグラフで更に精製し、同緩
衝液で溶出された。こうして取得された活性フラクショ
ンは、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動による試験時に単一蛋白バンドにより示さ
れる様に、精製コンドロイチナーゼのみを含有する。
本発明において、耐熱性のコンドロイチナーゼを用いる
ことにより、低分子量コンドロイチナーゼが副生物の生
成なしに高収率で得られる。
ことにより、低分子量コンドロイチナーゼが副生物の生
成なしに高収率で得られる。
実施例１
低分子量コンドロイチン硫酸は、５０ａ＋Ｍへペスハッ
ファーに５μ１ｇ／１１１コンドロイチン硫酸（鮫軟骨
由来のタイプＣ）および５０μｇ／１ａｌｌのバチルス
属菌菌株Ｂ）ｌ １１００（ＦＥＲＰ−１０４０８）由
来精製コンドロイチナーゼを含む反応液中で調製した。
ファーに５μ１ｇ／１１１コンドロイチン硫酸（鮫軟骨
由来のタイプＣ）および５０μｇ／１ａｌｌのバチルス
属菌菌株Ｂ）ｌ １１００（ＦＥＲＰ−１０４０８）由
来精製コンドロイチナーゼを含む反応液中で調製した。
該反応液は７５℃でインキニーベートした。試料は一定
時間毎に採取し、反応終了させるためにｐ Ｈ２，０の
２０ｍＭ塩化カリウム−塩酸を添加して希釈し、２３２
ｎｍの吸光度を測定して反応の程度をモニターした。結
果を以下に示す。
時間毎に採取し、反応終了させるためにｐ Ｈ２，０の
２０ｍＭ塩化カリウム−塩酸を添加して希釈し、２３２
ｎｍの吸光度を測定して反応の程度をモニターした。結
果を以下に示す。
（本真以下余白）
１．２９
１２．７８
１５．７３
１７．０７
１９．２７
２０．７５
反応液からの各試料の一部（５μりは、同量の５０％シ
ョ糖と混合し２０％から３０％までの直線濃度勾配ポリ
アクリルアミドゲル上に重層した。電気泳動は、０．１
Ｍはう酸、０．１Ｍ）リス、０．０μＭ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ８，３（陽極バッファー）および０．２Ｍトリス、１
．２５Ｍグリシン、ｐＨ８，３（陰極バッファー）を用
いて、５０＋ｗＭ定常電流で約１時間行った。ゲル中の
反応生成物は０．０８％アズア（Ａｚｕｒｅ） Ａ水溶
液で染色した。該ゲルは蒸留水で洗浄し、反応生成物を
さらに０．５％アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ Ｂｌ
ｕｅ）の２％酢酸溶液で３０分間染色し、該ゲルは２％
酢酸で脱色した。この染色法では、高分子量コンドロイ
チン硫酸多糖鎖が低分子量オリゴ糖より強く染色される
。結果第１図に示す。低分子量コンドロイチン硫酸がコ
ンドロイチナーゼ反応の生成物として得られ、反応時間
にともなって上記反応生成物の２３２ｎｏ＋の吸光度の
増加がみられるのに応じて、生成物の平均分子量が低下
することを、この結果は示している。
ョ糖と混合し２０％から３０％までの直線濃度勾配ポリ
アクリルアミドゲル上に重層した。電気泳動は、０．１
Ｍはう酸、０．１Ｍ）リス、０．０μＭ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ８，３（陽極バッファー）および０．２Ｍトリス、１
．２５Ｍグリシン、ｐＨ８，３（陰極バッファー）を用
いて、５０＋ｗＭ定常電流で約１時間行った。ゲル中の
反応生成物は０．０８％アズア（Ａｚｕｒｅ） Ａ水溶
液で染色した。該ゲルは蒸留水で洗浄し、反応生成物を
さらに０．５％アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ Ｂｌ
ｕｅ）の２％酢酸溶液で３０分間染色し、該ゲルは２％
酢酸で脱色した。この染色法では、高分子量コンドロイ
チン硫酸多糖鎖が低分子量オリゴ糖より強く染色される
。結果第１図に示す。低分子量コンドロイチン硫酸がコ
ンドロイチナーゼ反応の生成物として得られ、反応時間
にともなって上記反応生成物の２３２ｎｏ＋の吸光度の
増加がみられるのに応じて、生成物の平均分子量が低下
することを、この結果は示している。
低分子量コンドロイチン硫酸生成物は、蒸留水で前洗浄
し溶出したセファデックスＧ−２５カラムを使用するゲ
ル濾過によってコンドロイチナーゼを除いて回収し、該
生成物は凍結乾燥により濃縮された。低分子量コンドロ
イチン硫酸の回収率は９０％であった。
し溶出したセファデックスＧ−２５カラムを使用するゲ
ル濾過によってコンドロイチナーゼを除いて回収し、該
生成物は凍結乾燥により濃縮された。低分子量コンドロ
イチン硫酸の回収率は９０％であった。
実施例２
コンドロイチン硫酸の分解反応への温度の影響を以下の
ようにして調べた。５０ｍＭへペスハッファ−ｐＨ７，
０中に５ｇ／／２コンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来のタ
