JPH037165A - リンパ球亜群の分離材、分離器および分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リンパ球中の特定の亜群を分離・精製するた
めのリンパ球亜群の分離材、分離器および分離方法に関
するものである。詳しく述べると、本発明はヒトあるい
は非ヒト動物山来の白血球分画から簡便、迅速かつ安価
に高い純度のリンパ球亜群を分離・精製するリンパ球亜
群の分離材、分離器および分離方法を示すものである。

リンパ球は、血球系の幹細胞から分化した免疫機能を担
う細胞であり、機能あるいは細胞膜形質等の点からいく
つかの亜群に分けられる。それらは、抗体を産生じ体液
性免疫を担う８１２８球、免疫調節性リンホカインや炎
症性リンホカイン等を産生じ細胞性免疫を担うＴリンパ
球、およびヌル細胞等のリンパ球サブクラスであり、さ
らに、Ｔ、　　８１２８球には、機能的に異なるサブセ
ットが存在する。近年、このような免疫学的特性の異な
るＴ、８１２８球等のサブクラスを、機能的損傷を最小
限にとどめ純粋に分離、精製、濃縮する技術が、広範囲
にわたる社会的分野で強く望まれている。例えば細胞学
、免疫学などの基礎研究においては生体内免疫系の生体
外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での解析において、少なくとも
Ｔ、Ｂリンパ球Ｒｆまでの分離が必要であり、臨床医学
における診断、治療等では、機能低下あるいは昂進した
特定分画の移入あるいは除去が必要であり、またリンパ
系の生理活性物質の取得においては、産生細胞分画の分
離、濃縮が重要である。

（従来の技術） Ｔリンパ球と８１２８球の分離方法としては、まずソデ
ィウムメトリゾエイトフイコール混液などの高密度等張
液を用いた比重遠心法により末梢血あるいは生体組織等
からリンパ球分画を得、続いてこれを分離処理してＴリ
ンパ球と８１２８球に分離するのが従来−射的である。

この後続する分離処理方法としては、大きく　（１）細
胞膜表面の特異抗原、レセプター、免疫グロブリンを指
標とするもの、（２）物理的細胞分離および（３）吸着
クロマトグラフィーの３つに分けられる。

（１）の方法としては、ロゼツト形成法、（抗体や免疫
複合体を結合させた）アフィニティータロマ！・グラフ
ィー、抗体、補体による細胞融解法、マイトジェン活性
化リンパ球の除去、フルオレセインアクチベイテッドセ
ルソータ−（Ｆ、Ａ、Ｃ。

Ｓ、）などが知られているが、これらの方法では、生物
学的に特異性の高い強固な結合や刺激を受けるため、イ
ンタクトな状態でＴリンパ球もしくは８１２８球を回収
するのが難しく、かつ大量処理に向かない手法も多い。

また、（２）の方法としては、密度勾配遠心法、細胞電
気泳動法などが知られているが、Ｔリンパ球と８１２８
球との間に比重、表面電荷等の物理的諸物性に際だった
差がないため、分離回収された細胞の収率あるいは純度
に高い精度が要求できない。さらに（３）の方法として
は、ナイロン、テトロン、綿繊維等の異物に対するＴリ
ンパ球と８１２８球の非特異的接着能力の差を利用する
ものが知られているが、高精度に分離細胞を得るために
は、吸着担体の牛胎児血清（Ｆｅ２）等による処理が必
要であることや流速などの実施条件の設定が難しく、マ
クロファージ等の不純物の混入も多い。加えて、これら
の従来の方法は、全般に、繁雑な操作、あるいは準備が
ともない、分離操作を行う場合の経験的技術的習熟が必
須であるという大きな課題も存在しているものであった
。

（発明が解決しようとする問題点） 従って、本発明は、新規なリンパ球亜群の分離器、分離
器および分離方法を提供することを目的とする。本発明
はまた、細胞の諸活性に影響を与えることなく、簡便か
つ迅速に高収率、高純度でリンパ球を分離・精製するリ
ンパ球亜群の分離材、分離器および分離方法を示すもの
である。本発明はさらに、大量処理に適した白血球分離
材、分離器および分離方法を提供することを目的とする
。

（問題点を解決するための手段） −に２諸目的は、リンパ球中のＴリンパ球分画を他のリ
ンパ球分画よりも優先的に吸着させるアルキル鎖を、親
水的な分子構造を含むスペーサーを介して水不溶性固体
物質表面に固定化したことを特徴とするリンパ球亜群の
分離材により達成される◇　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　。

本発明はまた、前記アルキル鎖におけるメチレンの繰返
しが２５以下であるリンパ球亜群の分離材を示すもので
ある。本発明はさらに前記アルキル鎖が直鎖アルキル鎖
であるリンパ球亜群の分離材を示すものである。本発明
はさらに、スペーサーが親水部と疎水部とを有するもの
であるリンパ球亜群の分離材を示すものである。本発明
はまた不溶性固体物質として粒径０．０５〜５ｍｍの粒
子状体を用いるものであるリンパ球亜群の分離材を示す
ものである。

」−記諸目的はまた、リンパ球中のＴリンパ球分画を他
のリンパ球分画よりも優先的に吸着させるアルキル鎖を
、親水的な分子構造を含むスペーサーを介して水不溶性
固体物質表面に固定化したことを特徴とするリンパ球亜
群の分離材を充填したカラムを有することを特徴とする
リンパ球亜群の分離器により達成される。

