JPH03247346A - Ｔリンパ球亜分画の分離材、分離器および分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リンパ球中の特定の亜分画を分離・精製する
ためのリンパ球亜分画の分離材、分離器および分離方法
に関するものである。詳しく述べると、本発明はヒト末
梢血やリンパ系組織より得られたリンパ球浮遊液から１
９２８球中の亜分画であるＴヘルパー／インデューサー
（ＴＨｌｌ）およびＴサプレッサー／サイトトキシック
（Ｔ　ｓ、ｃ）を選択的に捕捉することのできる簡便、
迅速かつ高精度なリンパ球亜分画の分離材、分離器およ
び分離方法を示すものである。

リンパ球は、血球系の幹細胞から分化した免疫機能を担
う細胞であり、機能あるいは細胞膜形質等の点からいく
つかの亜群に分けられる。それらは、抗体を産生じ体液
性免疫を担う８９２８球、免疫調節性リンホカインや炎
症性リンホカイン等を産生じ細胞性免疫を担う１９２８
球、およびヌル細胞等のリンパ球サブクラスであり、さ
らに、Ｔ、８９２８球には、機能的に異なるサブセット
が存在する。近年、このような免疫学的特性の異なルＴ
、　　８９２８球等のサブクラスを、機能的損傷を最小
限にとどめ純粋に分離、精製、濃縮する技術が、広範囲
にわたる社会的分野で強く望まれている。例えば細胞学
、免疫学などの基礎研究においては生体内免疫系の生体
外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での解析において、少なくとも
Ｔ、　　Ｂリンパ球群までの分離が必要であり、臨床医
学における診断、治療等では、機能低下あるいは昂進し
た特定分画の移入あるいは除去が必要であり、またリン
パ系の生理活性物質の取得においては、産生細胞分画の
分離、濃縮が重要である。

（従来の技術） １９２８球と８９２８球の分離方法としては、まずソデ
ィウムメトリゾエイトフイコール混液などの高密度等張
液を用いた比重遠心法により末梢血あるいは生体組織等
からリンパ球分画を得、続いてこれを分離処理して１９
２８球と８９２８球に分離するｑが従来一般的である。

この後続する分離処理方法としては、大きく　（１）細
胞膜表面の特異抗原、レセプター、免疫グロブリンを指
標とするもの、（２）物理的細胞分離および（３）吸着
クロマトグラフィーの３つに分けられる。

（１）の方法としては、ロゼツト形成法、（抗体や免疫
複合体を結合させた）アフィニティータロマドグラフィ
ー、抗体、補体による細胞融解法、マイトジェン活性化
リンパ球の除去、フルオレセインアクチベイテッドセル
ソーター（Ｆ、Ａ、Ｃ。

Ｓ、）などが知られているが、これらの方法では、生物
学的に特異性の高い強固な結合や刺激を受けるため、イ
ンタクトな状態で１９２８球もしくは８９２８球を回収
するのが難しく、かつ大量処理に向かない手法も多い。

また、（２）の方法としては、密度勾配遠心法、細胞電
気泳動法などが知られているが、１９２８球と８９２８
球との間に比重、表面電荷等の物理的諸物性に際だった
差がないため、分離回収された細胞の収率あるいは純度
に高い精度が要求できない。さらに（３）の方法として
は、ナイロン、テトロン、綿繊維等の異物に対する１９
２８球と８９２８球の非特異的接着能力の差を利用する
ものが知られているが、高精度に分離細胞を得るために
は、吸着担体の牛胎児血清（Ｆｅ２）等による処理が必
要であることや流速などの実施条件の設定が難しく、マ
クロファージ等の不純物の混入も多い。加えて、これら
の従来の方法は、全般に、繁雑な操作、あるいは準備が
ともない、分離操作を行う場合の経験的技術的習熟が必
須であるという大きな課題も存在しているものであった
。