イプＣ）およびバチルス属菌菌株Ｂｌ（１００（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１０４０８）由来の精製コンドロイチナーゼを
含む反応液を調製した。様々な温度における相対反応速
度は該反応液の２３２ｎｍ吸光度をモニターすることに
より測定した。結果を第２図に示す。低分子量コンドロ
イチン硫酸の生成は、５０″Ｃから９０℃までの温度範
囲内で起こり、最大反応速度は約８０℃に出現したこと
を、この結果は示している。
ようにして調べた。５０ｍＭへペスハッファ−ｐＨ７，
０中に５ｇ／／２コンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来のタ
イプＣ）およびバチルス属菌菌株Ｂｌ（１００（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１０４０８）由来の精製コンドロイチナーゼを
含む反応液を調製した。様々な温度における相対反応速
度は該反応液の２３２ｎｍ吸光度をモニターすることに
より測定した。結果を第２図に示す。低分子量コンドロ
イチン硫酸の生成は、５０″Ｃから９０℃までの温度範
囲内で起こり、最大反応速度は約８０℃に出現したこと
を、この結果は示している。
実施例３
コンドロイチン硫酸の分解反応へのｐＨの影響を以下の
ようにして調べた。様々なｐＨ値の０．２Ｍカーモデイ
（Ｃａｒｓ＋ｏｄｙ）バッファー中に５ｇ／２コンドロ
イチン硫酸（鮫軟骨由来のタイプＣ）およびバチルス属
菌菌株ＢＨ１１００（ＦＥＲＰ−１０４０８）由来の精
製コンドロイチナーゼを含む反応液を調製した。
ようにして調べた。様々なｐＨ値の０．２Ｍカーモデイ
（Ｃａｒｓ＋ｏｄｙ）バッファー中に５ｇ／２コンドロ
イチン硫酸（鮫軟骨由来のタイプＣ）およびバチルス属
菌菌株ＢＨ１１００（ＦＥＲＰ−１０４０８）由来の精
製コンドロイチナーゼを含む反応液を調製した。
様々なｐＨにおける相対反応速度は、７５℃に保持した
該反応液に２３２ｎｍ吸光度をモニターすることにより
測定した。結果を第３図に示す。低分子量コンドロイチ
ン硫酸の生成は、約ｐＨ４，０から１０までのｐＨ範囲
内で起こり、最大反応速度は約ｐＨ６，０で出現したこ
とをこの結果は示している。
該反応液に２３２ｎｍ吸光度をモニターすることにより
測定した。結果を第３図に示す。低分子量コンドロイチ
ン硫酸の生成は、約ｐＨ４，０から１０までのｐＨ範囲
内で起こり、最大反応速度は約ｐＨ６，０で出現したこ
とをこの結果は示している。
第１図は酵素反応時間と生産物の分子量との関係を示す
図、第２図はコンドロイチン硫酸の分解反応への温度の
影響を示す図、第３図はコンドロイチン硫酸の分解反応
へのｐＨの影響を示す図である。
図、第２図はコンドロイチン硫酸の分解反応への温度の
影響を示す図、第３図はコンドロイチン硫酸の分解反応
へのｐＨの影響を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、コンドロイチン硫酸をコンドロイチナーゼにより５
０〜９０℃で処理することを特徴とする低分子量コンド
ロイチン硫酸の製造方法。 ２、コンドロイチナーゼがバチルス属菌菌株ＢＨ１００
（ＦＥＲＭＰ−１０４０８）から得られるものであるこ
とを特徴とする請求項１記載の方法。 ３、コンドロイチン硫酸をバチルス属に属するコンドロ
イチナーゼ生産菌の培養物、菌体又はその処理物により
５５０〜９０℃で処理することを特徴とする低分子量ヘ
パリンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4129790A JP2825100B2 (ja) | 1990-02-23 | 1990-02-23 | 低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4129790A JP2825100B2 (ja) | 1990-02-23 | 1990-02-23 | 低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03247296A true JPH03247296A (ja) | 1991-11-05 |
| JP2825100B2 JP2825100B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