本発明はまたカラムの出入口と分離材層との間にはリン
パ球分画液中の細胞成分は通過するが分離材は通過でき
ない網目を何するフィルターを備えてなるものであるリ
ンパ球亜群の分離器を示すものである。

、に２諸目的はさらに、リンパ球中のＴリンパ球分画を
他のリンパ球分画よりも優先的に吸着させるアルキル鎖
を、親水的な分子構造を含むスペーサーを介して水不溶
性固体物質表面に固定化したことを特徴とするリンパ球
亜群の分離材に、ヒトあるいは非ヒト動物山来のリンパ
球分画を接触させ、−ｆ、ｘ泥分離材にＴリンパ球を効
率よく捕捉させることでＢリンパ球に富む非捕捉分画液
を分離回収することを特徴とするリンパ球亜群の分離方
法を示すものである。

（作用） 本発明は、リンパ球中のＴリンパ球分画を他のリンパ球
分画よりも優先的に吸着させるアルキル鎖を、親水的な
分子構造を含むスペーサーを介して水不溶性固体物質表
面に固定化したことを特徴とするリンパ球亜群の分離材
を用いるために、ヒトあるいは非ヒト動物山来リンパ球
浮遊液を直接上記分離材に接触させただけで、効率よ＜
、Ｔ、Ｂリンパ球を分離・精製あるいは除去することが
できるものである。

すなわち、本発明のリンパ球亜群の分離材にリンパ球浮
遊液を接触させると、リンパ球の中でも異物に対する接
着において疎水的相互作用の寄与が比較的高いＴリンパ
球は、前記吸着剤の末端部に存在する疎水性の高いアル
キル鎖に効率よく吸着され、・一方、異物に対する疎水
的相互作用の寄与がより低いＢリンパ球は、水不溶性担
体と末端部のアルキル鎖との間に介在するスペーサーが
、その分子運動によって細胞が分離材表面に接近して相
互作用することを妨げるために、吸着材に対する付着が
抑制され、Ｔリンパ球の選択的な付着が達成されるもの
と考えられる。

さらに、本発明の分離材は、有機合成された物質を結合
させたものであるために、安定性が高く、複数回のオー
トクレーブ処理にも耐え、また経済性、多量生産性の面
でも優れたものとなる。さらに、本発明の分離材を用い
ての分離操作に廃して、リンパ球浮遊液中には、ウシ胎
児血清などを特に添加する必要もなく　（なお、場合に
よって添加することは可能である。）、滅菌処理された
分離材にリンパ球浮遊液を接触させるだけで無菌的にＢ
リンパ球に富む非捕捉分画液を分離回収することができ
、血清を用いなくとも回収細胞の生存率は常に９７％以
上を維持することからリンパ球に対する刺激も極めて低
いことが示唆されるものである。

以下、本発明を実施態様に基づきより詳細に説明する。

本発明のリンパ球亜群の分離材は、リンパ球中のＴリン
パ球分画を他のリンパ球分画よりも優先的に吸着させる
アルキル鎖を、親水的な分子構造をＡむスペーサーを介
して水不溶性固体物質表面に固定化したことを特徴とす
るものである。

本発明において用いられる疎水的アルキル鎖としては、
種々の鎖長のアルキル鎖を用いることができ、場合によ
っては分岐状のものであってもよいが、好ましくは、メ
チレンの繰返しが２５以下の直鎖状のもの、特にメチレ
ンの繰返しが２〜１４程度のものがより高い特性を付与
することができるために望ましい。またその原料として
も、アルキルアミン類、脂肪酸類、アルコール類やこれ
らを含む単純脂質や複合脂質などの各種の化合物を用い
ることができる。しかしながら、これらの原料化合物の
有するＯＨ基、ＮＨ２基、Ｃ０ＯＨ基などの親水性基は
後述するスペーサーとの結合において消費され、末端側
にはアルキル鎖が露出していることが必要である。

また、本発明の分離材において用いられる親水的な分子
構造を含むスペーサーとは、分子状をなし、水不溶性担
体表面と末端のアルキル鎖との間に介在して任意の長さ
を設けることのできるものであって、末端に存在する疎
水的なアルキル鎖どうしの強い分子間相互作用を抑制す
るものであればどのような貴格構造を有するものでもよ
い。例えば、カルボキシル基、スルホン基および種々の
アミン類などの解離性の官能基、および水酸基、または
エーテル結合などのうち、いずれかのものがスペーサー
分子内に単独あるいは複合して存在していればよい。水
不溶性担体とアルキル鎖との間にこのようなスペーサー
が介在していると、スペーサーの分子運動性によって、
細胞が分離材表面に接近して相互作用することが妨げら
れ、この結果、分離材との相互作用力の弱いＢリンパ球
の接層が優先的に抑制されるものと考えられる。

このようなスペーサーは、分子鎖の両端に有していたエ
ポキシ基やイソチオシアネート基等の公知の反応性官能
基を水不溶性担体表面および前記のごとき末端アルキル
鎖を形成する化合物にそれぞれ反応させて分子鎖の一端
において水不溶性担体表面に、他端においてアルキル鎖
に共有結合しているものである。またジアミン系、ジカ
ルボン酸系のスペーサー分子をビスエポキシド、ジイソ
シアネート、ジアルデヒドなどのカップリング剤で固定
化しても同等の効果を維持する。