（発明が解決しようとする問題点） 従って、本発明は、新規なリンパ球亜分画の分離材、分
離器および分離方法を提供することを目的とする。本発
明はまた、細胞の諸活性に影響を与えることなく、簡便
かつ迅速に高収率、高純度でナチュラルキラー（ＮＫ）
あるいはＬＧＬ　［ｌａｒｇｅ　ｇｒａｎｕｌａｒ　Ｉ
ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ］系のリンパ球分画を分離・精製す
るリンパ球亜分画の分離材、分離器および分離方法を示
すものである。本発明はさらに、大量処理に適した白血
球分離材、分離器および分離方法を提供することを目的
とする。

（問題点を解決するための手段） 上記諸目的は、リンパ球分画中のＴ、、、、、およびＴ
５２．。分画を他のリンパ球分画よりも優先的に吸着さ
せる脂質を、水不溶性固体物質表面に固定化したことを
特徴とするリンパ球亜分画の分離材によって達成される
。

本発明はまた、固定化される脂質が、炭素数８〜２６の
アシル鎖を有するリン脂質であることを特徴とするリン
パ球亜分画の分離材を示すものである。本発明はさらに
、不溶性固体物質として粒径０６０５〜５ｍｍの粒子状
体を用いるものであるリンパ球亜分画の分離材を示すも
のである。本発明は、さらに水不溶性固体物質表面に導
入された疎水部として、メチレンの繰返しからなる直鎖
アルキルによる疎水結合を介して脂質を固定化すること
を特徴とするリンパ球亜分画の分離材を示すものである
。

上記諸目的はさらに、前記したようなリンパ球亜分画の
分離材を充填したカラムを有することを特徴とするリン
パ球亜分画の分離器によっても達成される。

上記諸目的はさらに、前記したようなリンパ球亜分画の
分離材に、リンパ球浮遊液を接触させ、Ｔヘルパー／イ
ンデューサーおよびＴサプレッサー／サイトトキシック
分画を効率よく捕捉させることでＮＫあるいはＬＧＬ系
のリンパ球に富む非捕捉分画を回収することを特徴とす
るリンパ球亜分画の分離方法によっても達成される。

（作用） 本発明は、リンパ球分画中のＴＨ５５，およびＴ、７゜
分画を他のリンパ球分画よりも優先的に吸着させる脂五
を、水不溶性固体物質表面に固定化したことを特徴とす
るリンパ球亜分画の分離材を用いるために、例えば該分
離材を充填したカラムにリンパ球浮遊液を注入するのみ
で、効率よ＜ＮＫあるいはＬＧＬ系のリンパ球分画を分
離・濃縮することができるものである。なお、このよう
に所定の脂質を水不溶性固体物質表面に固定化した分離
材に、Ｔ、川’およびＴ’ｓ、ｃ分画が優先的に吸着さ
れることの詳細な機序は現在のところ明らかとなってい
ない。

さらに、本発明の分離材を用いての分離操作に際して、
リンパ球浮遊液中には、ウシ胎児血清などを特に添加す
る必要もなく　（なお、場合によって添加することは可
能である。）、滅菌処理された分離材にリンパ球浮遊液
を接触させるだけで無菌的にＮＫあるいはＬＧＬ系のリ
ンパ球分画を分離回収することができ、血清を用いなく
とも回収細胞の生存率は常に９８％以上を維持すること
からリンパ球に対する刺激も極めて低いことが示唆され
るものである。

以下、本発明を実施態様に基づきより詳細に説明する。

本発明のリンパ球亜分画の分離材は、リンパ球分画中の
Ｔ□１，１および”ｒｓ、、ｃ分画を他のリンパ球分画
よりも優先的に吸着させる脂質を、水不溶性固体物質表
面に固定化したことを特徴とするものである。

本発明において用いられるリンパ球分画中のＴ、・１お
よびＴ”ｓ、ｃ分画を他のリンパ球分画よりも優先的に
吸着させる脂質としては、リン脂質、特に炭素数８〜２
６、より好ましくは炭素数１２〜２０のアシル鎖を有す
るものが用いられ得る。なお、リン脂質の親水部のリン
酸エステルを含むリン酸部分は、どのような構造を有す
るものであっても構わない。リン脂質としては天然ある
いは非天然のいずれのものであってもよく、具体的には
例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセ
ロール、ホスファチジルエタノールアミンや、糖分子を
含むホスファチジルイノシトール、ガングリオシドなど
が好適に用いられ得る。また、場合によってはアシル鎖
中に不飽和結合が存在しても構わない。