ID=12604528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4129790A Expired - Fee Related JP2825100B2 (ja) | 1990-02-23 | 1990-02-23 | 低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2825100B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2804022A1 (fr) * | 2000-01-25 | 2001-07-27 | Ctpp Cooperative De Traitement | Compose de chondroitine sulfate de bas poids moleculaire a activite dermo-cosmetique et procede de fabrication |
| EP1308155A3 (en) * | 2001-10-12 | 2003-06-04 | Nipro Corporation | Injectable solution containing a colloid of iron and shark cartilage-derived chondroitin sulfate |
| WO2006068146A1 (ja) * | 2004-12-20 | 2006-06-29 | Seikagaku Corporation | 新規コンドロイチン硫酸画分 |
| JP2008001614A (ja) * | 2006-06-20 | 2008-01-10 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | コンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤及びその製造方法 |
| JP2009297007A (ja) * | 2008-06-16 | 2009-12-24 | Makoto Yafuji | 低分子コンドロイチン硫酸の製造方法 |
| JP2010077256A (ja) * | 2008-09-25 | 2010-04-08 | Tottori Univ | コンドロイチン硫酸の低分子化物の製造方法 |
-
1990
- 1990-02-23 JP JP4129790A patent/JP2825100B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2804022A1 (fr) * | 2000-01-25 | 2001-07-27 | Ctpp Cooperative De Traitement | Compose de chondroitine sulfate de bas poids moleculaire a activite dermo-cosmetique et procede de fabrication |
| EP1308155A3 (en) * | 2001-10-12 | 2003-06-04 | Nipro Corporation | Injectable solution containing a colloid of iron and shark cartilage-derived chondroitin sulfate |
| WO2006068146A1 (ja) * | 2004-12-20 | 2006-06-29 | Seikagaku Corporation | 新規コンドロイチン硫酸画分 |
| JPWO2006068146A1 (ja) * | 2004-12-20 | 2008-06-12 | 生化学工業株式会社 | 新規コンドロイチン硫酸画分 |
| JP2008001614A (ja) * | 2006-06-20 | 2008-01-10 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | コンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤及びその製造方法 |
| JP2009297007A (ja) * | 2008-06-16 | 2009-12-24 | Makoto Yafuji | 低分子コンドロイチン硫酸の製造方法 |
| JP2010077256A (ja) * | 2008-09-25 | 2010-04-08 | Tottori Univ | コンドロイチン硫酸の低分子化物の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2825100B2 (ja) | 1998-11-18 |
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|---|---|---|---|
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