このうち、特に、メチレンの繰返しが２〜８個である直
鎖アルキルジオール、エチレンオキシドの繰返しが２〜
２５である直鎖エーテル、あるいはアミン含有率が８５
％以下であるジエチレントリアミン、トリエチレンテト
ラミン等の直鎖状アミン含有化合物などが取扱いが容易
で好適に用いられる。これらは複合して用いることも可
能であり、むしろより良好な特性を得られる場合が多い
。

なお、より疎水的な水不溶性固体物質を担体として用い
る場合、アルキル鎖との疎水結合によって分子運動性が
制限され、Ｂリンパ球の付着抑制効果が失われることが
あるので、その場合より親水的なスペーサーを選択する
必要がある。

本発明において用いられる担体としての水不溶性固体物
質としては、アガロース系、デキストラン系、セルロー
ス系、ポリアクリルアミド系、ポリビニルアルコール系
、ポリビニルピロリドン系、ポリアクリロニトリル系、
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリスチレン系
、アクリル酸エステル系、メタクリル酸エステル系、ポ
リエチレン系、ポリプロピレン系、ポリ４−フッ化エチ
レン系、エチレン−酢酸ビニル共重合体系、ポリアミド
系、ポリカーボネート系、ポリフッ化ビニリデン系、ポ
リビニルホルマール系、ボリアリレート系、ポリエーテ
ルスルフォン系などのｈ″機高分子、ガラス系、アルミ
ナ系、チタン系、活性炭系、セラミックス系などの無機
物などが挙げられるが、特に細胞接着性の高すぎないも
の、すなわち、細胞−担体間の相互作用が比較的穏やか
なものが好まれる。また、生体由来の天然有機高分子で
あるコラーゲン、キトサン等も用いられ得る。このよう
な水不溶性固体物質の形態としては、特に限定されず、
平板上のものも用いることができるが、好ましくは、粒
子状、特に平均粒径が０．０５〜５ｍｍの粒子状のもの
が望ましい。なお平均粒径はＪ　ｌ５−Ｚ−８８０１に
規定されるフルイを用いて分級した後、各級の上限粒径
と下限粒径の中間値を各級の粒径とし、その重量平均と
して算出したものである。さらに粒子形状は細胞に物理
的な損傷を与えにくいことや均一な粒子を寿やすい等の
点から球形のものが好ましい。

本発明のリンパ球亜群の分離器は、上記のごときリンパ
球中のＴリンパ球分画を他のリンパ球分画よりも優先的
に吸着させるアルキル鎖を、親水的な分子構造を含むス
ペーサーを介して水不溶性固体物質表面に固定化したこ
とを特徴とする分離材を充填したカラムを有することを
特徴とするものである。

本発明のリンパ球亜群の分離材をリンパ球浮遊液に接触
させるには、例えば、平板状のリンパ球亜群の分離材に
リンパ球浮遊液を接触させて行なうことも可能であるが
、上記のごとき分離材の表面上に存在して細胞吸着に作
用する疎水性サイ！・の絶対量や十分な細胞吸着スペー
スを５ｉ寿するという点から、粒子状の分離材を充填し
てなるカラムを有する分離器を用いて接触させることが
望ましい。

この粒子状の分離材を充填してなるカラムをＨするリン
パ球亜群の分離器において、カラム容器を構成する材質
としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボ
ネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の
゛合成樹脂、ガラスおよびステンレス等の金属などが使
用できるが、オー！・クレープ滅菌が可能で取り扱いや
すいポリプロピレンやポリカーボネート等が特に好まし
い。

またこのリンパ球亜群の分離器のカラムの出入口とリン
パ球亜群の分離材を充填した分離材層との間には、リン
パ球浮遊液中の細胞成分は通過するが分離材は通過でき
ない網目を有するフィルターを備えていることが好まし
く、このフィルターを構成する材質としては、生理学的
に不活性で強度の高いものであればよいが、特にポリエ
ステル、ポリアミドであることが好まれる。

第１図は本発明のリンパ球亜群の分離器の一実施態様の
使用状態における模式図である。第１図に示す実施態様
において、カラム１は、両端部が開口され、かつ下端開
口部のやや上方の部位より流出口５となる下端開口部ま
では漸次縮径され先細とされた管形状のものであり、さ
らにこの先細部７には三方活栓４が備えられ、流出口５
に至る流路を開閉可能なものとしている。このカラム１
の前記先細部７より上方の実径部６内には−１−記のご
とき本発明のリンパ球亜群の分離器２が充填されており
、この分離材２は、カラム１の大径部６のに三方に設け
られたフィルター３および下端に設けられたフィルター
３′によってカラム１内に保持され分離材層を形成して
いる。

また本発明の白血球分離法は、上記のごときリンパ球中
のＴリンパ球分画を他のリンパ球分画よりも優先的に吸
着させるアルキル鎖を、親水的な分子構造を含むスペー
サーを介して水不溶性固体物質表面に固定化したことを
特徴とする分離材に、ヒトあるいは非ヒト動物山来のリ
ンパ球分画を接触させ、上記分離材にＴリンパ球を効率
よく捕捉゛させることでＢリンパ球に富む非捕捉分画液
を分離回収することを特徴とするものである。