このような脂質は、水不溶性固体物質表面に直接的に固
定化され得るが、好ましくは、水不溶性固体物質表面に
導入された疎水部としての、メチレンの繰返しからなる
直鎖アルキルによる疎水結合を介して固定化されること
が望ましい。

本発明においてメチレンの繰返しからなる直鎖アルキル
としては、炭素数が４〜２６程度の各種アルキルアミン
、脂肪酸、アルコールやこれらを含む単純脂質や複合脂
質かに用いられ得、場合によっては分岐状のものであっ
てもよいが、好ましくは、メチレンの繰返しが２６以下
の直鎖状のもの、特にメチレンの繰返しが８〜２０程度
のものがより高い特性を付与することができるために望
ましい。

このような直鎖アルキルは、例えば、多感応性エポキシ
ド、アルデヒド、カルボジイミドなどの公知のカップリ
ング剤を用いて水不溶性担体表面に導入され得る。特に
水不溶性担体として、後述するようにガラスピーズを用
いた場合には、例えばオクタデシルジメチル［３−（）
リメトキシシリル）プロピル］アンモニウムクロライド
などのシランカップリング剤を用いれば、容易に直鎖ア
ルキルを導入できる。

そしてこのように直鎖アルキルを表面に導入された水不
溶性担体は、疎水結合によって容易に上記したような脂
質を固定化できる。

本発明において用いられる担体としての水不溶性固体物
質としては、アガロース系、デキストラン系、セルロー
ス系、ポリアクリルアミド系、ポリビニルアルコール系
、ポリビニルピロリドン系、ポリアクリロニトリル系、
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリスチレン系
、アクリル酸エステル系、メタクリル酸エステル系、ポ
リエチレン系、ポリプロピレン系、ポリ４−フッ化エチ
レン系、エチレン−酢酸ビニル共重合体系、ポリアミド
系、ポリカーボネート系、ポリフッ化ビニリデン系、ポ
リビニルホルマール系、ボリアリレート系、ポリエーテ
ルスルフォン系などの有機高分子、ガラス系、アルミナ
系、チタン系、活性炭系、セラミックス系などの無機物
などが挙げられるが、特に細胞接着性の高すぎないもの
、すなわち、細胞−担体間の相互作用が比較的穏やかな
ものが好まれる。また、生体由来の天然有機高分子であ
るコラーゲン、キトサン等も用いられ得る。このような
水不溶性固体物質の形態としては、特に限定されず、平
板上のものも用いることができるが、好ましくは、粒子
状、特に平均粒径が０．０５〜５＋＋ｍの粒子状のもの
が望ましい。なお平均粒径はＪ　ｌ５−Ｚ−８８０１に
規定されるフルイを用いて分級した後、各級の上限粒径
と下限粒径の中間値を各級の粒径とし、その重量平均と
して算出したものである。さらに粒子形状は細胞に物理
的な損傷を与えにくいことや均一な粒子を得やすい等の
点から球形のものが好ましい。

本発明のリンパ球亜分画の分離器は、上記のごときリン
パ球分画中のＴＨ，’ｌおよびＴ５．、、Ｃ分画を他の
リンパ球分画よりも優先的に吸着させる脂質を、水不溶
性固体物質表面に固定化したことを特徴とするリンパ球
亜分画の分離材を充填したカラムを有することを特徴と
するものである。

本発明のリンパ球亜分画の分離材をリンパ球浮遊液に接
触させるには、例えば、平板状のリンパ球亜分画の分離
材にリンパ球浮遊液を接触させて行なうことも可能であ
るが、上記のごとき分離材の表面上に存在して細胞吸着
に作用する疎水性サイトの絶対量や十分な細胞吸着スペ
ースを獲得するという点から、粒子状の分離材を充填し
てなるカラムを有する分離器を用いて接触させることが
望ましい。

この粒子状の分離材を充填してなるカラムを有するリン
パ球亜分画の分離器において、カラム容器を構成する材
質としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカー
ボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等
の合成樹脂、ガラスおよびステンレス等の金属などが使
用できるが、オートクレーブ滅菌が可能で取り扱いやす
いポリプロピレンやポリカーボネート等が特に好ましい
。

またこのリンパ球亜分画の分離器のカラムの出入口とリ
ンパ球亜分画の分離材を充填した分離材層との間には、
リンパ球浮遊液中の細胞成分は通過するが分離材は通過
できない網目を有するフィルターを備えていることが好
ましく、このフィルターを構成する材質としては、生理
学的に不活性で強度の高いものであればよいが、特にポ
リエステル、ポリアミドであることが好まれる。

第１図は本発明のリンパ球亜分画の分離器の一実施態様
の使用状態における模式図である。第１図に示す実施態
様において、カラム１は、両端部が開口され、かつ下端
開口部のやや上方の部位より流出口５となる下端開口部
までは漸次縮径され先細とされた管形状のものであり、
さらにこの先細部７には三方活栓４が備えられ、流出口
５に至る流路を開閉可能なものとしている。このカラム
１の前記先細部７より上方の実径部６内には上記のごと
き本発明のリンパ球亜分画の分離材２が充填されており
、この分離材２は、カラム１の実径部６の上方に設けら
れたフィルター３および下端に設けられたフィルター３
′によってカラム１内に保持され分離材層を形成してい
る。

また本発明のリンパ球亜分画の分離方法は、上記のごと
きリンパ球分画中のＴＨ／Ｘおよび’ｒ、Ｃ分画を他の
リンパ球分画よりも優先的に吸着させる脂質を、水不溶
性固体物質表面に固定化したことを特徴とするリンパ球
亜分画の分離材に、リンパ球浮遊液を接触させ、Ｔヘル
パー／インデューサーおよびＴサプレッサー／サイトト
キシック分画を効率よく捕捉させることでＮＫあるいは
ＬＧＬ系のリンパ球に富む非捕捉分画を回収することを
特徴とするものである。

本発明のリンパ球亜分画の分離方法を、前記第１図に示
す分離器を用いた場合を例にとり、より具体的に説明す
ると、まず末梢血平衡塩溶液に浮遊させたリンパ球液あ
るいは動物血漿に再浮遊させたリンパ球液などのリンパ
球浮遊液を、リンパ球亜分画分離材２を充填してなるカ
ラム１内に注入して静置する。

ここで、リンパ球浮遊液の通液方法は、特に限定される
ものではなく、必要に応じて連続あるいは非連続にして
もよい。

このようにしてカラム１内において、リンパ球浮遊液を
分離材２と所定時間接触させた後、各種ポンプあるいは
ピペット等を用いてカラム１内にリンス液を注入し、三
方活栓４を開いて、流出口５から静かに洗浄液を落下さ
せ、試験管８などで回収する。

これにより分離材２に吸着されなかったＮＫあるいはＬ
ＧＬ系のリンパ球分画を多く含む非捕捉分画を回収する
ことができる。

なお、この洗浄操作の隙用いられるリンス液としては、
分離材２に吸着された細胞成分を溶離することなく、吸
着されなかった細胞成分を洗い落とすことを目的とする
ものであるために、活性の低いものが望まれ、平衡塩溶
液、細胞培養液等が用いられ、好ましくは２価カチオン
フリーの平衡塩溶液、例えばハンクス平衡塩溶液（Ｈａ
ｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔ１
ｏｎ：　ＨＢＢＳ　）などが用いられる。

（実施例） 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

比較例１ 水不溶性担体として、オキシラン基を有するアクリルビ
ーズ［オイバーキッドＣ（ＥＣ）、φ１５０μｍ、オキ
シラン基含４１２００　μｍｏｌ　／ｇ（ｗｅｔ）レー
ム　ファル？　［Ｒ’６ｈｍ　Ｐｈａｒｍａ　］社製］
を用いて、テトラデシルアミンンを固定化した疎水性ビ
ーズを調製した。

まず、ＥＣを蒸溜水で洗浄し、ジメチルホルムアミド（
ＤＭＦ）を用いて調製された０、２Ｍのテトラデシルア
ミン溶液に添加し、８０℃の水浴中で３時間加温した後
に、６０℃のオーブン中に約２０時間静置した。