本発明のリンパ球亜群の分離方法を、前記第１図に示す
分離器を用いた場合を例にとり、より具体的に説明する
と、まず平衡塩溶液に浮遊させたリンパ球液あるいは動
物血漿に再浮遊させたリンパ球液などのリンパ球浮遊液
を、リンパ球亜群分離材２を充填してなるカラム１内に
注入し、リンパ球浮遊液をリンパ球亜群分離材２と接触
さ゛せる。

ここで、リンパ球浮遊液の通液方法は、特に限定される
ものではなく、必要に応じて連続あるいは非連続にして
もよい。

このようにしてカラム１内において、リンパ球浮遊液を
分離材２と所定時間接触させた後、各種ポンプあるいは
ピペット等を用いてカラム１内にリンス液を注入し、三
方活栓４を開いて、流出口５から静かに洗浄液を落下さ
せ、試験管８などで回収する。

これにより分離材２に吸着されなかったＢリンパ球を多
く含む非捕捉分画を回収することができる。

なお、この洗浄操作の際用いられるリンス液としては、
分離材２に吸着された細胞成分を溶離することなく、吸
着されなかった細胞成分を洗い落とすことを目的とする
ものであるために、活性の低いものが望まれ、平衡塩溶
液、細胞培養液等が用いられ、好ましくは２価カチオン
フリーの平衡塩溶液、例えばハンクス平衡塩溶液（Ｉｌ
ａｎｋ’ｓ　ｂａｔａｎｃｃｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔ
ｉｏｎ：　ＩＩＢＢＳ　）などが用いられる。

（実施例） 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

実施例１ 水不溶性固体物質として、オキシラン基を有するキトサ
ンビーズ［キトパール　ＥＰ−８１０（ＩＥＩ）−Ｃ）
、φ３００μｍ、オキシラン基ａｆｆｉ０．　１２ｍｍ
ｏｌ／ｇ（Ｗｅｌ）　　富士紡績■製］を用い、スペー
サーとしてトリエチレンテトラミン（Ｔ　Ｅ　Ｔ）とブ
タンジオール（ＢＤＯ）を介して、メチレンの繰返しが
２であるアルキル鎖を疎水性末端として固定化した。

まず、０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ１０）を用いて０．
２ＭのＴＥＴ溶液を調製し、蒸溜水洗浄したＥＰ−Ｃを
０．　３〜０．　５ｇ（ｗｃｌ）／ｍｌの割合で投入し
した。これを８０°Ｃの水浴中で３時間加温した後に、
ブラッドミキサー（萱垣医理科Ｔ業製、ＢＭ−１０１）
を使用して室温で約２０時間撹拌した。次に反応物を蒸
留水で洗浄し、０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ１０）を用
いて調製された５　ｗ／ｗ％のブタンジオールジグリシ
ジルエーテル溶液に添加し、８，０℃の水浴中で３時間
加温した後にブラッドミキサーを使用して室温で約２０
時間攪拌した。この後、０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ１
０）を用いて調製された０、２Ｍのエチルアミン溶液に
洗浄された反応物を添加し、８０°Ｃの水浴中で３時間
加温した後に、ブラッドミキサーを使用して室温で約２
０時間攪拌した。次いで、未反応のオキシラン基を除去
するため、濃度１Ｍ　（ｐＨ８）のエタノールアミン溶
液に蒸留水洗浄した固定化ビーズを添加し、約２０時間
撹拌した。最後に、酢酸緩衝液（０，１Ｍ　　ｐＨ４）
、リン酸緩衝液（０，１Ｍ　　ｐＨ７，４）を順次用１
．５１２１°Ｃ１３０分でオートクレーブ処理した。

このようにして得られた分離材をハンクス平衡塩溶液（
ＨＢＳＳＳｐＨ７，４）に分散させ、ポリプロピレン製
カラムに湿潤状態で１．５ｍｌとなるように充填した。

次に、マウス（ＩＣＲ，８Ｍ令以上）の１坪臓より採取
したリンパ球をＲＰＭＩ　　１６４０　（日永製薬■製
）に懸濁させ濃縮し、２Ｘ１０７個以上の細胞を含む懸
濁液全体を分離材に浸した。そしてこのカラム内を１ｍ
１以上のＲＰＭＩ　　１６４０を用いて直ちに洗浄しリ
ンパ球を回収した。

回収された分画中の細胞数、単球とリンパ球の割合、お
よびＴＳＢリンパ球の割合は、自動血球計数器（オルソ
　インスツルメンツ［ＯＲ１’ｌＩＯＩＮＳＴＲＬＩＭ
ＥＮ’ｌ’Ｓ］社製、ＥＬＴ−８）と自動細胞分析装置
（日本分光■製、Ｃｙｔｏ　　ＡＣＥ−１００）と螢光
標識された抗マウスＩｇ抗体（ベクトン　ディッキンソ
ン社製）を用いて評価した。これらの測定結果に基づき
分離材への細胞付着率を算出した。結果を第１表に示す
。

実施例２ エチルアミンに代えてヘキシルアミンを用いる以外は実
施例１の方法に準じて、メチレンの繰返しが６である直
鎖アルキル鎖を疎水性末端として固定化したビーズを作
成し、実施例１と同様のリンパ球分離実験を行なった。

得られた結果を第１表に示す。

実施例３ エチルアミンに代えてデシルアミンを用い、また溶媒を
１００％ジメチルホルムアミドに代える以外は実施例１
の方法に準じて、メチレンの繰返しが１０である直鎖ア
ルキル鎖を疎水性末端として固定化したビーズを作成し
、実施例１と同様のリンパ球分離実験を行なった。得ら
れた結果を第１表に示す。

実施例４ デシルアミンに代えてテトラデシルアミンを用いる以外
は実施例３の方法に準じて、メチレンの繰返しが１４で
ある直鎖アルキル鎖を疎水性末端として固定化したビー
ズを作成し、実施例１と同様のリンパ球分離実験を行な
った。得られた結果を第１表に示す。

比較例１ 未処理のキトサンビーズ［キトパール　３０１０（Ｃ１
１）、φ３００μｍ、富士紡績■製］そのものを用い、
実施例１と同様のリンパ球分離実験を行なった。得られ
た結果を第１表に示す。

比較例２ オキシラン基を有するキ！・サンビーズしキトパール　
臼）−８１０（ＩＥＰ−Ｃ）、φ３００μｍ、オキシラ
ン基３量０．　１２ｍｍｏｌ／ｇ（ｗｅｔ）　　富士紡
績銖製］を濃度ＬＭ　（ｐＨ８）のエタノールアミン溶
液に添加し、約２０時間室温で攪拌した。この後、酢酸
緩衝液（０，１Ｍ　　ｐＨ４）、燐酸緩衝液（０゜ＬＭ
　　ｐＨ７，４）を順次用い、１２１℃にて２０分間オ
ートクレーブ処理した。このようにして得られた末端に
−ＣＨ２ＣＨ２０Ｈを有するモノエタノールアミン固定
化ビーズを用いて実施例１と同様のリンパ球分離実験を
行なった。得られた結果を第１表に示す。

比較例３ 不溶性担体としてオキシラン基を有するキトサンビーズ
［キトパール　Ｅｌ）−８１０（Ｅｌ）−Ｃ）、φ３０
０ｐｍ、オキシラン基台ｆｆ１Ｏ，１２ｏ＋ｌｌ１ｏｌ
／ｇ（ｗｅｔ）富士紡績■製］を用い、スペーサーであ
るトリエチレンテトラミンだけを結合させた分離材を実
施例１の方法に準じて作成し、実施例１と同様のリンパ
球分離実験を行なった。得られた結果を第１表に示す。

比較例４ 比較例３で調製された反応物を、０．２Ｍの炭酸緩衝液
（ｐＨ１０）を用いて調製された５　ｗ／ｖ％のブタン
ジオールグリシジルエーテル溶液に添加し、８０℃の水
浴中で３時間加温した後にブラッドミキサーを使用して
室温で約２０時間攪拌した。次に、濃度ＬＭ　（ｐＨ８
）のエタノールアミン溶液に蒸留水洗浄した固定化ビー
ズを添加し、約２０時間室温で撹拌した。このようにし
て末端が−ＣＨ２ＣＨｔ　ＯＨであるスペーサーを固定
化した分離材を用いて実施例１と同様のリンパ球分離実
験を行なった。得られた結果を第１表に示す。

比較例５ 不溶性担体としてオキシラン基をａするキトサンビーズ
［キトパール　ＣＰ−８１０（ＩＥＰ−Ｃ）、φ３００
μｍ、オキシラン基台ｆｆ１ｏ、　　１２ｍｍｏｌ／　
ｇ（ｗｅｔ）富士紡績側製］を用い、これに直接メチレ
ンの繰返しが４である直鎖アルキル鎖を固定化した。

まず、０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ１０）を用いて０．
２Ｍのブチルアミン溶液を調製し、蒸溜水洗浄したＥＰ
−Ｃを添加した。これを８０℃の水浴中で３時間加温し
た後に、ブラッドミキサーを使用して室温で約２０時間
撹拌した。次に濃度ＬＭ（ｐＨ８）のエタノールアミン
溶液に蒸溜水洗浄した反応物を添加し、約２０時間室温
で攪拌し残存するグリシジル基をブロックした。最後に
、酢酸緩衝液（０，１Ｍ　　ｐＨ４）　、リン酸緩衝液
（０，１Ｍ　　ｐＨ７，４）を順次用い、１２１℃、３
０分でオートクレーブ処理した。

このようにして得られた分離材を、実施例１と同様のリ
ンパ球分離実験を行なった。得られた結果を第１表に示
す。

比較例６ ブチルアミンに代えてオクチルアミンを用い、また溶媒
を１００％ジメチルホルムアミドに代える以外は比較例
５の方法に準じて、メチレンの繰返しが８である直鎖ア
ルキル鎖を直接固定化したビーズを作成し、実施例１と
同様のリンパ球分離実験を行なった。得られた結果を第
１表に示す。

比較例７ オクチルアミンに代えてアミノドデカンを用いる以外は
比較例６の方法に準じて、メチレンの繰返しが１２であ
る直鎖アルキル鎖を直接固定化したビーズを作成し、実
施例１と同様のリンパ球分離実験を行なった。得られた
結果を第１表に示す。

実施例５ 水不溶性担体としてキトサンビーズ［キトパール　３０
１０（Ｃ１１）、φ３００μｍ、富士紡績■製］を用い
、スペーサーとしてヘキサンジオール（ＨＤＯ）を介し
て、メチレンの繰返しが４であるアルキル鎖を疎水性末
端として固定化した。