調製された反応物を、ＤＭＦ、ジメチルスルフオキシド
（ＤＭＳＯ）　、および水の順で洗浄し、ＤＭＳＯとリ
ン酸緩衝液（０，１Ｍ　　ｐＨ７，４）を順次用いて１
２１℃、３０分でオートクレーブ処理した。

このようにして得られた分離材をハンクス平衡塩溶液（
ＨＢＳＳＳｐＨ７，４）に分散させ、ポリプロピレン製
カラムに湿潤状態で１．Ｏｍｌとなるように充填した。

次に、正常人より採取した新鮮面２ｍｌをカラムに注入
し、連続的に流出させた。そしてこのカラム内を１ｍ１
以上のハンクス平衡塩溶液などをを用いて直ちに洗浄し
リンパ球を回収した。

回収された分画中の細胞数、単球とリンパ球の割合、お
よびＴ、Ｂリンパ球の割合は、自動血球計数器（オルソ
　インスツルメンツ［０ＲＴＨＯＩＮｓＴＲＵＭＥＮＴ
Ｓ１社製、ＥＬＴ−８）と自動細胞分析装置（日本分光
■製、Ｃｙｔｏ　　ＡＣＥ−１００）と螢光標識された
抗１ｅｕ抗体（ベクトン　ディッキンソン社製）を用い
て評価した。これらの測定結果に基づき分離材への細胞
付着率を算出した。

結果を第１表に示す。

実施例１ 比較例１で調製された疎水性ビーズを用いてリン脂質固
定化ビーズを作成した。

まずテトラデシルアミン結合ビーズをクロロホルム溶液
を用いたホスファチジルグリセロール（日本精化■製）
（アシル鎖の炭素数が１６で、不飽和結合を１個含有す
る。）溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）に添加し、−時間攪拌の
後、減圧乾燥した。

この後、１５ｇのビーズあたり１ｇの水を用いて洗浄し
、１日間水中に保存し、実験に供した。

リンパ球分離実験および分離能の評価は、比較例１の手
順に従って、行なわれた。その結果を第１表に示す。

実施例２ 固定化するリン脂質をホスファチジルコリン（シグマ社
製）（アシル鎖の炭素数１６）に代える以外は実施例１
の方法に従って、リン脂質固定化ビーズを作成し、同様
の実験に供した。結果を第１表に示す。

実施例３ 固定化するリン脂質をガングリオシド（シグマ社製）（
ウシ脳由来）に代える以外は実施例１の方法に従って、
リン脂質固定化ビーズを作成し、同様の実験に供した。

結果を第１表に示す。

実施例４ 固定化するリン脂質をホスファチジルイノシトール（シ
グマ社製）（ダイズ由来）に代える以外は実施例１の方
法に従って、リン脂質固定化ビーズを作成し、同様の実
験に供した。結果を第１表に示す。

付着率（％） 総出血球 ・単球 リンパ幻 カラム通過前 比較例１ 実施例１ 実施例２ 実施例３ 実施例４ 各個は、 １５．９　　　　１．０５０．０ ２１．６　　　７．６５３．６ Ｂ１．１　　１８．９　５８．９ ２１．８　　１９．０　４４．７ ２５．５　　１１．９　５６．７ それぞれ５個のデータの平均値である。

第１表 （ １０゜ １３゜ ７５゜ （発明の効果） 以上述べたように本発明は、リンパ球分画中のＴＨ，、
およびＴ　Ｓ／Ｃ分画を他のリンパ球分画よりも優先的
に吸着させる脂質を、水不溶性固体物質表面に固定化し
たことを特徴とするリンパ球亜分画の分離材であるから
、リンパ球浮遊液から選択的にＴＨ／ｌ　　（ＣＤ４陽
性）およびＴ５／、ｃ　（ＣＤ８陽性）分画吸着するた
め、リンパ球浮遊液からの簡便かつ迅速なＮＫあるいは
ＬＧＬ系のリンパ球分画の分離１．濃縮を可能にするこ
とができることが明らかになった。従って、本発明のリ
ンパ球亜分画の分離材は免疫機能に関連した白血球並分
画の細胞間相互作用の解析、リンパ球由来の生理活性物
質を効率的に得るための基礎技術、さらには各種免疫疾
患の治療に応用できることを示すとともに、本発明の分
離材によって、特殊な生理活性物質を用いることなく、
精度の高いＴリンパ球亜分画分離が達成できることも示
された。