まず、３０　ｍｏ１％水酸化ナトリウムをＡむジメチル
ホルムアミド溶液を用い５　ａ＋ｏ１％ヘキサンジオー
ルジグリシジルエーテル溶液を調製し、蒸溜水洗浄され
たＣＨを添加した。これを８０℃の水浴中で３時間加温
した後に、ブラッドミキサーを使用して室温で約２０時
間撹拌した。次に、０゜２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ１０）
を用いて調製された０、２Ｍのブチルアミン溶液に洗浄
された反応物を添加し、８０℃の水浴中で３時間加温し
た後に、ブラッドミキサーを使用して室温で約２０時間
攪拌した。次いで、未反応のオキシラン基を除去するた
め、濃度ＩＭ（ｐＨ８）のエタノールアミン溶液に蒸留
水洗浄した固定化ビーズを添加し、約２０時間撹拌した
。最後に、酢酸緩衝液（Ｃ１。

ＩＭ　　ｐ）１４）　、リン酸緩衝液（０，１Ｍ　　ｐ
Ｈ７，４）を順次用い１２１℃、３０分でオートクレー
プ処理した。

このようにして得られた分離材を、実施例１と同様のリ
ンパ球分離実験を行なった。得られた結果を第１表に示
す。

実施例６ ブチルアミンに代えてオクチルアミンを用い、また溶媒
を１００％ジメチルホルムアミドに代える以外は実施例
５の方法に準じて、メチレンの繰返しが８である直鎖ア
ルキル鎖を疎水性末端として固定化したビーズを作成し
、実施例１と同様のリンパ球分離実験を行なった。得ら
れた結果を第１表に示す。

実施例７ オクチルアミンに代えてアミノドデカンを用いる以外は
実施例６の方法に準じて、メチレンの繰返しが１２であ
る直鎖アルキル鎖を疎水性末端として固定化したビーズ
を作成し、実施例１と同様のリンパ球分離実験を行なっ
た。得られた結果を第１表に示す。

実施例８ 水不溶性担体としてキトサンビーズ［キトパール　３０
１０（Ｃ１＋）、φ３００μｍＳ富士紡績側製］を用い
、スペーサーとしてヘキサンジオール（ＨＤＯ）、トリ
エチレンテトラミン（Ｔ　Ｅ　Ｔ）およびブタンジオー
ル（ＢＤＯ）を介して、メチレンの繰返しが４であるア
ルキル鎖を疎水性末端として固定化した。

まず、実施例５で調製されたＨＤＯ処理処理Ｃ前留水で
洗浄し、０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ１０）を用いて調
製されたＯ、、２Ｍ　　ＴＥＴ溶液に添加し、８０℃の
水浴中で３時間加温した後に、ブラッドミキサーを使用
して室温で約２０時間撹拌した。さらに０゜２Ｍの炭酸
緩衝液（ｐＨ１０）を用いて調製された５　ｗ／ｖ％の
ブタンジオールグリシジルエーテル溶液に洗浄された反
応物を添加し、８０℃の水浴中で３時間加温した後に、
ブラッドミキサーを使用して室温で約２０時間撹拌した
。この後、０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ１０）を用いて
調製された０、２Ｍのブチルアミン溶液に洗浄された反
応物を添加し、８０℃の水浴中で３時間加温した後に、
ブラッドミキサーを使用して室温で約２０時間攪拌した
。次いで、未反応のオキシラン基を除去するため、濃度
ＩＭ　（ｐＨ８）のエタノールアミン溶液に蒸留水洗浄
した固定化ビーズを添加し、約２０時間撹拌した。最後
に、酢酸緩衝液（０，ＩＭ　　ｐＨ４）、リン酸緩衝液
（０，１ｍｏ　！　　ｐＨ７，４）を順次用い１２１℃
、３０分でオートクレーブ処理した。

このようにして得られた分離材を、実施例１と同様のリ
ンパ球分離実験を行なった。得られた結果を第１表に示
す。

実施例９ ブチルアミンに代えてオクチルアミンを用い、また溶媒
を１００％ジメチルホルムアミドに代える以外は実施例
８の方法に準じて、メチレンの繰返しが８である直鎖ア
ルキル鎖を疎水性末端として固定化したビーズを作成し
、実施例１と同様のリンパ球分離実験を行なった。得ら
れた結果を第１表に示す。

実施例１０ オクチルアミンに代えてアミノドデカンを用いる以外は
実施例９の方法に準じて、メチレンの繰返しが１２であ
る直鎖アルキル鎖を疎水性末端として固定化したビーズ
を作成し、実施例１と同様のリンパ球分離実験を行なっ
た。得られた結果を第１表に示す。

実施例１１ 水不溶性担体としてキトサンビーズ［キトパール　３０
１０（Ｃ１１）、φ３００μｍ、富士紡績■製］を用い
、スペーサーとしてエチレングリコール（ＥＤＯ）、ト
リエチレンテトラミン（Ｔ　Ｅ　Ｔ）およびブタンジオ
ール（ＢＤＯ）を介して、メチレンの繰返しが４である
アルキル鎖を疎水性末端として固定化した。

まず、ＣＨを蒸溜水で洗浄し、０．２Ｍの炭酸緩衝液を
用いて調製された５ν／Ｖ％のエチレングリコールジグ
リシジルエーテル溶液に添加し、８０℃の水浴中で３時
間加温した後に、ブラッドミキサーを使用して室温で約
２０時間撹拌した。以下のＴＥＴおよびＢＤＯ処理は実
施例８の方法に準じ、メチレンの繰返しが４である直鎖
アルキル鎖を疎水性末端として固定化したビーズを作成
し、実施例１と同様のリンパ球分離実験を行なった。