さらに本発明はまた、固定化される脂質が、炭素数８〜
２６のアシル鎖を有するリン脂質であり、また、不溶性
固体物質として粒径０．０５〜５ｍｍの粒子状体を用い
、さらに水不溶性固体物質表面に導入された疎水部とし
て、メチレンの繰返しからなる直鎖アルキルによる疎水
結合を介して脂質を固定化するものであると、より効率
のよいリンパ球亜分画分離操作が可能となるものである
。

本発明はまた、前記したようなリンパ球分画中のＴＨ２
，１およびＴ　Ｓ／Ｃ分画を他のリンパ球分画よりも優
先的に吸着させる脂質を、水不溶性固体物質表面に固定
化したことを特徴とするリンパ球亜分画の分離材を充填
したカラムを有することを特徴とするリンパ球亜分画の
分離器であるから、上記のごとく優れた特性を有するリ
ンパ球亜分画の分離材と血球浮遊液との接触をより効率
よく行なうことができ、リンパ球亜分画の分離操作を短
時間でかつ守備よ〈実施することが可能となるものであ
る。

本発明はさらに、リンパ球分画中のＴ、、、、、および
Ｔｓｃ分画を他のリンパ球分画よりも優先的に吸着させ
る脂質を、水不溶性固体物質表面に固定化したことを特
徴とするリンパ球亜分画の分離材、リンパ球浮遊液を接
触させ、Ｔヘルパー／インデューサーおよびＴサプレッ
サー／サイトトキシック分画を効率よく捕捉させること
でＮＫあるいはＬＧＬ系のリンパ球に富む非捕捉分画を
回収することを特徴とするリンパ球亜分画の分離方法で
あるから、従来の分離法に比べ、操作の習熟を必要とし
ないでＮＫ系あるいはＬＧＬ系のリンパ球を分離・濃縮
することができ、さらに安価で、際だった細胞損傷も一
切与えないことから、極めて有用な技術であると言うこ
とができるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のリンパ球亜分画の分離器の一実施態様
の使用状態における模式図である。 １・・・カラム、　２・・・リンパ球亜分画の分離材、
３．３′・・・フィルター、　４・・・三方活栓、５・
・・流出口、　６・・・実径部、　７・・・縮径部、８
・・・試験管。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）リンパ球分画中のＴヘルパー／インデューサーお
   よびＴサプレッサー／サイトトキシック分画を他のリン
   パ球分画よりも優先的に吸着させる脂質を、水不溶性固
   体物質表面に固定化したことを特徴とするリンパ球亜分
   画の分離材。
2. （２）固定化される脂質が、炭素数８〜２６のアシル鎖
   を有するリン脂質であることを特徴とする請求項１に記
   載のリンパ球亜分画の分離材。
3. （３）不溶性固体物質として粒径０．０５〜５ｍｍの粒
   子状体を用いるものである請求項１または２のいずれか
   に記載のリンパ球亜分画の分離材。
4. （４）水不溶性固体物質表面に導入された疎水部として
   、メチレンの繰返しからなる直鎖アルキルによる疎水結
   合を介して脂質を固定化することを特徴とする請求項１
   〜３のいずれかに記載のリンパ球亜分画の分離材。
5. （５）請求項１〜４のいずれかに記載のリンパ球亜分画
   の分離材を充填したカラムを有することを特徴とするリ
   ンパ球亜分画の分離器。
6. （６）請求項１〜４のいずれかに記載のリンパ球亜分画
   の分離材に、リンパ球浮遊液を接触させ、Ｔヘルパー／
   インデューサーおよびＴサプレッサー／サイトトキシッ
   ク分画を効率よく捕捉させることでＮＫあるいはＬＧＬ
   系のリンパ球に富む非捕捉分画を回収することを特徴と
   するリンパ球亜分画の分離方法。