得られた結果を第１表に示す。

実施例１２ ブチルアミンに代えてオクチルアミンを用い、また溶媒
を１００％ジメチルホルムアミドに代える以外は実施例
１１の方法に準じて、メチレンの繰返しが８である直鎖
アルキル鎖を疎水性末端として固定化したビーズを作成
し、実施例１と同様のリンパ球分離実験を行なった。得
られた結果を第１表に示す。

実施例１３ オクチルアミンに代えてアミノドデカンを用いる以外は
実施例１２の方法に準じて、メチレンの繰返しが１２で
ある直鎖アルキル鎖を疎水性末端として固定化したビー
ズを作成し、実施例１と同様のリンパ球分離実験を行な
った。得られた結果を第１表に示す。

実施例１４ 水不溶性担体として、オキシラン基を白゛するアクリル
ビーズ［オイパーキツドＣ（ＥＣ）、φ１５０１ｔｍ、
オキシラン基含量１３　ｐ　ｍｏｌ　／　ｇ（ｗｅｔ）
　　レーム　ファルマ［Ｒｏｈｍ　Ｐｈａｒｍａ　］社
製］を用い、トリエチレンテトラミン（Ｔ　Ｅ　Ｔ）と
エチレンオキシドの繰返しが２２であるポリエチレング
リコール（ＥＧ）を介して、メチレンの繰返しが１２で
ある直鎖アルキル鎖を疎水性末端として固定化した。

まず、ＥＣを洗浄し、０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐ　Ｈ１
０）を用で調製された０、２ＭのＴＥＴ溶液に添加し、
８０℃の水浴中で３時間加温した後に、ブラッドミキサ
ーを使用して室温で約２０時間撹拌した。次に、０．２
Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ１０）を用いて調製されたＬｏｗ
／ｗ％のポリエチレングリシジルエーテル溶液に添加し
、８０℃の水浴中で３時間加温した後に、ブラ・ソドミ
キサーを使用して室温で約２０時間撹拌した。さらに、
実施例１０の方法に準じてアミノドデカンを固定化した
後、未反応のオキシラン基を除去するためにＩＭ　（ｐ
Ｈ８）のエタノールアミン溶液に蒸留水洗浄した固定化
ビーズを添加し、約２０時間撹拌した。最後に、酢酸緩
衝液（０，１Ｍ　　ｐＨ４）リン酸緩衝液（０，１Ｍ　
　ｐＨ７，４）を順次用い１２１℃、３０分でオートク
レーブ処理した。

このようにして得られた分離材を用いて、実施例１と同
様ρリンパ球分離実験を行なった。得られた結果を第１
表に示す。

実施例１５ 水不溶性担体としてキトサンビーズ［キトパール　３０
１０（Ｃ１１）、φ３００μｍ、富士紡績■製］を用い
、エチレンオキシドの繰返しが１５であるポリエチレン
グリコール（ＥＧ）を介して、メチレンの繰返しが１２
である直鎖アルキル鎖を疎水性末端として固定化した。

まず、ＣＨを蒸留水で洗浄し、０．２Ｍの炭酸緩衝液（
ｐＨ１０）を用いて調製された１０ｖ／ｗ％のラウリル
アルコールグリシジルエーテル（（：、ｊ＋、６．Ｃｌ
ＩＣ１１−０（ｅｌｌ。ｅｌ１２０）１５−（Ｃ１１□
）１□ｅ１１３）溶液に添加し、８０℃の水浴中で３時
間加温した後に、ブラッドミキサーを使用して室温で約
２０時間撹拌した。次に、０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ
１０）を用で調製された１０ｗ／ｗ％のポリエチレング
リシジルエーテル溶液に添加し、８０℃の水浴中で３時
間加温した後に、ブラッドミキサーを使用して室温で約
２０時間撹拌した。この後、酢酸緩衝液（０，１Ｍ　　
ｐＨ４）、リン酸緩衝液（０，１Ｍ　　ｐＨ７，４）を
順次用い１２１℃、３０分でオートクレーブ処理した。

このようにして得られた分離材を用いて、実施例１と同
様のリンパ球分離実験を行なった。得られた結果を第１
表に示す。

比較例１ 比較例２ 比・咬例３ 比較例４ 実施例１ 実施例２ 実施例３ 実施例４ 第１表 細胞付着率 リンパ球　　Ｔ細胞 ７７．２　　　　７４．６ ７７．７　　　　７７．２ ７１．４　　　　６８．０ ７４．０　　　　７２．２ ４１．７ ４９．１ ５３．０ ６１．８ ４４゜４ ５５．１ ６０．０ ７３．０ 比較例５ 比較例６　　１００．０ 比較例７　　１００．０ １００．０ １００．０ ｉｏｏ、。

１００．０ （％） Ｂ細胞 ８１．２ ８５゜９ ７６．６ ７６．７ ３８．３ ４１．５ ４６２ ４５．６ ｔｏｏ、。

１００．０ １００．０ 実施例５ 実施例６ 実施例７ 実施例８ 実施例９ 実施例１０ 実施例１１ 実施例１２ 実施例１３ 実施例１４ 実施例１５ リンパ球 ７３．２ ７３．８ ６５．３ ７２．９ ６６．１ ６０．７ ７０．４ ６９．５ ５９．５ ４３．７ ４５．０ 第１表（続き） 細胞付着率（％） Ｔ細胞　　Ｂ細胞 ７Ｂ、９　　　６４．０ ７Ｂ、０　　　６５．８ ６８．９　　　５３．６ ７６．６　　　　Ｇｏ、９ ７１．２　　　４９．８ ７１．６　　　２６１ ７６゜ｌ　　　　５７．１ ７４．８　　　５７．７ ６ｇ、６　　　４０．３ ４７．５　　　３８．４ ６０．６　　　２３．３ 第１表に示す結果から明らかなように、親水的な分子構
造を含むスペーサーを介し、直鎖アルキル鎖を固定化し
た分離材は、Ｔリンパ球に対し強い親和性を有し、一方
、Ｂリンパ球の付着を適度に抑制するものであった。

（発明の効果） 以上述べたように本発明は、リンパ球中のＴリンパ球分
画を他のリンパ球分画よりも優先的に吸着させるアルキ
ル鎖を、親水的な分子構造を倉むスペーサーを介して水
不溶性固体物質表面に固定化したことを特徴とするリン
パ球亜群の分離材であるから、リンパ球浮遊液と接触さ
せることで、リンパ球浮遊液から選択的にＴリンパ球を
吸着するため、リンパ球浮遊液からの簡便かつ迅速なり
リンパ球の分離、濃縮を可能にすることがあきらかとな
った。従って、本発明のリンパ球亜群の分離器は免疫機
能に関連した白血球亜群の細胞間相互作用の解析、リン
パ球由来の生理活性物質を効率的に得るための基礎技術
、さらには各種免疫病害の治療に応用できることを示す
とともに、本発明の分離材によって、特殊な生理活性物
質を用いることなく、精度の高いＴ、　　Ｂリンパ球分
離が達成できることも示された。

また、本発明のリンパ球亜群の分離器において、前記ア
ルキル鎖におけるメチレンの繰返しが２５以下のもので
あり、また前記アルキル鎖が直鎖アルキル鎖であり、不
溶性固体物質として粒径０゜０５〜５ｍｍの粒子状体を
用いるものであるとより効率のよいリンパ球亜群分離操
作が可能となるものである。

本発明はまた、リンパ球中のＴリンパ球分画を他のリン
パ球分画よりも優先的に吸着させるアルキル鎖を、親水
的な分子構造を含むスペーサーを介して水不溶性固体物
質表面に固定化したことを特徴とするリンパ球亜群の分
離材を充填したカラムを有することを特徴とするリンパ
球亜群の分離器であるから、」−２のごとく優れた特性
を有するリンパ球亜群の分離材と血球浮遊液との接触を
より効率よく行なうことができ、リンパ球亜群の分離操
作を短時間でかつ守備よ〈実施することが可能となるも
のである。

さらに本発明は、リンパ球中のＴリンパ球分画を曲のリ
ンパ球分画よりも優先的に吸着させるアルキル鎖を、親
水的な分子構造を含むスペーサーを介して水不溶性固体
物質表面に固定化したことを特徴とするリンパ球亜群の
分離材に、ヒトあるいは非ヒト動物山来のリンパ球分画
を接触させ、１−泥分離材にＴリンパ球を効率よく捕捉
させることでＢリンパ球に富む非捕捉分画液を分離回収
することを特徴とするリンパ球亜群の分離方法であるか
ら、前記のごときリンパ球亜群の分離材の優れた特性を
生かし、リンパ球浮遊液から、Ｔリンパ球分画とＢリン
パ球とに分離回収することができるため、従来の分離法
に比べ、操作の習熟を必要としないでリンパ球亜群の分
画を極めて高い収率で得ることができ、さらに安価で、
際だった細胞損傷も一切与えないことから、極めてＧ用
な技術であると言うことができるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のリンパ球亜群の分離器の一実施態様の
使用状態における模式図である。 １・・・カラム、　２・・・リンパ球亜群の分離）ｒＡ
、３．３′・・・フィルター、　４・・・三方活栓、５
・・・流出口、　６・・・実径部、　７・・・縮径部、
８・・・試験管。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）リンパ球中のＴリンパ球分画を他のリンパ球分画
   よりも優先的に吸着させるアルキル鎖を、親水的な分子
   構造を含むスペーサーを介して水不溶性固体物質表面に
   固定化したことを特徴とするリンパ球亜群の分離材。
2. （２）前記アルキル鎖におけるメチレンの繰返しが２５
   以下である請求項１に記載のリンパ球亜群の分離材。
3. （３）前記アルキル鎖が直鎖アルキルである請求項１ま
   たは２に記載のリンパ球亜群の分離材。
4. （４）スペーサーが親水部と疎水部とを有するものであ
   る請求項１〜３のいずれかに記載のリンパ球亜群の分離
   材。
5. （５）不溶性固体物質として粒径０．０５〜５ｍｍの粒
   子状体を用いるものである請求項１〜４のいずれかに記
   載のリンパ球亜群の分離材。
6. （６）請求項１〜５のいずれかに記載のリンパ球亜群の
   分離材を充填したカラムを有することを特徴とするリン
   パ球亜群の分離器。
7. （７）請求項１〜５のいずれかに記載のリンパ球亜群の
   分離材に、ヒトあるいは非ヒト動物山来のリンパ球分画
   を接触させ、上記分離材にＴリンパ球を効率よく捕捉さ
   せることでＢリンパ球に富む非捕捉分画液を分離回収す
   ることを特徴とする白血球分離法。